terapia genica contra enfermedades proliferativas celulares.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kInt. Cl. : C12N 15/00
11 Número de publicación:
2 143 463
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ESPAÑA
C12P 21/04
A61K 48/00
C12N 9/00
C12N 15/12
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 91908358.4
kFecha de presentación : 10.04.1991
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 527 804
kFecha de publicación de la solicitud: 24.02.1993
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54 Tı́tulo: Terapia génica contra enfermedades proliferativas celulares.
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73 Titular/es: CANJI, INC.
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72 Inventor/es: Fung, Yuen Kai y
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74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto
30 Prioridad: 10.04.1990 US 507417
3525 John Hopkins Court
San Diego, CA 92121, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.05.2000
ES 2 143 463 T3
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.05.2000
Aviso:
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Murphree, Alan Linn
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
Terapia génica contra enfermedades proliferativas celulares.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una modalidad terapéutica para el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, que comprende
la inserción de un elemento regulador del crecimiento que actúa negativamente (NGR) en una
célula en proliferación.
Antecedentes de la invención
Las condiciones patológicas que dan como resultado una proliferación local indebida de las
células, son una causa común de enfermedad humana. Las enfermedades humanas benignas difieren de los procesos malignos (cáncer), en primer
lugar, por la incapacidad de extenderse desde una
parte del cuerpo a otra y por su tasa de crecimiento generalmente más lenta. Ambas pueden
matar, producir ceguera y mutilar. Las adhesiones internas indeseadas y la cicatrización después
de cirugı́a abdominal pueden conducir a una estrangulación intestinal y la muerte. La ceguera
debida a diabetes mellitus es el resultado del
crecimiento indebido de nuevos vasos sanguı́neos
dentro del ojo. Los neurofibromas benignos causan desfiguración. Una enfermedad de la piel
similar a la psoriasis es un proceso de debilitamiento a lo largo de la vida, resultado del crecimiento excesivo indebido de células normales en
otras circunstancias. Evaluaciones de diferentes
enfermedades humanas se pueden asignar a esta
categorı́a.
Las enfermedades que resultan de la proliferación local inadecuada de células se denominarán colectivamente Enfermedades Proliferativas Benignas (EPB). Cuando la célula predominante en la población con crecimiento excesivo es
el fibroblasto, las enfermedades en el subgrupo
se conocen como trastornos “fibroproliferativos”.
Cuando la célula predominante es endotelio vascular (un tipo de célula que alı́nea la superficie
de los vasos sanguı́neos), el subgrupo se conoce
como trastornos “vasoproliferativos”. El crecimiento excesivo indebido del epitelio da como
resultado enfermedades graves de la piel. Actualmente, el tratamiento de estas enfermedades
proliferativas benignas requiere frecuentemente la
ablación de tejidos con uno o varios de los siguientes tratamientos: cirugı́a, radiación y/o quimioterapia. Estos tratamientos se acompañan generalmente todos de lesión de los tejidos normales y
patológicos. Otras modalidades de tratamientos
locales, tales como láser o crioterapia local, tienen
raramente éxito.
Regulación de la proliferación celular
El control de la proliferación celular es un proceso complejo que sólo ahora ha comenzado a ser
entendido en los últimos años. El que una célula
vaya a crecer o no depende del equilibrio de la expresión de elementos del crecimiento que actúan
negativa y positivamente. Los elementos reguladores del crecimiento que actúan negativamente
(NGR) son los que, cuando se expresan en la
célula o se suministran a la misma, conducen a la
supresión del crecimiento celular. Los elementos
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reguladores del crecimiento que actúan positivamente (PGR) son generalmente los productos o
genes y sus productos que, cuando se expresan en
una célula o se suministran a la misma, estimulan
su proliferación.
Elementos reguladores negativos del crecimiento
(NGR)
La expresión de los genes que actúan negativamente sobre el crecimiento es importante en
la regulación y control de la proliferación celular. Ejemplos de elementos NGR son distintos
genes que se han identificado, cuya expresión se
induce en células que están inactivas o en estado
de reposo. Estos genes se pueden denominar genes reguladores negativos del crecimiento (NGR).
Una deficiencia de la regulación de estos genes
que actúan negativamente sobre la regulación del
crecimiento da como resultado la eliminación de
la inhibición de la proliferación celular. Además
de los fenómenos biológicos o fisiológicos que dan
como resultado la inactivación de estos genes o
de los productos génicos, se han identificado ciertos estados patológicos en los que los genes que
actúan negativamente sobre la regulación del crecimiento están inactivos o ausentes. Estos genes
pueden estar inactivos debido a deleciones, mutaciones o deficiencia de la regulación del gen, o
debido a la sobreabundancia de un factor que se
une o inactiva el producto génico y, por tanto,
evita, parcial o completamente la expresión del
gen o la función de su producto, y por tanto, su
capacidad para bloquear o inhibir la proliferación
celular.
El gen del retinoblastoma humano, Rb1, es
el prototipo de esta clase de genes supresores de
tumores, denominados en esta memoria genes reguladores negativos del crecimiento (NGR) en los
que la ausencia de ambos alelos del gen en una
célula o la inhibición de la expresión del gen o
de su producto génico, conducirá a una proliferación celular neoplásica o anormal. Se ha demostrado a nivel molecular que la pérdida o inactivación de ambos alelos del gen RB1 está implicada en la manifestación clı́nica de tumores tales como retinoblastoma y tumores relacionados
clı́nicamente, tales como osteosarcomas, fibrosarcoma, sarcoma de tejido blando y melanoma.
Adicionalmente, la pérdida de la función del
gen Rb-1 también se ha asociado con otros tipos
de cáncer primario tal como carcinoma primario
de células pequeñas del pulmón (SCLP), sarcomas de tejidos blandos, carcinoma de pecho, carcinoma cervical y carcinoma de próstata.
La introducción del gen Rb-1 en una célula tumoral que ha perdido el gen Rb-1, da como resultado la supresión del crecimiento del tumor. Por
ejemplo, cuando el ADNc de Rb-1 se introdujo en
la lı́nea celular de osteosarcoma SAOS2 y la lı́nea
celular de cáncer de próstata DU 145, células tumorales que habı́an perdido su gen Rb endógeno,
el crecimiento de algunas de estas células tumorales fue suprimido especı́ficamente in vivo (Huang
y col., (1988) Science 242:1563; Bookstein y col.,
(1990) Science 247:712). Estos autores concluyeron que, aunque el gen del retinoblastoma suprimı́a especı́ficamente el fenotipo tumorı́geno, no
tenı́a efecto sobre las células normales.
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Elementos reguladores que actúan positivamente
sobre el crecimiento (PGR)
Los elementos reguladores que actúan positivamente sobre el crecimiento (PGR) incluyen todos los proto-oncogenes, en los que se ha observado que su expresión se activa en algunas formas de cáncer y durante la proliferación celular
en células normales y en ciertas enfermedades patológicas proliferativas celulares. La activación de
la expresión de los proto-oncogenes es indispensable para la proliferación celular. Muchos de los
genes especı́ficos en esta clase se han encontrado
que codifican factores de crecimiento o sus receptores. La expresión de algunos proto-oncogenes
se ha encontrado que está estrechamente ligada
al estado proliferativo cuando una célula se expone a factores de crecimiento. Muchos factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de
crecimiento epidérmico (EGF), insulina y transferrina, por nombrar unos pocos, son necesarios
para la proliferación celular. Las células que no
expresan la molécula especı́fica del receptor de
un factor de crecimiento, no pueden proliferar,
incluso cuando el factor de crecimiento está presente en la célula. Por otro lado, las células en
las que la regulación negativa normal de la expresión del receptor se interfiere, dando como resultado una expresión incontrolada del receptor,
proliferarán de un modo incontrolado. Cuando
las células inactivas se exponen al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o al factor de crecimiento epidérmico (EGF), se induce
la sı́ntesis del nuevo ARNm de diversos protooncogenes, incluyendo c-fos y c-myc. De forma
similar, las células hepáticas en reposo se pueden estimular para crecer in vivo mediante hepatomı́a parcial. Esta estimulación del crecimiento
está asociada con una expresión elevada de diversos proto-oncogenes, incluyendo c-myc. La activación de estos genes PGR es necesaria para la
proliferación celular normal, ası́ como la anormal
o patológica.
Las enfermedades o trastornos patológicos
proliferativos celulares se asocian frecuentemente
con una activación indebida de los proto-oncogenes. El nivel de expresión de c-myc, por ejemplo,
se amplifica altamente en la lı́nea celular de leucemia no linfocı́tica, HL-60. Cuando las células
HL-60 se inducen para detener la proliferación
mediante inductores quı́micos, tales como ácidos
retinoicos y sulfóxido de dimetilo, el nivel de cmyc se regula deficientemente. Por otro lado,
la exposición de las células HL-60 a una estructura de ADN que es complementaria al extremo
5’ de c-myc o c-myb produce la detención de la
traducción de estos ARNm y la expresión de las
proteı́nas de c-myc o c-myb se regula deficientemente, dando como resultado la detención de la
proliferación celular y de la diferenciación de las
células tratadas (Wickstorm y col. (1988) Proc.
Natl. Acad. Sci. 85: 1028; Anfossi y col., (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3379).
Sumario de la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona un acercamiento generalizado al tratamiento del crecimiento indebido o patológico de
células en enfermedades proliferativas benignas.
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Por tanto, la presente invención proporciona
el uso de ADN que codifica un gen de retinoblastoma que dirige la expresión de un péptido codificado, en la preparación de un medicamento
para uso en un método de tratamiento de enfermedades patológicas con proliferación de células
benignas mediante la administración de dicho medicamento a una célula.
Preferentemente, el ADN que codifica el gen
del retinoblastoma está contenido en un vector de
expresión recombinante.
El vector de expresión es preferentemente un
vector vı́rico, más preferentemente un vector retrovı́rico. En una realización más preferida, el
vector retrovı́rico es defectuoso y no transformará
células no proliferativas. El vector de expresión
puede ser un plásmido, preferentemente encapsulado en un liposoma.
Preferentemente, el medicamento es para uso
en el tratamiento de células anormalmente proliferativas asociadas con una enfermedad seleccionada entre el grupo consistente en enfermedades benignas proliferativas de la piel, psoriasis,
ictiosis, papilomas, carcinomas de células basales, carcinoma de células escamosas, enfermedades fibroproliferativas, enfermedades vasoproliferativas, enfermedades dermatoproliferativas y enfermedades neoplásicas del ojo.
Preferentemente, las células proliferativas
contienen al menos un alelo activo de un gen regulador negativo del crecimiento, pero todavı́a proliferan inadecuadamente.
Otros aspectos, aspectos adicionales y caracterı́sticas y ventajas de la presente invención serán
evidentes a partir de la siguiente descripción de
las realizaciones preferidas actualmente de la invención, proporcionadas con fin descriptivo.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la construcción y la
estructura del plásmido HuBAcpr-1-neo-Rb que
contiene parte o todo el ADNc de Rb-1 bajo el
control de un promotor de la β-actina humana.
La Figura 2 demuestra el efecto de plásmidos
transfectados sobre la proliferación de la lı́nea celular de fibroblastos humanos WS1.
La Figura 3 muestra la representación esquemática del vector retrovı́rico que contiene el
gen Rb-1.
Descripción detallada de las realizaciones
preferidas
Definiciones
La presente invención emplea una estructura
de ADN del gen Rb-1, incorporada preferentemente en un vehı́culo o vector preferentemente
bajo el estı́mulo de un promotor fuerte. Preferentemente, la estructura de ADN de la presente invención se obtiene de las células diana utilizando
el vector retrovı́rico basado en MuLV.
La expresión “expresión funcional del gen” se
emplea para incluir la supresión de la transcripción del gen, la degradación del transcrito del
gen (ARN pre-mensajero), la inhibición del empalme, la destrucción del ARN mensajero, evitar
la traducción del ARN mensajero, evitar las modificaciones post-traduccionales de la proteı́na, la
destrucción de la proteı́na o la inhibición de la
función normal de la proteı́na.
La expresión “plásmido transfectado” se em3
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plea para incluir el plásmido bacteriano que contiene el ADN que codifica un gen de retinoblastoma para ser transportado (transfectado) a la
célula elegida.
La expresión “terapia génica” se emplea para
incluir la inserción de parte o de todo el ADN
en una célula, grupo de células, tejido, lesión patológica, órgano u organismo con el fin de modular la expresión génica, y/o la función del producto génico.
La expresión “terapia génica profiláctica” se
emplea para incluir genes que se pueden utilizar
para la inhibición parcial o total, o para evitar
la enfermedad y la extensión de la enfermedad
y también se emplea para incluir genes que se
pueden utilizar para suplementar o reemplazar un
crecimiento negativo ausente o defectuoso en la
célula, tejidos o lı́neas germinales.
La expresión “enfermedad proliferativa celular” se emplea para incluir cualquier enfermedad
o transtorno humano o animal, que afecte a uno
cualquiera o a cualquier combinación de órganos,
cavidades o partes corporales, que se caracteriza
por proliferaciones anormales locales, aisladas o
múltiples, de células, grupos de células o tejido(s),
que son benignos.
El término “procariota” se emplea para incluir
todas las bacterias que se pueden transformar con
el ADN para la expresión de las moléculas recombinantes de la presente invención.
El término “eucariota” se emplea para incluir
todas las células de levaduras, hongos, animales y
vegetales que se pueden transformar con el ADN
para expresar las moléculas recombinantes de la
presente invención.
El ADN para las estructuras de ADN de la
presente invención puede ser sintético o se puede
obtener a partir de cualquier especie de mamı́fero.
Lo único que se requiere es que la secuencia
genética para el gen del retinoblastoma se exprese
funcionalmente en el organismo procarionte o eucarionte. Se prefiere ADN sintético.
Una molécula de ADN recombinante que codifica las estructuras de ADN de la presente invención, se puede utilizar para transformar un
hospedador empleando cualquiera de las tecnologı́as conocidas generalmente por los expertos en
la técnica.
Los métodos para preparar genes fusionados,
ligados funcionalmente y que se expresen en bacterias, son conocidos y se muestran, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n◦ 4.366.246, incorporada a esta memoria como referencia. Las
estructuras genéticas y los métodos descritos en
esta memoria se pueden utilizar para la construcción de las estructuras de ADN de la presente
invención y la transfección en hospedadores procariontes o eucariontes.
Los hospedadores procariontes pueden incluir
bacterias Gram negativas ası́ como Gram positivas, tales como E. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis.
Los hospedadores eucariontes pueden incluir
levaduras tales como Pichia pastoris o células de
mamı́fero.
En general, los vectores de expresión que contienen las secuencias del promotor que facilitan
la transcripción eficaz del fragmento de ADN in4
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sertado, se emplean en conexión con el hospedador. El vector de expresión contiene tı́picamente
un origen de replicación, promotor(es), terminador(es), ası́ como genes especı́ficos que son capaces de proporcionar una selección fenotı́pica
en células transformadas.
Los hospedadores
transformados se pueden fermentar y cultivar de
acuerdo con medios conocidos en la técnica para
conseguir un crecimiento celular óptimo.
Ejemplos de promotores que se pueden utilizar en la invención incluyen, pero no están limitados a: promotor de la β-actina humana, promotor de metalotionina, origen de replicación de
SV40 y promotor MMTV LTR y promotor MuLV
LTR. Ejemplos de algunos de los plásmidos o bacteriófagos que se pueden emplear en la invención
se enumeran en Maniatis y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982 y
otros son conocidos por los expertos en la técnica
y se pueden averiguar fácilmente.
Un gen es una secuencia de ADN que codifica mediante su molde o ARN mensajero una
secuencia de aminoácidos caracterı́stica de un
péptido especı́fico. El término ADNc incluye genes a partir de los cuales las secuencias que intervienen se han eliminado. La expresión “ADN
recombinante” (ADNr) se emplea para incluir
una molécula que se ha recombinado mediante
corte y empalme de secuencias de ADNc o ADN
genómico in vitro.
Un vehı́culo para la clonación es un ADN de
plásmido o de fago u otra secuencia de ADN que
es capaz de replicarse en una célula de hospedador
que se caracteriza por uno o una pequeña cantidad de sitios de reconocimiento de endonucleasas
en los que tales secuencias de ADN se pueden
cortar de un modo determinable sin pérdida de
una función biológica esencial del ADN, y que
contiene un marcador adecuado para usar en la
identificación de las células transformadas. Los
marcadores, por ejemplo, son resistentes a la tetraciclina o resistentes a la ampicilina. La palabra
“vector” se emplea algunas veces para un vehı́culo
de clonación.
Un vehı́culo de expresión es un vehı́culo similar a un vehı́culo de clonación pero que es capaz
de expresar un gen estructural dado en un hospedador, normalmente bajo control de ciertas secuencias de control.
El término “individuo” se emplea para incluir
animales y seres humanos.
La expresión “que inhibe biológicamente” o
“inhibición” del crecimiento de las células proliferantes se emplea para incluir una inhibición parcial o total del crecimiento y también se emplea
para incluir disminuciones en la tasa de proliferación o de crecimiento de las células. La dosis
biológicamente inhibidora del ADN de la presente
invención se puede determinar señalando los efectos del ADN sobre el crecimiento de las células
diana malignas o que proliferan anormalmente en
el cultivo del tejido (véanse ejemplos 3-4 y las figuras 2-4), el crecimiento tumoral en animales y
el cultivo celular o cualquier otro método conocido por los expertos en la técnica.
La administración del ADN empleado en la
invención puede ser por vı́a tópica, intraocular,
parenteral, oral, intranasal, intravenosa, intra-
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muscular, subcutánea o por cualquier otro medio
adecuado. El método preferido de administración
para el tratamiento de las enfermedades oculares
es la inyección intra o periocular. El método preferido de administración para el tratamiento de
las enfermedades proliferativas de las células de
la piel, es mediante aplicación tópica o inyección
subcutánea.
En otra realización, las estructuras de ADN
de la presente invención se pueden suministrar al
sitio de la enfermedad proliferativa focal directamente. En el caso de enfermedad ocular proliferativa, las estructuras de ADN de la presente invención se pueden inyectar directamente en el ojo.
Las estructuras de ADN de la presente invención
se pueden suministrar directamente a sitios de enfermedades focales en órganos internos, cavidades
corporales y similares, mediante el uso de dispositivos de formación de imágenes empleados para
guiar la aguja que se inyecta directamente en el
sitio de la enfermedad. Las estructuras de ADN
de la presente invención también se pueden administrar en sitios de la enfermedad en el momento
de una intervención quirúrgica.
La dosificación de ADN administrada depende
de la edad, del estado clı́nico y del grado de la
enfermedad o de la predisposición genética del
individuo, situación, peso, tipo de tratamiento
simultáneo, si existe alguno, y naturaleza del
estado patológico o maligno. El sistema eficaz de entrega, útil en el método de la presente invención, se puede emplear en forma de
cápsulas, comprimidos, soluciones lı́quidas, suspensiones o elixires, para administración oral, o
formas lı́quidas estériles tales como soluciones,
suspensiones o emulsiones. Preferentemente se
usa cualquier vehı́culo inerte, tal como solución
salina o solución salina tamponada con fosfato, o
cualquier otro vehı́culo en el que los compuestos
empleados en el método de la presente invención
tengan propiedades de solubilidad adecuadas.
Preferentemente, para el suministro intraocular y para el suministro a otros sitios localizados
de la enfermedad, los sistemas de entrega útiles
en el método de la presente invención, se pueden emplear en forma de lı́quidos estériles tales como soluciones, suspensiones o emulsiones.
Para el uso tópico se pueden emplear en forma
de ungüentos, cremas o pulverizaciones. Cualquier vehı́culo inerte se emplea preferentemente,
tal como solución salina o solución salina tamponada con fosfato, o cualquier otro vehı́culo, en el
que los compuestos empleados en el método de la
presente invención tengan propiedades de solubilidad adecuadas.
Para la administración local a células, el ADN
de la presente invención se puede administrar por
cualquier método conocido por los expertos en
la técnica, incluyendo, pero no estando limitado
a, transfección, electroporación, microinyección
de células, o en vehı́culos tales como liposomas,
lipofectina o como ADN o ARN desnudo. El
ADN de la presente invención se puede suministrar mediante sistemas de entrega de genes conocidos, tales como, pero no limitados a, vectores retrovı́ricos (Gilboa (1982) J. Virology 44:845;
Hocke (1986) Nature 320:275; Wilson y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:3014), sistema de virus
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vaccinia (Chakrabarty y col., (1985) Mol. Cell
Biol. 5:3403) u otros sistemas eficaces de entrega
de ADN (Yates y col., (1985) Nature 313:812) conocidos por los expertos en la técnica. Estas referencias son únicamente a modo de ejemplo y
se incorporan en esta memoria como referencias.
Para suministrar o transfectar especı́ficamente las
células que están proliferando anormalmente y excluir las células que no se dividen, es preferible
utilizar un sistema de suministro de retrovirus,
conocido por los expertos en la técnica. Puesto
que la replicación del ADN del hospedador es necesaria para que el ADN retrovı́rico se integre y
el retrovirus será incapaz de autoreplicación debido a la falta de los genes retrovı́ricos necesarios
para su ciclo vital, utilizando tal sistema de suministro retrovı́rico para el ADN de la presente
invención, dicho ADN se dirigirá a la diana de
células que proliferan anormalmente y se excluirá
de cualquier intervención a las células normales
que no se dividen.
El ADN de la presente invención se administrará con cualquier vehı́culo biológicamente eficaz. Los vehı́culos biológicamente eficaces pueden
incluir retrovirus, liposomas, y cualquier otro mecanismo de transfección capaz de introducir ADN
ajeno en el genoma de la célula. Tales mecanismos de transfección son conocidos por los expertos en la técnica. El vehı́culo también puede incluir cualquier agente o disolvente con el que las
estructuras de la presente invención son compatibles y que no es tóxico para los individuos o las
células tratadas en las cantidades administradas.
Existe una amplia variedad de estados patológicos proliferativos celulares para los que el
método de la presente invención proporcionará
beneficios terapéuticos. Estos estados patológicos
pueden tener lugar en casi todos los tipos celulares capaces de proliferación celular anormal.
Entre los tipos de células que muestran un crecimiento patológico o anormal se encuentran los
fibroblastos (1), en cuyo caso las enfermedades
se conocen como trastornos fibroproliferativos,
células endoteliales vasculares (2), en cuyo caso
las enfermedades se conocen como trastornos vasoproliferativos y células epiteliales (3) en cuyo
caso las enfermedades se conocen como dermatoproliferativas. Se puede observar por lo anterior
que el método de la presente invención es útil para
tratar estados patológicos locales o diseminados
en todos o en casi todos los órganos y sistemas de
tejidos del individuo.
Por ejemplo, sólo en el ojo, el método de
la presente invención se puede utilizar para tratar una amplia variedad de estados de enfermedades patológicas que se deben a la proliferación anormal de células o tejidos normales o
benignos, incluidos, pero no limitados a, las siguientes enfermedades fibroproliferativas, vasoproliferativas y/o neoplásicas del ojo: retinopatı́a
de la madurez, vitreo-retinopatı́a proliferativa,
retinopatı́a diabética proliferativa, hemangioma
capilar, mallas neovasculares coroidales, mallas
neovasculares subretinales, degeneración senil de
la mácula debida a neovascularización subretinal, neovascularización córneal, plegamiento de
la mácula debido a proliferación de la membrana
epiretinal, cataratas de adulto debido a esclerosis
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nuclear, invaginación fibrosa después de trauma
o cirugı́a, gliomas del nervio óptico, angiomatosis de la retina, glaucoma neovascular, hemangioma cavernoso, iridis rubeosis, retinopatı́a proliferativa de células enfermizas, deficiencia del
crecimiento epitelial después de cirugı́a o lesión
en el ojo, membrana post-catarata, papiloma,
neovascularización retinal con talasemia, neovascularización subretinal debido a pseudoxantoma
elástico y neurofibromatosis de tipo 1 y 11 y pseudotumor de la órbita.
Otras enfermedades proliferativas de células
benignas para las que es útil la presente invención
incluyen, pero no están limitadas a, psoriasis, ictiosis, papilomas, carcinomas de células basales,
carcinoma de células escamosas y sı́ndrome de
Stevens-Johnson.
De acuerdo con el método de la presente invención, se puede manipular el proceso proliferativo celular mediante la introducción del ADN
para evitar o inhibir una proliferación anormal en
una amplia variedad de enfermedades proliferativas celulares. La manipulación del proceso proliferativo se puede realizar introduciendo en una
célula diana proliferante, una estructura de ADN
que codifica un gen de retinoblastoma.
Para ilustrar el uso del ADN para inhibir la
proliferación celular anormal en células no malignas o no cancerı́genas mediante el método de
la presente invención, el gen del retinoblastoma
humano, Rb-1, se introdujo en una lı́nea celular
normal de fibroblastos humanos. Tal y como se
describe más a fondo en el Ejemplo 2, la introducción de un ADNc de Rb humano en un fibroblasto humano normal, WS1, conduce al cese del
crecimiento celular. De forma similar, la introducción de este gen de retinoblastoma humano
en varios tipos diferentes de células tumorales,
conduce a la supresión del crecimiento de estas
células in vitro o in vivo tal y como se describe
en los Ejemplos 3 y 4.
Nosotros y otros hemos mostrado que el producto del gen del retinoblastoma humano está
fuertemente fosforilado cuando las células están
proliferando en el lı́mite entre las fases G1/S
y la fase S del ciclo celular (Buckovich y col.,
(1989) Cell 58:1097; Mihara y col., (1989) Science
246:1300; Decaprio (1989) Cell 58:1085 y Chen y
col., (1989) Cell 58 1193), pero no está fosforilado o está menos fosforilado cuando las células
no están proliferando en la fase G1. La exposición
de una célula en reposo a mitógenos da como resultado la activación de un complejo de quinasa
que fosforila la proteı́na Rb. Como resultado, la
célula entra en la replicación del ADN y mitosis. Por tanto, para que una célula inicie la replicación del ADN, la inactivación del producto del
gen del retinoblastoma humano mediante fosforilación puede ser necesaria.
En una realización de la presente invención,
la fosforilación celular normal de la proteı́na Rb1 se puede inhibir o interferir con la introducción
de copias adicionales del gen RB-1, produciendo
una sobre-producción de proteı́na Rb-1, o mutagenizando el gen Rb-1 de forma que no se pueda
fosforilar.
Cuando un gen de retinoblastoma fuertemente
expresado se introducı́a en una célula normal no
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tumoral, se expresaban cantidades abundantes de
la proteı́na del retinoblastoma. La célula tratada
de esta forma contiene una cantidad excesiva de
proteı́na Rb activa y se detiene la proliferación.
La proteı́na de retinoblastoma que existe normalmente en una forma fosforilada de forma múltiple
se vuelve desfosforilada cuando se detiene el crecimiento de las células proliferantes mediante agotamiento del suero. Esta cantidad excesiva de
proteı́na Rb puede oprimir la capacidad de la quinasa celular para fosforilar e inactivar el producto
del gen Rb. Por tanto, en una realización, la proliferación celular se puede detener o inhibir introduciendo el gen Rb-1 en una célula. Para asegurar el procedimiento de detención del crecimiento,
los genes que se van a introducir se deben situar
bajo el control de un promotor fuerte. El promotor de la β-actina humana es un promotor fuerte.
La construcción de una estructura de ADN que
comprende el gen Rb bajo el control de un promotor fuerte tal como el gen de la β-actina humana, se muestra en el Ejemplo 1. Sin embargo,
será obvio para un experto en la técnica que otros
promotores fuertes también se pueden utilizar en
la práctica de la presente invención.
En otra realización, el sitio de fosforilación
del gen Rb-1 está mutagenizado antes de la introducción en una célula. Existen de 7-12 sitios
potenciales de fosforilación sobre la proteı́na Rb.
La mutación de las secuencias que codifican serina
o treonina en el ADNc de Rb-1, a alanina o valina
u otras, conducirá por tanto a la producción de
una proteı́na Rb permanentemente activa que no
se puede inactivar por fosforilación. Por tanto,
la célula hospedadora no será capaz de inactivar
la proteı́na Rb mediante fosforilación. La introducción de un tal gen Rb-1 mutado en una célula
conducirá de este modo a la detención del crecimiento.
Se puede administrar más de una estructura
de ADN de la presente invención, simultáneamente al mismo sitio.
Habiendo descrito ahora la invención de forma
general, un entendimiento más completo se puede
obtener a modo de referencia mediante los siguientes ejemplos especı́ficos. Estos ejemplos se
proporcionan sólo para fines de ilustración y no
se pretende que sean limitantes, a no ser que se
especifique de otro modo.
Ejemplo 1
Construcción del plásmido de expresión del ADNc
de Rb-1
El procedimiento general para la construcción
de plásmidos y la preparación del ADN fue como
se describe en Maniatis y col., (Maniatis, T.,
Fuitsch, E.F., y Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.,
EE.UU.). Todos los plásmidos crecieron en el
hospedador de Escherichia coli, DH5-α, obtenido
de Bethesda Research Laboratory (BRL). Se han
descrito la estructura y las propiedades del sistema del vector de expresión de la β-actina humana, pHBAPr-1-neo (Gunning y col., (1987)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4831-4835). La
secuencia del ADNc de Rb-1 se ha descrito previamente (Fung y col., (1989) en Oncogenes, capı́tulo
13, “Molecular Biology of the Human Retinoblas-
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toma Gene, Benz y Lin, (compiladores) Kluwen
Academic Publishers).
La construcción de HuBAcpr-1-neo-Rb-8342
se demuestra esquemáticamente en la Figura 1,
paneles A-C. Para la construcción de HuBAcpr1-neo-Rb-8342, se escindió un fragmento de ADN
BamHI-EagI que contenı́a parte del primer exón,
del clon del fago λ 4-14-5 (T’Ang y col (1989)
Oncogene 4, 401-407) y se ligó con el extremo
5’ del plásmido de ADNc Rb-1, PGH2, (Fung
y col., (1987) Science 236:1657-1661) en los sitios BamHI-EagI. (Véase Figura 1, panel A). El
plásmido resultante se hizo crecer y el fragmento
HindIII EcoRI que contenı́a la región del promotor de Rb-1 y la porción 5’ del ADNc de Rb-1
se transfirió a un plásmido PT7BRB en el sitio
HindIII y EcoRI (Véase Figura 1, panel B), generando el plásmido pBRB2.9. La mitad 3’ de
3,8 kb del ADNc de Rb se escindió con EcoRI
de PG 3.8 (Fung y col., (1987) Science 236:16571661) y se subclonó en el sitio EcoRI de pBRB2.9
para generar PT7BRBFL. (Véase Figura 1, panel C). Finalmente, el fragmento BamHI que contenı́a el ADNc de Rb-1 y su promotor se subclonó
en HBApr-1-neo en el sitio BamHI para generar
HuBAcpr-1-neo-Rb-8342.
Para la construcción de HuBAcpr-1-neo-RBPQ, se digirió un enlazador sintético bicatenario
(del que sólo se muestra una cadena en esta memoria):
5’ ACGGATC CGCGTC ATG CCG CCC AAA
ACC CCC CGA AAA ACG GCCG 3’ con BamHI
y EagI y se subclonó en el sitio BamHI/EagI
del plásmido PT7BRBFL (Véase Figura 1, panel C), reemplazando el promotor de Rb. Este
plásmido se digirió a continuación parcialmente
con la enzima ppum1 para linearizarlo en el nucleótido n◦ 2797-2799. Un enlazador sintético que
contenı́a una señal poli-A (AATAAA) y un sitio
BamHI flanqueado por los sitios ppum1, se insertó en el sitio ppum1 del PT7BRBFL linearizado. El plásmido resultante se hizo crecer, y el
fragmento BamHI que contenı́a la región que codificaba el ADNc de Rb1, se escindió y se insertó
luego en el sitio BamHI del plásmido HBAcpr-1neo para generar el plásmido HuBAcpr-1-neo-RbPQ.
La Figura 1D muestra la estructura general del plásmido HuBAcpr-1-neo-Rb que contiene
parte o todo el ADNc de Rb-1 bajo el control de
un promotor de la β-actina humana.
Se construyeron dos plásmidos de expresión
diferentes HuBAcpr-1-neo-Rb. Para HuBAcpr-1neo-Rb-8342, X es el fragmento BamHI de 2 Kb
enfrente del primer ATG del cuadro de lectura
abierto más largo (T’Ang y col., (1989) Oncogene
4:401) e Y es la región 3’ completa sin traducir
del ADNc de Rb.
Para HuBAcpr-1-neo-Rb-PQ, X es un enlazador sintético (5-GATCCGCGTC-3) situado enfrente del primer ATG e Y es un enlazador
sintético que contiene una señal para la cola poliA, AATAAA, detrás del nucleótido n◦ 2801.
Ejemplo 2
Efecto de los plásmidos transfectados sobre la proliferación de la lı́nea celular de fibroblastos humanos WS1
Cuando los queratinocitos normales se expo-
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nen al factor de crecimiento tumoral β (TGFβ)
que inhibe el crecimiento de muchos tipos de
células, la proteı́na del retinoblastoma en el queratinocito se desfosforila rápidamente y el queratinocito deja de crecer. El antı́geno T grande de
SV40, que presumiblemente inactiva el producto
del gen del retinoblastoma uniéndose a él, sólo se
puede unir a la forma poco fosforilada (activa) de
la proteı́na del retinoblastoma. Por tanto, cuando
una célula es inducida al estado de detención del
crecimiento, un cambio asociado es la desfosforilación de la proteı́na de retinoblastoma. La estimulación de nuevo de las células detenidas en el
crecimiento mediante la exposición a mitógenos,
da como resultado una fuerte fosforilación de la
proteı́na del retinoblastoma antes de la iniciación
de la sı́ntesis del ADN. El hecho de que ésto se observa en células normales y tumorales, sugiere que
la inactivación de la proteı́na del retinoblastoma
mediante fosforilación es necesaria para que tenga
lugar la proliferación celular. La proteı́na del retinoblastoma puede estar por tanto implicada en
el retardo o en la detención del crecimiento de
células normales o tumorales.
Para estudiar el efecto del ADNc de RB sobre el crecimiento celular, se transfectó HuBA1-neo-Rb-PQ en la lı́nea celular de fibroblastos
normales humanos, WS1. Como testigo, se escindió un fragmento de ADN que contenı́a el
gen de resistencia a la neomicina, bajo el control de RSV LTR, del plásmido PATV-6D3A, se
ligaron los enlazadores sintéticos sal 1 al fragmento, se digirió con sal 1 y se ligó a continuación
con PPVUO (Kalderon y Smith, (1984) Virology 139: 109-137) para generar PPVUO-Neo.
Este plásmido, PPVUO-Neo, que contiene el gen
del antı́geno T grande de SV40, se transfectó a
continuación para vigilar la eficacia de la transfección. Para la transfección, se mezclaron 100
µg de cada ADN de plásmido con células WS1
hechas crecer exponencialmente 107 , en un volumen final de 0,8 ml de medio RPMI 1640 (Gibco)
más 10 % de FCS en una unidad de cámara de
electroporación Cell-PoratorT M (BRL). La electroporación se realizó a 200 voltios y 1180 µF.
A las células electroporadas se les permitió recuperarse a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se diluyeron en RPMI 1640 más
suero de ternera fetal al 10 % (FCS) y se extendieron en placas de 60 mm con una densidad celular de 2 × 104 células/cm2 . Las células pudieron
fijarse y crecer en el mismo medio durante dos
dı́as. Después, se cambió el medio a RPMI 1640
+ 10 % de FCS + 15 µg/ml de G418 (GIBCO).
Cada tres dı́as se tomaron placas duplicadas para
tinción histoinmunoquı́mica empleando, bien anticuerpos policlonales RB1-ABA1 o RB1-AB18 de
conejo contra la proteı́na Rb (Mihara K. y col.,
(1989) Science 246:1300) (Figura 2A), o con el anticuerpo monoclonal PAB 101 de ratón contra el
antı́geno T grande de SV40 (Figura 2B). Se utilizó
el procedimiento de tinción descrito en el Ejemplo 8. Como se puede observar en la Figura 2A,
13 dı́as después de la transfección y la selección
en medio G418, las células WS1 que expresaban
el plásmido HuBAcpr-1-neo-Rb-PQ de ADNc de
Rb, se tiñeron intensamente con los anticuerpos
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anti-proteı́na Rb. Sin embargo, las células que expresaban la proteı́na Rb permanecieron en forma
de células aisladas y no se dividieron. Por el contrario, las células que expresaban el antı́geno T
grande de SV40 transfectado (SVLT) continuaron
dividiéndose en colonias, tal y como se muestra
por el grupo de células teñidas positivamente con
el anticuerpo de ratón anti-SVLT, en la Figura
2B.
Por tanto, la expresión excesiva del ADNc de
Rb en una célula conduce a un retardo o detención
extremos del crecimiento celular.
Ejemplo 3
Localización inmunohistoquı́mica de la proteı́na
Rb en las células
Las células se cultivaron en medio RPMI
1640 suplementado con FCS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 0,1 %. Las células se lavaron dos veces con PBS frı́o (solución salina tamponada con fosfato). Las células se fijaron con
una solución que contenı́a ácido acético al 5 % y
etanol al 95 % a 4◦C durante 12 horas.
Después de fijarlas, las células se lavaron dos
veces en PBS frı́o. La unión no especı́fica se bloqueó incubando las células en una solución de
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PBS que contenı́a suero de caballo normal al 1 %,
seroalbúmina de bovino al 3 % y Triton X-100 al
0,2 %, durante 1 hora a 4◦ C. Las células se lavaron
a continuación dos veces con PBS. Las células se
incubaron a continuación con la solución a 4◦ C
que contenı́a una dilución 1:1600 de RB1-AB18
o una dilución 1:100 de RB1-ABA1 en PBS durante 1 hora a 37◦C. Las células se lavaron a continuación secuencialmente con PBS frı́o y PBS que
contenı́a Triton X-100 al 1 % y PBS. La unión especı́fica de los anticuerpos de RB1 a las células fue
visualizada por incubación con anticuerpos IgG
biotinilados de cabra anti-conejo (diluidos 1:200
en PBS) durante 1 hora a 37◦ C. Después de lavar las células tres veces con PBS frı́o, las células
se incubaron con reactivo ABC (complejo de avidina:biotina) a 37◦ C durante 30 minutos, se lavaron con PBS frı́o y después se incubaron con
solución de DAB (3,3’-diamixobencidina - tetrahidrocloruro) de nuevo aporte (6 mg de DAB en 10
ml de Tris-HCl 0,05 M, pH 7,6, azuro sódico al
0,3 % y 10 µl de peróxido de hidrógeno) a temperatura ambiente durante 4 minutos. Las células
se lavaron a continuación con agua destilada y se
examinaron bajo un microscopio óptico.
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REIVINDICACIONES
1. Uso de ADN que codifica un gen de retinoblastoma que dirige la expresión de un péptido
codificado, en la preparación de un medicamento
para uso en un método de tratamiento de enfermedades patológicas proliferativas de células benignas, mediante la administración de dicho medicamento a una célula.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que dicho ADN que codifica el gen de retinoblastoma está contenido en un vector de expresión
recombinante.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el
que dicho vector de expresión es un vector vı́rico.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en
el que dicho vector de expresión es un vector retrovı́rico.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en
el que dicho vector de expresión es un plásmido.
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6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en
el que dicho plásmido está encapsulado en un liposoma.
7. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el tratamiento es
de células que proliferan anormalmente asociadas
con una enfermedad seleccionada entre el grupo
consistente en, psoriasis, enfermedades benignas
proliferativas de la piel, ictiosis, papiloma, carcinoma de células basales, carcinoma de células
escamosas, enfermedades fibroproliferativas, enfermedades vasoproliferativas, enfermedades dermatoproliferativas y enfermedades neoplásicas del
ojo.
8. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas células
proliferantes contienen al menos un alelo activo
de un gen regulador del crecimiento negativo pero
que aún prolifera de forma inadecuada.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
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Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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