iii. surfactante colonico.

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BARCELONA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE CIRUGIA
Vall d'Hebron
Hospitals
HOSPITAL VALL D’HEBRON
SERVICIO DE CIRUGIA GENERAL Y DIGESTIVA
BARCELONA
2002
2
EL SURFACTANTE COLONICO
Y
LA HIDROFOBICIDAD DE SUPERFICIE.
PAPEL EN LA BARRERA MUCOSA DEL COLON.
Tesis realizada por:
D. José Luis Sánchez García
para optar al grado de
Doctor en Medicina y Cirugía.
Dirección de la tesis:
Prof. Manuel Armengol Carrasco.
Prof. Francisco Guarner Aguilar.
3
D. Manuel Armengol Carrasco, Catedrático de Cirugía de la Universidad
Autónoma de Barcelona y Jefe de Servicio de Cirugía General del Hospital Vall
d’Hebron de Barcelona y D. Francisco Guarner Aguilar, Doctor en Medicina y
especialista en Aparato Digestivo del Hospital Vall D’Hebron de Barcelona
CERTIFICAN: Que el trabajo titulado “El surfactante colónico y la
hidrofobicidad de superficie. Papel en la barrera mucosa del colon” ha sido
realizado bajo su dirección por el licenciado en medicina y cirugía D. JOSE LUIS
SANCHEZ GARCIA para optar al grado de Doctor y reúne los requisitos para ser
presentado para su lectura y defensa ante el Tribunal correspondiente.
Y para que conste a los efectos oportunos, firman el presente certificado en
Barcelona, a veinticinco de Enero de dos mil dos.
Prof. Manuel Armengol Carrasco
Prof. Francisco Guarner Aguilar
4
A mis padres.
A Belén, mi hermana.
A Mari Angel.
5
AGRADECIMIENTOS
6
Al Profesor Manuel Armengol Carrasco, Catedrático de Cirugía de la
Universidad Autónoma de Barcelona y Jefe del Servicio de Cirugía General y del
Aparato Digestivo del Hospital Vall d’Hebron de Barcelona. Mi más profundo
agradecimiento por haberme permitido participar de sus cualidades científicas,
clínicas y humanas durante mi periodo de formación como residente y en la
actualidad como cirujano adjunto del servicio que él dirige. La orientación en la
elección del tema y la dirección e incansable colaboración durante la elaboración
del presente trabajo han sido indispensables para su realización.
Al Profesor Francisco Guarner Aguilar, Doctor en Medicina y Cirugía y
Médico Adjunto del Servicio de Aparato Digestivo del Hospital Vall d’Hebron de
Barcelona por haber aceptado codirigir el presente trabajo ofreciendo infinita
disponibilidad y paciencia en la misma.
Al Profesor Juan Ramón Malagelada Benaprés, Profesor Titular de Aparato
Digestivo de la Universidad Autónoma de Barcelona y Jefe del Servicio de
Aparato Digestivo del Hospital Vall d’Hebron por las facilidades ofrecidas y la
generosidad demostrada al permitir desarrollar la parte experimental del presente
trabajo en el ámbito del servicio que él dirige.
7
A la Doctora Aurelia Lugea, Doctora en Ciencias Biológicas y miembro de
la Unidad de Investigación del Servicio de Gastroenterología del Hospital Vall
d’Hebron de Barcelona por su entusiasmo incansable, paciencia y dedicación
dirigiendo la elaboración inicial del presente trabajo.
Al Doctor Felipe de Lara Eisman, Profesor Titular de Cirugía de la
Universidad Autónoma de Barcelona y Jefe Clínico del Servicio de Cirugía
General y del Aparato Digestivo del Hospital Vall d’Hebron de Barcelona por
haberme acogido bajo su tutela durante los primeros pasos en mi formación como
cirujano y permitir sentirme miembro de la escuela que en su amplia carrera como
cirujano ha creado.
Al Dr. José Masferrer Sala, Jefe Clínico del Servicio de Cirugía General y
del Aparato Digestivo del Hospital Vall d’Hebron de Barcelona pues aún siendo
nuestra relación profesional corta, gracias a la personalidad asequible de la que
hace gala, las enseñanzas que de él he recibido en este tiempo han sido intensas y
llenas de valor.
A los doctores Eloi Espín Basany, Manuel López Cano y Beatriz Sainz
Villacampa, Médicos Adjuntos del Servicio de Cirugía General y del Aparato
Digestivo del Hospital Vall d’Hebron de Barcelona que desde nuestro periodo de
formación han demostrado una sólida amistad que se ha traducido en
desinteresado aliento y ayuda a lo largo de todos estos años.
A los miembros del equipo médico y de enfermería de planta e
instrumentistas del Servicio de Cirugía General y del Aparato Digestivo del
Hospital Vall d’Hebron de Barcelona por las facilidades demostradas en la tarea de
recoger las muestras de tejido, base de la realización de la presente tesis.
8
A los miembros de la Unidad de Investigación del Servicio de
Gastroenterología del Hospital Vall d’Hebron de Barcelona por las facilidades
prestadas durante la realización de la fase experimental del presente trabajo.
A todos ellos mi más profundo agradecimiento.
9
INDICE
10
INTRODUCCION.
1
FUNDAMENTOS.
I. FENOMENOS DE SUPERFICIE.
4
1. Definiciones.
1.1. Tensión superficial.
5
1.2. Tensión interfacial.
6
1.3. Hidrofobicidad, hidrofilicidad y ángulo de contacto.
8
1.4. Relación entre estas propiedades.
10
2. Composición química de las superficies.
10
2.1. Lípidos
11
2.1.1. Lípidos no polares.
2.1.2. Lípidos polares.
2.2. Fosfolípidos
11
3. Métodos de medida.
12
II. APLICACIONES BIOLOGICAS DE LOS FENOMENOS
DE SUPERFICIE.
14
1. La piel.
14
2. Los alvéolos pulmonares.
15
III. HIDROFOBICIDAD DE SUPERFICIE A LO LARGO
DEL TRACTO DIGESTIVO.
1. Concepto de barrera mucosa gastrointestinal.
17
2. Estructura física de la barrera mucosa gastrointestinal.
18
2.1. Epitelio superficial.
19
2.2. Capa de moco.
21
2.2.1. Núcleo peptídico.
21
2.2.2. Oligosacáridos.
21
2.3. Surfactante gastrointestinal.
23
11
3. Regulación de la secreción del moco y
del surfactante gastrointestinal.
3.1. Factor de crecimiento epidérmico.
25
26
3.1.1. Variedades de EGF y péptidos relacionados
hallados en el tracto gastrointestinal.
26
3.1.2. Efectos sobre la fisiología gastrointestinal
del EGF y los péptidos relacionados.
27
3.1.2.1. Relacionados con la secreción ácida gástrica.
27
3.1.2.2. Relacionados con la secreción de bicarbonato.
28
3.1.2.3. Relacionados con el intercambio
de cloruro sódico y glucosa.
28
3.1.2.4. Relacionados con la secreción de cloruros.
28
3.1.2.5. Relacionados con la secreción de amilasa.
28
3.1.2.6. Relacionados con la producción de moco.
29
3.1.2.7. Control del flujo sanguíneo gastrointestinal.
29
3.1.2.8. Relacionados con la contracción del
músculo liso gastrointestinal.
29
3.1.2.9. Restitución epitelial mucosa.
29
3.1.3. Modelo integrado de las diferentes acciones que
sobre la fisiología del sistema gastrointestinal tienen
el EGF y los péptidos con él relacionados
30
3.1.3.1. Digestión, absorción y transporte de nutrientes.
30
3.1.3.2. Protección de la mucosa y su reparación
en caso de agresión.
3.2. Prostaglandinas.
31
32
3.2.1.Distribución y funciones de las prostaglandinas.34
3.2.1.1. Sistema nervioso.
35
3.2.1.2. Células sanguíneas y mastocitos.
35
3.2.1.3. Pared vascular.
35
3.2.1.4. Tejido pulmonar.
35
12
3.2.1.5. Riñón.
36
3.2.1.6. Sistema endocrino y reproductor.
36
3.2.2. Acciones de las prostaglandinas
en el tracto gastrointestinal.
36
3.2.2.1. Estómago y duodeno.
36
3.2.2.2. Intestino delgado y colon.
37
3.2.2.3. Músculo liso gastrointestinal.
37
3.2.2.4. Protección de la superficie mucosa luminal.
37
IV. HIDROFOBICIDAD EN LOS DISTINTOS TRAMOS
DEL TRACTO DIGESTIVO.
1. Esófago.
1.1. Histología.
1.1.1. Características microscópicas de la mucosa.
1.2. Propiedades de superficie en la mucosa esofágica.
38
38
39
2.Estómago.
2.1. Histología.
2.1.1. Estructura microscópica de la mucosa gástrica.
2.2. Propiedades de superficie de la mucosa gástrica.
40
41
42
2.2.1. La hidrofobicidad en la superficie mucosa gástrica. 43
2.2.2. Papel de los lípidos en la hidrofobicidad
del moco.
44
2.2.3. Efecto sobre la propiedad de la hidrofobicidad
de los distintos agentes ulcerogénicos.
44
2.2.4. Efecto sobre la hidrofobicidad de la superficie
mucosa y sobre el metabolismo lipídico de los
agentes gastroprotectores.
46
3.Intestino delgado: duodeno, yeyuno e íleon.
3.1. Histología.
3.1.1. Estructura microscópica de la mucosa entérica.
3.2. Propiedades de superficie de la mucosa intestinal.
47
48
50
13
V. PROPIEDADES DE SUPERFICIE A LO LARGO
DE LA MUCOSA DEL INTESTINO GRUESO.
1. Anatomía del colon y recto.
52
1.1. Ciego
53
1.2. Colon ascendente
53
1.3. Colon transverso proximal
54
1.4. Colon transverso distal
54
1.5. Colon descendente
54
1.6. Sigma
54
1.7. Recto
55
2. Fisiología del intestino grueso.
2.1. Motilidad.
55
56
2.1.1. Segmentación.
56
2.1.2. Peristaltismo masivo
56
2.1.3. Antiperistaltismo
56
2.2. Absorción.
57
3. Histología de la mucosa del colon y recto.
57
4. Propiedades de superficie en la mucosa colónica.
59
4.1. Adhesividad bacteriana.
61
4.2. Lubrificación de superficies.
62
4.3. Defensa ante la presencia de factores lesivos intraluminales. 63
4.4. Absorción de moléculas desde la luz.
OBJETIVOS.
64
65
MATERIAL Y METODO.
MATERIAL.
I. MUESTRAS DE COLON.
1.Criterios de inclusión.
67
67
14
2. Criterios de exclusión.
68
II. MATERIAL DE LABORATORIO.
1. Instrumental.
68
2. Reactivos.
69
3. Aparatos de lectura.
70
METODO.
71
I. TIEMPO PREOPERATORIO.
73
II. TIEMPO INTRAOPERATORIO.
74
III.TIEMPO DE LABORATORIO.
75
1. Preparación de la muestra.
75
2. Determinación de lípidos y fosfolípidos.
76
2.1. Extracción de lípidos.
77
2.2. Extracción de fosfolípidos.
77
2.3. Determinación de fosfolípidos.
78
3. Determinación de la hidrofobicidad.
79
3.1. Procesamiento de la muestra.
79
3.2. Diluciones.
80
3.3. Incubación de la muestra.
81
3.4. Medida de la hidrofobicidad.
83
IV. RECOGIDA DE DATOS.
84
V. ANALISIS ESTADISTICO DE LOS DATOS.
86
RESULTADOS.
I. CARACTERISTICAS EPIDEMIOLOGICAS DE LA POBLACION.
87
II. PROPIEDADES DE SUPERFICIE EN LA MUCOSA DEL COLON.
92
1.Validación del tiempo de isquemia y de la temperatura
de conservación de las muestras de mucosa colónica.
92
2. La hidrofobicidad en la superficie de la mucosa colónica.
94
15
3. Hidrofobicidad de la superficie mucosa del colon
como propiedad presente y modificable “ex vivo”.
95
4. Influencia de la patología asociada
en la hidrofobicidad de la mucosa del colon.
97
5. Hidrofobicidad de la superficie mucosa
del colon como propiedad modulable “ex vivo”.
101
5.1. Citoprotección.
101
5.2. Antiinflamatorios no esteroideos.
103
5.2.1. Dosis dependencia.
5.3. Citoprotectores vs. AINE.
106
109
6. Hidrofobicidad en la superficie endoluminal de la mucosa
del colon. Estudio topográfico.
111
6.1.División de la superficie colónica
en siete segmentos y cuatro sectores.
111
6.2.Comparación entre hidrofobicidades
en el colon dividido en siete segmentos.
115
6.3.Comparación entre hidrofobicidades
en el colon en los diferentes sectores.
115
6.3.1. Colon derecho
115
6.3.2. Colon transverso
116
6.3.3. Colon izquierdo
116
6.4. Comparación entre hidrofobicidades en el colon
dividido en cuatro sectores.
III. SURFACTANTE COLONICO.
117
118
1. Lípidos.
118
2. Fosfolípidos.
120
3. Relación entre lípidos y fosfolípidos.
121
4. Relación entre hidrofobicidad y surfactante.
122
16
DISCUSION.
124
I. CARACTERISTICAS DE LAS MUESTRAS.
126
II. CONSERVACION DE LA MUESTRA DE MUCOSA.
127
III. METODO DE MEDIDA DE LA HIDROFOBICIDAD.
127
IV. HIDROFOBICIDAD EN LA SUPERFICIE MUCOSA DEL COLON. 128
V. MODIFICACIONES EN LAS PROPIEDADES DE SUPERFICIE
DE LA MUCOSA DEL COLON TRAS SU INCUBACION
EN SOLUCION FISIOLOGICA.
129
VI. INFLUENCIA DE LA PATOLOGIA ASOCIADA
EN LAS PROPIEDADES DE SUPERFICIE.
130
VII. HIDROFOBICIDAD EN LA SUPERFICIE MUCOSA
DEL COLON COMO PROPIEDAD MODULABLE “EX VIVO”.
1. Citoprotectores.
131
2. Antiinflamatorios no esteroideos.
132
VIII. HIDROFOBICIDAD EN LA SUPERFICIE ENDOLUMINAL
DE LA MUCOSA DEL COLON HUMANO.
ESTUDIO TOPOGRAFICO.
IX. SURFACTANTE COLONICO.
X. APLICACIONES CLINICAS DE LA PROPIEDAD DE
133
134
LA HIDROFOBICIDAD EN LA SUPERFICIE MUCOSA
DEL COLON.
135
1. Neoplasia.
135
2. Enfermedad inflamatoria intestinal.
138
CONCLUSIONES.
142
BIBLIOGRAFIA.
145
17
INTRODUCCION
18
En su cara endoluminal, el tracto digestivo (esófago, estómago, duodeno,
intestino delgado, colon y recto) está tapizado a lo largo de toda su extensión por
mucosa. Dicha mucosa, aún siendo estructuralmente distinta en los diferentes
tramos, tiene una función común a lo largo de todo el tubo digestivo: actúa como
barrera para prevenir el paso de agentes lesivos y antígenos desde la luz de dicho
tracto al medio interno (sangre y linfa).
Esta barrera defensiva no solo está formada por el epitelio mucoso sino que
además existe una capa de moco que lo tapiza y que constituye el primer
componente de la denominada “barrera mucosa gastrointestinal”.
La función como barrera protectora del moco gastrointestinal depende de
su composición y estructura siendo ésta, la de una capa viscoelástica con
propiedades de gel, formada principalmente por agua y electrolitos, glicoproteinas
(mucinas) y fosfolípidos.
Los fosfolípidos, estrato más superficial de la barrera, forman complejos
con regiones no glicosiladas de las mucinas, estabilizando su estructura y
protegiéndolas de la degradación por enzimas proteolíticas. Además, dichos
fosfolípidos se disponen formando una monocapa hidrófoba sobre la mucosa, con
19
las cabezas polares unidas a cargas negativas de la capa de moco y las colas
hidrófobas hacia la luz. Este estrato es el denominado surfactante gastrointestinal.
Un gran número de estudios, sobretodo en tramos altos de la mucosa
digestiva, la mucosa gastroduodenal, han demostrado que esta monocapa impide la
difusión de iones hidrógeno desde la luz, aumentando así la resistencia de la
mucosa al ácido. Así mismo se ha constatado que distintos agentes lesivos como el
ácido, etanol, sales biliares, antiinflamatorios y la bacteria Helicobacter pylori
reducen la hidrofobicidad de la mucosa haciéndola más susceptible al daño.
Pacientes con gastritis crónica, úlcera péptica o reflujo gastroesófagico presentan
valores de hidrofobicidad de la mucosa menores que los voluntarios sanos. Así
mismo, agentes citoprotectores, como las prostaglandinas, el factor de crecimiento
epidérmico (EGF) y los fosfolípidos exógenos, elevan el nivel de fosfolípidos en la
capa de moco y aumentan la hidrofobicidad de la mucosa.
En la mucosa colónica, la capa de moco forma un gel semipermeable que
atrapa bacterias y previene la entrada de antígenos al medio interno. Existen
estudios a cerca de las mucinas y su alteración en estados patológicos sugiriéndose
que alteraciones en la composición del moco o en su función desempeñan un papel
importante en el desarrollo de la enfermedad inflamatoria intestinal (1)
Sin embargo, apenas se conoce el contenido en fosfolípidos de esta capa de
moco ni las propiedades de hidrofobicidad de la mucosa colónica.
Estudios realizados en ratas en nuestro laboratorio mostraron que la
hidrofobicidad de la mucosa variaba a lo largo del trayecto colónico, siendo más
alta en los tramos del colon distal (2). Estas diferencias podrían estar relacionadas
con distintas funciones de permeabilidad de la mucosa a lo largo del colon, así
como con la presencia de distintas especies bacterianas.
20
En humanos no se han realizado tan apenas estudios sobre la
hidrofobicidad colónica, si bien es conocido el papel que desempeña la capa de
moco sobre la permeabilidad y el desarrollo de estados patológicos.
El presente trabajo tiene por objeto caracterizar la estructura de la barrera
mucosa a nivel del colon y recto en humanos, haciendo hincapié en el surfactante,
así como describir algunas de sus propiedades fisicoquímicas y biológicas con el
fin de correlacionarlas con los fenómenos clínicos.
21
FUNDAMENTOS
22
I. FENOMENOS DE SUPERFICIE.
La materia se puede manifestar en uno de estos tres estados: sólido, líquido
o gaseoso. Cada uno de estos tres estados exhibe un conjunto de propiedades que
los caracterizan y por tanto diferencian de los otros dos.
Estos tres estados, a su vez, pueden relacionarse entre sí apareciendo
entonces una serie de propiedades nuevas y distintas que definen esta interrelación.
El sustrato físico en el cual se desarrollan estas interrelaciones y que a su
vez separa cada uno de los estados fundamentales de la materia se denomina
interfase.
Esta interfase viene definida por dos o tres fases (sólido, líquido o gas) con
sus correspondientes superficies que realmente es donde se describen una serie de
propiedades nuevas.
Dichas propiedades se manifiestan en forma de lo que conocemos como
fenómenos de superficie (3).
23
1. DEFINICIONES.
1.1. TENSION SUPERFICIAL.
En una masa líquida, las fuerzas que experimentan las moléculas que
forman parte de la superficie son diferentes de las del resto de la masa.
Una molécula cualquiera del interior del líquido, la cual se encuentra
rodeada por todas partes de moléculas idénticas que ejercen fuerzas sobre ella, está
sometida a una fuerza resultante distinta de la que corresponde a una molécula de
la superficie, la cual por una parte está próxima a moléculas del líquido idénticas a
ella, pero por otra está próxima a las moléculas de otro medio con propiedades
diferentes. (Figura 1)
Figura 1: Las fuerzas a las
que está sometida una
molécula de la superficie de
un
líquido
como
consecuencia de la acción de
las restantes son distintas a
las que operan sobre una
molécula del interior de la
masa líquida.
Supongamos que este otro medio no existe y que al otro lado de la
superficie libre se encuentra el vacío. Entonces una molécula de líquido, colocada
en la superficie, será atraída hacia el interior por el resto de las moléculas, y si no
se hunde en el seno de la masa líquida es porque materialmente se lo impiden las
demás.
Para aumentar la superficie de este líquido se deberían llevar más
moléculas al exterior, y para ello se tendría que utilizar una fuerza por molécula
por lo menos igual a la que tiende a llevarlas al interior.
24
La fuerza por unidad de longitud que es necesaria realizar es lo
denominado como tensión superficial (4).
La tensión superficial es una característica del líquido que no se altera
aunque la superficie crezca o disminuya.
Cuando la superficie tiende a cero como la tensión superficial del líquido se
mantiene constante este líquido tiende a adoptar formas que “adapten” su volumen
a esta mínima superficie. Esta es la razón por la que las pequeñas gotas de agua en
el aire tienen forma esférica: ocupan, para el volumen que poseen, la estructura
que presenta menos superficie.
La tensión superficial da lugar a fuerzas que operan paralelas a la
superficie.
Si esta superficie es curvada, dichas fuerzas paralelas a la superficie dan
lugar a una presión hacia el interior de la curvatura cuya magnitud viene dada por
la ley de Laplace:
P=T(1/R1+1/R2)
Cuando se trata de una superficie esférica en la cual los dos radios de
curvatura son iguales:
P=T2/R
1.2. TENSION INTERFACIAL.
La tensión superficial de un líquido no solamente depende de éste, sino
también del medio con el que se encuentra en contacto que habitualmente es un
sólido.
La superficie de contacto líquido-sólido tiene una tensión superficial que
normalmente es distinta de la que corresponde a la superficie líquido-aire.
Además, como las moléculas gaseosas ejercen una atracción muy pequeña sobre
las líquidas, la tensión superficial líquido-gas es siempre positiva. En cambio, la
25
tensión líquido-sólido, que se ha denominado tensión interfacial, puede ser
positiva (el líquido no moja el sólido) o negativa (sí lo moja).
El hecho de que sea negativa, por ejemplo, significa que las moléculas del
sólido atraen a las del líquido más que las del líquido entre sí, y por ello el líquido
tiende a tener en contacto con el sólido la máxima superficie posible.
Al poner una pequeña porción de líquido sobre una plancha de un sólido
determinado suele adquirir forma de gota. La superficie del líquido forma, en el
contacto con el sólido, un ángulo de conjunción θ , que puede ser menor de 90º (si
el líquido no moja al sólido) o mayor de 90º (si el líquido moja al sólido). (Figura 2)
θ
θ<90º
θ
θ>90º
Figura 2 : Forma de la gota.
Considerando que el perímetro de la superficie de contacto, en cualquiera
de los casos, es una circunferencia por cada punto de esta circunferencia actúan
dos fuerzas:
-F1: tensión superficial, tangente a la superficie líquido-aire (TGL)
-F2: tensión interfacial, tangente a la superficie líquido-sólido (TSL)
El sistema estará en equilibrio cuando la proyección de la tensión
superficial, F1’, y la tensión interfacial sean iguales.
Es fácil comprobar que esto se verificará cuando:
26
cos θ = TSL/TGL
y que de esta manera quedará definida la forma de gota.
Como la tensión superficial entre el líquido y el aire (TGL) es siempre
positiva, es decir, la atracción entre las moléculas líquido-líquido es más intensa
que entre las líquido-sólido, cos θ será positivo, y θ menor que 90º. En cambio, si
la tensión interfacial es negativa, es decir, las moléculas del sólido atraen a las del
líquido más que las del líquido entre sí, o dicho de otra manera el líquido moja al
sólido, cos θ es negativo, y θ mayor de 90º.
1.3. HIDROFILICIDAD, HIDROFOBICIDAD Y ANGULO DE
CONTACTO.
La hidrofilicidad de una superficie es el término con el que se conoce a la
propiedad que caracteriza la afinidad de dicha superficie por el agua.
Por el contrario, la hidrofobicidad de una superficie viene definida por la
tendencia que tiene un volumen de agua depositado sobre ella a adquirir “forma de
gota” más que a extenderse sobre dicha superficie (5).
Cuando un pequeño volumen de líquido es depositado sobre una superficie
sólida, este adquiere forma de gota.
Esta forma, que se identifica como el ángulo de contacto, es la resultante
del equilibrio entre las fuerzas de superficie que se dan en el triple punto de la
interfase aire-líquido-sólido.
Dicho ángulo de contacto tiene una relación inversa con la energía libre de
la superficie del sólido.
Cuando un mismo líquido (suero salino) es utilizado sobre distintas
superficies sólidas con distintas energías de superficie, el ángulo de contacto
aumenta si la energía de la superficie del sólido disminuye.
27
Del mismo modo cuando un líquido con menor tensión superficial que el
suero salino (glicerol) es depositado sobre la misma superficie sólida, el ángulo de
contacto es más cerrado. ( Figura 3) (6)
L
SL
S
Figura 3: Vectores
El balance de las fuerzas de superficie localizadas en la triple fase viene
definida por la ecuación de Young (7):
γS = γSL + γL cos θ
dónde:
γS: energía libre de la superficie sólida.
γSL: energía en la interfase sólido-líquido.
γL: tensión superficial del líquido.
θ: ángulo de contacto entre el líquido y la superficie sólida.
28
1.4. RELACIONES ENTRE ESTAS PROPIEDADES.
Cuando una superficie tiene un alto grado de hidrofobicidad los valores del
ángulo de contacto serán elevados, pero en cambio serán bajos los valores de
tensión superficial que exhiba esta misma superficie.
En caso de superficies hidrofílicas sus valores de tensión superficial son
altos pero el ángulo de contacto como medida de esta propiedad tenderá a 0º como
valor extremo (8).
2. COMPOSICION QUIMICA DE LAS SUPERFICIES.
El conjunto de propiedades físicas englobadas como fenómenos de
superficie tienen su base en la composición química de dichas superficies.
Cuando nos referimos a las interfases del tipo sólido-líquido y tomando
como referencia al agua como la parte líquida de dicha interfase las moléculas que
forman parte de la superficie sólida se podrían dividir en dos grandes grupos según
su afinidad por el agua (9):
- Aquellas que tienen una afinidad grande por el agua,
denominadas
hidrófilas y que se caracterizan por poseer estructura química con grupos
polares siendo estos fundamentalmente: -CO2H, -CH2OH, -NH2.
- Aquellos que carecen de dicha afinidad, siendo denominados como
hidrófobos, con estructura química no polar y siendo fundamentalmente los
grupos: -CH3, -NH3.
En las superficies biológicas, aún sabiendo que no es exclusivo de ellas, las
moléculas que cumplen estas características y por tanto realizan esta función son
los lípidos.
29
2.1. LIPIDOS.
Siguiendo lo propuesto por Christie en 1987, se define como lípidos a los
ácidos grasos y sus derivados así como a toda sustancia relacionada
biosintéticamente o funcionalmente con estos.
Desde un punto de vista físico los lípidos los podemos dividir en dos
grandes grupos. (10)
2.1.1. Lípidos no polares.
En este grupo se encontrarían los ácidos grasos esterificados con glicerol
que serían los diglicéridos y sobretodo los triglicéridos, con función esencialmente
energética y los esteroles y sus esteres cuyo ejemplo fundamental es el colesterol
cuya función primordial es estructural como parte imprescindible de las
membranas celulares.
2.1.2. Lípidos polares.
Dentro de este apartado se englobarían los monogliceridos, los fosfolípidos
(fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilinositol) de vital importancia en
la
composición
y
funcionalidad
de
las
membranas
celulares,
los
galactosilglicerolípidos de los vegetales y los esfingolípidos relacionados con la
piel (cerámidas) o con el sistema nervioso (esfingomielina).
2.2. FOSFOLIPIDOS.
Los fosfolípidos son los lípidos más polares.
Su estructura química (3) está formada sobre la base de una molécula de un
polialcohol, principalmente el glicerol (CH2OH-CHOH-CH2OH), que se
esterifica en un extremo por ácidos grasos y por el otro extremo por una molécula
de ácido fosfórico la cual a su vez está esterificada por otra molécula de alcohol.
(Figura 4)
30
El extremo fosforilado está cargado siendo fuertemente polar e hidrófilo; a
su vez el otro terminal, los ácidos grasos, contrariamente es apolar y por ende
hidrófobo.
En una interfase con el agua, estos fosfolípidos forman una película a modo
de monocapa con las cabezas hidrófilas sobre esta y las colas hidrófobas en
situación opuesta.
Figura 4: Fosfolípido.
3. METODOS DE MEDIDA.
Durante el último siglo han sido descritas numerosas técnicas con el fin de
medir la tensión interfacial y la tensión superficial (11).
Todos estos métodos se basan en la utilización de principios
termodinámicos y las diferencias entre unos y otros son de pequeños detalles en el
planteamiento de la técnica de medida propiamente dicha.
31
El conjunto de técnicas se ha propuesto agrupar de la siguiente manera:
1.- Procedimientos relacionados con la medida de fuerzas:
1.1.- Método del aro. (Ringmethod)
1.2.- Método de la lámina. (Platemethod)
1.3.- Método del lazo. (Loopmethod)
2.- Procedimientos relacionados con medidas de presión:
2.1.- Tubos capilares.
2.2.- Máxima presión en burbujas de gas.
3.- Procedimientos geométricos:
3.1.- Método de la gota suspendida. (Pending drop method)
3.2.- Método de la gota sésil. (Sesil drop method)
3.3.- Método del volumen de la gota.
3.4.- Método de la rotación de la gota. (Spinning-drop
method)
3.5.- Medida del ángulo de contacto.
4.- Procedimientos dinámicos de medida:
4.1.- Método de las ondas de superficie.
4.2.- Método de la oscilación del “jet” de líquido.
De todos estos métodos los más utilizados en la actualidad son los basados
en medidas de fuerza sobretodo el método de la lámina y el del aro así como el de
rotación de la gota junto al de la medida del ángulo de contacto.
32
II. APLICACIONES BIOLOGICAS DE LOS
FENOMENOS DE SUPERFICIE.
La presencia de lípidos con propiedades que conllevan el desarrollo de
fenómenos de superficie está presente en diferentes partes del organismo humano.
Las más representativas serían:
-
La superficie cutánea.
-
Los alvéolos pulmonares.
-
La superficie mucosa endoluminal del tracto digestivo.
A continuación haremos una breve reseña a cerca de las dos primeras,
dejando para capítulos posteriores la exposición exhaustiva de las características
tensoactivas de la mucosa del tubo digestivo ya que esto es el fin del presente
trabajo.
1. LA PIEL.
La epidermis, capa más superficial de la piel está recubierta en toda su
extensión y en su parte más superficial por una superficie lipídica.
Esta lamina superficial tiene dos orígenes: uno en los lípidos originados de
la destrucción celular, sobretodo a expensas de las membranas celulares, en el
33
continuo ciclo celular en el proceso de renovación de la piel y otro en una
sustancia secretada por las glándulas sebáceas, localizadas en la dermis, que se
denomina sebo.
El sebo es un aceite de características hidrófobas y que está constituido por
varios tipos de lípidos: un 59% de triglicéridos (que es el componente principal),
un 28% de esteres tipo cera y un 13% de escualeno.
La elevada proporción de trigliceridos en la composición del sebo hace que
este adquiera propiedades que le confieren una marcada tendencia a extenderse por
superficies de características hidrofílicas como lo es la cutánea.
Por todo esto la piel exhibe una serie de características que a continuación
enumeramos:
-Barrera defensiva frente a la penetración de sustancias químicas.
-Control en la evaporación del agua a través de la superficie cutánea.
-Mecanismo de defensa ante microorganismos presentes en la superficie
cutánea como flora de la misma o bien los patógenos potenciales.
2. LOS ALVEOLOS PULMONARES.
El funcionamiento pulmonar en lo que se refiere al intercambio gaseoso
entre la sangre y el aire está sustentado en la superficie de los aproximadamente
300 millones de alvéolos.
Esta superficie de extensión considerable (entre 80 y 100 m2 en el varón
adulto) permite la difusión rápida de los gases así como el equilibrio de las
presiones parciales a ambos lados de la pared alveolar.
Los alvéolos pulmonares tienen un diámetro entre 50 y 100 micras. Están
formados por una sola capa de células epiteliales. Estas células no están en
contacto directo con el aire alveolar sino que están separadas por una delgadísima
capa acelular de un espesor aproximado de una micra que se denomina hipofase.
Esta enorme superficie alveolar conlleva varias consecuencias:
34
-Las superficies extensas implican una elevada energía de superficie. Esto
implica que la tendencia natural del pulmón sería a retraerse y colapsarse.
-Los alvéolos tienen diferentes tamaños con lo que se deduce por la ley de
Laplace que la presión que reina en los de menor diámetro es superior a la que
existe en los de diámetro mayor. La tendencia sería a compensar este gradiente de
presión distendiéndose los de mayor tamaño e expensas de los menores
provocando el vaciado de estos últimos en los mayores.
-Estos valores elevados de tensión superficial producirían la trasudación de
líquido desde la sangre hacia el interior de los alvéolos (12).
En 1957 Cléments a partir del estudio de extractos pulmonares pudo de
mostrar que el pulmón exhibe unas propiedades de superficie caracterizadas por
una tensoactividad realmente elevada de tal manera que la tensión superficial en el
alvéolo pulmonar cae a 0 dina/cm-1 cuando el pulmón se colapsa y asciende hasta
50 dina/cm-1 en la reexpansión pulmonar siendo las curvas de presióndescompresión totalmente independientes.
Investigaciones posteriores pusieron de manifiesto que estas propiedades
tensoactivas en la superficie alveolar pulmonar son debidas básicamente a una
delgadísima capa de fosfolípidos, especialmente la dipalmitoilfosfatidilcolina
(lecitina), que tapiza uniformemente la interfase aire-hipofase y que se denominó
como surfactante pulmonar.
Este surfactante esta sintetizado por los neumocitos tipo II presentes en los
alvéolos pulmonares y en su composición química entran a formar también parte
de él un grupo de apoproteinas y el ion calcio cuyas funciones están relacionadas
con la más rápida distribución del fosfolípido por la superficie alveolar con el fin
de optimizar sus propiedades (13).
35
III. HIDROFOBICIDAD DE SUPERFICIE A LO
LARGO DEL TRACTO DIGESTIVO.
1.
CONCEPTO
DE
BARRERA
MUCOSA
GASTROINTESTINAL.
La barrera mucosa gastrointestinal es una estructura compleja en sus
características fisicoquímicas que separa el medio interno de la luz del tubo
digestivo (14).
El concepto de barrera mucosa fue introducido por Davenport en los años
sesenta, y se aplicó originalmente a la mucosa gástrica por su capacidad de repeler
y resistir la acidez del medio intraluminal en el estómago (15). Hoy en día, dicho
termino se aplica a toda la superficie del tubo digestivo.
La luz gastrointestinal presenta condiciones fisicoquímicas y biológicas
idóneas para la digestión de los alimentos y para el control y desarrollo de los
microorganismos que constituyen el ecosistema de la flora intestinal, pero muchas
de esas condiciones (pH ácido, enzimas proteolíticos, sales biliares, ambiente
anaerobio, productos bacterianos, etc.) resultan altamente tóxicas para las células
del huésped porque se apartan de las constantes requeridas en el medio interno. Es
36
por tanto necesaria la presencia de una estructura de separación entre el medio
interno y la luz gastrointestinal, que resulte parcialmente impermeable con lo que
permita mantener condiciones fisicoquímicas y biológicas distintas en cada medio,
pero que a su vez constituya una interfase apta para el intercambio controlado.
2. ESTRUCTURA FISICA DE LA BARRERA MUCOSA
GASTROINTESTINAL.
Físicamente, la barrera mucosa gastrointestinal incluye el epitelio
superficial, la capa de moco y el surfactante gastrointestinal. (Figura 5)
Figura 5: Barrera mucosa gastrointestinal. Esquema.
Dicha capa de moco está constituida por un gel formado por la interacción
de mucinas y péptidos “trefoil” (péptidos de estructura trifoliada o en trébol) con
un espesor variable de hasta 200 µm. Una monocapa constituida por fosfolípidos
con propiedades anfóteras denominada surfactante gastrointestinal es la que cubre
la superficie de la capa de moco.
En términos generales, la barrera mucosa no es obstáculo para el
intercambio de productos liposolubles, mientras que resulta prácticamente
infranqueable para la inmensa mayoría de las sustancias hidrosolubles, a no ser
37
que por su particular interés para el organismo su transporte través de la mucosa se
produzca mediante mecanismos activos específicos.
Las propiedades dinámicas de la barrera mucosa dependen también del
flujo sanguíneo de la mucosa que suministra oxígeno y nutrientes para mantener la
vitalidad y las secreciones de las células mucosas, y facilita el aclaramiento de los
elementos tóxicos que logran franquear la barrera.
2.1 EPITELIO SUPERFICIAL.
El epitelio superficial está formado por células cilíndricas simples de
aspecto columnar. Intercaladas entre ellas encontramos las células caliciformes
(goblet cells) que proceden del cuello de las glándulas gástricas o del fondo de las
criptas del intestino.
Durante un periodo de 3 a 5 días dichas células caliciformes ascienden
desde su origen hasta la superficie epitelial. A lo largo de este periodo la célula
cambia de forma, reduciendo su volumen y elongándose, así como secretando
gránulos de mucina que almacena en vacuolas (16).
La proporción de goblet cells en el tracto gastrointestinal se hace mayor
conforme nos acercamos a tramos más distales del mismo siendo de un 10% en el
duodeno hasta de un 24% de las células epiteliales en el sigma (17).
Las células caliciformes (goblet cells), que encontramos en el epitelio de
muchas mucosas, son el único ejemplo de glándula exocrina unicelular (esto
quiere decir que la glándula está formada por una única célula secretora) presente
en los mamíferos.
Dichas células secretan mucina que es una glucoproteina. Con la
incorporación del agua la mucina se transforma en moco. En una célula
caliciforme llena de producto de secreción, la zona apical está distendida por las
gotas acumuladas de mucinógeno (el precursor de la mucina), mientras que el
núcleo se encuentra en la zona más estrecha y basal de la célula que es fuertemente
38
basófila. La zona apical, ensanchada del citoplasma se denomina teca y la forma
de la célula recuerda a un cáliz.
Al microscopio electrónico se observan las gotas de mucinógeno rodeadas
por membranas. La síntesis de la parte proteica del mucinógeno se produce en los
ribosomas del retículo endoplasmico rugoso (RER), mientras que la glicosilación
de este núcleo peptídico se realiza en el complejo de Golgi. (Figura 6)
Figura 6: Célula caliciforme.
Una vez sintetizada completamente la molécula de mucina esta se
almacena en forma de gránulos, donde las mucinas están concentradas, rodeados
de una membrana y formando vacuolas.
La liberación del producto de secreción se realiza por secreción merocrina,
esto es vaciando
su contenido a la superficie del epitelio mucoso, y es
relativamente constante durante toda la vida de la célula, es decir,
aproximadamente 3 días en el caso de las células de la mucosa intestinal. Las
células caliciformes cumplen entonces solo un ciclo secretor largo (18).
39
2.2. CAPA DE MOCO.
El moco es secretado por las células caliciformes. Sus propiedades
viscoelásticas y lubrificantes se deben a su estructura de gel, que resulta de la
interacción de mucinas y péptidos “trefoil”.
Las mucinas son un grupo muy heterogéneo de glucoproteinas constituidas
por un núcleo peptídico y múltiples cadenas de oligosacáridos.
2.2.1. NUCLEO PEPTIDICO.
La estructura de las mucinas intestinales, así como de las ubicadas en otras
zonas del organismo, está formada por un núcleo peptídico (entre 1500 y 4500
aminoácidos) del cual surgen cientos de ramas con estructura de oligosacáridos;
estos últimos son moléculas de gran heterogeneidad estructural y comprenden
entre el 50% y el 80% del peso seco de la molécula de mucina.
La estructura del núcleo peptídico se divide en dos regiones claramente
diferenciadas (19):
-una mayor, dominante, densamente glicosilada, resistente a las proteasas y
rica en los aminoácidos serina, treonina y prolina.
-un fragmento menor, pobremente glicosilado o sin glicosilar, sensible a las
proteasas y rica en el aminoácido cisteina.
2.2.2. OLIGOSACARIDOS.
Excepto en sus extremos N- y C- el núcleo polipeptídico de la mucina está
completamente recubierto de cadenas de oligosacáridos las cuales se unen a este
con un patrón repetitivo en zonas con serina o treonina.
Estas cadenas varían en longitud desde uno a 20 azúcares, aunque en las
mucinas del colon la mayor parte de los oligosacáridos tienen de uno a 12 azúcares
(20).
40
Además de la N-acetil galactosamina que une las cadenas del péptido, otros
azúcares encontrados son la fucosa, N-acetilglucosamina, galactosa y ácido siálico.
Los péptidos “trefoil” han sido descritos en años recientes (21). (Figura 7)
Figura 7: Péptido trefoil.
Se trata de una familia de péptidos caracterizada por la presencia de una
secuencia de 38 ó 39 aminoácidos que adquiere una configuración espacial en
forma de trébol por medio de tres puentes laterales tipo disulfuro entre 6 residuos
de cisteína integrados en la secuencia. El módulo en forma de trebol, también
denominado módulo P, parece que determina la resistencia de estos péptidos frente
a la digestión por proteasas, que son muy abundantes en la luz gastrointestinal, y
facilita su permanencia en la barrera mucosa.
En el ser humano en el tracto digestivo superior se producen el péptido pS2
y el spasmolytic polypeptide (SP), mientras que el intestinal trefoil factor (ITF) es
producto de las células caliciformes del intestino delgado y grueso.
El significado funcional de los distintos péptidos trefoil es prácticamente
superponible, puesto que todos ellos contribuyen a la configuración del gel
41
mucoso en conjunción con las mucinas y ejercen un efecto barrera que protege las
células epiteliales de las condiciones adversas del medio (22).
Los péptidos trefoil son productos tan abundantes como las mucinas en la
superficie del tracto gastrointestinal.
La capa de moco contribuye con su grosor a crear una franja de separación
en la interfase entre el epitelio, que precisa de un ambiente pericelular en
condiciones próximas a las del medio interno, y la luz del tubo digestivo.
El efecto protector de la capa de moco se debe en parte a la distancia física
que se interpone entre el epitelio y el medio intraluminal; así, el grosor del moco
retarda la difusión de iones desde la luz a la superficie epitelial (23).
Algunos autores (24) sugieren que el papel del moco no es tan trascendente
para la prevención de agresiones desde la luz como para la reparación de lesiones
agudas en la superficie del epitelio. Debajo de la capa de moco se puede crear y
mantener un microclima favorable para el desarrollo de procesos de restitución
celular, que requieren condiciones adecuadas de pH, osmolaridad, etc.
2.3. SURFACTANTE GASTROINTESTINAL.
El
surfactante
gastrointestinal
es
una
monocapa
constituida
fundamentalmente por fosfolípidos con propiedades anfóteras, que cubre la
superficie de la capa de moco (25).
Esta monocapa tiene características tensoactivas por la cohesión lateral de
sus elementos, que determina su disposición espacial en monoplano y su extensión
por la superficie del moco estableciendo la interfase moco-luz gastrointestinal (26).
El surfactante expresa hacia la luz gastrointestinal su cara hidrófoba y
constituye, por tanto, una superficie que repele iones, enzimas, toxinas
hidrosolubles y rechaza la retrodifusión de hidrogeniones hacia el epitelio.
(Figura 8)
42
H+
H+
+
+
+
+
+
+
Superficie
hidrofóbica
Superficie
hidrofílica
Figura 8: Surfactante gastrointestinal.
El componente principal del surfactante lo constituyen las fosfatidilcolinas,
siendo la dipalmitoilfosfatidilcolina la más abundante. No hay grandes diferencias
en su composición entre el surfactante gástrico y el intestinal, y ambos son
similares al surfactante pulmonar (27).
Se sabe que las prostaglandinas inducen la secreción de fosfolípidos por las
células mucosas del epitelio superficial del tracto digestivo. El material surfactante
se almacena en organelas celulares especificas y se segrega mediante un
mecanismo prostaglandín-dependiente (28).
Varios estudios experimentales señalan que el fenómeno de citoprotección
está mediado y depende en gran parte de la secreción de fosfolípidos tensoactivos,
ya que al aumentar la densidad del surfactante se incrementan considerablemente
la impermeabilidad de la barrera y la resistencia de la mucosa (29).
43
3. REGULACION DE LA SECRECION DEL MOCO Y DEL
SURFACTANTE GASTROINTESTINAL.
Un gran número de sustancias con naturaleza química diversa y agrupadas
bajo el término general de secretagogos, son capaces de estimular la secreción de
las mucinas y de los fosfolípidos desde las vacuolas dónde están almacenadas
intracelularmente hacia la superficie luminal del tracto digestivo.
Dicho proceso es relativamente complejo y requiere de dos pasos
intermedios desde la llegada de la molécula estimulante de la secreción:
-
Un receptor específico de cada secretagogo ubicado habitualmente en
la membrana celular.
-
Un mediador, común para diferentes estímulos, intracelular.
Las principales sustancias que actúan como secretagogos en la producción
de mucina y fosfolípidos en el tracto digestivo se exponen a continuación. (Tabla 1)
Tabla 1: Secretagogos en la producción de mucina y fosfolípidos.
Neurotransmisores Hormonas
Derivados
del Miscelánea
(30)
gastrointestinales
•Acetilcolina
•Sustancia P
•Neurotensina
•Péptido
•Neuromedina N
intestinal (VIP)
E1, E2, F2β
epidérmico (EGF)
•Secretina
•Prostaciclina
•Toxina colérica
ácido araquidónico
•Interleuquina 1
vasoactivo •Prostaglandinas
•ATP
•Factor de crecimiento
Tres son los mediadores intracelulares que conducen el estímulo producido
por las sustancias antes descritas hasta la secreción de los distintos componentes
de la película lipídica que tapiza la superficie luminal del tracto gastrointestinal: el
44
calcio iónico, el AMP cíclico (a través de la proteinquinasa A) y la proteinquinasa
C.
3.1. FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDERMICO (EGF).
En 1962 Cohen y Levi-Montalcini aislan por primera vez de las glándulas
salivares submaxilares del ratón un polipéptido de 6 kD que induce la prematura
erupción de los dientes y apertura de los párpados (31).
Dicho péptido fue denominado como factor de crecimiento epidérmico
(EGF) atribuyéndosele la propiedad de producir el crecimiento y la proliferación
de numerosos tipos celulares (32).
En el tracto gastrointestinal, donde el ciclo celular epitelial es entre 2 y 4
días en los mamíferos, el EGF se ha visto que juega un papel definitivo en la
función de proliferación celular (33).
Pero no solo el EGF y los péptidos EGF-like desarrollan un papel
fundamental en la proliferación y reparación tisular del tracto digestivo; también
presentan propiedades que los convierten en mediadores en la protección de la
mucosa y su adaptación a las agresiones (34).
3.1.1.
VARIEDADES
RELACIONADOS
DE
EGF
HALLADOS
Y
PÉPTIDOS
EN
TRACTO
GASTROINTESTINAL.
Tres son los péptidos relacionados con el EGF que se han aislado en el
tracto gastrointestinal: TGF-α (transforming growth factor α), la amfiregulina y la
betacelulina. Todos estos péptidos tienen en común una secuencia química básica,
las propiedades biológicas y su afinidad por el receptor de EGF (erbB1) (35).
Lo que realmente diferencia uno de otro es su distribución a lo largo del
tracto digestivo siendo los más comúnmente hallados el EGF y el TGF-α.
45
Así, el EGF se encuentra abundantemente en la saliva, el duodeno
(secreción procedente de las glándulas de Brunner (36)) y de la secreción
pancreática. También se han aislado de la mucosa gástrica, el epitelio vellositario
yeyunal, las células epiteliales del colon y de las células de las criptas del intestino
delgado fetal (37).
A diferencia del EGF, el TGF-α no se encuentra en las secreciones
digestivas. La mucosa gastrointestinal es el lugar donde se detecta habiéndose
descrito en la gástrica, intestinal, páncreas exocrino y colon.
Por último los otros dos péptidos EGF-like menos comunes, la
amfiregulina y la betacelulina se han aislado del colon y páncreas el primero y del
hígado, intestino delgado y páncreas el segundo.
3.1.2.
EFECTOS
GASTROINTESTINAL
SOBRE
DEL
EGF
LA
Y
FISIOLOGÍA
LOS
PÉPTIDOS
RELACIONADOS.
3.1.2.1. Relacionados con la secreción ácida gástrica.
Tanto en estudios in vitro como in vivo se ha demostrado una acción
directa del EGF sobre las células parietales gástricas humanas y de animales de
experimentación. Dicha acción se manifiesta en el sentido de producir una
reducción de la secreción gástrica ácida basal así como de la secreción ácida
estimulada (38).
El mecanismo por el cual se produce esta acción no está completamente
definido y parece ser que realmente su acción la desarrolla en distintos puntos y en
el ámbito de los mediadores intracelulares (c-AMP, calcio iónico, proteinquinasa
C).
46
3.1.2.2. Relacionados con la secreción de bicarbonato.
Esta regulación se desarrolla en el sentido de un estímulo a la secreción por
parte de las glándulas duodenales de bicarbonato. Dicha acción parece estar
mediada por el efecto que el EGF tiene sobre la síntesis de la prostaglandina E2
(39).
3.1.2.3. Relacionados con el intercambio de cloruro sódico y
glucosa.
Varios estudios han puesto de manifiesto el efecto que produce el EGF a
nivel del intestino delgado (yeyuno e íleon) en el sentido de incrementar la
absorción de agua, cloruro sódico y glucosa a lo largo de su borde en cepillo. Esta
propiedad vendría mediada por la activación de la enzima fosfatidilinositol 3kinasa en el borde basolateral del enterocito (40).
3.1.2.4. Relacionados con la secreción de cloro.
El efecto que sobre las células del epitelio mucoso colónico produce el
EGF pasa por el de inhibir la secreción de cloro hacia la luz. Este efecto está
mediado por la activación de la fosfatidilinositol 3-kinasa y la consiguiente
producción de fosfolípidos (41).
3.1.2.5. Relacionados con la secreción de amilasa.
Además del efecto sobre el transporte de diferentes iones y moléculas a
través del epitelio gastrointestinal, se ha visto que el EGF tiene influencia sobre el
acino pancreático en su secreción exocrina.
Mediado por el cAMP, el EGF no solo incrementa la secreción basal de
amilasa sino que también potencia la respuesta del acino al estímulo de la
colecistoquinina en dicha secreción (42).
47
3.1.2.6. Relacionados con la producción de moco.
Mediante una acción directa sobre las células caliciformes, el EGF induce
la síntesis y secreción de mucina. Este estímulo parece que no es directo; así en la
mucosa gástrica se ha visto que está mediado por las prostaglandinas y en la del
intestino delgado lo es por el sistema colinérgico (43).
3.1.2.7. Control del flujo sanguíneo gastrointestinal.
Estudios en perros han demostrado que la administración endovenosa del
EGF provoca un rápido incremento en el flujo sanguíneo portal y de la arteria
mesentérica superior con una caída de la tensión sanguínea sistémica (44).
La aplicación tópica sobre la mucosa gástrica de EGF produce así mismo
un incremento del flujo sanguíneo gástrico implicándose esta propiedad como uno
de los factores importantes en la defensa de la mucosa frente a la agresión (45).
3.1.2.8. Relacionados con la contracción del músculo liso
gastrointestinal.
Al igual que en otras partes del organismo (p.e. las arterias coronarias), el
EGF y sus péptidos afines actúan sobre la fibra muscular del tracto digestivo.
Dicha actividad se manifiesta tanto en el músculo liso circular como longitudinal,
en el estómago y en el intestino siendo su acción de estímulo de la contractilidad
lo que conlleva una acción estimuladora sobre la motilidad gastrointestinal.
3.1.2.9. Restitución del epitelio de la mucosa.
El término restitución hace referencia al fenómeno por el cual una zona del
epitelio mucoso dañada es reparada mediante la migración de células epiteliales
antes de que se produzca el proceso de proliferación celular (46).
Esta propiedad también le ha sido atribuida al EGF. De nuevo parece estar
mediada por las prostaglandinas y su base física radica en el aumento de la
permeabilidad mucosa que supone la pérdida de las “tight junctions” entre las
células.
48
3.1.3. MODELO INTEGRADO DE LAS DIFERENTES
ACCIONES QUE SOBRE LA FISIOLOGÍA DEL SISTEMA
GASTROINTESTINAL TIENEN EL EGF Y LOS PÉPTIDOS
CON ÉL RELACIONADOS.
Las propiedades anteriormente descritas para el EGF se agrupan en dos
conjuntos desde el punto de vista de su relación con el aparato gastrointestinal:
1. Las relacionadas con la digestión, absorción y transporte de los
nutrientes ingeridos.
2. Las relacionadas con la protección de la mucosa y su reparación en
caso de agresión.
Un tercer grupo de propiedades, indirectamente relacionadas con el sistema
gastrointestinal serían las relativas a la proliferación y diferenciación celular.
3.1.3.1. Digestión, absorción y transporte de nutrientes.
Tras la ingestión de la comida y su primera digestión en el estómago el
EGF procedente de las glándulas salivares y el presente en el torrente sanguíneo
actúan de manera que se estimula el vaciamiento gástrico, junto a la disminución
de la secreción ácida y el estímulo de la secreción duodenal de bicarbonato lo que
incrementa el pH del contenido intestinal. Así mismo se estimula la secreción
pancreática de amilasas lo que lleva a la primera digestión de los carbohidratos
complejos ingeridos.
Todo esto junto al estímulo sobre la motilidad intestinal hace que el
contenido duodenal esté a punto para ser asimilado en el siguiente tramo del tubo
digestivo: el intestino delgado.
En este tramo las propiedades desarrolladas están sobretodo en relación con
fenómenos de absorción de sales, agua y carbohidratos. Los mecanismos puestos
en práctica son tanto de activación (cotransporte de sodio-glucosa y absorción
pasiva de cloruro sódico) como de inhibición (inhibición de la secreción de
cloruros). Esta última acción tiene un especial significado en el colon.
49
3.1.3.2. Protección de la mucosa y reparación en caso de
agresión.
En este apartado no solo se incluirían funciones específicas de la
protección de la mucosa como son la activación de la síntesis y secreción de moco
y el estímulo de la propiedad de la restitución sino que también tienen un papel
fundamental otra serie de acciones que podríamos definir como complementarias y
que son la inhibición de la secreción ácida gástrica, el estímulo de la secreción
duodenal de bicarbonato y la regulación del flujo sanguíneo gastrointestinal en el
sentido de su facilitación.
Por todo este conjunto de propiedades interrelacionadas (Tabla 2) que
desarrolla el EGF y sus péptidos afines ha sido denominado por algunos autores
como “péptido vigía intraluminal” (47).
Tabla 2: Interrelación entre las acciones del EGF a nivel del tracto gastrointestinal.
PROLIFERACION
PROTECCION
DIGESTION
•Estímulo de la división •Síntesis y secreción de •Activación de la absorción
celular.
moco
de cloruro sódico y glucosa
•Restitución del epitelio
•Estímulo para la secreción de
amilasa
•Inhibición de la secreción de
cloruro.
•Estímulo a la motilidad
gastrointestinal.
•Inhibición de la secreción ácida gástrica
•Estimulación de la secreción de bicarbonato
•Aumento del flujo sanguíneo gastrointestinal
50
3.2. PROSTAGLANDINAS.
Las prostaglandinas son una familia de sustancias sintetizadas por la
transformación enzimática de los ácidos grasos poliinsaturados y que se
caracterizan por tener una gran variedad de actividades biológicas de naturaleza
reguladora y hormonal.
El nombre prostaglandina se debe al fisiólogo sueco U. S. von Euler, que
en 1930 aisló una sustancia liposoluble en la próstata, vesículas seminales y suero
del semen (48).
Actualmente, se conocen numerosas moléculas distintas de prostaglandinas
algunas de las cuales se han
aislado de diferentes tejidos y otras se han
sintetizado en el laboratorio.
Dichas sustancias están englobadas en un conjunto que se ha denominado
eicosanoides siendo todas ellas derivadas de la transformación enzimática de
ácidos grasos poliinsaturados de 20 carbonos, en especial el ácido araquidónico
(ácido 5, 8, 11, 14-eicosatetraenoico) que es el precursor más importante (49).
(Figura 9)
Figura 9: Acido Araquidónico.
Los principales grupos de sustancias originadas son:
-A partir del proceso de ciclo-oxigenación (50): prostaglandinas,
prostaciclina y tromboxanos.
51
-A partir del proceso de lipoxigenación (51): leucotrienos, lipoxinas y
anandamidas.
A diferencia de otros mediadores celulares, los eicosanoides no se
encuentran almacenados en sitios o células especiales sino que su presencia está
extendida por todo el organismo en una gran variedad de células.
Su aparición y desaparición se realizan con extraordinaria rapidez, en
función de la velocidad con que se libera el ácido araquidónico a partir de los
fosfolípidos de membrana.
Una misma célula puede producir diversos eicosanoides; por eso, la
función celular dependerá de la naturaleza del eicosanoide sintetizado, de la
naturaleza de la célula donde se sintetiza, y del tipo de célula sobre la que actúa.
De ahí que resulte difícil a veces predecir la acción ya que, cuando actúen varios
simultáneamente, está dependerá de que las acciones de los diversos eicosanoides
liberados se contrarresten o, por el contrario se asocien (52).
Entre las características generales (53) de todas estas sustancias destacan las
siguientes:
-Su síntesis
depende de manera muy precisa de estímulos de diversa
cualidad: nerviosos, hormonales, mecánicos...
-Su acción se circunscribe a las células más próximas a su sitio de origen.
-Sus precursores son liberados a partir de los fosfolípidos de membrana por
acción del estímulo inicial.
-Las
reacciones
de
ciclo-oxigenación
y
lipooxigenación
son
estereoespecíficas y autolimitantes.
-En el curso de su biosíntesis se generan radicales libres de oxígeno (54)
-Su acción consiste con frecuencia en reforzar o antagonizar reacciones
celulares ya en marcha, y en sensibilizar a las células frente a los efectos de otros
mediadores.
-Funcionan como biorreguladores en los procesos de acoplamiento entre
estímulo y secreción, involucrándose con frecuencia en el control de la
información de nucleótidos cíclicos y de movilización del calcio.
52
El inicio de la biosíntesis es común a todos los eicosanoides. Un estímulo
determinado y que puede ser de diversa índole (nervioso, antigénico, traumático,
isquémico, peptídico...) provoca en la membrana celular la transformación del
fosfolípido fosfatidiletanolamina, presente en la cara interna de la membrana
celular, en el fosfolípido fosfatidilcolina que se encuentra en la cara más externa.
La consecuencia es un cambio en la fluidez de la membrana y la activación de los
enzimas fosfolipasa A2 y C lo que conlleva la producción de ácido araquidónico
(55).
Posteriormente y centrándonos en la vía de la ciclooxigenasa, enzimas
microsomales actúan sobre al ácido araquidónico ciclándolo hacia el anillo
ciclopentano y posteriormente oxidándolo (50).
La catabolización de los eicosanoides se produce en muy diversos tejidos,
recayendo un porcentaje elevado en el tejido dónde fueron sintetizados. El hígado,
el riñón y el pulmón actúan además como órganos que metabolizan la fracción que
haya podido pasar a la circulación general (56).
En cuanto a su mecanismo de acción este se inicia en receptores (57)
específicos para cada uno de los eicosanoides y se realiza a través de la acción de
segundos mensajeros: cAMP, cGMP y fosfoinosítidos (58).
3.2.1.
DISTRIBUCIÓN
Y
FUNCIONES
DE
LAS
PROSTAGLANDINAS.
La distribución de las prostaglandinas por los tejidos es enormemente
variable. Dicha variabilidad depende de la especie animal de que se trate, del
estado fisiológico o patológico e incluso de la “contaminación” de cada tejido con
células de otro origen.
Las funciones desarrolladas por estas moléculas son múltiples y de muy
diversa índole. Todos los órganos y sistemas de la economía se ven afectados por
las acciones que los eicosanoides desempeñan bien directamente sobre ellos o por
efectos indirectos como consecuencia de lo desarrollado en otro órgano.
53
3.2.1.1. Sistema nervioso.
En múltiples funciones de las que se llevan a cabo tanto en el sistema
nervioso central como periférico tienen su importancia estas sustancias. Desde su
función en la neurotransmisión cerebral (59), hasta su relación con el sistema
adrenérgico pasando por la termorregulación (60) a nivel central y la nocicepción a
nivel periférico.
3.2.1.2. Células sanguíneas y mastocitos.
Los neutrófilos, las plaquetas, los macrófagos y los basófilos no solo son
células diana de los eicosanoides sino que también
son una fuente rica de
prostaglandinas. Por la función transcendental que estas células desempeñan en los
procesos de la inflamación y de la inmunidad inmediata y diferida estos
compuestos juegan un especial papel en dichos procesos (61).
Acciones de quimiotaxis y en el ámbito de la permeabilidad y el tono
microvascular conllevan que las prostaglandinas desempeñen una función
determinante en las manifestaciones tanto agudas como crónicas de la inflamación
(62).
3.2.1.3. Pared vascular.
No solo a nivel de la microcirculación las prostaglandinas desempeñan su
función, también lo hacen en los grandes y medianos vasos (dos ejemplos claros
son las arterias cerebrales y el ductus arteriosus fetal (63)), actuando como
vasodilatadores (64).
3.2.1.4. Tejido pulmonar.
Fenómenos de constricción (65) de pequeños y grandes bronquios así como
edema de la mucosa de las vías respiratorias hace que los pulmones sean la sede de
episodios de inflamación e inmunidad. El mecanismo de liberación de las
prostaglandinas es doble; por un lado proceden de los mastocitos del intersticio
pulmonar y por otro de la propia pared bronquial.
54
3.2.1.5. Riñón.
La acción combinada de distintas prostaglandinas en el riñón se dirige a
regular la resistencia vascular renal, facilitar el mantenimiento adecuado de la
velocidad de filtración glomerular y del flujo plasmático intrarrenal, manteniendo
así el intercambio adecuado de sodio y agua (66).
3.2.1.6. Sistema endocrino y reproductor.
Su función se describe como mediadores entre estímulos nerviosos y
humorales y la capacidad secretora de las células. Facilitan la secreción de ACTH,
hormona del crecimiento y prolactina. Estimulan la producción de esteroides por
las suprarrenales, la liberación de insulina y la acción sobre el tiroides a modo de
tirotropina. Actúan como mediadores en la influencia noradrenérgica sobre la
liberación de LH/RH (65)
En el sistema reproductor las prostaglandinas han sido aisladas del suero
seminal, endometrio y liquido amniótico. Su función se desarrolla en lo referente a
la motilidad del esperma en el tracto genital, de las trompas, el transporte del
huevo y la motilidad y maduración uterina en el útero a término (52).
3.2.2. ACCIONES DE LAS PROSTAGLANDINAS EN EL
TRACTO GASTROINTESTINAL.
Mención a parte merece las acciones que sobre el aparato digestivo
producen las prostaglandinas (66), pues es el apartado directamente relacionado
con nuestro trabajo.
Las prostaglandinas que juegan un papel más directo en el funcionamiento
de dicho sistema son la PGE, la PGF y la PGI2 aunque no son las únicas.
55
3.2.2.1. Secreción en estómago y duodeno.
PGE y PGI2 inhiben de la secreción de jugo gástrico provocada por el
alimento, la gastrina o la histamina. Dicha inhibición se produce tanto a nivel de
volumen como de acidez y de contenido en pepsina mediante una acción directa
sobre las células secretoras.
Además las prostaglandinas son vasodilatadoras en la submucosa gástrica
siendo la PGI2 reguladora local del flujo sanguíneo.
El hecho de que la PGE2 sea un potente estimulante de la secreción de
moco por el estómago así como de bicarbonato por las glándulas duodenales hacen
de estas sustancias protectoras frente a factores lesivos.
3.2.2.2. Intestino delgado y colon.
Tanto en un tramo como en otro las prostaglandinas favorecen la secreción
de electrolitos y agua, fenómeno que se produce mediado por el cAMP.
Concretamente en el colon la prostaglandina E2 resulta ser un potente secretagogo
para el cloro.
La secreción de moco en estos tramos también se ve estimulada por la
acción de las prostaglandinas.
3.2.2.3. Músculo liso gastrointestinal.
Su función a nivel del músculo liso es un estímulo de su contractilidad en
cuanto al músculo longitudinal se refiere; a nivel de las fibras circulares la PGE
tiene función relajante mientras que la PGF la tiene como estímulo de la
contractilidad.
En síntesis las prostaglandinas reducen el tiempo de tránsito intestinal tanto
en el intestino delgado como de colon.
3.2.2.4. Protección de la superficie mucosa luminal.
El estímulo generalizado en todos los órganos del tracto gastrointestinal en
lo que se refiere a la síntesis y secreción de moco (67) así como la facilitación de
56
los fenómenos de restitución (68) y renovación celular configuran una de las
propiedades más características de estas moléculas.
IV. HIDROFOBICIDAD EN LOS DISTINTOS TRAMOS
DEL TRACTO DIGESTIVO.
1. ESOFAGO.
1.1. HISTOLOGIA (18).
El esófago es un tubo de unos 25 cm de longitud que comienza en la
faringe a nivel del borde inferior del cartílago cricoides y termina en el estómago
unos pocos centímetros por debajo del diafragma.
Es la porción del tubo digestivo que presenta el músculo más desarrollado.
Debido a la contracción tónica de esta capa muscular su luz es pequeña e
irregular y su mucosa desarrolla unos pliegues longitudinales.
1.1.1.
CARACTERÍSTICAS
MICROSCÓPICAS
DE
excepcionalmente
grueso
LA
MUCOSA.
El
epitelio
es
plano
estratificado,
y
ocasionalmente queratinizado observándose capa cornea. Este epitelio se continua
imperceptiblemente con el epitelio plano estratificado de la faringe, mientras que
en la transición al estómago en la región del cardias bruscamente se modifica a
cilíndrico simple.
Así mismo la lamina muscular propia es muy gruesa en el esófago.
Dos tipos de glándulas nos encontraremos en el esófago:
57
-Las glándulas cardiales ubicadas en la lámina propia de la mucosa y
apareciendo sólo en una zona limitada de la parte superior e inferior del esófago
pudiendo faltar las superiores. Se trata glándulas tubulares mucosas, muy
ramificadas.
-Las glándulas submucosas, ubicadas en la capa submucosa, su número es
mayor en la mitad superior del esófago. Son glándulas tubuloacinosas, ramificadas
cuyos conductos excretores más pequeños tienen epitelio cúbico o cilíndrico
reemplazado por epitelio plano estratificado durante su curso por la mucosa.
Ambos tipos glandulares secretan mucina cuya función principal es
lubrificar la superficie mucosa esofágica para facilitar el paso del bolo alimenticio.
Por otra parte en la zona del cardias la secreción mucínica jugaría un papel
importante en la protección de dicha mucosa contra la digestión por el reflujo del
jugo gástrico ácido.
1.2.
PROPIEDADES
DE
SUPERFICIE
EN
LA
MUCOSA
ESOFAGICA.
El esófago ha sido uno de los órganos menos estudiados desde el punto de
vista de sus características de hidrofobicidad ya que su función primordial es de
conducción del bolo alimenticio entre la boca y el estómago lo que hace que las
funciones de digestión y absorción de los alimentos en este tramo del tracto
digestivo sean inexistentes.
Revisada la literatura solamente un único trabajo, el de B.A. Hills (autor
que por otra parte ha publicado numerosos trabajos sobre las propiedades de
superficie en la mucosa del tubo digestivo) expone resultados sobre estas
características de la mucosa esofágica siendo pues los datos expuestos en este
apartado los obtenidos de la mencionada publicación (69)
Se han podido determinar características hidrofóbicas en la superficie
mucosa esofágica, sobre todo en el epitelio más próximo al cardias, determinadas
58
por la existencia de una barrera física de fosfolípidos que se extiende sobre dicha
superficie infiriéndole dichas características.
Los valores de hidrofobicidad medidos con un goniómetro, en grados
según la técnica de la gota, nos confirman la existencia de propiedades de este tipo
en el epitelio mucoso esofágico si bien cuando los comparamos con los que se
obtienen en idénticos estudios sobre la mucosa gástrica resultan ser, en valor
absoluto, mucho menores los esofágicos.
Dicha barrera fosfolipídica se ve drásticamente afectada, llegando a
desaparecer, cuando incubamos una muestra de mucosa esofágica en un medio que
contiene sales biliares lo cual explica la sensibilidad del esófago en la práctica
clínica a la esofagítis por reflujo biliar.
2. ESTOMAGO.
2.1. HISTOLOGIA (18).
El estómago es la parte más ensanchada del tracto digestivo y comunica el
esófago con el duodeno. El bolo alimenticio, que tras la masticación adquiere una
consistencia blanda, se acumula durante un cierto tiempo en el estómago donde
tras sufrir de una acción mecánica y química se transforma en un líquido espeso
denominado quimo. Por tanto el estómago actúa por un lado como reservorio y por
otra parte como órgano digestivo participando de la absorción de ciertas
sustancias.
La unión del estómago con el esófago se llama cardias mientras que la
salida del estómago al duodeno se denomina píloro. A la izquierda del cardias el
estómago forma una cúpula por encima del plano horizontal que se denomina
fundus.
Los bordes gástricos lateral cóncavo y medial convexo se denominan
curvaturas menor y mayor respectivamente. La curvatura menor tiene una
hendidura, la incisura angularis, donde pasa de una disposición horizontal a una
59
vertical y que separa la parte mayor y más central del estómago, el cuerpo gástrico
de la porción más distal y que termina en el esfínter pilórico denominada antro
gástrico.
La mucosa gástrica es gruesa y posee una superficie blanda aterciopelada.
Su color es rosado aclarándose cerca del cardias y del píloro. En el estómago vacío
y contraído la superficie forma numerosos pliegues longitudinales, las arrugas
gástricas, que desaparecen cuando el estómago se llena. Así mismo se identifica un
entramado de cisuras que dividen la superficie mucosa en pequeños campos
convexos, las áreas gástricas, cuyas dimensiones son de 1-6 mm. En cada área se
puede observar un pequeño orificio que llevan a cavidades en forma de embudo:
las criptas gástricas.
2.1.1. ESTRUCTURA MICROSCÓPICA DE LA MUCOSA
GÁSTRICA.
El epitelio superficial es del tipo cilíndrico simple, alto y recubre toda la
superficie libre así como las criptas continuándose con el epitelio cilíndrico simple
del intestino.
Las células del epitelio superficial son todas secretoras de moco y
representan en conjunto un epitelio secretor. Su citoplasma esta lleno de gránulos
de mucígeno que se colorean por el método de PAS.
El contenido celular de gránulos mucígenos disminuye a medida que se
penetra en las criptas y simultáneamente las células se hacen más bajas.
Toda la mucosa gástrica está ocupada por glándulas tubulares simples, las
glándulas gástricas, que se abren en el fondo de las criptas gástricas.
Estas glándulas son distintas en las diferentes zonas del estómago
describiéndose tres zonas mucosas que no están delimitadas claramente:
•Glándulas
cardiales. Son glándulas tubulares muy ramificadas; sus células
son esencialmente mucosas similares a las de las glándulas pilóricas. Además
podemos encontrar alguna célula endocrina.
60
•Glándulas
corpofúndicas. Son glándulas rectas y perpendiculares a la
superficie mucosa aunque ocasionalmente se pueden ramificar y están algo
curvadas y enrolladas en la muscularis mucosae.
Cada túbulo glandular se
compone de tres secciones: una parte principal profunda, un cuello medio y un
istmo superior mediante el cual la glándula se abre al fondo de la cripta (a menudo
varias glándulas en cada una).
En estas glándulas corpofúndicas encontramos 4 tipos celulares distintos:
-
Células principales. Se encuentran en mayor número en la parte
principal de la glándula. Contienen gránulos de pepsinógeno,
estadio precursor de la enzima proteolítica pepsina.
-
Células parietales. Su localización primordial es en cuello de la
glándula aunque también las encontramos en el adenómero. Su
función es la secreción del ácido clorhídrico.
-
Células mucosas del cuello. Las encontramos entre las células
parietales y su secreción es de mucina.
-
Células endocrinas secretoras de glucagón.
•Glándulas
pilóricas. Son tubulares simples pero mucho más ramificadas
que las corpofúndicas. Sus células son de dos tipos: las mucosas y las endocrinas
que secretan gastrina.
2.2.
PROPIEDADES
DE
SUPERFICIE
DE
LA
MUCOSA
GASTRICA.
Desde que en el siglo XVIII Spallanzani demostrara que el jugo gástrico
humano tiene la capacidad de digerir la carne, los investigadores del aparato
gastrointestinal se han preguntado a cerca del mecanismo por el cual la superficie
luminal gástrica resiste la autodigestión por dicha secreción (70).
A mediados de los años 60 Davenport introduce el concepto de “barrera
mucosa gástrica”, demostrando que el epitelio de la mucosa gástrica de los
61
mamíferos es resistente al ácido intraluminal y a otros electrolitos siendo
susceptible de ser lesionado por otros agentes liposolubles (71).
Los mecanismos por los cuales está resistencia aparece son múltiples y de
naturaleza diversa (72):
-Bombas de intercambio iónico.
-Secreción de bicarbonato por las células del epitelio superficial
tanto a nivel intraluminal como intersticial.
-Flujo sanguíneo local mantenido y con débito elevado.
-Rapidez en la reparación de la superficie en la mucosa lesionada.
-Evidencia de una monocapa lipídica con características de gel en la
superficie de la mucosa que le confiere propiedades de
hidrofobicidad y por tanto de resistencia al ácido.
En cuanto a este último mecanismo de defensa nos tenemos que remontar
150 atrás cuando Beaumont relaciona la resistencia al ácido de la mucosa gástrica
con la capa de moco que la cubre (14).
2.2.1.
LA
HIDROFOBICIDAD
DE
LA
SUPERFICIE
MUCOSA GÁSTRICA.
Numerosos estudios recientes han puesto de manifiesto la existencia de esta
propiedad.
En 1983, empleando el método del ángulo de contacto, se demuestra que la
superficie mucosa gástrica del perro exhibe valores de hidrofobicidad elevados
(entre 75º y 90º) (73).
Estudios posteriores han puesto de relieve dicha propiedad en las
superficies mucosas gástricas de numerosas especies de mamíferos incluido el
hombre (74).
62
2.2.2. PAPEL DE LOS LÍPIDOS EN LA HIDROFOBICIDAD
DEL MOCO.
Al principio de los años 80, Waseff y colaboradores (75) ponen de
manifiesto la presencia de concentraciones valorables de fosfolípidos con
propiedades tensoactivas como la dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) en la
mucosa gástrica y buscan una relación incluso embriológica con el surfactante
pulmonar ya que este fosfolípido es componente primordial de dicha sustancia.
Diez años después en un nuevo trabajo (76), Smith ratifica la presencia de
esta DPPC como componente de la fracción lipídica del moco gástrico si bien tan
solo en menos de un 10% de su fracción fosfatidilcolínica lo que supone
concentraciones de hasta cuatro veces menos de lo propuesto por Wasef.
No obstante, en nuevos estudios se ha comprobado que las concentraciones
de estos fosfolípidos tensoactivos en el moco gástrico no son constantes y su
síntesis y secreción depende de secretagogos gástricos como de la acción de
agentes protectores o lesivos sobre la mucosa gástrica (14).
2.2.3.
EFECTO
SOBRE
HIDROFOBICIDAD
DE
LA
PROPIEDAD
DISTINTOS
DE
LA
AGENTES
ULCEROGÉNICOS.
Durante los últimos años y basado en experimentos con animales tanto in
vivo como in vitro, se creía que numerosos agentes lesivos para la mucosa gástrica
como el ácido acetil salicílico y otros salicilatos, el etanol, las sales biliares y las
fosfolipasas entre otros llevaban a cabo su acción actuando a nivel del
metabolismo de los fosfolípidos y como consecuencia alterando la propiedad de la
hidrofobicidad.
Esta tesis, que apoya el concepto de que la propiedad de la hidrofobicidad
de superficie es pieza clave en el mantenimiento
de la barrera mucosa
gastrointestinal, debió ser reinterpretada a partir de las experiencias de Goddard
63
(77)
que demostraron que el efecto sobre la propiedad de la hidrofobicidad de la
superficie mucosa no viene precedido por un sustrato de alteración en la síntesis de
los lípidos sino más bien por una interacción directa sobre la monocapa de
fosfolípidos a nivel molecular.
Así, posteriores estudios demostraron que los antiinflamatorios no
esteroideos (AINES) los cuales poseen en su estructura química un grupo
carboxilo libre, forman a través de éste, fuertes enlaces electrostáticos con las
“cabezas” con carga positiva de los fosfolípidos con lo que se incrementa la
solubilidad de dichos fosfolípidos en el agua y por consiguiente se neutralizan sus
propiedad tensoactivas (78) (79).
En parecida línea cabría señalar el mecanismo íntimo por el cual el
Helicobacter pylori produce el desarrollo de gastritis crónica activa y ulcera
péptica.
Dos son estos mecanismos: (Figura 10)
-La producción por parte del H. pylori de una fosfolipasa (80) que
provoca por una parte la lesión en la capa de surfactante y por otra
parte la asimilación por la bacteria de estos fosfolípidos con el fin
de utilizarlos como mecanismo de defensa dentro del medio ácido
donde subsiste el germen (81).
-La síntesis así mismo de una segunda enzima del tipo ureasa que
generaría a partir de la urea una elevada concentración de grupos
amonio en el espesor del moco gástrico los cuales competirían con
los lugares de enlace electrostático de las “cabezas” positivas de los
fosfolípidos produciéndose una disrrupción de la monocapa y por
tanto de las características tensoactivas que esta le confiere (82).
64
Figura 10: Mecanismos de ulcerogénesis del H. Pylori
2.2.4. EFECTO SOBRE LA HIDROFOBICIDAD DE LA
SUPERFICIE MUCOSA
Y SOBRE EL METABOLISMO
LIPÍDICO DE LOS AGENTES GASTROPROTECTORES.
El concepto “citoprotección” fue acuñado a mediados de los años 70 por
Robért y colaboradores tras demostrar que determinados tipos de prostaglandinas y
sus análogos a dosis más bajas de las necesarias para inhibir la secreción ácida
gástrica eran capaces de proteger la mucosa gástrica ante la acción de distintos
factores ulcerogénicos (14).
Los mecanismos clásicos por los cuales se produciría este efecto serían:
-Incremento en la secreción de moco.
-Incremento en la producción de bicarbonato por la mucosa.
-Reducción de la permeabilidad vascular.
65
-Mantenimiento del flujo sanguíneo gástrico.
Estudios posteriores de tipo morfológico pusieron de manifiesto que
realmente el epitelio de superficie de la mucosa gástrica de ratas pretratadas con
prostaglandinas y sometidas posteriormente a la acción de agentes ulcerogénicos
aparecía lesionado si bien el tejido glandular se mantenía indemne (83). Ante esto
se decidió sustituir el término “citoprotección” por el más preciso de
“gastroprotección”.
Añadiendo a los efectos clásicos antes descritos de las prostaglandinas
sobre las propiedades de barrera de la mucosa gástrica se ha comprobado que estas
sustancias tienen la capacidad de incrementar la propiedad de la hidrofobicidad de
superficie mediante la estimulación de la biosíntesis y/o acumulación de los
fosfolípidos por parte de las células de dicha mucosa (84).
3. INTESTINO DELGADO: DUODENO, YEYUNO E ILEON.
3.1. HISTOLOGIA (18)
El intestino delgado es un órgano tubular de entre 4 y 5 metros de largo que
se inicia en el píloro y termina en la válvula ileocecal continuándose con el
intestino grueso.
Macroscopicamente el intestino delgado se divide en tres porciones aunque
el paso de una a otra es imperceptible y su estructura histológica es la misma.
Estas tres secciones serían una proximal, retroperitoneal excepto en sus tres
primeros centímetros y de unos 25-30 cm de longitud denominada duodeno y otra
mucho más larga fijada por el mesenterio a la pared posterior del abdomen con
cierta movilidad y recubierta de peritoneo que se conoce como intestino delgado y
que se divide en un tramo proximal (2/5) denominado yeyuno y ubicado en el
cuadrante superior izquierdo del abdomen y otra más distal, de mayor longitud
(3/5), ubicada en el cuadrante inferior derecho abdominal que termina en la
válvula ileocecal y que se denomina ileon.
66
En el intestino delgado se produce el tránsito del quimo, mientras sufre
degradación química completa a compuestos absorbibles por los vasos sanguíneos
y linfáticos de la mucosa.
La capacidad de absorber los componentes degradados del alimento por
parte de la mucosa del intestino delgado está incrementada por diferentes rasgos
estructurales que producen un gran aumento de su superficie luminal que viene a
ser de unos 250 m2.
Las válvulas conniventes de Kerking son unos pliegues circulares visibles
macroscópicamente que se extienden como semilunas ocupando los 2/3 de la luz.
Estos están especialmente desarrollados en el yeyuno, faltando en los 5 cm
proximales del duodeno y en la última mitad del íleon. Su existencia aumenta la
superficie de la mucosa en 3 veces.
Las vellosidades intestinales son evaginaciones de la mucosa formadas por
un núcleo de tejido conectivo y recubiertas por epitelio de superficie. Su tamaño
promedio es de 1 mm y su forma es digitiforme o foliacea. Estas vellosidades
tapizan densamente toda la superficie mucosa intestinal lo que le confiere un
aspecto aterciopelado, así mismo su presencia aumenta en 10 veces dicha
superficie.
3.1.1. ESTRUCTURA MICROSCÓPICA DE LA MUCOSA
ENTÉRICA.
El epitelio que reviste la mucosa del intestino delgado es cilíndrico simple.
En él diferenciamos 4 tipos celulares: células absortivas, caliciformes, endocrinas
y las células de Paneth.
Las células absortivas son cilíndricas altas. Su superficie libre presenta un
borde en cepillo conocido como “chapa estriada”. Esta chapa estriada, con un
espesor de 1 µm aparece formada por microvellosidades paralelas muy juntas que
aumenta la superficie de la mucosa intestinal en 20 veces. Estas vellosidades a su
vez están cubiertas de una gruesa capa de filamentos que se conoce como cubierta
67
superficial. Sus funciones son de dos tipos: una función protectora y otra como
soporte de enzimas intestinales del tipo peptidasa, disacaridasas (sacarasa, maltasa,
isomaltasa y lactasa) y lipasa.
Las células caliciformes que se encuentran insertadas entre las células
absortivas, se reconocen por ser fuertemente PAS positivas debido a su contenido
en mucinógeno.
Las células endocrinas son de cuatro tipos en el intestino delgado según el
producto de su secreción: secretoras de secretina, colecistoquinina, enteroglucagon
y serotonina (células argentafines).
Las células de Paneth localizadas únicamente en el fondo de las criptas
tienen función desconocida aunque se sabe que exhiben características da células
secretoras con una secreción rica en proteínas y cinc.
Por otro lado es necesario hablar ahora de otras dos estructuras, esta vez
glandulares, que si bien no se encuentran localizadas en su totalidad en la mucosa
desembocan a este nivel:
- Las criptas de Lieberkühn que corresponden a glándulas tubulares
simples, que drenan entre las vellosidades y que se extienden a lo largo de la
lámina propia y muscularis mucosae. Así mismo en la profundidad de dichas
criptas hallamos células muy indefernciadas precursoras tanto de células
absortivas como de caliciformes.
- Las glándulas de Brunner, muy desarrolladas en el duodeno y que van
disminuyendo en número según accedemos a tramos más distales del intestino
delgado. Se trata de glándulas tubulares ramificadas y otras simples localizadas
principalmente en al submucosa y cuyos conductos excretores desembocan en las
criptas de Lieberkühn.
Su secreción (13) es mucosa muy rica en iones bicarbonato lo que hace que
su pH sea básico. La misión de esta secreción es la de protección de la mucosa,
sobre todo duodenal, fijándose a ella y ligando los iones bicarbonato.
68
3.2.
PROPIEDADES
DE
SUPERFICIE
DE
LA
MUCOSA
INTESTINAL.
De la misma manera que ocurre a lo largo de toda la superficie
endoluminal del tubo digestivo la del intestino delgado también está tapizada por
una capa lipídica compuesta en su estrato más superficial de fosfolípidos.
Dicho manto lípidico (denominado como “fuzzy coat” en la literatura
inglesa) tiene un triple origen en el caso del intestino delgado:
-
Lípidos de membrana originados de la destrucción celular.
-
Fosfolípidos, ácidos biliares y colesterol a partir de la bilis.
-
Lípidos y sus productos de degradación con origen en la ingesta y
degradados por los enzimas pancreáticos.
Debido al íntimo y amplio contacto que supone la extensa superficie del
intestino existe un sistema defensivo a este nivel que se sustenta en dos pilares
fundamentalmente:
-
La presencia de característicos acúmulos de linfocitos T en el espesor
del epitelio intestinal.
-
La colonización por parte del Lactobacilo (10) de la superficie intestinal
lo que conlleva por un lado la competencia con la colonización por
parte de otros gérmenes patógenos (como los bacilos gram negativos
que colonizan el intestino grueso) en dicha superficie así como un
estímulo inmunológico mantenido.
El papel del surfactante intestinal en este tramo del tubo digestivo está más
relacionado con la estabilización de esta colonización por huéspedes específicos
para cada especie tanto en el tipo de germen (Lactobacilli) como en su
concentración (1.000.000 de unidades formadoras de colonias).
69
Como ya hemos reseñado en apartados anteriores la función primordial del
intestino delgado es la de digestión y absorción principalmente de nutrientes (84).
La absorción de agua en este tramo no es tan importante siendo la parte
importante en esta función el colon sobretodo el lado derecho.
En esta función de la absorción las propiedades de superficie que
caracterizan al surfactante tienen un papel fundamental y lo desarrollan a nivel de
las uniones intercelulares laterales (“tight junctions”).
El espacio entre células en su región más lateral es un camino bloqueado
por unas fuerzas de superficie que conducen a la aposición entre lípidos y
proteínas de membrana (85). La presencia del surfactante intestinal a nivel de estas
uniones basoleterales entre las cédulas facilita la apertura de los puentes
inercelulares laterales y como consecuencia un camino para el paso de moléculas
desde la luz intestinal al medio interno (86). Dicho surfactante, aislado
posteriormente en intestino humano, tiene similar composición en distintas
especies de mamíferos siendo a su vez química y estructuralmente diferente de los
lípidos que conforman la estructura de las membranas del borde apical en cepillo y
del borde basolateral de las células epiteliales (87).
70
V. PROPIEDADES DE SUPERFICIE DE LA MUCOSA
DEL INTESTINO GRUESO.
1. ANATOMIA DEL COLON Y RECTO.
El intestino grueso comprende el tramo de tubo digestivo que se extiende
desde el final del íleon (válvula ileocecal) hasta el ano y tiene por término medio
una longitud de 135 cm. (Figura 11).
Su calibre es máximo en su tramo inicial, el ciego, y disminuye
gradualmente en dirección distal, aunque de nuevo se dilata en la porción más
inferior del recto.
En su curso describe un arco que rodea las asas de intestino delgado. Se
distingue fácilmente de este último por su mayor calibre, su aspecto saculado, la
posesión en muchas zonas de apéndices grasos (los apéndices epiploicos), la
adherencia de una parte (el colon transverso) al epiplon mayor y su mayor fijación.
El rasgo más destacado de la pared del colon es la concentración de la capa
muscular longitudinal externa en tres estrechas bandas o tenias, más cortas que el
propio intestino, de manera que éste queda fruncido dando lugar a la formación de
las típicas haustras.
71
Desde un punto de vista topográfico el intestino grueso lo podemos dividir
en
cuatro grandes sectores que a su vez se subdividirían hasta definir siete
segmentos (88). (Tabla 3)
Tabla 3: División del colon en sectores y segmentos.
SECTORES
COLON DERECHO
COLON TRANSVERSO
COLON IZQUIERDO
RECTO
SEGMENTOS
•Ciego
•Colon ascendente
•Proximal (ángulo hepático)
•Distal (ángulo esplénico)
•Colon descendente
•Sigma
•Recto
1.1. CIEGO.
Con estructura de fondo de saco, el ciego se aloja en la fosa ilíaca derecha
por encima de la mitad externa del ligamento inguinal.
Dos estructuras anatómicas destacan en relación con el ciego; el apéndice
vermiforme y la válvula ileocecal. Este es el lugar dónde se inserta el íleon y su
función principal es la de antirreflujo del contenido fecal hacia la luz del intestino
delgado.
1.2. COLON ASCENDENTE.
De unos 15 cm de longitud comunica el ciego con el colon transverso
ocupando el parietocólico derecho y apoyándose en el hueso iliaco, el músculo
cuadrado lumbar y el polo inferior renal.
72
1.3. COLON TRANSVERSO PROXIMAL.
Originado en el ángulo hepático del colon se extiende unos 15 cm.
horizontalmente apoyandose sobre la segunda porción duodenal y la cabeza del
páncreas
1.4.COLON TRANSVERSO DISTAL.
Continuación en el plano horizontal y a lo largo de una longitud de 20 cm.
del colon transverso hasta el ángulo esplénico del colon lugar de fijación de este al
diafragma mediante el ligamento frenocólico.
El epiplon mayor, estructura grasa que cuelga de la curvatura mayor del
estómago, desciende por delante del colon transverso y asciende después para
fijarse laxamente a su cara anterior y ala cara superior del mesocolon transverso.
1.5.COLON DESCENDENTE.
El siguiente segmento tiene un curso vertical a lo largo del espacio
parietocólico izquierdo, comprende los siguientes 20 cm del trayecto colónico y
pone en comunicación el ángulo esplénico del colon con el colon sigmoide a nivel
del músculo psoas izquierdo.
1.6.SIGMA.
Con forma de asa su longitud es muy variable pudiendo medir desde 15
hasta 60 cm siendo por termino medio de una longitud de 38 cm.
Habitualmente se localiza en la mitad izquierda de la pelvis uniéndose con
el recto a nivel del tercer segmento sacro.
73
1.7. RECTO.
Tramo final del intestino grueso de unos 15 cm de longitud y que termina
en el ano.
Su localización es en la pelvis menor por debajo de la reflexión peritoneal.
Colon transverso proximal
Colon transverso distal
Colon descendente
Colon ascendente
Ciego
Recto
Sigma
Figura 11: Anatomía del colon
2. FISIOLOGIA DEL INTESTINO GRUESO. (13)
En el ser humano, el colon recibe el contenido ileal, absorbe agua y
electrolitos y actúa de reservorio para la materia fecal resultante, hasta que está en
condiciones de ser evacuada del recto.
Se ha calculado que entre 800 y 1000 ml de líquido penetran en el colon
diariamente procedentes del íleon aunque solamente 150 ml de estos se expulsan
con las heces.
74
2.1. MOTILIDAD EN EL INTESTINO GRUESO.
Cuatro son los tipos de movimientos que observamos en esta parte del
tracto digestivo.
2.1.1. SEGMENTACION.
Son movimientos mezcladores y de amasado principalmente y en menor
medida de progresión del contenido colónico a intervalos regulares que se
caracterizan por su pequeña amplitud y se observan con una frecuencia de unas
tres a ocho veces por minuto.
2.1.2. PERISTALTISMO MASIVO.
Se considera como el principal modo de transporte del colon. Aparece con
mayor frecuencia inmediatamente después de una comida cuando están
aumentadas todas las formas de actividad motora del colon.
Este movimiento consiste en una súbita desaparición de las haustras de
unos cuarenta cm de colon estrechándose éste considerablemente a modo de una
cinta. Este estado de cosas dura solamente entre dos y tres segundos y retorna
inmediatamente al aspecto haustrado normal.
2.1.3. ANTIPERISTALTISMO.
Este movimiento frecuente en otras especies animales, en el hombre solo
se observa ocasionalmente.
Son ondas que se desplazan proximalmente desde el ángulo hepático al
ciego y desde el colon pélvico al descendente fundamentalmente.
En resumen,
todo este conjunto de movimientos desarrollados por el
intestino grueso provocan que lo ingerido en un momento dado entre en el ciego
cuatro horas y media más tarde alcanzando el colon pélvico alrededor de dieciocho
75
horas después. No obstante estos tiempos no son constantes y dependen tanto de la
cantidad como de la calidad del contenido colónico.
2.2. ABSORCION EN EL INTESTINO GRUESO.
Las principales sustancias absorbidas son el agua y los electrolitos. Además
se absorben el amoniaco, las sales biliares, la urea, la glucosa y algunos fármacos
como la hidrocortisona y la morfina.
Se ha calculado que cada día se absorben en el colon y en el recto unos 500
ml de agua y unos 70 mM de sodio.
La absorción de sodio parece depender de un mecanismo activo
desarrollándose concomitantemente una absorción pasiva de agua.
Por otro lado se produce una secreción de potasio a la luz del colon de un
modo activo y contra un gradiente de concentración de hasta 15 nM/l.
En cuanto al amoniaco este se absorbe en proporción a su concentración en
la luz y dependiendo del pH de la misma siendo facilitada esta por valores básicos
de este.
3. HISTOLOGIA DE LA MUCOSA DEL COLON Y RECTO. (18)
La superficie mucosa luminal del intestino grueso es relativamente lisa,
pues a diferencia del intestino delgado no presenta vellosidades.
El epitelio es cilíndrico alto. El borde en cepillo de las células absorbentes
es más bajo que en el intestino delgado, apareciendo células caliciformes en mayor
cantidad, especialmente en las criptas de Lieberkühn, donde casi todas las células
suelen ser células caliciformes.
Las criptas de Lieberkühn, glándulas simples, no ramificadas, tubulares y
mixtas del tubo digestivo, están ocupadas por un enorme número de células
caliciformes. Estas criptas son más largas y más rectas que en el intestino delgado.
76
En el fondo de las mismas se encuentran otros tipos celulares como células
epiteliales más indiferenciadas (regenerativas) y distintas células endocrinas, que
producen principalmente enteroglucagón.
Las células caliciformes (goblet cells), que encontramos en el epitelio de
muchas mucosas, son el único ejemplo de glándula exocrina unicelular que
encontramos en los mamíferos; esto quiere decir que la glándula está formada por
una única célula secretora.
Dichas células secretan mucina que es una glucoproteina. Con la
incorporación del agua la mucina se transforma en moco. En una célula
caliciforme llena de producto de secreción, la zona apical está distendida por las
gotas acumuladas de mucinógeno (el precursor de la mucina), mientras que el
núcleo se encuentra en la zona más estrecha y basal de la célula que es fuertemente
basófila. La zona apical, ensanchada del citoplasma se denomina teca y la forma
de la célula recuerda a un cáliz.
Al microscopio electrónico se observan las gotas de mucinógeno rodeadas
por membranas. La síntesis de la parte proteica del mucinógeno se produce en el
retículo endoplásmico rugoso, mientras que los glucosaminoglucanos ácidos
sulfatados son sintetizados e incluidos en el complejo de Golgi
La liberación del producto de secreción se realiza por secreción merocrina,
esto es vaciado de su contenido a la superficie del epitelio mucoso, y es
relativamente constante durante toda la vida de la célula, es decir,
aproximadamente 3 días en el caso de las células de la mucosa intestinal. Las
células caliciformes cumplen entonces solo un ciclo secretor largo.
77
4. PROPIEDADES DE SUPERFICIE EN LA MUCOSA DEL
COLON.
El epitelio glandular en general y los fosfolípidos mantienen una serie de
interrelaciones que conforman una serie de propiedades fisicoquímicas entre las
que se encuentran englobadas las denominadas propiedades de superficie.
Si bien el surfactante pulmonar es el ejemplo mejor y más extensamente
estudiado de lo anteriormente expuesto, el moco que recubre el epitelio de la
mucosa del tracto gastrointestinal se caracteriza por una serie de propiedades,
algunas de las cuales se incluirían dentro de las denominadas de superficie, que
han hecho de esta parte del organismo objeto de múltiples estudios en el marco de
su funcionalismo en relación con esta faceta (12).
Las primeras investigaciones a cerca del surfactante y sus propiedades en el
tracto gastrointestinal fueron realizadas en el estómago, siendo este órgano el
mejor y más extensamente estudiado con el paso del tiempo. No obstante el resto
del tubo digestivo también ha sido estudiado en relación con sus propiedades de
superficie.
Dado que la función principal del intestino delgado es la de absorción de
nutrientes, es en el colon y recto donde las propiedades de superficie en su mucosa
recobran un mayor protagonismo y se relacionan con numerosas funciones que
esta parte del tubo digestivo desarrolla.
En estudios en perros se ha comparado la composición y distribución del
surfactante en distintas zonas del tubo digestivo (esófago, estómago, duodeno
medio, yeyuno medio y segmentos medios del colon), concluyéndose que existe
una composición similar entre las distintas zonas estudiadas. Así mismo en este
estudio se pone de manifiesto la capacidad lubricante que desarrolla dicho
surfactante en la superficie del tubo digestivo redundando en la propiedad de
protección ya no solo ante noxas de tipo químico sino también ante las que
actuarían mediante una agresión de tipo mecánico (89).
78
Otros estudios llevados a cabo en conejos han puesto de manifiesto las
diferencias regionales entre los valores de hidrofobicidad medidos en tramos de
intestino delgado y los medidos en tramos de colon. Así mismo, dichos valores se
ven modificados tanto en el proceso de maduración del animal como en el de
fenómenos que cursen con inflamación de la mucosa. En una como en otra ocasión
los cambios en las propiedades de esta mucosa se traducen en último termino, en
alteraciones de la capa de moco que tapiza el epitelio (90).
En similar línea y con experimentos diseñados para provocar inflamación
en la mucosa colónica, en este caso de ratas, se demuestra que la interacción del
agente que induce la inflamación lo hace mediante una reacción con los
fosfolípidos del surfactante colónico conduciendo esto a la neutralización de sus
funciones; consiguientemente la propiedad de la hidrofobicidad en dicha superficie
mucosa del colon queda significativamente disminuida o incluso abolida lo que
facilitará la acción mediada inmunológicamente de la sustancia química que
desencadena todo este proceso (91).
En modelos experimentales sobre ratas realizados en el laboratorio del
servicio de gastroenterología del hospital Vall d’Hebron de Barcelona se vuelve a
poner de manifiesto el papel modulador sobre las propiedades de superficie
(concretamente la hidrofobicidad) de la mucosa del colon a la permeabilidad de
moléculas hidrofílicas y como consecuencia la función protectora frente a toxinas
(92).
Una consecuencia clínica que se desprende de los resultados obtenidos de
estos trabajos y que también ha sido tenida en cuenta por otros autores (93) , es la
relación en su fisiopatología que enfermedades inflamatorias crónicas que afectan
al intestino delgado, como por ejemplo la enfermedad de Crohn, tiene con las
propiedades de superficie en los tramos de mucosa digestiva sana de estos
pacientes que se encuentran alteradas en el sentido de una disminución de sus
valores de hidrofobicidad. En esta misma línea se apunta el valor que la
administración de fosfolípidos exógenos puede tener como tratamiento de estos
pacientes.
79
Utilizando cultivos celulares para estudios de laboratorio procedentes de
células de colon humano se han aislado partículas similares al surfactante, con
propiedades que comparten con este (94).
En trabajos realizados con muestras de recto humano se aislaron
secreciones de la superficie del epitelio mucoso ricas en fosfolípidos (95)
encontrándose también en mucosa de estómago y duodeno.
Trabajos más recientes (96) han identificado en muestras amplias de
mucosa de colon humano obtenidas de piezas operatorias o de donante para
transplante la existencia de una fina película aislada de la superficie de la
“membrana” que cubre las microvellosidades de los colonocitos y cuya
composición química es diferente de esta compartiendo proteinas con el
surfactante pulmonar.
De la presencia de esta monocapa de surfactante (fosfolípidos con
propiedades hidrofóbicas) en la superficie de la mucosa del intestino grueso se
derivan una serie de propiedades fisiológicas relacionadas con los aspectos que a
continuación detallaremos:
-
Fenómenos de adhesividad bacteriana.
-
Lubrificación de la superficie luminal mucosa y su repercusión en la
motilidad colónica.
-
Defensa ante la presencia de factores lesivos en la luz colónica.
-
Absorción de los diferentes principios que circulan por la luz intestinal.
4.1. ADHESIVIDAD BACTERIANA.
La propiedad de la adhesividad que exhiben la mayor parte de las especies
bacterianas tiene una gran importancia como factor de virulencia en el inicio de
infecciones sobre todo a nivel del tracto respiratorio, genitourinario y
gastrointestinal (97).
80
La habilidad con la que numerosas especies bacterianas se fijan a las
superficies mucosas de estos sistemas es esencial en el punto de partida del
fenómeno de colonización.
Esta adhesividad bacteriana viene mediada por dos mecanismos que en
unas ocasiones serán independientes pero en otras actuarán juntos.
Dichos mecanismos son los siguientes:
-
Uno especifico y basado en interacciones químicas del tipo receptorligando (98).
-
Otro, inespecífico y mediado por propiedades fisicoquímicas como son
los fenómenos de superficie (hidrofobicidad) (99).
Estos mismos mecanismos y ciñéndonos al tracto gastrointestinal son
también los responsables de la colonización y por tanto competencia con gérmenes
patógenos de la flora saprófita del colon (100).
4.2. LUBRICACION DE SUPERFICIES.
A diferencia del intestino delgado el contenido que circula por la luz
colónica, las heces, es de naturaleza sólida.
La movilización (101) de dicha masa fecal, a menudo con forma irregular,
se facilita por la existencia de una fina capa de surfactante que cubre la superficie
por la cual discurre el transito colónico.
Este surfactante debe cumplir una serie de propiedades químicas y físicas
que lo hagan idóneo en su función lubricadora.
Aunque la composición del surfactante está formada por varios tipos de
fosfolípidos
(fosfatidilcolina,
esfingomielina,
fosfatidiletanolamina,
fosfatidilinositol, fosfatidilserina, y fosfatidilglicerol) el de mayor proporción
(40%) es la fosfatidilcolina cuya capacidad de disminuir la fricción entre
superficies se aproxima al 99%, lo que hace que la disminución del coeficiente de
fricción que conlleva la superficie cubierta de dicha mezcla de distintos
fosfolípidos en diferente proporción sea mayor del 75% (12).
81
Así mismo y dado que la materia fecal, al igual que la gástrica y a
diferencia de la intestinal, tiene características ácidas, la distribución de las
moléculas de surfactante en la superficie de la mucosa desarrolla una
conformación lineal y homogénea sustentada en fuerzas de cohesión entre ellas
medidas por puentes de hidrógeno a nivel del grupo fosfatidil de la molécula de
fosfolípido (102).
4.3. DEFENSA ANTE LA PRESENCIA DE FACTORES LESIVOS
INTRALUMINALES.
El mecanismo íntimo por el cual numerosas moléculas desarrollan su
acción lesiva directa sobre la mucosa colónica es distinto según se trate de
fenómenos inflamatorios agudos o bien de inflamación crónica.
Durante el desarrollo de fenómenos inflamatorios crónicos la activación del
sistema inmunitario juega un papel primordial en la patogénesis de la colitis (103).
Contrariamente en el desencadenamiento y desarrollo de la colitis aguda la
participación de fenómenos de inmunidad no se da (104).
La interacción exclusivamente química entre la molécula del tóxico y la del
fosfolípido (105) que conlleva una anulación en sus propiedades de superficie, el
impedimento a la secreción del surfactante por las células del epitelio mucoso sin
relación con la destrucción celular y derivado de todo esto el aumento a la
permeabilidad de macromoléculas de diferentes tamaños de características
hidrofílicas son los mecanismos por los cuales los tóxicos que actúan directamente
sobre la superficie mucosa del colon desarrollan su acción.
82
4.4. ABSORCION DE MOLECULAS DESDE LA LUZ.
Aunque la función de absorción de sustancias desde la luz intestinal no es
la principal en el intestino grueso, también existe siendo los electrolitos y el agua
las moléculas principalmente involucradas en esta propiedad.
Si bien algunos de los electrolitos que se absorben lo hacen mediante un
sistema de transporte activo otros lo llevan a cabo a favor de gradientes de
concentración y habitualmente relacionados con una concomitante absorción de
agua.
La disposición de la capa de surfactante sobre la superficie endoluminal del
intestino grueso le confiere a dicha superficie características hidrofóbicas. La
pérdida o el deterioro de dicha monocapa afectará por un lado la absorción de los
iones que está relacionada con la del agua y por otro a la de moléculas que exhiben
propiedades hidrofílicas.
83
OBJETIVOS
84
Los objetivos que nos hemos planteado alcanzar con el desarrollo de la
presente investigación se han agrupado en cinco puntos.
• Evidenciar los fenómenos de superficie y concretamente la propiedad de
la hidrofobicidad que se manifiesta en la monocapa de surfactante que tapiza el
moco colónico.
• Analizar la relación entre las características clínicas de los pacientes
(enfermedades asociadas que presentan) y los valores de hidrofobicidad de la
mucosa del colon.
• Estudiar ex vivo el efecto que sobre la hidrofobicidad de la mucosa del
colon produce la exposición ante agentes citoprotectores y otros lesivos.
• Analizar la hidrofobicidad en la superficie mucosa del colon a lo largo
de los distintos segmentos en los que anatómicamente se divide.
• Analizar la composición fosfolipídica del surfactante colónico y su
relación con las propiedades de superficie que presenta la mucosa.
85
Como consecuencia de todo esto plantearemos posibles implicaciones de
estos fenómenos y sus bases fisicoquímicas en entidades clínicas concretas tanto a
nivel de su etiopatogenia como de su tratamiento.
86
MATERIAL
87
I. MUESTRAS DE COLON.
Las muestras de mucosa colónica utilizadas en el presente trabajo
provienen todas de piezas operatorias procedentes de pacientes intervenidos en la
Unidad de Cirugía Colorectal del Servicio de Cirugía General y del Aparato
Digestivo del Hospital Vall d’Hebron de Barcelona.
La indicación de la intervención quirúrgica como tratamiento de una
determinada patología así como la técnica quirúrgica empleada en cada caso se
han establecido de acuerdo con los protocolos del centro y en último caso
dependen de la decisión del cirujano o equipo quirúrgico responsable del paciente.
1. CRITERIOS DE INCLUSION.
- Muestras procedentes de pacientes intervenidos quirúrgicamente para
serles extirpado parte o todo el colon y/o el recto de forma electiva.
- Muestras procedentes de dichas piezas operatorias de pacientes cuya
patología no afecta de forma difusa a la mucosa colónica
88
2. CRITERIOS DE EXCLUSION.
- Pacientes intervenidos de forma urgente.
- Pacientes que no han recibido limpieza colónica preoperatoria o la que
recibieron fue incompleta o distinta a la protocolizada.
- Pacientes con enfermedades que afectan difusamente a la mucosa del
colon y recto principalmente enfermedad inflamatoria intestinal
(enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), colitis isquémica, infecciosa
o de cualquier otra etiología y enfermedades sistémicas (vasculitis y
otras).
- Pacientes que han recibido tratamiento previamente con radioterapia
sobre la pelvis cuando se trata de muestras obtenidas del recto.
II. MATERIAL DE LABORATORIO.
1. INSTRUMENTAL.
•
Papel secante
•
Pinzas de disección
•
Tijeras de Castroviejo
•
Batea metálica
•
Portaobjetos de vidrio.
•
Viales de vidrio.
•
Rejilla metálica portaviales
•
Baño(Thermomix BM. B. Braun Biotech International).
•
Congelador (AEG. SANTO).
•
Matraz de decantación
89
•
Tubos de Eppendorf
•
Papel de filtro Whatman nº 1 (Whatman International.
Maidstone, England).
•
Micropipetas de 100, 200, 1000 y 5000 µL.
•
Puntas de pipeta
•
Centrifugadoras (GERHARDT MAG-H y
HEIDOLPH REAX 2000).
•
Balanza de precisión (OHAUS GALAXY TM 110).
•
Tiras reactivas para medida del pH.
2. REACTIVOS.
•
Nitrógeno líquido (Merck)
•
Metanol absoluto (Merck)
•
Cloroformo absoluto (Merck)
•
Cloruro potásico 0.1 Molar (Merck)
•
Acido sulfúrico 10 Normal (Merck)
•
Peróxido de hidrógeno al 30% (Merck)
•
Urea al 5% (Merck)
•
Molibdato de amonio al 5% (Merck)
•
Reductor de Fiske-Subbarow (Merck)
•
Carbógeno (Oxígeno y dióxido de carbono en mezcla
comprimida).
•
Mouse Epidermal Grow Factor (Sigma, St. Louis, MO, USA)
•
Prostaglandina E2 (ácido 5Z,11α, 13E,15S-11,15-dihidroxi-9oxoprosta-5,13-dienoico). (Sigma, St. Louis, MO, USA)
•
Indometacina (ácido 1-p-clorobenzoil-5-metoxi-2-metilindol-3acético). (Sigma, St. Louis, MO, USA)
90
•
Diclofenaco
(ácido
2-2,6-diclorofenilamino-bencenoacético)
(Sigma, St. Louis, MO, USA).
3. APARATOS DE LECTURA.
•
Goniómetro (Model 100-00 NRL Contact Angle Goniometer. RaméHart, Mountain Lakes, NJ, USA).
91
METODO
92
El método utilizado en el presente trabajo se puede dividir en tres fases
consecutivas en el tiempo y dependientes una de otra. Previamente y dentro del
periodo preoperatorio existe una selección del paciente siguiendo los criterios de
inclusión que se han definido en el material.
Una primera fase es aquella que comprende la preparación preoperatoria
del paciente que va a ser sometido a la intervención quirúrgica a través de la cual
obtendremos los especímenes (muestras de mucosa colónica) que servirán como
sustrato de nuestros experimentos.
A continuación se desarrolla la fase en la cual se obtiene dicho especimen,
en el área quirúrgica, y tras la resección del colon.
Por último, el periodo que se desarrolla en el laboratorio que a su vez tiene
dos etapas claramente diferenciadas; la que se refiere a la determinación de lípidos
y fosfolípidos que se lleva a cabo de una manera diferida en muestras de tejido
congelado y la que incumbe a la determinación de las propiedades de superficie de
la mucosa colónica (hidrofobicidad) que esta es necesario realizarla en tejido en
fresco y por consiguiente inmediatamente a la llegada de la muestra al laboratorio.
En la siguiente pagina esquematizamos los pasos que seguimos en el
método del presente trabajo.
93
CRITERIOS DE INCLUSION Y EXCLUSION.
SELECCIÓN DE PACIENTES
INTERVENCION QUIRURGICA.
OBTENCION DE LA MUESTRA
PROCESO EN EL LABORATORIO
LECTURA EN FRESCO
HIDROFOBICIDAD
CONGELACION
DETERMINACION
DE LIPIDOS Y FOSFOLIPIDOS
ELABORACION DE RESULTADOS.
ESTADISTICA
94
I. TIEMPO PREOPERATORIO.
Los pacientes sometidos a cirugía colorectal electiva y siguiendo el
protocolo vigente en nuestro hospital requieren una preparación preoperatoria, la
cual expondremos seguidamente.
Anteriormente al ingreso se recomienda al paciente y por un periodo no
inferior a 48-72 horas hacer una ingesta exenta de alimentos ricos en residuos con
el fin de disminuir el contenido fecal colónico lo máximo posible.
El día previo a la intervención con el paciente ingresado y en dieta
absoluta, comenzando entre las 8:00 y las 9.00 horas se administra vía oral al
paciente entre 3 y 4 litros de solución evacuante Bohm reconstituida, consumida
a razón de 250 ml cada 15 minutos, hasta que la totalidad del volumen haya sido
ingerido o el afluente rectal es claro y exento de restos fecales. La composición
química de dicha solución es la siguiente. (Tabla 4)
Tabla 4: Composición química de la solución evacuante.
COMPUESTO QUIMICO
g / 250 ml DE SOLUCIÓN
Polietilenglicol
15 gramos
Cloruro sódico
0.365 gramos
Cloruro potásico
0.186 gramos
Sulfato sódico
1.4 gramos
Bicarbonato sódico
0.42 gramos
Bifosfonato sódico
0.12 gramos
Cuando cesan las deposiciones líquidas perfundimos un suero glucosado al
5% a ritmo de 1000cc cada 24 horas.
Una hora después de haber finalizado la preparación intestinal mecánica se
administra el antibiótico oral: neomicina 1 g. y eritromicina base 1 g. tres dosis, la
segunda 2 horas después de la primera y la tercera 9 horas después de la segunda.
95
Estos antibióticos tienen función descontaminante intraluminal siendo
irreabsorbibles.
El mismo día de la intervención, a las 7:00 horas, se administra al paciente
20 mg por vía subcutánea de enoxaparina sódica como medida profiláctica de la
trombosis venosa.
Durante la inducción anestésica y como profilaxis antibiótica se administra
2 g endovenosos de cefoxitina o bien 600 mg de clindamicina junto a 80 mg de
gentamicina, así mismo endovenosos, en caso de alergia a los β-lactámicos.
II. TIEMPO INTRAOPERATORIO.
Según la localización de la patología por la cual se interviene el paciente se
procede a un tipo u otro de resección de colon.
El tipo de resección que se realiza se lleva a cabo según el criterio del
cirujano responsable del paciente y esta viene definida por la situación en los
diferentes segmentos del colon de la patología.
En general se agrupan en dos grandes bloques los tipos de resección que se
aplican en la cirugía del colon dependiendo del segmento colónico subsidiario de
ser resecado:
•Resecciones típicas. (Tabla 5)
•Resecciones más o menos amplias que las anteriores.
Una vez ligado el pedículo vascular no debe pasar un tiempo mayor a
treinta minutos hasta el inicio del procesamiento de la pieza (tiempo de isquemia).
Durante este periodo de tiempo la pieza se conserva totalmente sumergida
en suero fisiológico (77 mM de Cl y 77 mM de Na-0.9 g de cloruro sódico- en 500
ml de solución) y en la nevera a 4 ºC.
96
Se seccionan dos o tres rodetes de 3 cm de ancho cada uno de los
segmentos de colon que estudiaremos trasladándose inmediatamente y sumergidos
así mismo en suero fisiológico al laboratorio.
Tabla 5: Resecciones típicas de colon.
TIPO DE RESECCION COLONICA
HEMICOLECTOMIA DERECHA
HEMICOLECTOMIA IZQUIERDA
LOCALIZACION DE LA MUESTRA
-CIEGO
-COLON ASCENDENTE
-COLON TANSVERSO PROXIMAL
-COLON TRANSVERSO DISTAL
-COLON DESCENDENTE
-SIGMA
SIGMOIDECTOMIA
-SIGMA
RESECCION ANTERIOR DE RECTO
-SIGMA
-RECTO
AMPUTACION
ABDOMINOPERINEAL
-SIGMA
-RECTO
III. TIEMPO DE LABORATORIO.
1. PREPARACION DE LA MUESTRA.
Una vez en el laboratorio se colocan las piezas, cuya mucosa
será
procesada, sumergidas en solución fisiológica modificada de Krebs-Ringer-Tris
con un pH de 7.4 y a una temperatura de 4ºC. (Tabla 6)
97
Tabla 6: Solución fisiológica modificada. Composición.
COMPONENTE
CONCENTRACION (mM/L)
GLUCOSA
11.1
CLORURO SODICO (NaCl)
118.3
CLORURO POTASICO (KCl)
4.7
SULFATO MAGNESICO (MgSO4)
1.2
FOSFATO POTASICO (KH2PO4)
1.2
CLORURO CALCICO (CaCl2)
2.5
BICARBONATO SODICO (NaHCO3)
2.5
De cada rodete de colon se diseca la mucosa del resto de la pared colónica
seccionándose longitudinalmente dicha mucosa en muestras de 2 x 3 cm que se
pesarán.
El número de muestras necesarias de cada segmento de colon es como
mínimo de 9.
Una de estas muestras la reservamos y congelamos en nitrógeno líquido a
–80ºC para la determinación de lípidos y en las ocho restantes medimos la parte
correspondiente a la hidrofobicidad.
2. DETERMINACION DE LIPIDOS Y FOSFOLIPIDOS.
Tras el proceso de disección de la mucosa colónica, una de las nueve
secciones en las que subdividimos cada pieza de colon se pesa y congela en
nitrógeno líquido a –80ºC reservándose para ser utilizada en esta determinación.
Todas estas secciones de mucosa se homogeneizan en suero fisiológico.
98
El homogeneizado se redisuelve en metanol-cloroformo (1:1) para la
extracción de la fase lipídica, según el método de Folch (106).
Posteriormente y tras evaporación en atmósfera de nitrógeno, las muestras
se resuspenden en benzeno y el contenido de fosfolípidos se mide a través de la
determinación del fósforo inorgánico según el método descrito por Ames (107).
2.1. EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS.
Para n ml de homogeneizado en suero fisiológico de tejido añadimos 5n ml
de metanol absoluto y lo mantenemos en agitación durante 30 minutos a
temperatura ambiente.
Seguidamente añadimos 5n ml de cloroformo agitando vigorosamente
durante 15 minutos más.
Posteriormente lo filtramos en Whatman nº1 y resuspendemos de nuevo el
residuo en metanol cloroformo.
Finalmente evaporamos el extracto con atmósfera de Nitrógeno a sequedad
obteniendo los lípidos presentes en la muestra la cual denominaremos extracto A.
2.2. EXTRACCIÓN DE FOSFOLÍPIDOS.
Resuspendemos el extracto A en 5 ml de cloroformo y lo vertimos en un
matraz de decantación.
Lavamos el tubo que contenía dicho extracto A con 3 ml de metanol y lo
añadimos al matraz.
Volvemos a lavar dicho tubo con 2 ml de cloruro potásico (KCl) 0.1 Molar
y lo añadimos al matraz. Agitamos el matraz, abriéndolo para sacar el aire y lo
ponemos en posición normal. Con esto conseguimos que quede la fase acuosa
arriba y la fase orgánica debajo.
99
Decantamos la fase acuosa y la evaporamos en atmósfera de nitrógeno a
sequedad obteniendo lo que denominaremos como extracto B.
En la fase acuosa se puede determinar el fósforo inorgánico
correspondiente a otras moléculas que no sean proteínas ni fosfolípido
2.3. DETERMINACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS.
Resuspendemos el extracto B en 1 ml de benceno.
Ponemos 0.5 ml de dicha suspensión en un vial de vidrio y lo evaporamos
en atmósfera de nitrógeno a sequedad.
Añadimos 0.5 ml de ácido sulfúrico 10 Normal (para preparar dicha
concentración de sulfúrico se añaden poco a poco 28 ml de ácido sulfúrico
concentrado a una probeta puesta en hielo y que contenga 72 ml de agua destilada,
dejando lo resultante en hielo hasta que se enfríe).
Colocamos la muestra en estufa (200ºC) durante 3 horas. Dicha muestra se
calcina con lo que el líquido adquiere color negro.
Añadimos ahora una gota de peróxido de hidrógeno al 30% con lo que el
líquido quedará blanco o casi blanco.
Recolocamos la muestra en la estufa a idéntica temperatura durante 90
minutos más, repitiendo la operación si la muestra no queda transparente.
Sacamos la muestra y le añadimos una gota de urea al 5%.
Por último y para determinar el fósforo inorgánico (108) tratamos la muestra
añadiendo 4.4 ml de agua destilada, 0.2 ml de molibdato de amonio al 5% y por
último, ya que es lo que inicia la reacción, 0.2 ml de reductor de Fiske-Subbarow
0.158 g/ml.
Se coloca el vial en un baño a 100ºC durante 7 minutos. La muestra toma
un color azul.
100
Mediante la siguiente fórmula determinamos la cantidad de los distintos
fosfolípidos presentes en lo aislado:
µg de fosfolípido = µmoles de fósforo inorgánico x peso molecular del fosfolípido
3. DETERMINACION DE LA HIDROFOBICIDAD.
3.1. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA.
Cada uno de los ocho segmentos de mucosa colónica destinados al estudio
de las propiedades de superficie es procesado de diferente manera:
1- Sumergido durante 60 minutos en solución fisiológica (segmento no
procesado).
2- Sumergido durante 60 minutos en 3 ml. de solución fisiológica
inyectando durante este tiempo carbógeno al medio y calentado en estufa a 37ºC.
3- Sumergido durante 60 minutos en un volumen total de 3 ml. de solución
fisiológica y EGF inyectando durante este tiempo carbógeno al medio y calentado
en estufa a 37ºC.
4- Sumergido durante 60 minutos en un volumen total de 3 ml. de solución
fisiológica y PGE2 inyectando durante este tiempo carbógeno al
medio y
calentado en estufa a 37ºC.
5- Sumergido durante 60 minutos en un volumen total de 3 ml. de solución
fisiológica y diclofenaco (150 µL) inyectando durante este tiempo carbógeno al
medio y calentado en estufa a 37ºC.
6- Sumergido durante 60 minutos en un volumen total de 3 ml. de solución
fisiológica y diclofenaco (300 µL) inyectando durante este tiempo carbógeno al
medio y calentado en estufa a 37ºC.
101
7- Sumergido durante 60 minutos en un volumen total de 3 ml. de solución
fisiológica e indometacina (150 µL), inyectando durante este tiempo carbógeno al
medio y calentado en estufa a 37ºC.
8- Sumergido durante 60 minutos en un volumen total de 3 ml. de solución
fisiológica e indometacina (300 µL ), inyectando durante este tiempo carbógeno al
medio y calentado en estufa a 37ºC.
Previamente a la incubación medimos el pH de cada uno de los diferentes
medios.
3.2. DILUCIONES.
La preparación previa de las distintas sustancias con las cuales se procesa
la mucosa de colon requiere la dilución de las mismas en distintos disolventes
según las características fisicoqímicas de cada una de ellas.
EGF: en solución fisiológica.
PGE2: el vial de 1 mg se diluye en 20 ml de etanol absoluto.
DICLOFENACO: 10 mg de diclofenaco en 10 ml de agua destilada
agitando posteriormente
INDOMETACINA: 10mg de indometacina en 10 ml de bicarbonato sódico
al 5% en peso/volumen (5mg de HCO3Na en 100ml de agua destilada) agitándolo
en caliente hasta que la solución adquiera color amarillo.
Estas diluciones en lo que se refiere al EGF y a la PGE2 se llevan a cabo y
se congelan en volúmenes adecuados contenidos en viales de Eppendorf para su
utilización en el momento que se disponga de muestra de colon.
En cuanto a la dilución del diclofenaco y de la indometacina esta tiene que
llevarse a cabo en el momento de ser utilizada ya que sus propiedades no se
mantienen con la congelación.
102
3.3. INCUBACIÓN DE LA MUESTRA.
Se sacan del congelador los Eppendorf necesarios (según tamaño de la
pieza) de PGE2 o de EGF para que se vayan descongelando a temperatura
ambiente.
Los tubos de EGF contienen 100 µl de solución fisiológica, con una
concentración de 60µg de EGF/ml, de forma que hay 6 µg de EGF por tubo.
Los tubos de PGE2 tienen 1 ml de solución fisiológica, con una
concentración de 9 µg/ml.
Colocamos agua destilada en el baño donde incubaremos las muestras de
mucosa de forma que el nivel del agua llegue a la mitad de los viales, sin que estos
se muevan.
Ponemos el termostato a 37ºC y comprobamos que se alcanza exactamente
esta temperatura.
Utilizamos una gradilla del tamaño ajustado al baño y viales de vidrio (20
ml de volumen) suficientes.
Preparamos la solución fisiológica y la dejaremos en la mesa junto a
micropipetas de 5000, 1000 y 100 (o 200) µl, las puntas de pipeta necesarias, el
material quirúrgico de disección y el papel de filtro.
El lavado de la pieza de colon se hace en un vaso lleno de solución
fisiológica enterrado hasta la mitad en una bandeja con hielo agitando dicha pieza
en la solución ayudándonos con unas pinzas.
A continuación, ponemos la pieza sobre papel de filtro humedecido con
solución fisiológica fría y disecamos la mucosa del resto de las capas de la pared
del colon.
Cortamos dicha mucosa en fragmentos de unos 3x2 cm y los colocamos en
otro vaso con solución fisiológica limpia y fría. Reservamos un fragmento para
determinar la hidrofobicidad a tiempo 0 (sin incubar).
103
El volumen de incubación total será de 3 ml (3000 µL). Ponemos 1 pieza
de colon por vial con lo que incubaremos grupos de 7 viales por zona de colon.
(Tabla 7).
Tabla 7: Diluciones en la incubación.
CONTROL
EGF
PGE2
DICLOFENACO
45 g
DICLOFENACO
90 g
INDOMET.
45 g
INDOMET.
90 g
SOLUC.
FISIOL.
3000 µL
2900 µL
2333 µL
EGF
PGE2
DICLOF.
INDOMET.
100µL
667 µL
2850 µL
150 µL
2700 µL
300 µL
2850 µL
150 µL
2700 µL
300 µL
Colocamos los viales en una gradilla, introduciremos en cada vial un
inyector de carbógeno de tal manera que la punta del inyector produzca el
burbujeo del líquido contenido en el vial pero no contacte con la muestra de
mucosa y pondremos dicha gradilla en el baño. Incubamos durante 1 hora.
Una vez transcurrido este tiempo se extraen las piezas de colon de los
viales cuidadosamente con ayuda de unas pinzas y se depositan sobre papel de
filtro humedecido con solución fisiológica, con la cara luminal hacia arriba.
Extendemos la pieza y la colocaremos arrastrándola sujetando los bordes de la
misma con unas pinzas sobre un portaobjetos de cristal. Posteriormente dejamos
secar al aire, a temperatura ambiente y durante el tiempo que sea necesario dichos
fragmentos de mucosa colónica.
104
3.4. MEDIDA DE LA HIDROFOBICIDAD.
Una vez que hemos comprobado que la superficie de la mucosa está
completamente seca se coloca el porta que la contiene sobre la plataforma del
goniómetro.
Este goniómetro-microscopio (Figura 12) consta básicamente de un
cuentagotas, una fuente de luz, un sistema de lentes, una regla con forma
semicircular graduada con valores de ángulo de contacto y un sistema de
cremalleras y ruedas que permite mediante movimientos de rotación y de
aproximación proyectar sobre la regla semicircular las líneas tangentes que nos
determina el valor de ángulo de contacto correspondiente a la gota formada sobre
la muestra de tejido que se está estudiando.
Figura 12: Goniómetro.
105
A continuación, previo desecho de la primera y mediante el cuentagotas
que está fijo en el aparato depositamos separadas entre ellas 5 gotas de suero
salino de 5 µL cada una sobre el lado luminal de la mucosa.
Ahora ya se puede medir el ángulo que forma la gota en la interfase airelíquido-sólido que es un índice de la hidrofobicidad del tejido, de tal manera que
cuanto mayor es el ángulo de contacto mayor es la hidrofobicidad y menor la
permeabilidad de la mucosa a sustancias hidrofílicas y iones.
IV. RECOGIDA DE DATOS.
Los parámetros evaluados se recogieron mediante una base de datos
diseñada con el sistema MICROSOFT ACCESS 97.
En la siguiente página exponemos los parámetros objeto del presente
estudio agrupados en la columna de la izquierda y subdivididos en la columna de
la derecha (Tabla 8).
106
Tabla 8: Parámetros de la base de datos.
FILIACION
DATOS ANTROPOMETRICOS
ENFERMEDADES ASOCIADAS
PATOLOGIA PRIMARIA
LOCALIZACION DE LA PATOLOGIA
PRIMARIA
Nombre y apellidos
Número de historia clínica
Fecha de nacimiento
Sexo
Peso
Talla
Diabetes Mellitus
Hipertensión arterial
Broncopatía
Cardiopatía
Dislipemia
Enfermedad diverticular del colon
Tumor benigno de colon
Poliposis colónica
Tumor maligno de colon
Tumor benigno de intestino delgado
Ciego
Colon ascendente
Colon transverso proximal
Colon transverso distal
Colon descendente
Sigma
Recto
NUMERO DE MUESTRAS OBTENIDAS
LOCALIZACION DE LAS MUESTRAS
OBTENIDAS
PESO DE LA MUESTRA
VALOR DE ANGULO DE CONTACTO
Ciego
Colon ascendente
Colon transverso proximal
Colon transverso distal
Colon descendente
Sigma
Recto
Solución fisiológica
EGF
PGE2
Diclofenaco (150 µL)
Diclofenaco (300 µL)
Indometacina (150 µL)
Indometacina (300 µL)
Solución fisiológica
EGF
PGE2
Diclofenaco (150 µL)
Diclofenaco (300 µL)
Indometacina (150 µL)
Indometacina (300 µL)
107
V. ANALISIS ESTADISTICO DE LOS DATOS.
El estudio estadístico ha sido realizado mediante el programa informático
GRAPHPAD INSTAT 3.0. (San Diego, California, EUA).
Como primer paso en el desarrollo estadístico de este trabajo se valora
mediante el test de Kolmogorov y Smirnov (109) si las poblaciones estudiadas
siguen una distribución gaussiana (normal).
Cuando los grupos no siguen la distribución normal las variables
se
describen mediante los valores de mediana, valor máximo y valor mínimo. La
comparación entre estos grupos se realizó mediante los siguientes tests no
paramétricos:
-La U de Mann-Whitney para comparar dos muestras no relacionadas.
-El análisis de la varianza de Kruskal-Wallis para comparar tres o más
muestras no relacionadas aplicando el post-test de las múltiples
comparaciones de Dunn.
-El coeficiente de correlación de Spearman.
Cuando la distribución poblacional es la normal, la descripción de las
variables la hacemos mediante la media y el error estándar (típico) de la media
(SEM). Entonces los tests estadísticos aplicados son:
-La t de Student con la corrección de Welch para dos muestras.
-El análisis de la varianza (ANOVA) para comparar tres o más muestras
con el post-test de las comparaciones múltiples de Tukey-Kramer.
El nivel de significación estadística aceptado ha sido del 5% (p<0.05)
108
RESULTADOS
109
La exposición de los resultados obtenidos en el presente trabajo se ha
dividido en tres apartados para facilitar su comprensión:
1. Características epidemiológicas de la población.
2. Resultados relacionados con las propiedades de superficie de la
mucosa colónica.
3. Resultados relacionados con la naturaleza del surfactante
colónico.
I. CARACTERISTICAS EPIDEMIOLOGICAS DE LA
POBLACION.
Las muestras de mucosa colónica objeto de este estudio se obtuvieron de
74 pacientes. La edad media de este grupo fue de 66 años con un rango entre 17
años y 85 años. La distribución por sexos de esta población fue de 40 varones
(54.054%) y 34 mujeres (45.945%). (Tabla 9)
110
Tabla 9: Características demográficas de la población.
Población del estudio (n)
74
Distribución por edades:
Edad media:
66 años
Rango de edad:
17-85 años
Distribución por sexos:
Varones:
40 (54.054%)
Mujeres:
34 (45.945%)
De los 74 pacientes que componen la población objeto del presente trabajo,
46 (62.162 %) no referían patología asociada y 28 (37.837 %)
presentaban
antecedentes patológicos reseñables. En estos 28 enfermos se detectaron cuatro
casos de patologías asociadas coincidentes, lo que supone un total de 32 casos de
patología asociada.
Las patologías asociadas halladas en la población en estudio se detallan en
la siguiente tabla. (Tabla 10)
Tabla 10: Patologías asociadas.
PATOLOGIA
NUMERO DE PACIENTES
DISLIPEMIA
3
DIABETES MELLITUS
5
BRONCOPATIA CRONICA
7
HIPERTENSION ARTERIAL
8
CARDIOPATIA
9
111
Los pacientes en los cuales coincidieron dos enfermedades asociadas
fueron cuatro y lo hicieron tal y como se reseña en el siguiente cuadro. (Tabla 11)
Tabla 11: Asociación de antecedentes patológicos.
HTA Y DIABETES MELITUS
2 PACIENTES
HTA Y CARDIOPATIA
1 PACIENTE
CARDIOPATIA Y DISLIPEMIA
1 PACIENTE
La distribución porcentual de la población con patologías asociadas se
refleja con respecto al total de la población en estudio mediante un diagrama
circular. (Figura 13)
Figura 13: Patología asociada.
38%
SIN PATOLOGIA ASOCIADA
(46 PACIENTES)
62%
CON PATOLOGIA ASOCIADA
(28 PACIENTES)
La distribución en tanto por ciento dentro del grupo de población con
antecedentes patológicos viene representada en el siguiente gráfico. (Figura 14)
112
Figura 14: Antecedentes patológicos.
25%
DISLIPEMIA
22%
DIABETES MELLITUS
BRONCOPATIA CRONICA
28%
16%
HIPERTENSION ARTERIAL
CARDIOPATIA
9%
La patología por la cual se intervinieron estos 74 pacientes quedó
distribuida de la siguiente manera. (Tabla 12)
Tabla 12: Patología actual.
PATOLOGIA
NUMERO DE
PACIENTES
TUMOR MALIGNO DE COLON:
ADENOCARCINOMA
63
PSEUDOMIXOMA PERITONEAL
1
ENFERMEDAD DIVERTICULAR
8
POLIPOSIS DE COLON
1
TUMOR BENIGNO DE ILEON
1
La distribución en porcentajes de dicha patología viene reflejada en el
siguiente diagrama circular. (Figura 15)
113
Figura 15: Patología actual.
87%
Neoplasia
Enfermedad diverticular
Poliposis colónica
Tum. Benigno ileon
1%1%
11%
Del conjunto de estos 74 pacientes se obtuvieron 134 muestras de mucosa
colónica.
La distribución por segmentos colónicos de estas muestras quedó de la
siguiente manera. (Tabla 13)
Tabla 13: Distribución de las muestras en los segmentos colónicos.
SEGMENTO DE COLON
NUMERO DE
MUESTRAS
CIEGO
15
COLON ASCENDENTE
15
COLON TRANSVERSO PROXIMAL
15
COLON TRANSVERSO DISTAL
15
COLON DESCENDENTE
17
SIGMA
37
RECTO
20
114
La distribución en porcentajes de las muestras en cuanto a su localización
viene reflejada en el siguiente diagrama circular. (Figura 16)
Figura 16: Distribución de las muestras de mucosa en los diferentes segmentos
del colon.
13%
CIEGO
28%
11%
COL ASC.
COL. TRV. PROX
COL. TRV. DIST
COL. DES.
11%
SIGMA
11%
15%
11%
RECTO
II. PROPIEDADES DE SUPERFICIE EN LA MUCOSA DEL
COLON.
1. VALIDACION DEL TIEMPO DE ISQUEMIA Y DE LA
TEMPERATURA DE CONSERVACION DE LAS MUESTRAS
DE MUCOSA COLONICA.
Como paso previo al estudio de la propiedad de la hidrofobicidad en la
mucosa colónica se valido en una muestra de 20 especimenes el efecto que sobre
los valores de ángulo de contacto tienen:
-El tiempo de isquemia, medido en minutos desde la ligadura del pedículo
vascular.
-La temperatura de conservación de dicho especimen, diferenciando entre
ambiente (22ºC) y frío (4ºC).
115
Los resultados medios obtenidos expresados en porcentajes del valor de
hidrofobicidad a tiempo 0 de isquemia vienen reflejados de la siguiente forma.
(Tabla 14)
Tabla 14: Efecto de la isquemia y la temperatura sobre la mucosa colónica.
TIEMPO DE ISQUEMIA
AMBIENTE (22ºC)
FRIO (4ºC)
30
90%
99.5%
60
85%
90%
120
80%
83%
150
71%
80%
180
64%
72%
(minutos)
Cuando representamos en una gráfica los valores obtenidos durante la
validación del efecto de la temperatura y el tiempo de isquemia en las muestras de
mucosa colónica estudiadas vemos que con un tiempo de isquemia máximo de 30
minutos y en unas condiciones de conservación de la muestra en frío los valores de
hidrofobicidad medidos como valor de ángulo de contacto se aproximan a los que
se obtienen de muestras que no han sufrido isquemia y no han requerido ningún
tipo de conservación. (Figura 17)
116
PORCENTAJE DE LA
HIDROFOBICIDAD A TIEMPO 0
Figura 17: Validación del tiempo de isquemia y la temperatura de conservación
de las muestras.
120
100
80
AMBIENTE (22ºC)
60
FRIO (4ºC)
40
20
0
30
60
120
150
180
TIEMPO DE ISQUEMIA (minutos)
2. LA HIDROFOBICIDAD EN LA SUPERFICIE MUCOSA
COLÓNICA.
De la población objeto de nuestro estudio formada por 74 pacientes se
obtuvo en total 134 muestras de mucosa colónica. En cada muestra se midieron
cinco valores de hidrofobicidad.
74
Pacientes
134
5
670
Muestras de
Medidas por
Valores de
mucosa colónica
muestra
hidrofobicidad
En este primer grupo de 134 muestras obtenemos los valores de ángulo de
contacto en tejido sin procesar (el cual hemos denominado en el método como
grupo “al aire”), siendo este el grupo control.
117
Su distribución poblacional es la siguiente. (Tabla 15)
Tabla 15: Hidrofobicidad en la mucosa colónica. Grupo control.
N
MEDIA
DESVIACION ESTANDAR
ERROR ESTANDAR DE LA MEDIA
MINIMO
MAXIMO
MEDIANA
LIMITE INFERIOR DE CONFIANZA
PARA UN 95%
LIMITE SUPERIOR DE
CONFIANZA PARA UN 95%
TIPO DE DISTRIBUCION
POBLACIONAL
CONTROL
134
39.5223
0.6456
0.0557
38
41
39.5
39.413
39.632
NORMAL
3. HIDROFOBICIDAD DE LA SUPERFICIE MUCOSA DEL
COLON COMO PROPIEDAD PRESENTE Y MODIFICABLE
“ EX VIVO”.
Comparamos los valores de hidrofobicidad, como valores de ángulo de
contacto, entre muestras de mucosa de colon sin incubar (grupo “control”) y
muestras incubadas en un medio que solo contiene solución fisiológica (grupo
“solución fisiológica”). (Tabla 16).
118
Tabla 16: Hidrofobicidad en la mucosa colónica. Grupo solución fisiológica.
CONTROL
SOLUCION
FISIOLOGICA
N
134
134
MEDIA
39.5223
42.291
DESVIACION ESTANDAR
0.6456
0.5596
ERROR ESTANDAR DE LA MEDIA
0.0557
0.0483
MINIMO
38
41
MAXIMO
41
44
MEDIANA
39.5
42
39.413
42.196
39.632
42.386
9062.5
26984
LIMITE INFERIOR DE CONFIANZA
PARA UN 95%
LIMITE SUPERIOR DE CONFIANZA
PARA UN 95%
SUMA DE RANGOS
Los estadísticos aplicados y los resultados obtenidos son (Tabla 17)
Tabla 17: Control / Solución fisiológica. Significación estadística.
U de MANN-WHITNEY= 17.5
U’= 17939
P 0.0001
119
4. INFLUENCIA DE LA PATOLOGIA ASOCIADA EN LA
HIDROFOBICIDAD DE LA MUCOSA DEL COLON.
Del total de las 134 muestras de mucosa colónica obtenidas de los 74
pacientes objeto del presente trabajo, 47 pertenecen a pacientes con patología
asociada y 87 a pacientes sin patología acompañante.
La distribución por patologías de estas 47 muestras quedan divididas en
cinco grupos correspondientes a los cinco antecedentes patológicos detectados en
este grupo de población. (Tabla 18)
Tabla 18: Número de muestras en cada patología asociada.
PATOLOGIA ASOCIADA
NUMERO DE
MUESTRAS
DISLIPEMIA
5
DIABETES MELLITUS
7
HIPERTENSION ARTERIAL
10
BRONCOPATIA CRONICA
12
CARDIOPATIA
13
TOTAL
47
Comparamos los resultados de hidrofobicidad obtenidos en las 47 muestras
de pacientes en los cuales se asocia alguna enfermedad como antecedente
patológico con los obtenidos de las 87 muestras de los pacientes que no refieren
tener antecedentes patológicos en su historia clínica. (Tabla 19).
120
Tabla 19: Asociación de patología.
Número de muestras (N)
Media
Desviación estándar(SD)
Mediana
Mínimo
Máximo
Error estándar de la media
(SEM)
Límite inferior de confianza
para un 95%
Límite superior de confianza
para un 95%
PATOLOGIA
ASOCIADA
47
39.340
0.6351
39
38
41
SIN PATOLOGIA
ASOCIADA
87
39.643
0.6283
40
38
41
0.092
0.067
39.154
39.510
39.527
39.778
La distribución estadística que siguen estos dos grupos es la normal en el
caso del que no asocia antecedentes patológicos (p>0.1 para un KS de 0.363)
mientras que el primer grupo no la sigue (p< 0.0001 para un KS de 0.1114).
Ante esto se han aplicado tests estadísticos no parámetricos cuyos
resultados se exponen en la siguiente tabla. (Tabla 20).
Tabla 20: Resultados estadísticos.
Suma de rangos
U de Mann-Whitney
U’
p
Patología
asociada:
2652.5
Sin patología
asociada:
6392.5
1524.5
2564.5
0.0141
121
En el contexto de las muestras provenientes de pacientes con antecedentes
patológicos buscamos si existen diferencias entre los distintos grupos según las
cinco patologías asociadas que hemos encontrado. (Tabla 21)
Tabla 21: Patologías asociadas.
DIABETES
MELLITUS
HTA
7
10
12
13
5
39
39
39.583
39.3076
40
0.5774
0.4714
0.6686
0.4804
0.7071
39
38
40
39
38
40
39.5
39
41
39
39
40
40
39
41
0.2182
0.1491
0.1930
0.1332
0.3162
38.466
38.663
39.159
39.017
39.122
39.534
39.337
40.008
39.598
40.878
Número de muestras
(N)
Media
Desviación estándar
(SD)
Mediana
Mínimo
Máximo
Error estándar de la
media (SEM)
Límite inferior de
confianza para un
95%
Límite superior de
confianza para un
95%
BRONCOPAT. CARDIOPAT.
DISLIP.
La distribución estadística que siguen estos cinco grupos es la normal.
(Tabla 22)
Tabla 22: Valores de la prueba de Kolmogorov-Smirnov de normalidad.
KS
DIABETES
MELLITUS
0.2627
HTA
BRONCOPATIA
CARDIOPATIA
DISLIPEMIA
0.2125
0.1721
0.1860
0.1791
122
En cada uno de los cinco grupos el valor de la p es mayor de 0.1 lo que
implica la posibilidad de aplicar test normales.
El no haber hallado diferencias significativas entre las desviaciones
estándar de los cinco grupos tras la aplicación del método de Bartlett (estadístico
de Bartlett de 2.139 para una p=0.7102) nos permite la aplicación del análisis de
la varianza (ANOVA) del cual resulta una p=0.0109 (<0.05).
De la aplicación del test de las comparaciones múltiples de Tukey-Kramer
como post-test se deduce que la p<0.05 se dará siempre que el valor de q>4.033.
En la comparación de los cinco grupos dos a dos esta condición se define en dos
de ellos. (Tabla 23)
Tabla 23: Significación estadística dentro del grupo con enfermedades asociadas.
DIABETES MELLITUS / DISLIPEMIA
q=4.231 (p 0.05)
HTA / DISLIPEMIA
q=4.523 (p 0.05)
En el resto de las comparaciones dos a dos los valores de la q son menores
de 4.033 lo que supone una p>0.05.
123
5. HIDROFOBICIDAD DE LA SUPERFICIE MUCOSA DEL
COLON COMO PROPIEDAD MODULABLE “ EX VIVO”.
Compararemos los valores de hidrofobicidad, como valores de ángulo de
contacto, entre las muestras incubadas solo con solución fisiológica y las
incubadas en un medio que contiene dicha solución y sustancias citoprotectoras
(EGF y PGE2) y otras lesivas (antiinflamatorios no esteroideos: diclofenaco e
indometacina).
5.1. CITOPROTECCION.
Los parámetros estadísticos obtenidos de la incubación de las muestras de
mucosa de colon en un medio con citoprotectores han sido los siguientes. (Tabla 24)
Tabla 24: Citoprotección.
N
Media
Desviación estándar (SD)
Error estándar de la media
(SEM)
Límite inferior de confianza
para un 95%
Límite superior de confianza
para un 95%
SOL. FISIOL.
134
42.291
0.5596
EGF
134
49.4477
0.6201
PGE2
134
47.3208
0.6082
0.0483
0.0535
0.0525
42.196
49.343
47.218
42.386
49.553
47.424
La aplicación de la prueba de Kolmogorov-Smirnov en estos tres grupos de
valores nos indica que no siguen una distribución normal lo cual nos lleva al
empleo de pruebas estadísticas no paramétricas para su comparación. (Tabla 25)
124
Tabla 25: Prueba de Kolmogorov-Smirnov.
SOLUCION
EGF
PGE2
0.2729
0.2167
FISIOLOGICA
0.2131
KS
p
0.0001 ( 0.05)
El test estadístico que en este caso corresponde ser aplicado es la ANOVA
para no paramétricos de Kruskal-Wallis (Tabla 26) y el post-test de las
comparaciones múltiples de Dunn. (Tabla 27).
Tabla 26: ANOVA de Kruskal-Wallis.
N
SOLUCION
FISIOLOGICA
EGF
PGE2
ESTADISTICO
KW
MEDIANA MINIMO MAXIMO
SUMA DE
RANGO
RANGOS PROMEDIO
134
42
41
44
9045
67.5
134
134
49
47
48
45
51
49
44773
27186
334.12
202.86
363.92 ( p 0.0001)
Tabla 27: Test de las comparaciones múltiples de DUNN.
SOLUCION FISIOLOGIA
versus EGF
SOLUCION FISIOLOGIA
versus PGE2
EGF
versus PGE2
DIFERENCIA ENTRE
PROMEDIO DE RANGOS
SIGNIFICACION
ESTADISTICA
-266.62
SI (p 0.001)
-135.38
SI (p 0.001)
131.25
SI (p 0.001)
125
La representación gráfica de las diferencias entre los valores de
hidrofobicidad medidos como ángulo de contacto en las muestras sometidas al
efecto de sustancias citoprotectoras la representamos en el siguiente diagrama de
barras. (Figura 18).
Figura 18: Efecto de los citoprotectores sobre la hidrofobicidad.
49
ANGULO DE CONTACTO
50
45
47
42
40
35
30
SOL.FISIOL
EGF
PGE2
5.2. ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDEOS.
Los parámetros estadísticos obtenidos de la incubación de las muestras de
mucosa de colon en un medio con antiinflamatorios no esteroideos han sido los
siguientes. (Tabla 28)
126
Tabla 28: AINE.
N
Media
Desviación estándar (SD)
Error estándar de la media
(SEM)
Límite inferior de confianza
para un 95%
Límite superior de confianza
para un 95%
SOL. FISIOL.
134
42.291
0.5596
DICLOFEN.
134
35.4328
0.6654
INDOMET.
134
35.9701
0.4056
0.0483
0.0574
0.0350
42.196
35.320
35.901
42.386
35.546
36.039
La aplicación de la prueba de Kolmogorov-Smirnov en estos tres grupos de
valores nos indica que no siguen una distribución normal lo cual nos lleva al
empleo de pruebas estadísticas no paramétricas para su comparación. (Tabla 29)
Tabla 29: Prueba de Kolmogorov-Smirnov.
KS
p
SOLUCION
FISIOLOGICA
0.2131
DICLOFENACO INDOMETACINA
0.3468
0.0001 ( 0.05)
0.4622
El test estadístico que en este caso corresponde ser aplicado es la ANOVA
para no paramétricos de Kruskal-Wallis (Tabla 30) y el post-test de las
comparaciones múltiples de Dunn. (Tabla 31).
127
Tabla 30: ANOVA de Kruskal-Wallis.
SOLUCION
FISIOLOGICA
DICLOFENACO
INDOMETACINA
ESTADISTICO
KW
N
Mediana
Mínimo
Máximo
Suma
de
rangos
Rango
promedio
134
42
41
44
44957
335.5
134
134
35
36
33
34
38
37
13526
22521
100.94
168.06
317.94 (p 0.0001)
Tabla 31: Test de las comparaciones múltiples de DUNN.
DIFERENCIA ENTRE
PROMEDIO DE RANGOS
SIGNIFICACION
ESTADISTICA
234.56
SI (p 0.001)
167.44
SI (p 0.001)
-67.127
SI (p 0.001)
SOLUCION FISIOLOGIA
vs. DICLOFENACO
SOLUCION FISIOLOGIA
vs. INDOMETACINA
DICLOFENACO
vs. INDOMETACINA
La representación gráfica de las diferencias entre los valores de
hidrofobicidad medidos como ángulo de contacto en las muestras sometidas al
efecto de antiinflamatorios no esteroideos la representamos en el siguiente
diagrama de barras. (Figura 19).
128
ANGULO DE CONTACTO
Figura 19: Efecto de los AINE sobre la hidrofobicidad.
50
45
42
40
35
36
35
30
SOL. FISIOL
DICLOFEN.
INDOMET.
5.2.1. DOSIS-DEPENDENCIA.
En el presente apartado comparamos el efecto que sobre los valores de
hidrofobicidad tiene la exposición de las muestras de mucosa de colon a diferentes
dosis de antiinflamatorios no esteroideos.
Esta comparación la realizaremos por separado con dos antiinflamatorios
distintos (diclofenaco e indometacina) y las dosis utilizadas serán las mismas en
ambos fármacos siendo una el doble de la otra (45 µg y 90 µg). (Tablas 32 y 34).
En ambos casos utilizamos tests no paramétricos pues las muestras no
siguen una distribución gaussiana. (Tablas 33 y 35).
129
Tabla 32: Diclofenaco; dosis dependencia.
DICLOFENACO
Número de muestras (N)
Media
Desviación estándar(SD)
Mediana
Mínimo
Máximo
Error estándar de la media (SEM)
Límite inferior de confianza para
un 95%
Límite superior de confianza para
un 95%
Dosis (45 g)
134
35.43
0.6654
35
33
38
0.0574
Doble dosis (90 g)
134
35
0.3468
35
34
36
0.0299
35.320
34.941
35.546
35.059
Tabla 33: Resultados estadísticos: diclofenaco-dosis dependencia.
Suma de rangos
Dosis
Doble dosis
21260
14786
U de Mann-Whitney
5741
U’
12215
p
0.0001
130
Tabla 34: Indometacina: dosis dependencia.
INDOMETACINA
Número de muestras (N)
Media
Desviación estándar(SD)
Mediana
Mínimo
Máximo
Error estándar de la media (SEM)
Límite inferior de confianza para
un 95%
Límite superior de confianza para
un 95%
Dosis (45 g)
134
35.97
0.4056
36
34
37
0.0350
Doble dosis (90 g)
134
34.53
0.69
34
32
36
0.0596
35.901
34.420
36.039
34.654
Tabla 35: Resultados estadísticos: indometacina-dosis dependencia.
Suma de rangos
Dosis
Doble dosis
25894
10153
U de Mann-Whitney
1107.5
U’
16849
p
0.0001
131
5.3. CITOPROTECTORES vs AINES.
Por último valoramos si existen diferencias entre sí en el efecto que sobre
la hidrofobicidad de la mucosa del colon tienen las sustancias ya descritas. (Tablas
36 y 37).
Tabla 36: ANOVA de Kruskal-Wallis.
SUMA DE RANGOS
RANGO PROMEDIO
EGF
62729
468.12
PGE2
45142
336.88
DICLOFENACO
13526
100.94
INDOMETACINA
22521
168.06
ESTADISTICO KW
481.68 (p 0.0001)
Tabla 37: Test de las comparaciones múltiples de Dunn.
EGF vs PGE2
EGF vs DICLOFENACO
EGF vs INDOMETACINA
PGE2 vs DICLOFENACO
PGE2 vs INDOMETACINA
DICLOFENACO vs
INDOMETACINA
DIFERENCIA ENTRE
PROMEDIO DE
RANGOS
131.25
367.19
300.06
235.94
168.81
-67.127
SIGNIFICACION
ESTADISTICA
p
p
p
p
p
0.001
0.001
0.001
0.001
0.001
p 0.01
132
La representación gráfica de las diferencias entre los valores de
hidrofobicidad medidos como ángulo de contacto en las muestras sometidas al
efecto de citoprotectores y de antiinflamatorios no esteroideos la representamos en
el siguiente diagrama de barras. (Figura 20).
Figura 20: Citoprotección-AINES.
ANGULO DE CONTACTO
50
49
47
45
40
35
35
36
30
EGF
PGE2
DICLOFENACO
INDOMETACINA
133
6. HIDROFOBICIDAD EN LA SUPERFICIE ENDOLUMINAL
DE LA MUCOSA DEL COLON. ESTUDIO TOPOGRAFICO.
En el presente apartado exponemos los resultados obtenidos de las
comparaciones entre los valores de ángulo de contacto como medida de la
hidrofobicidad en la superficie mucosa del colon a lo largo del trayecto de la
misma.
6.1. DIVISIÓN DE LA SUPERFICIE COLÓNICA EN SIETE
SEGMENTOS Y CUATRO SECTORES.
La longitud completa del intestino grueso se divide en cuatro tramos
largos, los sectores, y a su vez estos en un total de siete tramos más cortos, los
segmentos, de tal manera que exceptuando el más distal en el que coincide cada
sector está formado por dos segmentos. (Tabla 38)
Tabla 38: Topografía colónica.
SECTOR
Colon derecho
Colon transverso
Colon izquierdo
Recto
SEGMENTO
Ciego
Colon ascendente
Proximal
Distal
Colon descendente
Sigma
Recto
134
Los valores de los parámetros estadísticos hallados en los segmentos
colónicos vienen reflejados en las siguientes tablas. (Tabla 39, 40, 41, 42).
Tabla 39: Colon derecho: parámetros estadísticos.
COLON DERECHO
N
Media
Desviación estándar
Error estándar de la media
Mínimo
Máximo
Mediana
Límite inferior de confianza
para un 95%
Límite superior de confianza
para un 95%
CIEGO
15
39.2666
0.5936
0.1533
38
40
39
COLON ASCENDENTE
15
39.5333
0.5164
0.1333
39
40
40
38.93
39.247
39.59
39.819
Tabla 40: Colon transverso: parámetros estadísticos.
COLON TRANSVERSO
N
Media
Desviación estándar
Error estándar de la media
Mínimo
Máximo
Mediana
Límite inferior de confianza
para un 95%
Límite superior de confianza
para un 95%
PROXIMAL
15
39.2666
0.5936
0.1533
38
40
39
DISTAL
15
39.4666
0.639
0.1652
39
41
39
38.938
39.112
39.595
39.821
135
Tabla 41: Colon izquierdo: parámetros estadísticos.
COLON IZQUIERDO
COLON DESCENDENTE
SIGMA
N
17
37
Media
39.5294
39.7027
Desviación estándar
0.7998
0.7018
Error estándar de la media
0.1940
0.1154
Mínimo
39
38
Máximo
41
41
Mediana
39
40
39.118
39.469
39.941
39.937
Límite inferior de confianza
para un 95%
Límite superior de confianza
para un 95%
Tabla 42: Recto: Parámetros estadísticos.
RECTO
N
20
Media
39.6
Desviación estándar
0.5026
Error estándar de la
muestra
Mínimo
0.1124
39
Máximo
40
Mediana
40
Límite inferior de
confianza para un 95%
límite superior de
confianza para un 95%
39.365
39.835
La representación gráfica de las medias de los valores de ángulo de
contacto como medida de la hidrofobicidad en la superficie mucosa del colon
queda expresado en forma de diagrama de barras. (Figura 21).
136
Figura 21: Representación gráfica de los valores de hidrofobicidad a lo largo del trayecto
colónico.
ANGULO DE CONTACTO
39,53
39,26
CIEGO
39,26
C. ASCEN.
C. TRV. PROX.
39,46
C. TRV. DIST.
39,52
39,7
C. DESCEN. SIGMA
39,6
RECTO
La aplicación de la prueba de Kolmogorov-Smirnov a los siete grupos nos
indica que solo los tres segmentos más proximales siguen la distribución normal
(p>0.05). (Tabla 43).
Tabla 43: Test de la normalidad en los segmentos colónicos.
CIEGO
KS
0.166
COLON
ASCENDT
0.35
p
>0.1
0.0505
C. TRV.
PROXIM.
0.34
C. TRV.
DIST.
0.3671
COLON
DESCENT
0.3930
SIGMA
RECTO
0.3398
0.3869
0.0623
0.0351
0.0105
0.0004
0.0050
137
6.2. COMPARACIÓN ENTRE HIDROFOBICIDADES EN EL
COLON DIVIDIDO EN 7 SEGMENTOS.
El hecho de que todos los segmentos de colon no sigan una distribución
normal nos lleva a utilizar pruebas estadísticas no paramétricas. (Tabla 44).
Tabla 44: ANOVA de Kruskal-Wallis.
SUMA DE RANGOS
RANGO PROMEDIO
CIEGO
814
54.267
COLON ASCENDENTE
1032
68.8
COLON TRANSVERSO PROXIMAL
814
54.267
COLON TRANSVERSO DISTAL
942.5
62.833
COLON DESCENDENTE
1081.5
63.618
SIGMA
2903
78.459
RECTO
1458
72.900
ESTADISTICO KW
8.960 (p=0.1758)
6.3. COMPARACIÓN ENTRE HIDROFOBICIDADES EN EL
COLON DENTRO DE LOS DIFERENTES SECTORES.
En el presente apartado valoraremos la existencia de diferencias entre los
segmentos de colon que forman parte de un mismo sector.
Expresando esto de una forma esquemática se reduciría a dos segmentos
por sector en los tres sectores más proximales.
6.3.1. COLON DERECHO.
La aplicación de la prueba de Kolmogorov-Smirnov que nos indica que
ambas poblaciones se distribuyen según la normalidad nos permite aplicar tests
parámetricos.
138
Aplicamos el t-Test para no pareados con la corrección de Welch. (Tabla 45)
Tabla 45: Resultados estadísticos en el sector colon derecho.
COLON DERECHO
CIEGO/COLON ASCENDENTE
t
1.313 con 27 grados de libertad
p
0.2003
Diferencia de las medias
0.2667
Intervalo de confianza del
95% de las medias
-0.1501/0.6835
6.3.2. COLON TRANSVERSO.
En el presente sector y dado que el segmento distal no sigue la distribución
normal aplicamos tests no paramétricos. (Tabla 46).
Tabla 46: Estadística del sector colon transverso.
COLON TRANSVERSO
PROXIMAL
DISTAL
Sumatorio de rangos
218.00
247.00
U de Mann-Whitney
98.00
U’
127.000
p
0.5668
6.3.3. COLON IZQUIERDO.
Ninguna de las dos muestras (colon descendente y sigma) siguen una
distribución normal con lo que aplicamos test no paramétricos. (Tabla 47)
Tabla 47: Estadística del sector colon izquierdo.
COLON IZQUIERDO
COLON DESCENDENTE
SIGMA
Sumatorio de rangos
405.50
1079.5
U de Mann-Whitney
252.50
U’
376.50
p
0.2476
139
Representamos en forma de diagrama de barras los valores de
hidrofobicidad (valores de la media) a lo largo de la mucosa del colon dividida en
siete segmentos que a su vez agrupamos en cuatro sectores. (Figura 22)
Figura 22: Diagrama de barras; hidrofobicidad por sectores y segmentos.
39,7
ANGULO DE CONTACTO
39,7
39,6
39,6
39,53
39,52
CIEGO
39,46
39,5
C. ASCEN.
C. TRV. PROX.
39,4
C. TRV. DIST.
39,3
39,26
39,26
C. DESCEN.
SIGMA
39,2
RECTO
39,1
39
Colon
derecho
Colon
transverso
Colon
izquierdo
Recto
6.4. COMPARACIÓN ENTRE HIDROFOBICIDADES EN EL
COLON DIVIDIDO EN CUATRO SECTORES.
La aplicación de la prueba de Kolmogorov-Smirnov indica que los cuatro
grupos de valores siguen una distribución poblacional normal lo que nos permite la
aplicación de tests estadísticos paramétrcos. (Tabla 48)
Tabla 48: Prueba de Kolmogorov-Smirnov.
KS
p
COLON
DERECHO
0.1318
COLON
TRANSVERSO
0.1764
>0.1
COLON
IZQUIERDO
0.1011
RECTO
0.1608
140
El test Bartlett nos indica que no existen diferencias significativas entre las
desviaciones estándar de los grupos: estadístico de Bartlett de 4.838 para una
p=1841 (p>0.05).
Ambas condiciones nos permiten aplicar el test del ANOVA y como posttest el de las comparaciones múltiples de Tukey-Kramer. (Tabla 49).
Tabla 49: ANOVA y test de Tukey-Kramer.
ANOVA
TUKEYKRAMER
(p 0.05 si
q 3.684)
p=0.1601
Colon
derecho
Colon
transverso
Colon
derecho
Colon
izquierdo
Colon
derecho
Recto
Colon
transverso
Colon
izquierdo
Colon
transverso
Recto
Colon
izquierdo
Recto
0.2852
2.407
1.530
2.731
1.786
0.4063
q
III. SURFACTANTE COLONICO.
En el presente apartado exponemos la relación existente entre los valores
de hidrofobicidad a lo largo de la mucosa colónica y la cantidad de surfactante
(fosfolípidos) presente en cada segmento del trayecto de colon.
Previamente determinamos la composición de lípidos totales y de estos la
proporción de fosfolípidos.
1. LIPIDOS.
En un homogeneizado de 10 muestras de mucosa de colon por segmento
colónico se extrae la fracción lipídica. (Tabla 50)
141
Tabla 50: Composición lipídica de la mucosa colónica.
Ciego
N
(número de muestras)
10
LIPIDOS
(mg/g de tejido)
74.5
Colon ascendente
10
74.5
Colon transverso proximal
10
74.6
Colon transverso distal
10
74.6
Colon descendente
10
74.7
Sigma
10
74.8
Recto
10
75
SEGMENTO COLONICO
La representación gráfica de la composición lipidica en general a lo largo
de la mucosa colónica dividida en siete segmentos. (Figura 23).
Figura 23: Distribución de los lípidos a lo largo de la superficie del colon.
LIPIDOS (mg/g de tejido)
75,2
75
75
74,8
74,8
74,6
74,7
74,7
74,6
74,5
74,5
74,4
74,2
Ciego
Colon ascendente
Colon transverso proximal
Colon transverso distal
Colon descendente
Sigma
Recto
142
2. FOSFOLIPIDOS.
Del conjunto de lípidos resultantes del homegeneizado de mucosa
extraemos la fase fosfolipídica sustrato químico del surfactante colónico. (Tabla 51)
Tabla 51: Composición fosfolipídica de la mucosa colónica.
Ciego
N (número de
muestras)
10
FOSFOLIPIDOS
( M/g de tejido)
200.3
Colon ascendente
10
203.1
Colon transverso proximal
10
210.4
Colon transverso distal
10
212
Colon descendente
10
217.5
Sigma
10
223.4
Recto
10
226.2
SEGMENTO COLONICO
Representamos gráficamente (en forma de diagrama de barras adosadas)
dicha distribución del surfactante colónico a lo largo de los distintos segmentos
colonicos. (Figura 24)
FOSFOLIPIDOS
(microMoles/g de tejido)
Figura 24: Distribución del surfactante a lo largo de la superficie mucosa del colon.
230
223,4
220
210
210,4
200,3
212
226,2
217,5
203,1
200
190
180
Ciego
Colon ascendente
Colon transverso proximal
Colon transverso distal
Colon descendente
Sigma
Recto
143
3. RELACION ENTRE LIPIDOS Y FOSFOLIPIDOS.
Del conjunto de todos los lípidos extraídos del homogeneizado de las diez
muestras de mucosa de colon en cada segmento del mismo, se ha aislado la
fracción fosfolipídica como sustrato material del denominado surfactante
gastrointestinal. Ambas partes se expresan en unidades de peso relativas (por
gramo de tejido), siendo en gramos los lípidos y en micromoles los fosfolípidos.
La prueba estadística que aplicamos en este caso es la prueba de
correlación. (Tabla 52)
Tabla 52: Correlación lípidos-fosfolípidos.
r Spearman
0.9820
p
0.0004
La representación gráfica mediante un diagrama de puntos unidos por una
línea de la prueba estadística aplicada es la siguiente. (Figura 25)
Figura 25: Representación gráfica de la correlación entre lípidos y fosfolípidos.
250
225
200
175
150
125
100
75
50
25
0
LIPIDOS (mg/g)
FOSFOLIPIDOS
(microM/g)
CIEGO
COL.
ASC.
COL.
TRV.
PROX
COL.
TRV.
DIST.
COL.
DESC.
SIGMA
RECTO
144
4. RELACION ENTRE HIDROFOBICIDAD Y SURFACTANTE.
En este último apartado estudiaremos la relación existente entre los valores
de hidrofobicidad a lo largo de los diferentes siete segmentos en los que hemos
dividido el trayecto mucoso colónico (expresados como valores de ángulo de
contacto y medidos en grados sexagesimales) y los valores de surfactante
(expresados como peso) obtenidos del homogeneizado de mucosa.
La prueba estadística aplicada en este caso es el coeficiente de correlación.
(Tabla 53)
Tabla 53: Correlación hidrofobicidad-surfactante.
r Spearman
0.7207
p
0.0881
La representación gráfica (Figura 26) en forma de diagrama de puntos
unidos por una línea nos permite valorar las tendencias de los valores de
hidrofobicidad y fosfolípidos a lo largo de la mucosa del colon dividida en siete
segmentos: ciego-colon ascendente-colon transverso proximal- colon transverso
distal-colon descendente- sigma- recto.
145
Figura 26: Representación gráfica de la correlación entre hidrofobicidad
y fosfolípidos.
250
225
200
175
150
125
100
75
50
25
0
HIDROFOBICIDAD (º)
FOSFOLIPIDOS
(microM/g)
CIEGO COL.
ASC.
COL.
TRV.
PROX
COL.
TRV.
DIST.
COL. SIGMA RECTO
DESC.
146
DISCUSION
147
La luz gastrointestinal presenta condiciones biológicas y fisicoquímicas
idóneas para la digestión de los alimentos y para el control y desarrollo de los
microorganismos que constituyen el ecosistema de su flora. Muchas de esas
condiciones (pH ácido, enzimas proteolíticas, sales biliares, ambiente anaerobio,
productos bacterianos, etc.) resultan altamente tóxicas para las células del huésped
porque se apartan de las constantes requeridas en el medio interno. Es por tanto
necesaria la presencia de una estructura de separación entre medio interno y luz
gastrointestinal, que resulte parcialmente impermeable permitiendo mantener
condiciones fisicoquímicas y biológicas distintas en cada medio, pero que a la vez
constituya una interfase apta para el intercambio controlado. Esta estructura de
separación entre el medio interno y la luz del tubo digestivo es lo que se ha
llamado barrera mucosa gastrointestinal, termino introducido en los años sesenta,
originalmente aplicado a la mucosa gástrica por su capacidad de repeler y resistir
la acidez de la luz del estómago, y que hoy en día se aplica a toda la superficie
endoluminal del tracto digestivo.
Físicamente, la barrera mucosa gastrointestinal incluye el epitelio
superficial de la mucosa y sobre este una capa de moco con características de gel y
espesor variable de hasta 200 µm. Por encima de esta capa de moco se extiende
una monocapa constituida por fosfolípidos con propiedades anfóteras y
denominada surfactante gastrointestinal. Esta monocapa tiene características
148
tensoactivas por la cohesión lateral de sus elementos, que determina su disposición
espacial en monoplano y su extensión por la superficie del moco estableciendo así
la interfase moco-luz gastrointestinal. El surfactante expresa hacia la luz su cara
hidrófoba y constituye por tanto una superficie contra iones, enzimas y toxinas
hidrosolubles. En términos generales, la barrera mucosa no es obstáculo para el
intercambio de productos liposolubles, mientras que resulta prácticamente
infranqueable para la inmensa mayoría de las sustancias hidrosolubles, a no ser
que por su particular interés para el organismo su transporte a través de la mucosa
se produzca mediante mecanismos activos específicos.
Las propiedades de la barrera mucosa dependen también del flujo
sanguíneo de la submucosa. Este suministra oxígeno y nutrientes para mantener la
vitalidad y por ende la función de secreción de las células que se localizan en la
mucosa; así mismo, facilita el aclaramiento de los elementos tóxicos que logran
franquear la barrera.
En el presente trabajo hemos pretendido colaborar en la definición de la
superficie mucosa del colon humano en su función de barrera, ya que ésta ha sido
mucho menos estudiada que la gástrica, y a diferencia del esófago donde prima
una función de conducción exclusivamente y el intestino delgado donde las
funciones principales son las de digestión y absorción, pensamos que el intestino
grueso al desarrollar funciones de absorción de agua e iones en tramos proximales
y de conducción de la materia fecal con textura sólida cuando nos acercamos a
tramos más distales y poseer una rica flora bacteriana presente en su luz hace que
las propiedades de superficie de su mucosa jueguen un papel principal en este
tramo a diferencia de otros segmentos del tracto digestivo.
149
I. CARACTERISTICAS DE LAS MUESTRAS.
Los escasos trabajos presentes en la literatura a cerca del estudio de las
propiedades de barrera de la mucosa del colon se han llevado a cabo
principalmente con muestras de mucosa colónica de diferentes especies de
mamíferos, especialmente ratas (70), conejos (113) y menos en perros (110). Los que
se han realizado sobre muestras humanas se han hecho en especímenes obtenidos
habitualmente por biopsia siendo escasas las publicaciones en las que las muestras
proceden de intervenciones quirúrgicas (96).
En nuestro trabajo se han utilizado muestras amplias (2x3 cm) de mucosa
colónica humana procedentes de piezas quirúrgicas. Esto hace que los resultados
obtenidos de estos especímenes, a diferencia de los biópsicos, sean en muestras
menos manipuladas, lo que creemos implica una mejora en el mantenimiento de
las propiedades de superficie de la muestra. Así mismo el tratarse de muestras
amplias nos ha permitido realizar varías mediciones de ángulo de contacto por
muestra (cinco) (77) lo que implica poder referir una homogeneidad en los valores
obtenidos. Además y como ya discutiremos más adelante, el tejido estudiado
procede de colon humano lo que pensamos tiene esencial importancia a la hora de
definir unos valores de ángulo de contacto que son diferentes a los publicados en
la literatura en otras especies animales.
Por último el número de muestras utilizadas, (N=134), hacen de nuestro
trabajo el que posee la serie más larga de muestras de colon humano para el
estudio de las propiedades de superficie de su mucosa, siendo los tamaños
muestrales más amplios hasta ahora publicados menores de veinte (96).
150
II. CONSERVACION DE LA MUESTRA DE MUCOSA.
Al utilizar muestras de mucosa procedentes de segmentos de colon
obtenidos de pacientes intervenidos quirúrgicamente, la inmediatez y por
consiguiente el tiempo de isquemia se ha supeditado al proceso puramente técnico
de la intervención quirúrgica llevada a cabo.
Hemos considerado tiempo cero de isquemia el momento en el que el
cirujano extrae la pieza quirúrgica. Hemos medido hidrofobicidades a distintos
intervalos de tiempo constatando que dichos valores disminuyen progresivamente
conforme aumenta el tiempo llegando a ser prácticamente de la mitad (64%) a las
tres horas de la extracción de la muestra.
También y en el mismo orden de cosas y dado que la muestra requiere un
medio de conservación hemos obtenido valores de hidrofobicidad medidos como
ángulo de contacto superponibles al tiempo cero de isquemia (99.5%) en un medio
frío (nevera a 4ºC) frente a los obtenidos a temperatura ambiente (22ºC) que han
sido de un 90%.
Con todo esto decidimos utilizar únicamente muestras de mucosa colonica
procedentes de piezas que no rebasaran los treinta minutos de isquemia habiendo
sido conservadas estas en suero fisiológico frío (nevera a 4ºC), condiciones iguales
a las utilizadas por otros autores (96).
III. METODO DE MEDIDA DE LA HIDROFOBICIDAD.
Numerosos han sido los métodos descritos para cuantificar las propiedades
de superficie en distintos materiales (11), siendo el método de la medida del ángulo
151
de contacto en relación con una gota en cualquiera de sus variedades el más
utilizado en los distintos trabajos publicados (111) por su sencillez en la realización
así como por su reproductibilidad.
Al utilizar, para la obtención de los valores de ángulo de contacto, un
método óptico (el goniómetro) las medidas realizadas por diferentes observadores
pueden no ser todo lo uniformes que sería deseable lo cual nos ha llevado, tal y
como expone en su trabajo Lichtenberger (112) a ser el mismo observador el que ha
medido los 670 valores de ángulo de contacto y siempre realizados con el mismo
aparato colocado en el mismo lugar.
IV. HIDROFOBICIDAD EN LA SUPERFICIE MUCOSA DEL
COLON.
El valor de ángulo de contacto, como expresión de la propiedad de la
hidrofobicidad, en la superficie de la mucosa del colon humano que hemos
obtenido en nuestra población es de 39.52 ± 0.05º (N=134).
Dicho valor, similar al obtenido en el esófago (69) (39.4 ± 2.4º),
relacionarían ambos segmentos del tubo digestivo en su faceta de meramente
conductores en detrimento de la propiedad de la digestión y de la absorción.
Cuando lo comparamos con valores hallados en la superficie endoluminal
gástrica (113) (66º) vemos que los valores colónicos son mucho menores que los
gástricos puesto que las propiedades fisicoquímicas del contenido intraluminal
gástrico hacen que la función de barrera de la mucosa gástrica sea mucho más
evidente.
152
En el intestino delgado contrariamente se describen valores mucho más
bajos de hidrofobicidad (70) (10º), valores necesarios para que la función
primordial de esta parte del tubo digestivo, que es la absorción, se lleve a cabo.
Cuando buscamos referencias en la literatura a valores de hidrofobicidad de
la mucosa colónica humana estos son muy escasas (74) siendo los más numerosos
estudios diseñados en modelos animales y obteniéndose valores tan dispares como
alrededor de 90º en un modelo desarrollado con conejos (90) y en otros 34 ± 3º
donde el animal de experimentación era la rata (2) siendo los obtenidos en este
último más próximos a los de nuestro trabajo.
V. MODIFICACION EN LAS PROPIEDADES DE SUPERFICIE
DE LA MUCOSA DEL COLON TRAS SU INCUBACION EN
SOLUCION FISIOLÓGICA.
Al someter las muestras de mucosa colónica a una incubación durante
sesenta minutos en un medio de características similares al medio interno (pH 7.4
y 37ºC) constituido por solución de Krebs-Ringer-Tris y oxígeno con dióxido de
carbono comprimido, los valores de hidrofobicidad como medida de ángulo de
contacto (42.29 ± 0.04º) aumentan con respecto a los obtenidos cuando se miden
en muestras que no han sido sometidas a ningún procesamiento (39.52 ± 0.05º)
siendo está diferencia estadísticamente significativa (p< 0.0001). De esta
diferencia en los valores de hidrofobicidad se puede deducir lo siguiente:
-
El incremento en los valores de hidrofobicidad hallado en las muestras
sometidas a incubación con el medio descrito es consecuencia de una
acción puramente fisicoquímica sobre la película de fosfolípidos que
tapiza la superficie mucosa del colon.
153
-
Realmente los valores basales de hidrofobicidad son más bajos (39.52º)
y su aumento (+2.77º) se explica por un efecto de carácter más
biológico como consecuencia de un estímulo a la producción de
surfactante por el epitelio de la mucosa.
VI. INFLUENCIA DE LA PATOLOGIA ASOCIADA EN LAS
PROPIEDADES DE SUPERFICIE.
Como una aplicación de índole más clínico, se han dividido el conjunto de
las 134 muestras de mucosa colónica en dos grupos: las provenientes de pacientes
que no referían
ningún tipo de antecedente patológico (87 pacientes) y las
obtenidas de pacientes que en su historia clínica constaba la presencia de otras
enfermedades acompañantes (47 pacientes). Cuando comparamos los valores de
ángulo de contacto como expresión de la hidrofobicidad obtenemos valores más
elevados en el grupo exento de patología asociada teniendo está diferencia
significación estadística (p=0.01).
A su vez y dentro del grupo de los pacientes con enfermedades asociadas
se han contemplado la diabetes mellitus, hipertensión arterial, broncopatía crónica,
cardiopatía y dislipemia. La comparación entre estos cinco grupos exhibe
diferencias estadísticamente significativas (p=0.01) Dichas diferencias se
refuerzan al comparar los grupos dos a dos en los casos entre dislipemia y diabetes
y entre dislipemia e hipertensión arterial.
Así mismo el grupo afecto de dislipemia es el que presenta unos valores de
hidrofobicidad más elevados (40º). Revisada la literatura no hemos encontrado
reseñas bibliográficas que relacionen los trastornos en el metabolismo lipídico con
alteraciones en el funcionalismo del surfactante tanto gastrointestinal, menos
154
estudiado, como pulmonar más profundamente conocido. De los datos obtenidos
en nuestro trabajo se puede exponer una relación entre la presencia de
enfermedades del metabolismo de los lípidos, por otro lado muy frecuentes en la
población, con un refuerzo en las propiedades de barrera mucosa gastrointestinal
basando está relación de alguna manera en las vías metabólicas de síntesis de los
distintos lípidos.
VII. HIDROFOBICIDAD EN LA SUPERFICIE MUCOSA DEL
COLON COMO PROPIEDAD MODULABLE “EX VIVO”.
Una vez definida la existencia de propiedades de superficie en la cara
endoluminal de la mucosa colónica valoramos si dichas propiedades son
subsidiarias de ser modificadas mediante la acción de moléculas con
características citoprotectoras (EGF y PGE2) o por la de moléculas cuya acción se
ha visto lesiva para la mucosa del tracto digestivo (antinflamatorios no
esteroideos).
1. CITOPROTECTORES.
Al someter a las muestras de mucosa colónica a una incubación en un
medio que contiene solución fisiológica y moléculas con características de
citoprotección, concretamente factor de crecimiento epidérmico y prostaglandina
E2 los valores de hidrofobicidad han sido mayores que los que se obtienen cuando
las muestras son incubadas en un medio que solo contiene la solución fisiológica
(control), siendo dicha diferencia estadísticamente significativa (p<0.0001).
Por otro lado cuando comparamos específicamente los valores obtenidos en
la incubación con EGF con los obtenidos de la hecha en un medio con PGE2
también se describen diferencias con significación estadística (p<0.001) en el
155
sentido de mayores valores de ángulo de contacto en las muestras procedentes del
medio que contiene el factor de crecimiento.
Estos hallazgos coinciden con lo publicado en la literatura por Lugea y
colaboradores donde en distintos tramos del tubo digestivo y en animales de
experimentación se ha visto que el EGF incrementa las propiedades de
hidrofobicidad de la mucosa mediante el estímulo de la síntesis de fosfolípidos
(36).
2. ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDEOS.
El procesar la muestra de mucosa de colon con antinflamatorios no
esteroideos provoca un cambio en las propiedades de superficie de dicha mucosa
en el sentido de disminuir los valores de ángulo de contacto siendo esta diferencia
estadísticamente significativa (p<0.0001).
Cuando comparamos los resultados obtenidos con dos moléculas
procedentes de familias distintas de antinflamatorios no esteroideos (el diclofenaco
perteneciente al grupo de los ácidos heteroaril acéticos y la indometacina de la
familia de los ácidos indolacéticos) y que actúan por diferentes mecanismos
también obtenemos diferencias con significación estadística (p<0.001) en su
reducción de los valores de la hidrofobicidad siendo esta reducción mayor en las
muestras procesadas con el diclofenaco.
Además, y coincide en las dos moléculas estudiadas, el efecto sobre la
reducción de la hidrofobicidad tiene relación con la dosis de antiinflamatorio
utilizada de modo que a dosis dobles la reducción de la hidrofobicidad es mayor
siendo dicha diferencia estadísticamente significativa (p<0.0001).
156
VIII.
HIDROFOBICIDAD
EN
LA
SUPERFICIE
ENDOLUMINAL DE LA MUCOSA DEL COLON HUMANO.
ESTUDIO TOPOGRAFICO.
Aunque la función de barrera mucosa es una constante a lo largo de todo el
tracto digestivo, no todos los tramos de dicho tubo desempeñan idénticas
funciones ni con la misma intensidad.
Esófago, estómago, duodeno e intestino delgado y colon desarrollan
diferentes papeles en lo que se refiere a la conducción, digestión y absorción del
alimento, estando estas funciones muy relacionadas con las propiedades de
superficie de la mucosa que a su vez condicionan el papel defensivo que
caracteriza a esta barrera mucosa gastrointestinal.
El colon humano se divide funcionalmente en dos tramos, uno derecho en
el que predominan las funciones de absorción en lo que al agua se refiere y otro
izquierdo o distal en el cual la principal función es la de conducción y expulsión
de la masa fecal.
Estudios realizados en colon de rata han puesto de manifiesto que en este
animal existen diferencias entre distintos segmentos a lo largo del trayecto
colónico en cuanto a los valores de hidrofobicidad (2) evidenciándose valores más
altos conforme las medidas se toman de tramos colónicos más distales.
En el presente trabajo, hemos dividido el colon basándonos en criterios
anatómicos (siete segmentos) o bien en criterios funcionales (cuatro sectores) no
habiendo hallado significación estadística entre los valores de ángulo de contacto
obtenidos en las diferentes zonas aunque los valores en los tramos derechos, ciego
(39.26 ± 0.15º) y colon ascendente (39.53 ± 0.13º), son inferiores a los calculados
157
para tramos izquierdos, sigma (39.70 ± 0.11º) y recto (39.6 ± 0.11º). Esta
tendencia a hidrofobicidades izquierdas más elevadas la relacionamos con la
función más de conducción y consiguientemente con la propiedad de la
lubrificación (101) de este tramo del colon. De este mismo modo en tramos
derechos prima la función de absorción del agua la cual estaría facilitada por
valores más bajos de hidrofobicidad (2).
IX. SURFACTANTE COLONICO.
La base bioquímica del surfactante gastrointestinal está compuesta por los
fosfolípidos. Estos forman parte del extracto lipídico que se obtiene de la mucosa.
A su vez la propiedad de la hidrofobicidad asienta en la película de surfactante
que se extiende a lo largo de la superficie mucosa del tracto digestivo.
La cantidad de fosfolípidos extraídos del homogeneizado de mucosa de
colon en los diferentes segmentos colónicos se correlaciona con los lípidos
extraídos de dichos segmentos; dicha correlación es positiva, lo que significa que
la proporción de fosfolípidos es directamente proporcional al total de lípidos del
homogeneizado siendo además dicha correlación estadísticamente significativa
(p<0.05).
En este mismo sentido cuando correlacionamos a lo largo del trayecto del
colon humano las proporciones de fosfolípidos por gramo de tejido, como sustrato
químico del surfactante gastrointestinal, con los valores de ángulo de contacto
como forma de expresar la propiedad de la hidrofobicidad de la mucosa del colon
obtenemos un coeficiente de correlación positivo lo que se interpreta como que
existe una relación directa entre la cantidad de surfactante y la propiedad de la
hidrofobicidad con una significación estadística en el límite (p=0.08).
158
X. APLICACIONES CLINICAS DE LA PROPIEDAD DE LA
HIDROFOBICIDAD DE LA SUPERFICIE MUCOSA EN EL
COLON.
Sin ser el fin del presente trabajo el describir las implicaciones
fisiopatológicas y por consiguiente posibilidades terapéuticas relacionadas con
alteraciones de la barrera mucosa y concretamente la monocapa fosfolipídica que
es el surfactante, pensamos que una revisión de lo publicado hasta ahora sobre
esto, puede completar la presente discusión y abrir las puertas a futuros trabajos
que seguirían la línea de investigación que nosotros hemos pretendido recoger de
los estudios precedentes que sobre esto existen en la literatura.
La neoplasia y la enfermedad inflamatoria intestinal son dos de los
principales procesos patológicos que afectan a la mucosa del colon; su aparición y
desarrollo están relacionados con defectos en las propiedades de superficie de la
mucosa.
1. NEOPLASIA.
Este proceso, que es común a todo el tracto digestivo, está relacionado con
el efecto directo que sobre la mucosa digestiva tienen
diferentes agentes
carcinogénicos presentes en la luz del tracto gastrointestinal.
El agente carcinogénico presente en la luz del tracto digestivo necesita
actuar directamente sobre la célula epitelial cuando se encuentra esta en la fase S
de su ciclo proliferativo (114). Para ello la integridad previa de la barrera mucosa
(surfactante y capa de moco) debe de estar rota. En estudios realizados en mucosa
gástrica procedente de enfermos afectos de gastritis atrófica (entidad que se
conoce relacionada con el desarrollo de neoplasia gástrica) se ha visto una
permeabilidad anormalmente elevada para moléculas pequeñas hidrofílicas (115).
159
La propiedad de la hidrofobicidad y por lo tanto una barrera mucosa integra
es uno de los mecanismos directamente implicados en la defensa de la mucosa
ante la acción de moléculas carcinogénicas constatándose diferencias regionales
en el desarrollo de neoplasias entre las diferentes partes del estómago (116).
En el colon, el recto con un 37% de las neoplasias diagnosticadas, el sigma
con un 27% y el ciego con un 14% son los tramos donde se localizan más
frecuentemente las neoplasias (117). Uno de los factores que se relacionan con esto
es que son zonas en las cuales el movimiento de la masa fecal es más lento y por
tanto el tiempo de contacto con la mucosa mayor. En nuestro trabajo los valores de
hidrofobicidad mayores corresponden al colon distal, lo que nos hace pensar en un
“refuerzo” fisiológico de la barrera mucosa a este nivel y una puerta abierta para
investigar en trabajos sucesivos si realmente las propiedades de superficie están
alteradas en el colon afecto de neoplasia.
Investigaciones recientes (118) han puesto de manifiesto el papel que la
ciclooxigenasa (COX) juega en la génesis tumoral. La COX regula la síntesis de
prostaglandinas desde el ácido araquidónico. Hay dos formas enzimáticas de la
COX: la forma constitutiva (COX-1) y la forma inducible (COX-2). La inducción
de esta segunda forma enzimática viene mediada por la acción de algunas
citoquinas (TGF-α y EGF) (119) (Figura 27) Esta segunda isoenzima, la forma
inducible, se sobreexpresa frecuentemente en las células de la neoplasia de colon,
favoreciendo la capacidad de invasión tumoral al inhibir el fenómeno de la
apoptosis y estimular la síntesis de factores promotores de la angiogénesis (120). A
partir de estas observaciones se ha visto que la acción de los antiinflamatorios no
esterioideos (AINE) y concretamente los que actúan inhibiendo selectivamente la
ciclooxigenasa 2 (COX-2) frenan el crecimiento de las células neoplásicas (121)
(122).
160
FOSFOLIPIDOS
ACIDO ARAQUIDONICO
EGF
+
COX
+
-
AINE
PROSTAGLANDINAS
Figura 27: Regulación en la síntesis de prostaglandinas.
Nuestro trabajo,
se ha realizado en mucosa de tejido sano y hemos
analizado “ex vivo” el efecto que sobre la hidrofobicidad y por consiguiente sobre
su sustrato químico el surfactante (fosfolípidos) provocan las prostaglandinas
(PGE2), el EGF y los antiinflamatorios no esteroideos (los utilizados no son
inhibidores selectivos de la COX-2), obteniendo un aumento en los valores de
ángulo de contacto (hidrofobicidad) bajo la acción de los dos primeros y una
disminución cuando actúan los antiinflamatorios.
Esto nos hace pensar que idénticas moléculas actuando a través de iguales
vías metabólicas pero dependiendo del sustrato celular sobre el que actúen, causan
efectos antagónicos. Consiguientemente, la utilización de un mismo tratamiento
(los antinflamatorios no esteroideos) puede estar contraindicado en el caso de
gastropatías de tipo ulceroso o por el contrario indicado como profilaxis en el
desarrollo de neoplasia de colon (123).
161
2. ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL.
La enfermedad inflamatoria intestinal (colitis ulcerosa y enfermedad de
Crohn) es otra patología que afecta a la mucosa del colon, con etiopatogenia
probablemente multifactorial y no del todo conocida.
Dentro de todo el conjunto de factores que se imbrican en al desarrollo de
la enfermedad inflamatoria se describen factores medioambientales que actúan
desde la luz del colon interaccionando con el sistema inmunológico del paciente y
bajo una susceptibilidad genética a la enfermedad del mismo acaba
desarrollándola. (124) (Figura 28)
El hecho de producirse una interacción entre moléculas intraluminales y el
sistema inmunológico del enfermo implica una disrupción completa estructural o
como mínimo un déficit en la función como barrera de la doble capa más externa
que cubre el epitelio mucoso y que junto a este conforman la denominada barrera
mucosa gastrointestinal la cual constituye el primer mecanismo de defensa ante la
acción de noxas intraluminales.
Modelos experimentales para el desarrollo de colitis han puesto de
manifiesto que el desarrollo de esta tiene dos etapas con mecanismos de
producción diferentes. Una primera etapa que incluye el desarrollo de la
enfermedad aguda en la cual el mecanismo de acción es directo e independiente de
factores inmunológicos y una segunda etapa con una enfermedad de características
crónicas y en la cual mecanismos mediados inmunológicamente juegan un papel
básico (125).
Estudios realizados en muestras de mucosa provenientes de pacientes
afectos de enfermedad inflamatoria intestinal han puesto de manifiesto la
alteración en la función de barrera de la mucosa intestinal (126) en el sentido de
162
reducir o anular sus características de hidrofobicidad con el consiguiente aumento
a la permeabilidad de la misma a moléculas presentes en la luz gastrointestinal
(127).
Esto no se ha descrito exclusivamente en mucosa afecta por la enfermedad,
sino que también se ha visto que muestras de tejido sano de pacientes afectos por
colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn, y muestras de familiares de primer grado
de enfermos de enfermedad inflamatoria intestinal pero que no sufren la
enfermedad, tienen alteraciones en la composición tanto del moco como de la
monocapa de surfactante que lo recubre y que a su vez cubre el epitelio mucoso
del tracto gastrointestinal y por consiguiente colónico, lo que provoca que la
propiedad de la hidrofobicidad en estos tejidos exhiba valores menores de los
esperados con lo cual la integridad de la función de barrera se ve comprometida.
Observaciones como estas implican múltiples mecanismos etiopatogénicos
en el desarrollo de la enfermedad inflamatoria intestinal donde con el sustrato de
alteraciones genéticas y mediados por el efecto de agentes medioambientales bien
por acción directa o a través de mecanismos inmunológicos se producirían los
fenómenos inflamatorios ante
gastrointestinal (128).
la incompetencia de la barrera mucosa
163
Predisposición
genética
Surfactante
Moco
Factores
inmunológicos
Factores
medioambientale
Propiedades de superficie
Permeabilidad
Fenómenos inflamatorios:
-Agudos
-Crónicos
Figura 28: Etiopatogenia de la EII.
En modelos de colitis inducida desarrollados en animales de laboratorio se
ha podido constatar que el sometimiento de la mucosa inflamada ante agentes
citoprotectores como pueden ser los factores de crecimiento análogos al EGF (129)
y las prostaglandinas (130) hace que se produzca una reparación del tejido dañado;
así mismo el tratamiento previo de los animales de experimentación con los
164
agentes antes señalados previene la lesión al reforzar la resistencia de la mucosa
del colon a fenómenos agresivos.
En esta línea en nuestro trabajo se ha podido demostrar que el hecho de
someter las muestras de mucosa sana de colon a la acción de dichos agentes
protectores representa un aumento de los valores de sus propiedades de
hidrofobicidad, aumento con significación estadística (p<0.0001), lo que nos hace
deducir, coincidiendo con la literatura (131) que las acciones que desarrollan dichas
moléculas lo hacen en el sentido de reforzar la barrera mucosa colónica.
165
CONCLUSIONES
166
Utilizando el ángulo de contacto como medida de la hidrofobicidad en la
superficie de la mucosa del colon:
1. El valor medio de dicho ángulo de contacto determinado en la superficie
de la mucosa colónica humana es de 39.52 ± 0.05º.
2. La hidrofobicidad adquiere valores menores conforme aumenta el
tiempo de isquemia al que se somete la mucosa del colon.
3. La hidrofobicidad de la superficie mucosa del colon se incrementa
cuando dicho tejido se somete a condiciones de laboratorio que semejan las del
medio interno.
4. Los valores de hidrofobicidad en la superficie mucosa del colon
obtenidos cuando esta se somete a condiciones de laboratorio similares al medio
interno pero además se añade Prostaglandina E2 o Factor de Crecimiento
Epidérmico, moléculas con propiedades citoprotectoras, son mayores que los
obtenidos en condiciones idénticas pero en un medio exento de estas dos
moléculas.
167
5. El incremento en los valores de hidrofobicidad que se obtiene al someter
la mucosa del colon a la acción del Factor de Crecimiento Epidérmico es mayor al
que se constata al incubar dicha mucosa en un medio idéntico pero que contiene
Prostaglandina E2.
6. La exposición de la mucosa colónica a un medio que contiene
diclofenaco o indometacina, antiinflamatorios no esteroideos, determina la pérdida
de sus propiedades de superficie.
7. La hidrofobicidad de la mucosa colónica disminuye bajo el efecto de
moléculas de antiinflamatorio no esteroideo de familias distintas, diclofenaco e
indometacina, siendo el efecto mayor en el caso del diclofenaco. Así mismo la
dosis de antinflamatorio utilizada también influye en la disminución de los valores
de ángulo de contacto.
8. La hidrofobicidad de la mucosa colónica procedente de pacientes afectos
de diabetes mellitus, hipertensión arterial, broncopatía crónica, cardiopatía o
dislipemia se ven disminuida frente al grupo de pacientes que no presentan estos
antecedentes patológicos.
En pacientes con dislipemia los valores de ángulo de contacto en las
muestras de mucosa son mayores que los obtenidos del resto de las muestras
provenientes de pacientes con los demás antecedentes patológicos analizados.
9. La hidrofobicidad de los distintos tramos del colon no muestra
variaciones estadísticamente significativas.
Sin embargo hemos observado una tendencia a presentar valores de ángulo
de contacto mayores en tramos más distales del colon.
10. La variación en los valores de hidrofobicidad obtenidos en los distintos
tramos del intestino grueso se relaciona directamente con la proporción de
168
fosfolípidos que hemos obtenido del homogeneizado de mucosa colónica en cada
uno de ellos.
169
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