TP 9 2016 - Campus Virtual - Universidad Nacional de Tucumán

Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia
Universidad Nacional de Tucumán
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
Nº 9
Pruebas básicas y especiales para el
estudio de la coagulación sanguínea
1
MECANISMO DE LA HEMOSTASIA NORMAL
INTRODUCCIÓN
Hemostasia es el conjunto de mecanismos encargados de mantener el flujo
sanguíneo constante, evitando la producción de hemorragias excesivas y
limitando la magnitud del coágulo formado. En ella participan distintos
sistemas o factores:
 Sistema de coagulación.
 Sistema fibrinolítico.
 Endotelio vascular.
 Plaquetas.
 Factores reológicos (se refieren a la velocidad, viscosidad y características
del flujo sanguíneo).
Las alteraciones en alguno de ellos son las que provocan los cuadros
hemorrágicos y/o las trombosis localizadas o generalizadas.
El coágulo hemostático perfecto se forma específicamente en el lugar de la
injuria y lleva a que la pared vascular detenga su sangrado, pero también
implica que dicha activación del sistema de coagulación no se extienda al resto
del árbol vascular. El coágulo formado constituye un marco delimitador para la
reparación del tejido dañado y dicho tapón hemostático es lo suficientemente
lábil para ser removido durante la remodelación.
Cuando ocurre una injuria vascular se produce una vasoconstricción refleja,
con exposición de la matriz subendotelial y reducción del flujo sanguíneo. El
punto de partida lo constituye la unión de una proteína soluble, el factor von
Willebrand (FvW), a la matriz subendotelial. El mismo, una vez pegado al
subendotelio, expone múltiples sitios intrínsecos de unión para la glicoproteína
Ib específica de la membrana plaquetaria (GPIb).
La unión FvW al complejo GPIb-V-IX estimula a la plaqueta, la cual expone la
glicoproteína IIb-IIIa (GPIIb-IIIa) que une más FvW y fibrinógeno.
Los gránulos densos de las plaquetas liberan ADP, ATP, serotonina, calcio y
por activación de la cascada del ácido araquidónico generan tromboxano A2,
potente agregante plaquetario y vasoconstrictor. El calcio es esencial en la
activación de las proteínas solubles del sistema de coagulación.
Los gránulos alfa de las plaquetas liberan fibrinógeno, factor plaquetario 4,
trombospondina, fibronectina, FvW, FV, FVIII, FXI y factores de crecimiento.
En la plaqueta activada se produce una redistribución de los fosfolípidos de la
membrana celular (fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina) quedando expuestos
sobre la superficie externa. De esta manera se crea una superficie
procoagulante que permite la interacción de las plaquetas con los factores de
la coagulación, sirviendo de base esencial para el inicio de la coagulación.
La coagulación se desencadena rápidamente cuando el factor tisular (FT: un
complejo proteína-fosfolípido) es expuesto al FVII en presencia de calcio. El
FT está normalmente presente en las células extravasculares que circundan
los vasos sanguíneos y en otros tejidos. También está presente en leucocitos
circulantes y monocitos, de forma encriptada, de manera que se expone
cuando hay activación de la célula que lo contiene.
MECANISMO DE COAGULACIÓN
El proceso de coagulación se describió 1964 como un modelo que se
2
desarrolla en forma de cascada. Si bien con fines didácticos se describen dos
mecanismos de activación, uno intrínseco y otro extrínseco, entre ambos
existen interconexiones y sistemas de retroalimentación (positivos y negativos)
que lo hace un mecanismo complejo y único. Este modelo de cascada se basa
en una serie de reacciones proteolíticas que actúan como amplificadores de la
reacción.
El sistema intrínseco está compuesto por factores que se encuentran todos en
circulación, mientras que el sistema extrínseco incluye el FT que, en
condiciones normales, no se encuentra en circulación.
El sistema de coagulación está constituído por proteínas plasmáticas llamadas
factores de coagulación, que circulan en la sangre en forma inactiva como
zimógenos o proenzimas. Los mismos se activan secuencialmente, al sufrir un
clivaje enzimático, dando lugar a la formación de enzimas activas que
culminan con la formación de trombina, que al actuar sobre el fibrinógeno
forma la malla de fibrina.
Hasta ahora han sido reconocidos como factores de coagulación diez
glicoproteínas plasmáticas, que se designaron con números romanos por el
Comité Internacional de Nomenclatura de Factores de la Coagulación, pero
además existen otras proteínas que también intervienen en la coagulación y
aún no han sido designadas numéricamente (ver Tabla N° 1).
MECANIMO EXTRÍNSECO
El mecanismo extrínseco se inicia cuando la sangre entra en contacto con
elementos tisulares. El FT se combina en forma estequiométrica con el FVII, en
presencia de calcio, y forma un complejo enzimático capaz de activar al FVII
en FVIIa, que es más activo que el FVII nativo (retroalimentación positiva), y a
los factores X y IX formando FXa y FIXa.
MECANISMO INTRÍNSECO
En el modelo celular de la coagulación se observó que en la llamada fase de
contacto sólo interviene el FXI ya que el FXII y
precalicreínas no
desempeñan un papel importante en la coagulación.
El FXIa actúa sobre el FIX en una reacción dependiente del calcio formando el
FIXa, el cual forma un complejo enzimático con los fosfolípidos (factor
plaquetario 3), calcio y FVIII (complejo tenasa) para transformar el FX en FXa.
A partir de allí se inicia la vía final común.
VIA FINAL COMÚN
Se inicia con la activación del FX por el mecanismo intrínseco o extrínseco. In
vitro puede ser activado por otras enzimas proteolíticas como tripsina o veneno
de víbora de Russell en presencia o no de fosfolípidos. El FXa forma el
“complejo protrombinasa” con fosfolípidos, calcio y FV, el cual actúa sobre el
FII para generar trombina.
La trombina es la enzima coagulante por excelencia. Actúa sobre el
fibrinógeno para formar la malla de fibrina, sobre los cofactores V y VIII
aumentando su actividad, y sobre el FXIII, estabilizador de la fibrina. Participa
además en la adhesividad y agregación plaquetaria.
El fibrinógeno es un dímero constituído por tres pares de cadenas: 2A, 2B y
2. A y B son los fibrinopéptidos con densidad de carga negativa que producen
3
repulsión entre las moléculas de fibrinógeno. La trombina libera el
fibrinopéptido A de la cadena alfa y luego el B de la cadena beta. Así se
forman los monómeros que se polimerizan mediante uniones tipo hidrógeno
formando un gel soluble, la fibrina.
Los polímeros adquieren mayor cohesión y estabilidad cuando actúa sobre
ellos el FXIII, previamente activado por trombina, introduciendo enlaces
covalentes entre los monómeros de fibrina.
TABLA N° 1. Componentes del sistema de coagulación
Nivel
Cc. Plasmática Hemostát
(µg/mL)
ico (%)
Vida
Media
(horas)
FACTOR
SINONIMO
PROTEINA
FUNCION
I
Fibrinógeno
Estructural
Forma fibrina al sufrir un
clivaje enzimático
300
50
72-120
II
Protrombina
Serinoproteasa vitamina K
dependiente
Activa a los factores
I,V,VIII,XIII,Prot.C
y
plaquetas
100
40
67-106
V
Proacelerina
Unión
Ayuda al FXa
activación del FII
10
10-15
12-15
VII
Proconvertina
Serinoproteasa vitamina K
dependiente
0.1
10
4-6
VIII
Antihemofílico A
Unión
0.1
25
10-16
IX
Factor Christmas o
antihemofílico B
Serinoproteasa vitamina K
dependiente
Activa al FX
5
25-20
18-40
X
Factor Stuart-Prower
Serinoproteasa vitamina K
dependiente
Activa al FII
8
20
20-60
XI
Antecedente
tromboplástico
Serinoproteasa
Activa al FIX
5
15-20
48-80
XII
Factor Hageman
Serinoproteasa
Activa al FXI y el sistema
de las quininas
30
50-70
XIII
Estabilizador de la
fibrina
Transglutaminasa o
transpeptidasa
Entrecruza la fibrina con
uniones covalentes
10
10
FACTOR VON
WILLEBRAND
Factor VIII antígeno
relacionado
Unión
Une plaquetas y FVIII
10
22-40
PRECALICREINA
Factor Fletcher
Serinoproteasa
Activa al FXII y libera
bradiquinina de los QAPM
50
FACTOR
TISULAR
Factor tisular
Unión
Se une al FVII formando
un complejo que activa a
FX y FIX
0
QUININOGENOS
DE ALTO PESO
MOLECULAR
Factor Fitzgerald ,
Williams o Flaujeac
Unión
Une la precalicreína y el
FXI al endotelio dañado
70
en
la
Activa FIX y FX
Ayuda al FIXa
activación del FX
en
la
MODELO CELULAR DE LA COAGULACIÓN
El concepto actual de la activación de la coagulación involucra la cascada de
coagulación como mecanismo que se lleva a cabo en superficies celulares
específicas; este modelo refleja más eficientemente el proceso de coagulación
in vivo y la regulación del sistema. El modelo celular de coagulación requiere
de la participación de dos tipos celulares: células que expresan factor tisular y
100-200
4
las plaquetas. La clave en la regulación del proceso de coagulación es
mantener los dos tipos celulares separados hasta que una injuria requiera la
activación de la coagulación.
El mecanismo hemostático se desarrolla en tres etapas: iniciación,
amplificación y propagación.
Fase de Iniciación: La etapa de iniciación de la coagulación se localiza en
células que expresan FT en la circulación sanguínea. Dichas células
normalmente se encuentran fuera de la vasculatura y la injuria expone el FT.
Inmediatamente se forma el complejo FT-VIIa el cual activa pequeñas
cantidades de FIX y FX. El factor Xa se asocia con el Va para formar el
complejo protrombinasa en las células que expresan el FT, lo cual genera
pequeñas cantidades de trombina. El FXa unido a las células está
relativamente protegido de la inactivación por inhibidores de proteasas;
cuando el FXa se libera de las superficies es rápidamente inhibido por el
Inhibidor del vía del Factor Tisular (TFPI) o por Antitrombina. La presencia de
inhibidores circulantes localiza al FXa en el lugar de la lesión. Por el contrario,
el FIXa no es neutralizado por los inhibidores (la AT lo inhibe muy lentamente)
y se puede desplazar a las plaquetas cercanas y otras células, llevando la
activación de la coagulación de la célula endotelial a otras células
(principalmente plaquetas).
Fase de Amplificación: Como consecuencia de la iniciación se forman
pequeñas cantidades de trombina que cumplirán al menos tres funciones: 1activar las plaquetas; 2- promover la activación de los cofactores FVIII y FV en
las superficies de las plaquetas; 3- activar también al FXI en la superficie
plaquetaria. Al promediar el proceso de amplificación se generaron las
condiciones necesarias para que en la propagación de produzcan grandes
cantidades de trombina.
Fase de Propagación: La finalidad de la fase de propagación es generar
grandes cantidades de trombina de modo de llegar a la formación del coágulo
de fibrina. La propagación se lleva a cabo sobre la superficie de las plaquetas
activadas. En esta fase se incluyen tres conceptos: 1- El FIXa formado durante
la iniciación se une al FVIIIa en la superficie plaquetaria formando el complejo
tenasa; 2- El factor XIa unido a plaqueta provee mayor cantidad de FIXa y 3Mediante el complejo FIXa/FVIIIa en la plaqueta se debe formar nuevo FXa ya
que el generado en la célula que presenta FT no se puede desplazar a las
plaquetas. De esta manera se forma el complejo protrombinasa (FXa/FVa) que
es generador de grandes cantidades de trombina.
INTERRELACIONES ENTRE MECANISMO INTRÍNSECO Y EXTRÍNSECO
 El FIX es activado por el FVIIa
 El FVII es activado por el FIXa , el FXIa
5
GRAFICO N° 1. Activación de la coagulación: a) vía extrínseca in vitro (modelo
de cascada) y b) in vivo (modelo celular)
GRAFICO N° 2. Activación de la coagulación: a) vía intrínseca in vitro (modelo de
cascada a) e b) in vivo (modelo celular)
REACTIVOS DE USO GENERAL
1) Soluciones
1-a) Solución fisiológica (cloruro de sodio 0,15 M)
Cloruro de sodio ...................
9g
Agua destilada ...................... 1000 mL
1-b) Solución sulfocrómica
6
Bicromato de potasio ................. 100 g
Acido sulfúrico .......................... 500 mL
Agua destilada ...........................1000 mL
Disolver el bicromato de potasio en agua y agregar lentamente el ácido
sulfúrico en pequeños volúmenes, enfriando la solución. Llevar a volumen.
2) Anticoagulantes o descalcificantes
2-a) Citrato de sodio 0.11 M
Citrato de sodio (2 H 20) ........ 31,3 g
Agua destilada ....................csp. 1000 mL
2-b) Oxalato de sodio 0,1 M
Oxalato de sodio .................. 13,4 g
Agua destilada ..................csp. 1000 mL
2-c) Cloruro de calcio 0,1 M (Solución Madre)
Cloruro de calcio anhidro ......... 11,1 g
Agua destilada ...................csp. 1000 mL
2-d) Cloruro de calcio 0,025 M (Solución de trabajo)
Se preparan a partir de la solución madre realizando una dilución ¼ en
agua destilada.
3) Soluciones tampones
Tampón de Owren modificado pH 7,35
Tampón de Owren pH 7,35 .............. 200 mL
Citrato de sodio 0,025 M .................. 200 mL
LIMPIEZA Y ACONDICIONAMIENTO DEL MATERIAL
Para la toma de las muestras y la realización de ciertas pruebas es importante
el empleo de tubos y pipetas de plástico, a fin de evitar la activación por
contacto. En cambio, para la realización de las pruebas que miden tiempos de
coagulación se utilizan tubos de vidrio, aprovechando en ciertos casos (TTPA,
por ejemplo) la propiedad de este material de activar la vía intrínseca de la
coagulación. Se prefiere el uso de tubos de vidrio a base de borosilicatos, de
11 x 74 mm. Se descartarán aquellos tubos que presenten rayaduras, ya que
afectarán los tiempos de coagulación.
Es imprescindible la limpieza perfecta del material. De ordinario se realiza del
siguiente modo:
 Lavado del material con agua y detergente no iónico, cepillar
enérgicamente.
 Enjuagar con agua destilada (repetir este paso varias veces).
 Secar en estufa.
Ocasionalmente puede colocarse el material de vidrio en mezcla sulfocrómica
para eliminar restos de reactivos y proceder a una limpieza más profunda aún.
7
CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE
HEMOSTASIA
Para obtener un buen resultado de laboratorio es imprescindible que se
cumplan correctamente con todas las etapas de una buena metodología
diagnóstica: Preanalítica, Analítica y Postanalítica.
Etapa Preanalítica: Las variables preanalíticas son todos aquellos factores
que afectan a la calidad de la muestra (identificación, condiciones previas del
paciente, correcta toma, conservación y transporte de la muestra) hasta el
momento de su procesamiento. A todo paciente que consulta por una
alteración de la hemostasia se le debe realizar una correcta anamnesis. La
misma debe contener datos como edad, ocupación, ingesta de medicamentos,
sangrados por mucosas (gingivorragias, epistaxis, melena, hematuria,
menstruaciones), operaciones previas, embarazos, abortos, enfermedades
metabólicas como diabetes, insuficiencia renal, dislipemias y antecedentes
familiares.
Para la toma de muestra el paciente debe concurrir con 8-12 hs de ayuno
previo y con escasa actividad física.
Dentro de la etapa preanalítica se considera el perfecto estado y la adecuada
selección de los materiales a utilizar para la extracción, incluyendo el
anticoagulante y la limpieza del material.
La calidad del examen de coagulación depende muy estrechamente de la
toma de muestra.
Etapa Analítica: Involucra la realización de la técnica solicitada, la cual debe
estar perfectamente estandarizada. Se deben procesar los controles de
calidad correspondientes.
El término control de calidad describe el conjunto de medidas que se realizan
para asegurar la veracidad del dato obtenido en el laboratorio, es decir la
calidad analítica.
El programa de administración de calidad debe comprender:
1- Mantenimiento del equipamiento (coagulómetros).
2- Calibración de pipetas automáticas y sistemas dilutores.
3- Realizar diariamente el procesamiento del control de calidad interno.
4- Participar de un control de calidad externo.
5- Evaluar la veracidad del dato.
Etapa Postanalítica: Comprende la validación y la emisión de los resultados.
La emisión de los resultados debe ser rápida y clara; los informes deben incluir
la técnica utilizada, los valores de referencia para la técnica y la firma del
profesional responsable del sector. Es responsabilidad del personal del
laboratorio validar clínicamente los resultados, para lo cual se requiere
combinar los datos clínicos con los hallazgos del laboratorio para investigar si
estos hallazgos son causa o efecto de la patogénesis de la enfermedad.
TOMA DE MUESTRA
Consideraciones
8
 Para la extracción de sangre se debe utilizar jeringas plásticas y agujas
descartables calibre 19 o 20 G. Los tubos para recoger la muestra deben ser
de plástico.
 La punción debe ser precisa y rápida, logrando una buena canalización.
La velocidad de salida de la sangre debe ser semejante a la del flujo
sanguíneo. Evitar la entrada de aire y la formación de burbujas, el éstasis y la
contaminación con tromboplastina tisular (evitar el uso prolongado de
torniquete). Ante una extracción dificultosa se debe proceder al cambio de
jeringa luego de extraer 2-3 mL de sangre.
 Transvase: retirar la aguja de la jeringa y verter la sangre por la pared de
los tubos suavemente, a igual velocidad que la extracción, hasta la marca
prevista. Mezclar inmediatamente por inversión suave varias veces.
 Anticoagulante: la proporción de anticoagulante habitual es 1 parte para 9
partes de sangre. Tener presente que se deberá ajustar la relación
anticoagulante/sangre en caso de hematocritos superiores a 55% (Figura N°1
y Tabla N° 2).
 Centrifugación: Inmediata (antes de los 20 minutos de realizada la
extracción). Para obtener:
Plasma rico en plaquetas (PRP): centrifugar a 900 r.p.m. durante 5 minutos.
Plasma pobre en plaquetas (PPP): se obtiene por doble centrifugación
(primero de sangre entera y luego el plasma citratado y separado) a 3.000
r.p.m. durante 10 minutos cada vez.
 Transvase: transferir el plasma inmediatamente a tubos plásticos con
pipetas plásticas. En caso de no poder realizar las pruebas dentro de las 2
horas posteriores a la extracción, el plasma se mantendrá a 4ºC. Si las
muestras no se procesan en el día, guardar el plasma en freezer (-20ºC).
FIGURA N°1: La relación del anticoagulante con el volumen plasmático depende del
hematocrito
Alto
9
TABLA N° 2. Relación anticoagulante/sangre según el hematocrito
HEMATOCRITO
(%)
Volumen de anticoagulante (mL) para
un volumen total de sangre de
5 mL
10 mL
30
0,62
1,20
35
0,57
1,13
40
0,54
1,07
45
0,50
1,00
50
0,46
0,94
55
0,43
0,87
60
0,39
0,80
65
0,35
0,74
70
0,32
0,66
75
0,28
0,60
80
0,25
0,53
PRUEBAS PARA EL ESTUDIO DE LA COAGULACIÓN
SANGUÍNEA
ORIENTACIÓN POR EL LABORATORIO DE LOS TRASTORNOS DE LA
HEMOSTASIA
La realización e interpretación de las pruebas de hemostasia deben siempre
subordinarse a los hallazgos del examen clínico. Las pruebas pueden dividirse
en:
a) Pruebas globales de coagulación: se investigan, en conjunto, los
diferentes componentes del mecanismo hemostático (vascular, plaquetario, pro
coagulante o fibrinolítico) o vías de activación de algunos de estos
componentes. Sus resultados indican que hay una alteración pero sin
identificar los factores implicados en ella.
Tiempo de protrombina: (TP): vía extrínseca.
Tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT): vía intrínseca.
Tiempo de trombina (TT): etapa final de la coagulación.
Tiempo de Sangría (TS): cantidad y calidad de plaquetas, fibrinógeno y
subendotelio.
Retracción del coágulo (RC): cantidad y calidad de plaquetas.
Lisis de sangre entera: evalúa activadores e inhibidores del sistema
fibrinolítico.
Lisis de euglobulinas: evalúa los activadores del sistema fibrinolítico.
10
Tromboelastografía: brinda una visión global del proceso de
coagulación desde la formación inicial de trombina hasta el proceso de
fibrinolisis incluyendo las plaquetas
b) Pruebas específicas: se analizan en forma selectiva los factores o
elementos que intervienen o forman parte del compartimiento que se halló
anormal con la realización de las pruebas globales.
1) Pruebas para el estudio de la vía intrínseca de la coagulación







Tiempo de coagulación
Tiempo de coagulación activado*
Prueba de generación de tromboplastina*
Tiempo de tromboplastina parcial*
Tiempo de tromboplastina parcial activado
Consumo de protrombina*
Tromboelastografía*
2) Prueba para el estudio de la vía extrínseca de la coagulación
 Tiempo de protrombina en una etapa o tiempo de Quick
3) Pruebas para el estudio de la transformación del fibrinógeno en
fibrina
 Tiempo de trombina
 Tiempo de trombina-calcio*
 Tiempo de reptilasa
4) Prueba para el estudio de la vía final común

Tiempo de Stypven o tiempo del veneno de víbora de Russell
*Las técnicas de estas pruebas pueden consultarse en la bibliografía
TÉCNICAS
TIEMPO DE COAGULACIÓN (Modificado de Lee-White)
Fundamento: Es el tiempo que tarda en coagular la sangre in vitro, al ser
extraída sin mayor contaminación con tromboplastina tisular.
Procedimiento: Obtener, mediante punción venosa 3,5 mL de sangre.
Desconectar la aguja y vaciar 1,0 mL de sangre en cada uno de 3 tubos de
hemólisis, previamente colocados en un baño a 37° C. Poner en marcha el
cronómetro al añadir la sangre al primer tubo (al llegar el tercer tubo no deben
haber transcurrido más de 5 segundos). Inclinar ligeramente el primer tubo e
investigar el deslizamiento de sangre por las paredes del tubo. Repetir la
operación cada 30 segundos hasta que la sangre coagule (deja de escurrir por
11
las paredes del tubo). Seguidamente observar el segundo tubo y se anota
como definitivo el tiempo obtenido en el tercer tubo.
Resultados
Valores de referencia: 5-15 minutos
Observaciones
Este tiempo de coagulación in vitro reflejará mejor la eficacia del sistema in
vivo, cuanto menos se modifique o manipule esta sangre, pero al carecer de
sensibilidad sólo se modifica ante deficiencias severas de factores de la
coagulación. Entre los factores de orden técnico que modifican esta prueba
podemos mencionar:
1) Contaminación con líquidos tisulares (tromboplásticos).
2) Formación de espuma.
3) Inadecuada limpieza del material.
4) Diámetro de los tubos (se recomienda usar tubos de 11 mm de diámetro)
5) Los movimientos de los tubos.
6) La temperatura.
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO (TTPA)
Fundamento: Es el tiempo que tarda en coagular el plasma pobre en
plaquetas en presencia de un activador de la fase de contacto (caolín, celite,
ácido elágico), un substituto plaquetario (cefalina o inositina) e iones calcio. El
agregado de activadores (sustancia inerte con carga negativa), tiene por objeto
uniformar la activación por contacto de todos los plasmas. El substituto
plaquetario, al ser aportado como reactivo, se encuentra disponible en su
totalidad en el momento de la recalcificación plasmática.
Cuando el activador es el caolín la prueba se denomina tiempo de
tromboplastina parcial activado con caolín (TTPK).
Esta prueba estudia globalmente calicreínas, quininógenos de alto peso
molecular, factores XII, XI, IX, VIII, X, V, II y I. La sensibilidad de la técnica no
es la misma para todos los factores, en orden decreciente tenemos: FVIII, FIX,
XI, XII y para fibrinógeno cuando su concentración es inferior a 100 mg %
Procedimiento:
En un tubo de Kahn pipetear:
- 100 µL del reactivo cefalina-caolín
- 100 µL del PPP (muestra)
Incubar el tubo en baño a 37ºC y al cabo de 3 minutos adicionar 100 µL de
cloruro de calcio 0,025 M. Simultáneamente poner en marcha un cronómetro. A
los 30 segundos observar la formación del coágulo. En el momento de su
aparición, detener el cronómetro y registrar la lectura correspondiente. Esta
determinación se efectúa por duplicado y se calcula el promedio de ambas
lecturas.
12
Resultados
Valores de referencia: 35-45 segundos.
Cada laboratorio debe establecer los valores de referencia de acuerdo al
reactivo y a la técnica empleada (manual o automatizada).
El TTPa se usa para evaluar la vía intrínseca de la coagulación, y por lo tanto
se encontrará prolongado en:
Déficit congénito de los factores XII, XI, IX, VIII, X, II y V
Alteración cualitativa de algún factor
Déficit adquirido de factores (hepatopatía, antibiótico-terapia,
alimentación parenteral, etc)
Presencia de inhibidores (específicos o de interferencia)
Pacientes heparinizados
El acortamiento del TTPA puede ser tomado como un indicio de
hipercoagulabilidad.
MONITOREO DE LA ANTICOAGULACION CON HEPARINA
Introducción
Las complicaciones tromboembólicas arteriales y venosas son susceptibles de
terapéuticas preventivas y/o resolutivas por medio de medicamentos que
afectan alguno de los mecanismos normales de la hemostasia. Los
medicamentos que afectan la cinética de la coagulación directa o
indirectamente son las heparinas y los anticoagulantes orales (dicumarínicos).
La heparina es el anticoagulante más usado por vía parenteral en medicina
clínica humana. Ejerce su efecto uniéndose a ciertas proteínas plasmáticas
llamadas serpinas, de las cuales la Antitrombina (AT) es la única que expone
su sitio activo, normalmente inaccesible, por unión a heparina. El papel
fisiológico de la AT es regular las serinoproteasas de la coagulación,
incluyendo trombina y los factores XIIa, XIa, Xa y IXa. La acción de la heparina
consiste en unirse a la AT provocando cambios conformacionales en ésta, que
hacen más asequible su sitio neutralizante y por lo tanto acelerando
enormemente su capacidad inhibitoria sobre la trombina y FXa.
Las heparinas son glicosaminoglicanos sulfatados con fuerte carga negativa,
extraídos de pulmón o mucosa intestinal de origen bovino o porcino, que se
presentan en forma de polímeros. Su efecto sobre la trombina y FXa varía de
acuerdo al peso molecular de las mismas.
En general, acción anticoagulante y antitrombótica no son términos sinónimos,
ya que la acción anticoagulante puede ser observada in vitro; la sangre en
general es poco coagulable y los tiempos de coagulación suelen estar
prolongados, siendo un proceso esencialmente plasmático; mientras que el
efecto antitrombótico es un fenómeno primordialmente observable in vivo, los
tiempos de coagulación podrían ser normales aún con buen efecto
antitrombótico, siendo un proceso multicelular en el que participan
componentes plasmáticos junto a componentes celulares como endotelio,
plaquetas, eritrocitos y leucocitos. Las heparinas de bajo peso molecular (PM
entre 4.000 y 6.500) tienen reducida su capacidad antitrombínica (anti-IIa)
medida por el alargamiento del TTPA mientras que conservan su capacidad
antitrombótica medido por su acción inhibitoria sobre el FXa. En cambio las
heparinas no fraccionadas (HNF), de alto peso molecular o convencionales
tienen tanto efecto anti-IIa como efecto anti-Xa.
13
Control de la terapéutica con heparina
Se puede realizar por varios métodos:
1. Tiempo de tromboplastina parcial activado
2. Tiempo de trombina
3. Determinación del nivel de heparinemia
La prueba de elección será aquella que tenga precisión, reproducibilidad y se
procese en un tiempo corto. El TTPA tiene la ventaja de poder ser realizado en
pocos minutos y su reproducibilidad dentro de los rangos terapéuticos es
mayor que con el tiempo de coagulación, que ha sido el método más usado en
el control. Si bien el tiempo de trombina es un método rápido y reproducible,
tiene la desventaja de que el reactivo de trombina es inestable aún conservado
a bajas temperaturas.
En el monitoreo de la terapia con HNF empleando el TTPA, se considera que
el tratamiento es adecuado cuando el APTT del paciente prolonga entre 1,5 a
2,5 veces los valores del APTT basal (esta relación se denomina razón)
razón = TTPA paciente
TTPA basal
Debe establecerse el rango terapéutico del sistema de TTPa usado (de
acuerdo al reactivo y sistema de detección), ya que para un mismo valor de
heparinemia el rango varía según el sistema de TTPA empleado.
En la práctica lo que se hace es evaluar la respuesta del sistema de TTPA en
plasma de pacientes con diferentes dosis de HNF y adoptar la razón (rango
terapéutico) que corresponda a una concentración de heparina en sangre de
0,2 a 0,4 UI/mL. Por lo tanto, se debe ajustar la dosis de heparina de manera
de mantener el TTPA entre 1,5 y 2,5 del valor basal.
PRUEBA DE CORRECCIÓN CON PLASMA NORMAL
Un TTPA prolongado se debe corregir con plasma normal. La prueba consiste
en determinar el valor de TTPA en una mezcla constituida por 1 volumen de
plasma del paciente y 1 volumen de plasma normal (relación 1/1). De esta
manera se podrá evaluar si la alteración es debida a un déficit de factores o a
la presencia de inhibidores.
P (paciente): PPP paciente
TTPA (M) - TTPA (N)
Índice de Rossner (IR) =
TTPA (P)
N (normal): PPP normal
M (mezcla): P+N
Interpretación
IR < 0,1
Corrige. Por lo tanto hay déficit de factores de la vía intrínseca.
IR > 0,1
No corrige. Hay un efecto inhibitorio.
Este valor también debe ser establecido en cada laboratorio. En nuestro
sistema se considera que corrige cuando es inferior a 0,1.
DETERMINACIÓN DEL NIVEL DE HEPARINEMIA
Se puede valorar la acción de la heparina de bajo peso molecular mediante
metodología que mide directamente su capacidad de potenciar la inhibición del
14
FXa por la AT, para ello se desarrollaron métodos coagulables y métodos
amidolíticos.
TIEMPO DE QUICK O TIEMPO DE PROTROMBINA EN UNA ETAPA
Fundamento: Es la medida del tiempo de coagulación de un plasma citratado
en presencia de un exceso de tromboplastina tisular e calcio.
Esta prueba evalúa la eficiencia del mecanismo extrínseco de la coagulación.
Es más sensible a los defectos de los factores VII, X y V que a la deficiencia de
factor II. La presencia de heparina en concentraciones mayores a 150 µg/mL,
niveles disminuidos de fibrinógeno (< 50 mg/mL) y productos de degradación
de la fibrina por encima de 40 µg/mL prolongan el valor del TP y modifican su
validez como prueba de screening de la vía extrínseca del sistema de
coagulación.
La sensibilidad de la prueba depende de la tromboplastina utilizada y las hay
de distintos orígenes (placenta, cerebro de conejo, recombinante). Las
tromboplastinas recombinantes desarrollan una cinética de activación
demasiado rápida arrojando valores muy cortos de manera que no se detectan
variaciones muy pequeñas en las actividades de los factores de coagulación.
Procedimiento
Colocar un tubo de Kahn en baño a 37ºC y agregar los siguientes reactivos:
- 100 µL del PPP normal o del paciente e incubar 1 minuto
- 200 µL de tromboplastina cálcica
Disparar el cronómetro cuando se adiciona el reactivo y registrar el tiempo de
coagulación. La prueba se realiza por duplicado.
Resultados
El tiempo de protrombina (TP) puede ser expresado de diferentes maneras:
1. En segundos: los valores de referencia están entre 11-14 segundos (con
tromboplastina humana o de conejo) según la actividad de la
tromboplastina. Los duplicados no deben diferir en más de 0,5 segundos
con tiempos cortos y no más de 2-3 segundos en tiempos mayores de 30
segundos.
2. Concentración o actividad protrombínica %: calculado en relación a
curvas de referencia obtenidas por dilución de plasmas normales en
solución fisiológica (ver más adelante).
Valores de referencia: 70-120 %
Esta es la forma más indicada de informar en los estudios de rutina.
3. Cociente o razón
TP del plasma del paciente
Razón= —————————————————
TP promedio de los plasmas normales
Esta expresión ha mostrado ser la más indicada para el control de la
anticoagulación con antagonistas de la vitamina K (anticoagulantes orales), al
disminuir los efectos de las variaciones intra como interlaboratorio, si bien ello
no es suficiente para eliminar las variaciones debidas a la utilización de
reactivos de distinta sensibilidad.
15
CURVA DE CALIBRACIÓN
Preparar diluciones de un pool de plasmas normales (mezcla en partes iguales
de plasma fresco citratado, de por lo menos 20 dadores normales) en solución
fisiológica, según se indica en la tabla y determinar el TP para cada dilución.
Realizar cada determinación por duplicado. Al usar solución fisiológica como
diluyente, se produce una dilución progresiva del fibrinógeno, que afecta la
formación y visualización de la malla de fibrina. Por ello, se aconseja mover
lentamente el tubo para observar la formación del coágulo, luego de
transcurrido un tiempo equivalente al tiempo de coagulación de la dilución
anterior.
TUBO
Nº
1
2
3
4
5
6
7
SOLUCION
FISIOLOGICA (mL)
0,3
0,5
0,6
0,7
0,8
1,75
POOL NORMAL
(mL)
1
0,7
0,5
0,4
0,3
0,2
0,25
CONCENTRACION
(%)
100
70
50
40
30
20
12,5
TIEMPO DE COAGULACIÓN (SEG)
Graficar en papel milimetrado el tiempo promedio de cada dilución, expresado
en segundos, en función del porcentaje de actividad. Trazar la hipérbola
correspondiente. Cuando se grafican logaritmos, la curva se transforma en una
recta.
ACTIVIDAD PROTROMBÍNICA (%)
Resultados
Se expresan en porcentaje de actividad en relación a la mezcla de plasmas
normales, al cual se asigna por definición 100% de actividad. Obtenido el
tiempo de coagulación, extrapolar en la curva de calibración e informar la
actividad del plasma analizado.
La curva se debe realizar para cada lote de tromboplastina, para cada aparato
y metodología utilizada (una curva para el método manual y una curva para
cada coagulómetro).
16
Valores de referencia: 70-120 %
Cada laboratorio debe establecer su rango de referencia determinando el TP
en por lo menos 20 individuos sanos que incluyan mujeres y varones, con
edad entre 14-70 años.
La prolongación del TP puede deberse a:
Síntesis disminuida por alteraciones en la función hepática.
Alteraciones en el ciclo de la vitamina K (alteración en la actividad
procoagulante pero con síntesis normal).
Deficiencia congénita de alguno de los factores.
Presencia de un inhibidor adquirido que interfiera en la vía extrínseca.
Observaciones
Cuando el plasma se diluye en solución fisiológica, todos los factores están
igualmente reducidos, en cambio, en los pacientes tan sólo uno o algunos de
estos factores pueden estar disminuidos; por lo tanto el porcentaje global
obtenido no es reflejo proporcional del defecto presente.
La expresión del TP en porcentaje es útil en los pacientes sin anticoagulación
oral y es la más indicada en los estudios de rutina.
PRUEBA DE CORRECCIÓN CON PLASMA NORMAL
Un TP prolongado se debe corregir con plasma normal, en una relación 1/1,
para evaluar si la alteración es debida a un déficit de factores o a la presencia
de inhibidores.
Si la prolongación de la prueba es debida al déficit de uno o más factores
intervinientes en el TP, el valor obtenido en el TP de la mezcla (TPM) tendrá un
valor igual o superior al TP teórico calculado. Es decir, la prueba CORRIGE
porque el plasma normal aporta el o los factores ausentes en el plasma del
paciente.
TPM ≥ TPteórico calculado → CORRIGE
Se considera que la prueba de corrección NO CORRIGE cuando la misma
exhibe tiempos prolongados, sugiriendo la presencia de un inhibidor.
TPM < TPteórico calculado →
NO CORRIGE
El TP teórico se calcula de la siguiente manera:
TPP + TPN
TPteórico calculado = —————————
2
TP P : paciente
TP N : normal
Ejemplo:
TPP = 30 %
TPN = 100%
TP teórico calculado = 65 %
Si el TPM obtenido es mayor o igual a 65% significa que la prueba corrige
(déficit de factores), mientras que si el valor obtenido es menor de 65%
significa que no corrige (presencia de un inhibidor).
17
ESTANDARIZACIÓN DEL CONTROL DE LA TERAPÉUTICA CON
ANTICOAGULANTES ORALES
CALIBRACIÓN DE LAS TROMBOPLASTINAS
Introducción
El tratamiento y la profilaxis de los trastornos trombóticos se realiza mediante
la administración oral de medicamentos anticoagulantes a base de cumarinas.
Estos interfieren en la producción hepática de los factores de coagulación
vitamina K dependientes.
La dosis adecuada de estos medicamentos se ajusta según el resultado del
TP, en la cual se usa como reactivo la tromboplastina. Las diversas
tromboplastinas preparadas varían en su reacción (sensibilidad) al efecto
anticoagulante de las cumarinas.
El uso de tromboplastinas calibradas permite relacionar, en una escala común,
los TP obtenidos con diferentes tromboplastinas, y por lo tanto comparar el
efecto anticoagulante independientemente de la tromboplastina utilizada. De
esta manera se puede normalizar el control del tratamiento con
anticoagulantes orales.
Cada lote de tromboplastina debe ser calibrado contra una preparación estable
de referencia, la que debe ser similar y del mismo origen (especie) que el lote
a calibrar. Existen preparaciones de referencia de origen humano, bovino y de
conejo
Tromboplastinas de origen humano
 Primera preparación de referencia primaria de tromboplastina humana
combinada (67/40).
 Segunda preparación internacional de referencia primaria de
tromboplastina simple (BCT 253).
 Primer reactivo nacional argentino de referencia de tromboplastina de
cerebro humano (RNAT).
 Primer reactivo nacional argentino de trabajo de tromboplastina de cerebro
humano.
En 1983 el Comité de expertos de la OMS modificó el tratamiento estadístico
del modelo de calibración propuesto por Biggs y Denson. La sensibilidad de un
lote de tromboplastina en relación a la referencia internacional, se expresa
mediante el Indice de Sensibilidad Internacional (ISI) y los resultados del
control de anticoagulación, en Razón Internacional Normatizada (RIN).
CÁLCULO DEL ÍNDICE INTERNACIONAL DE SENSIBILIDAD (ISI)
1. Se determina el TP a 20 dadores normales y a 60 pacientes bajo tratamiento
anticoagulante por vía oral, con más de 3 meses de tratamiento y sin otro
trastorno de la hemostasia, utilizando la tromboplastina a calibrar y la de
referencia .
2. Graficar en escala doble logarítmica los TP obtenidos con la preparación de
referencia en función de los TP obtenidos con el lote a calibrar. Establecer
la recta de ajuste por el método de regresión ortogonal. La pendiente de la
recta se denomina índice de sensibilidad del lote (b) en relación a la
referencia empleada. Conociendo el ISI de la referencia (ISI r) se calcula el
ISI del lote :
18
ISI = b x ISIr
El ISI de la tromboplastina de referencia es = 1
No deben utilizarse tromboplastinas que tengan ISI superior a 1,2
Resultados
Expresión del control de la terapéutica anticoagulante oral en Razón
Internacional Normatizada (RIN)
Primero se calcula el cociente r:
r = TP del plasma del paciente anticoagulado
TP promedio de los plasmas normales
Luego, conociendo el ISI de la tromboplastina usada en la determinación, se
calcula el RIN mediante la fórmula:
RIN = rISI
TIEMPO DE TROMBINA
Fundamento: Esta prueba mide el tiempo de coagulación del plasma citratado
en presencia de una cantidad fija de trombina. Permite evaluar la
transformación del fibrinógeno en fibrina, excluyendo la participación del
Factor XIII. Concentraciones de PDF/pdf mayores a 40 µg/mL prolongan el
Tiempo de Trombina (TT), la prueba es alterada por trazas de heparina pero
con valores mayores de 60 segundos no se correlaciona con la heparinemia.
Reactivos y Procedimiento
19
 Solución de trombina de origen humano o bovino (100 U/mL). Se diluye en
el momento de ser utilizada de modo tal que la prueba realizada con plasma
normal dé un valor de 18 a 20 segundos (aproximadamente 5 U/mL).
En un tubo de vidrio previamente incubado durante 1 minuto en un baño de
agua a 37 °C colocar:
- 200 µL de PPP (normal o problema)
Incubar durante 30 segundos.
- 100 µL de la solución de trombina diluída.
A los 5 seg aproximadamente comenzar a investigar la formación de la red de
fibrina y registrar el tiempo de coagulación. Realizar la prueba por duplicado.
Resultados
Valores de referencia: entre 15-20 segundos.
Se informa el tiempo de coagulación de la muestra expresado en segundos,
junto con el tiempo de trombina del plasma normal (control).
Esta prueba se ve alterada por anomalías cualitativas (el fibrinógeno fetal
presenta prolongación de esta prueba por su contenido en ácido siálico) y
cuantitativas del fibrinógeno; inhibidores adquiridos del tipo antitrombina,
productos de degradación de la fibrina y/o fibrinógeno; presencia de
paraproteínas. Si bien esta prueba se prolonga por la presencia de heparina,
no se utiliza para monitorear el tratamiento con este anticoagulante por su gran
sensibilidad. Los pacientes con tratamientos crónicos con dicumarínicos
presentan un TT 4 a 6 segundos mayor que el de referencia.
TIEMPO DE REPTILASA
Fundamento: Esta prueba mide el tiempo de coagulación del plasma citratado
por acción de una enzima derivada del veneno de víbora Bothrops atrox, la
reptilasa. La enzima promueve la transformación del fibrinógeno en fibrina, por
su acción proteolítica semejante a la de la trombina. La reptilasa escinde el
fibrinopéptido A de la molécula del fibrinógeno y no es inhibida por la
antitrombina, por lo que el tratamiento con heparina no interfiere o afecta su
actividad.
Procedimiento
En un tubo de vidrio, incubado durante 1 minuto en un baño de agua a 37ºC,
colocar:
- 150 µL de PPP (normal o problema)
Incubar durante 1 minuto.
- 50 µL de reactivo (extracto purificado del veneno de Bothrops atrox)
Registrar el tiempo de coagulación. La prueba debe realizarse por duplicado.
Resultados
Valores de referencia: 15-22 segundos
Se informan los tiempos de coagulación expresados en segundos del plasma
problema y del plasma normal. Se considerará prolongado cuando la
diferencia con el control resulte mayor de 5 segundos.
Esta prueba es de utilidad para el estudio de las disfibrinogenemias congénitas
y adquiridas (hepatopatías, macroglobulinemias). El Tiempo de reptilasa no se
altera por la presencia de heparina ni de hirudina, pero sí por niveles elevados
de PDF/pdf.
20
TIEMPO DE STYPVEN
Fundamento: El reactivo de Stypven (veneno de víbora de Rusell) contiene un
complejo enzimático con actividad sobre los factores de la coagulación. Ha
sido demostrado que los componentes del veneno activan directamente el FX
a FXa sin la participación de otros factores de la coagulación. Esta propiedad
es empleada para diferenciar una deficiencia del FVII de una deficiencia de
FX.
El tiempo de coagulación del plasma, desencadenado por el agregado del
reactivo de Stypven, es independiente de la concentración del Factor VII en la
muestra.
Procedimiento
Colocar en baño de agua a 37° C un tubo de vidrio y agregar los siguientes
reactivos:
- 100 µL de PPP (normal o problema)
- 100 µL de Stypven-cefalina.
Incubar 30 segundos exactamente y adicionar
- 100 µL de CaCl2
Registrar el tiempo de coagulación de la muestra.
Resultados
Valores de referencia: 10-17 segundos
Se informan los tiempos de coagulación expresados en segundos del plasma
problema y del plasma normal.
DETERMINACIÓN DE LOS FACTORES DE COAGULACIÓN
El estudio de los factores de coagulación comprende:
1. La determinación funcional.
2. La determinación inmunológica.
La determinación funcional se puede realizar dosando la actividad coagulante
de los factores empleando para ello un sistema coagulable. Además, se puede
determinar la actividad amidolítica, mediante la utilización de péptidos
sintéticos (sustratos cromogénicos), cuya secuencia de aminoácidos es
semejante a los sustratos naturales.
En general, existe correlación entre la actividad coagulante y la actividad
amidolítica, excepto en ciertas alteraciones moleculares. Cuando este defecto
implica cambios estructurales que alteran la interacción con el sustrato natural,
aunque no afecten el sitio activo, ello disminuye la actividad coagulante y, en
cambio, no afectan la interacción con el sustrato sintético, manteniéndose la
actividad amidolítica.
En la determinación inmunológica de la concentración de proteína plasmática
completa, se pueden usar diversas técnicas: radioinmunoensayo,
enzimoinmunoensayo,
inmunodifusión
radial,
electroinmunodifusión,
inmunoturbidimetría, inmunonefelometría, etc. El empleo de estas técnicas ha
demostrado que factores con niveles antigénicos normales (cantidad de
proteína) pueden tener alteraciones moleculares de causa congénita o
adquirida, que disminuyen su actividad biológica en los sistemas de
coagulación o sustratos cromogénicos. Estas modificaciones cualitativas de los
factores pueden ser evidenciadas por: inmunoelectroforesis cruzada, técnicas
cromatográficas, análisis de secuencia de aminoácidos, y otras.
21
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DE LOS
FACTORES VIII, IX, XI Y XII, PRECALICREÍNA Y QAPM
Introducción
La prueba de elección para el análisis del mecanismo intrínseco, por su
sensibilidad para detectar alteraciones de los factores de esta vía, es el tiempo
de tromboplastina parcial activado (TTPA).
La cuantificación de la actividad coagulante de los factores que pertenecen
exclusivamente a la vía intrínseca se realiza mediante técnicas en una etapa,
en un sistema de coagulación similar a la prueba del TTPA utilizando como
sustratos, plasmas carentes de la actividad procoagulante del factor a
determinar. El tiempo de coagulación será inversamente proporcional a la
concentración plasmática del factor limitante.
Los factores VIII y IX también pueden ser determinados por técnicas en dos
etapas, cuyo fundamento es la prueba de generación de tromboplastina.
Ambas técnicas presentan ventajas y desventajas. Los métodos en una etapa
son rápidos, sencillos y los resultados tienen buena correlación con la clínica y
con la respuesta luego de la terapéutica sustitutiva. Como inconveniente está
la necesidad de contar con plasma humano deficiente como sustrato. En la
actualidad existen plasmas sustratos comerciales, los cuales fueron obtenidos
por adsorción inmunológica del factor en cuestión a partir de plasmas
normales. Estos métodos se ven afectados por la presencia de inhibidores.
Los métodos en dos etapas no requieren el uso de plasmas deficientes, son
más precisos a bajas concentraciones del factor a determinar y no son
sensibles a la presencia de inhibidores. En cambio, son laboriosos y lentos.
DETERMINACIÓN DE FACTOR VIII.c: MÉTODO EN UNA ETAPA
Fundamento: El método usa un sistema de coagulación semejante al TTPA,
que aporta todos los factores excepto el Factor VIII. El tiempo de coagulación
de este sistema es inversamente proporcional a la actividad coagulante del
FVIII del plasma del paciente.
Reactivos
 Plasma humano deficiente en FVIII (plasma humano hemofílico A severo:
FVIII menor de 1 U/dL, sin inhibidor)
 Reactivo cefalina-caolín
 CaCl2 0,025 M
 PPP
 Tampón de dilución: Tampón de Owren modificado pH 7,35 (Ver reactivos
de uso general)
Procedimiento
- 100 µL de reactivo para FVIII diluído 1/2 en tampón de Owren modificado
pH 7,35.
- 100 µL de PPP diluído 1/2 en tampón de Owren modificado pH 7,35.
- 100 µL de reactivo cefalina-caolín.
Incubar 2 minutos a 37 C.
- 100 µL 0,1 mL de CaCl2 0,025 M.
Registrar el tiempo de coagulación.
22
Resultados: Los resultados se expresan en unidades por mililitro (U/mL) o en
%, deducidos de una curva de valoración construída utilizando una mezcla de
plasmas normales (estándar de trabajo) de actividad conocida (0.1 U/mL o
100%).
Curva de calibración
DILUCIÓN DEL PLASMA
DE REFERENCIA
1/2
1/4
1/8
1/20
1/40
1/80
%
100
50
25
10
5
1
Con cada una de estas diluciones se realiza el procedimiento antes explicado,
de tal manera que para cada concentración se obtendrá un tiempo en
segundos. La curva se construye en papel doble logarítmico, anotando las
concentraciones (U/mL) sobre la abscisa y los tiempos de coagulación
(segundos) sobre la ordenada. De la recta resultante, se deduce la
concentración de FVIII:c del plasma problema.
Valores de referencia: 0.5-1.50 U/mL ó 50-150 %
Observaciones. Inicialmente se usó plasma hemofílico sin diluír, pero la
dilución 1/2 da resultados similares, por lo tanto se usa esta última para
ahorrar plasma.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DE LOS FACTORES
II, V, VII Y X
Introducción
La prueba del tiempo de Quick permite evidenciar la actividad del mecanismo
extrínseco de la coagulación. La cuantificación de la actividad coagulante de
los factores II, V, VII y X por métodos en una etapa, se fundamenta en una
modificación del tiempo de Quick, usando como sustrato un plasma deficiente
en el factor a investigar. El tiempo de coagulación de este sistema es
inversamente proporcional a la actividad funcional (coagulante) del factor
presente en el plasma en estudio.
DETERMINACIÓN DEL FACTOR V
Método en una etapa
Fundamento. El método para dosar el FV utiliza como sustrato un plasma
artificialmente desprovisto de FV, que aporta los factores II, VII, X y
fibrinógeno. El tiempo de coagulación de la mezcla del plasma problema
(diluído), el reactivo para FV, la tromboplastina y el calcio, dependerá de la
concentración del FV en el plasma incógnita.
Reactivos
 Plasma deficiente en FV
 Tromboplastina de cerebro humano o de conejo
 Cloruro de calcio 0,025 M
23
 Tampón de Michaelis pH 7,35 (ver reactivos) para realizar las diluciones
 PPP
Procedimiento
Colocar en un baño de agua a 37ºC un tubo de vidrio y agregar los siguientes
reactivos:
- 100 µL de plasma deficiente en FV
- 100 µL de PPP diluído 1/10 en tampón de Michaelis
- 100 µL de tromboplastina
Incubar exactamente 20 segundos
- 100 µL de CaCl2 0,025 M
Registrar el tiempo de coagulación de la mezcla.
Resultados
Los resultados se expresan en unidades por decilitro (U/dl ó en %) y se
deducen de una curva de calibración construida empleando como calibrador
un plasma de referencia o un pool de plasmas normales. Cada nuevo lote de
reactivos debe ser controlado, trazando la curva correspondiente.
Curva de calibración
DILUCIÓN DEL
PLASMA CONTROL
1/10
1/20
1/40
1/80
%
100
50
25
12,5
Se grafica en papel doble logarítmico, colocando sobre la abscisa las
concentraciones del factor (%) y los tiempos de coagulación (segundos) sobre
la ordenada De la recta resultante, se deduce la concentración de FV en el
plasma problema.
Valores de referencia: 0.7-1.2 U/dL ó 70-120 %
Observaciones
Se usa el plasma del paciente diluído porque aumenta la sensibilidad de la
técnica.
DETERMINACIÓN DE FIBRINÓGENO: MÉTODO FUNCIONAL DE CLAUSS
Fundamento: El tiempo de coagulación del plasma, por acción de un exceso
de trombina, es inversamente proporcional a la concentración plasmática de
fibrinógeno.
Reactivos
 Tampón imidazol pH 7,5 (ver reactivos)
 Solución fisiológica.
 Solución de trombina 100 U/mL en solución fisiológica.
 PPP
 Estándar de fibrinógeno.
Procedimiento
Colocar un tubo de vidrio en baño de agua a 37°C y adicionar los siguientes
reactivos:
- 100 µL de PPP diluído 1/10 en tampón imidazol pH 7,5.
Incubar durante 30 segundos.
24
- 100 µL de de la solución de trombina (100 U/mL).
Mezclar suavemente y registrar el tiempo de coagulación de la mezcla. La
prueba debe efectuarse por duplicado.
Resultados
Los resultados se expresan en gramos de fibrinógeno por 1itro de plasma La
concentración se deduce de una curva, en escala logarítmica, del tiempo de
coagulación (segundos) en función de la concentración de fibrinógeno (g/L).
Para realizar la curva se preparan diluciones (1/5, 1/10, 1/20, 1/40) del
estándar de fibrinógeno en tampón imidazol pH 7,5 y luego se determina el
tiempo de coagulación por acción de la trombina para cada dilución.
El tiempo de trombina de la muestra incógnita se interpola en la curva y se
obtiene la concentración de fibrinógeno.
Valores de referencia: 1,7-4,0 g/L
Los siguientes algoritmos resultarán útiles en la interpretación de las pruebas
de uso frecuente en el laboratorio de hemostasia.
Paciente con: TP alterado, APTT normal
Realizar TP en mezcla con plasma normal (1+1)
No corrige
Corrige
Dosaje de los factores
de la vía extrínseca
Búsqueda de Inhibidor
Paciente con: APTT alterado, TP normal, TT normal
APTT con incubación
Prolongada 20 min a 37°C
Corrige
No Corrige
Realizar APTT en mezcla
con plasma normal
Dosaje de
precalicreínas
Corrige
Dosaje de factores
de la vía intrínseca
No Corrige
Búsqueda de
inhibidor
25
Paciente con: TT alterado, TP normal, APTT normal
Realizar TT en mezcla con
plasma normal (1+1)
Corrige
No Corrige
Dosaje de
Fibrinógeno
Tiempo de Reptilasa
Alterado
Normal
Disminuido
Hipo o afibrinogenemia
Congénita o adquirida
Disfrinogenemia
Congénita o adquirida
Inhibidor tipo
heparina
BIBLIOGRAFÍA
 Manual de Hematología de la Academia Nacional de Medicina. 1990.
 Manual de Hemostasia y Trombosis - Grupo Cooperativo de Hemostasia y
Trombosis (Grupo CLAHT). 1990.
 Hemostasia y Trombosis Técnicas e interpretación. Dr. Edgardo Iglesias 1978.
 Guía de trabajos prácticos de Hemostasia. Universidad de Buenos Aires.
Departamento de Análisis Clínicos – 1987.
 Wintrobe’s Clinical Hematology . 9ª Edición. 1993.
 Trombosis. Tomo 1. Raúl Altman y colaboradores. 2005.
 Fundamentos para el Manejo Práctico en el Laboratorio de Hemostasia. Grupo
CAHT (Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis). 2003.
 Guías de Trabajo Práctico del Curso de Posgrado Avances en Hemostasia 1999.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA.
 Monroe D.M., Hoffman M. What does it to make the perfect clot? Arterioscler
Thromb Vasc Biol. 2006; 26:41-48.
 Roberts H.R., Monroe D.M., Escobar M.A. Current concepts of Hemostasis.
Anesthesiology V 100, N° 3, Mar 2004.
 Collection, transport and processing of blood specimens for testing plasma based
coagulation assays and molecular hemostasis assays. Approved guideline- Fifth
edition. NCCLS 2012; 28(5).