revista_biotecnologia I

CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA DE ALFA-AMILASA
Y GLUCOAMILASA EN LA HIDRÓLISIS DE
ALMIDÓN DE YUCA (manihot esculenta)
ENZYMATIC ALPHA-AMYLASE AND GLUCOAMILASA
CHARACTERIZATION IN CASSAVA STARCH HYDROLYSIS
INGRID MERA, JOSE LUIS HOYOS, JORGE CARRERA, CLARA LUZ FORERO, REINALDO VELASCO1
PALABRAS CLAVE:
RESUMEN
Almidón, amilosa, amilopectina,
hidrólisis enzimática, alfa amilasa y
glucoamilasa.
Para desarrollar la hidrólisis enzimática de almidón de yuca usando enzimas
comerciales (alfa amilasa y glucoamilasa). Se inicio con el proceso de caracterización de las materias primas, al almidón de yuca producido en el Departamento del Cauca, obtenido de la Cooperativa de Rallanderos
(COPRACAUCA) se le realizó el análisis bromatológico, se determino la
relación amilosa/amilopectina y se encontraron las condiciones óptimas de
operación en el proceso de hidrólisis con las enzimas comerciales de Novo
Nordisk. También se caracterizaron las enzimas comerciales para observar
su comportamiento en temperatura como en acidez.
KEY WORDS:
Starch, amylese, amylopectim,
hydrolisis, enzyme´s, alfa amilase,
glucoamilase.
ABSTRACT
In order to develop the enzymatic hydrolysis of cassava starch using
commercial enzymes (alpha amilasa and glucoamilasa). The process initial
was the charac-terization of the raw materials, the starch from mandioca
was obtained in the Departmento del Cauca, of the Cooperativa de
Rallanderos (COPRA-CAUCA) It's was carried out the analysis and look
the relationship amilosa/amilopectina and they were the good conditions
of operation in the hydrolysis process with Novo Nordisk's commercial
enzymes. The commercial enzymes were also characterized in order to
observe their behavior in temperature like in acidity
____________
Recibido para evaluación: Diciembre 2 de 2002. Aprobado para publicación: 28 de febrero de 2003.
1
Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ingeniería Agroindustrial, Proyecto Producción de glucosa farmacéutica a partir de
almidón de yuca, Grupo de Investigación Asubagroin, Universidad del Cauca. 2003.
Correspondencia: Jorge Eliécer Carrera, e_mail: [email protected]
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Vol 1 No.1 Marzo 2003
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INTRODUCCIÓN
La yuca (Manihot esculenta) es una planta originaria de
la América tropical. Los principales países productores
son Brasil, Zaire, Nigeria e Indonesia. La yuca, uno de
los productos tradicionales de la agricultura nacional,
se convirtió en fuente básica del desarrollo económico
y social en el norte del Cauca generando un perfil industrial que beneficia directamente a casi 28 mil e indirectamente a miles de personas más. Es así como en el
norte del Cauca se encuentran 170 rallanderías con capacidad de procesamiento de 1.000 - 2.500 Kg. de yuca
fresca/día. De 100 Kg. de yuca fresca, se producen 20
Kg. de almidón, 6.5 Kg. de afrecho (subproducto de
mediana finura constituido por fibra y porciones de raíces) y 1.5 Kg. de mancha. Estos volúmenes de producción de almidón benefician al sector agrícola al dar un
valor agregado a la yuca, pero al mismo se le puede dar
un mayor valor si se lo somete a un proceso de transformación nivel 2, como el de la hidrólisis enzimática para
la producción de glucosa (9). En los procesos
enzimáticos, tales como producción del jarabe de la glucosa, el almidón es generalmente el componente principal de las mezclas de reacción.
Hay tres etapas en la conversión del almidón:
•
•
•
Gelatinización, implicando la disolución de los
gránulos del almidón para formar una suspensión
viscosa.
Licuefacción, implicando la hidrólisis parcial del
almidón.
Sacarificación, implicando la producción de la
glucosa y de la maltosa por hidrólisis adicional.
MATERIALES Y MÉTODOS
Caracterización del Almidón de Yuca (3)
El almidón se obtuvo de la cooperativa de rayanderos
COPRACAUCA.
Determinación de Humedad. La humedad de la muestra
se extrae por evaporación a temperatura de 100-105° C
hasta peso constante, considerándose que la pérdida
de peso es agua .
Determinación de Cenizas totales. El método se basa
en la eliminación de la materia orgánica de un material
por medio de incineración a 600° C. El residuo restante
se considera que son las cenizas.
Determinación del Extracto Etéreo o Grasa bruta.
Se determino utilizando en método de Soxlhet
(gravimetricamente).
Determinación de Nitrógeno (Proteína). Se determinó a través del de método de Kjeldhl.
Determinación de la relación amilosa/amilopectina.
Caracterización de las Enzimas
Se utilizaron dos tipos de enzimas amilolíticas para el
desarrollo del proceso a nivel de pruebas de laboratorio
donadas por Novo Nordisk (1,6,2)
A. α - Amilasa. (BAN) (Tabla 1)
B. Glucoamilasa. (AMG) (Tabla 1)
Caracterización de la Alfa-Amilasa (7,8)
Comportamiento de la Actividad de la Enzima con
la Variación de pH
Se prepararon 5 muestras cada una con 3 repeticiones
de 10 ml al 30% en peso (base húmeda) de almidón en
agua; se mantuvo la temperatura a 60ºC. Se agregó
CaCl2 y Buffer fosfato o acetato de sodio, para hacer
variar el pH en un rango de 5.0 - 7.0 Se agregó la enzima a - amilasa en una concentración 0.1% de acuerdo
con las recomendaciones del fabricante. Posteriormente, se tomaron muestras de la solución a los 90 min.
Para obtener la concentración de almidón realmente
deseada. La cantidad de almidón hidrolizado se dividió
sobre el máximo teórico hidrolizado (1.000 g de almidón/g enzima). Ésta relación se multiplico por 100 y se
llamo % de actividad.
Tabla 1. Protocolo de enzimas comerciales marzo de
2003.
ENZIMA
Rango de
Temperatura (°C)
Rango de pH
Unidad Kilo Novo
(KNu/g)
Concentración de
Calcio (ppm)
Dosis enzima
(Kg/Ton)
Sustrato (% p/p)
Estabilizador de pH
Fuente: Novo, (4)
BAN
AMG
60 – 80
70 – 80
5–7
4.5 – 5.5
480
300
100-150
1.0-1.5
1.1-1.3
30
30
Fosfato
monosodico
Acetato Na
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Vol 1 No.1 Marzo 2003
Comportamiento de la Actividad de la Enzima con
la Variación de Temperatura
Se prepararon 5 muestras cada una con 3 repeticiones
de 10 ml al 30% en peso (base húmeda) de almidón en
agua; se mantuvo el pH en el valor optimo encontrado
controlado con buffer fosfato y CaCl2 efectuaron reacciones de 90 min., se vario la temperatura a 55 - 75ºC.
Se agregó la enzima a - amilasa en una concentración
0.1% de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Posteriormente, se tomaron muestras para obtener la concentración del almidón remanente deseada en
la solución. La cantidad hidrolizada de almidón se dividió sobre el máximo teórico hidrolizado (1.000 g de
almidón/g enzima). Ésta relación se multiplico por 100
y se llamo % de actividad.
Caracterización de la Glucomilasa (7,8)
Comportamiento de la Actividad de la Enzima con
la Variación de pH
Se prepararon 5 muestras de 250ml al 30% en peso
(base húmeda) de almidón en agua. Se realizaron
dextrinizaciones con a - amilasa en las condiciones
óptimas encontradas; se ajustó la temperatura a 60ºC +
1ºC y se agrego Acetato de Sodio buffer 0.1 M, para
hacer variar el pH en un rango de 4 a 6. Se añadió la
enzima glucoamilasa en una concentración de 0.25%,
de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Luego, se tomaron muestras de la solución a las 4.5 h
para obtener la concentración de glucosa remanente en
la solución. La cantidad glucosa se dividió sobre el
máximo teórico hidrolizado (1,125 Mm de maltosa/g
enzima). Ésta relación se multiplico por 100 y se llamo
% de actividad.
Comportamiento de la Actividad de la Enzima con
la Variación de Temperatura
Se prepararon 5 muestras de 250ml al 30% en peso (base
húmeda) de almidón en agua. Se realizaron
dextrinizaciones con a - amilasa en las condiciones óptimas encontradas; se ajustó el pH en el valor optimo encontrado con Acetato de Sodio buffer 0.1 M y se vario la
temperatura entre 55 y 75°C. Se añadió la enzima
glucoamilasa en una concentración de 0.25%, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Luego, se
tomaron muestras de la solución a las 4.5 h para obtener
la concentración de glucosa remanente en la solución. La
cantidad glucosa se dividió sobre el máximo teórico
hidrolizado (1,125 Mmol de maltosa/g enzima). Ésta relación se multiplico por 100 y se llamo % de actividad.
85
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caracterización del Almidón
Tabla 2. Análisis proximal almidón de yuca.
Humedad
16.43%
Fuente: Starch, (2)
La muestra tomada para la hidrólisis no presenta las
condiciones optimas para un proceso eficiente, se observa un porcentaje alto de humedad, genera un porcentaje de Aw (actividad de agua) propicia para el ataque de microorganismos, a nivel industrial esto produce acumulaciones de pirógenos. El porcentaje de 7.15%
en cenizas, corrobora que la extracción de almidón no
es adecuada, es indicativo de contenido de impurezas.
La relación amilosa/amilopectina para una hidrólisis en
condiciones optimas de trabajo debe ser 12/88 (CIAT).
El porcentaje de amilosa presentado en la muestra es de
32%, alejado de los rangos ideales de trabajo, a menor
relación amilosa/amilopectina, mayor rompimiento de
enlaces endo alfa- 1,4, Glucosidicos obteniéndose un
mayor rendimiento en la producción de glucosa libre.
(Ver tabla 2).
CARACTERIZACIÓN DE LAS ENZIMAS
El diseño experimental que se uso para el análisis de los
datos obtenidos fue completamente al azar, por tratarse
de un experimento de laboratorio donde las unidades
experimentales son homogéneas y la variación entre ellas
es muy pequeña. Después de analizar los datos en el
paquete estadístico (SAS), se observa que los datos se
ajustan al diseño. Al realizar el análisis de varianza y al
comparar el valor de F (Función de probabilidad) calculado y F tabulado se observa que el F calculado es
mayor que el F tabulado, lo cual indica que hay
significancia. Esto quiere decir que existe uno o varios
tratamientos mejores que los demás. Para saber cual es
el mejor tratamiento se aplicaron las pruebas de significación, usando el método de análisis de promedios DMS
(diferencia mínima significativa). (5)
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Caracterización de la Alfa-Amilasa
Tabla 4. Alfa-amilasa. Actividad Vs Temperatura.
Comportamiento de la Actividad de la Enzima con
la Variación de pH
La alfa amilasa (BAN) de Novo Nordisk presento una
mayor actividad a pH 6.0, como se muestra en la Tabla
3, de acuerdo al DMS (Diferencia mínima significativa)
se observo que los tratamiento a pH5.0 y pH6.0 son los
que presentan mayor diferencia en actividad amilolitica.
(Ver gráfico 1).
7HPSHUDWXUD
ž&
5
$FWLYLGDG
5
5 3URP
Grafico 2. Alfa-amilasa. Actividad Vs Temperatura.
Tabla 3. Alfa-amilasa. Actividad Vs pH .
S+
5
*OXFRDP LODV D$FWLYLGDGYV 7H P SH UDWXUD
$FWLYLGDG
5
5
3URP
51
50
49
48
47
46
45
44
50
80
75
70
65
5,5
6
70
75
80
Comportamiento de la Actividad de la Enzima con
la Variación de pH
$FWLYLGDGYV S+
5
65
Caracterización de la Glucomilasa
$OIDDP LODV D
4,5
60
T emper at ur a °C
Grafico 1. Alfa-amilasa. Actividad Vs pH.
85
55
6,5
7
7,5
pH
Comportamiento de la Actividad de la Enzima con
la Variación de Temperatura
La alfa amilasa fúngica (BAN) de Novo Nordisk logra su
mayor actividad a una temperatura media de 70°C, como
se muestra en la Tabla 4. El análisis de promedios DMS
se observo que los tratamientos a temperatura 70°C y
55°C son los que presentan mayor diferencia en actividad amilolitica, por encima de 70 °C la actividad disminuye, tomando la grafica un comportamiento Gaussiano
(Ver Gráfico 2).
La amiloglusidasa (AMG de Novo Nordisk) presento
una mayor actividad a pH 4.8 como se muestra en la
Tabla 5, Las actividades fueron muy bajas por el tiempo de la hidrólisis indicando que sus comportamientos están por el orden de mas de 5 horas. de acuerdo a
prueba de promedios en la Gráfica 3 se observa un
comportamiento ideal a pH 4.8 indicando que existen
diferencias significativas con respecto a los otros tratamientos.
Tabla 5. Glucoamilasa. Actividad Vs pH.
S+
5
$FWLYLGDG
5
5
3URP
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La tabla 7 resume las condiciones optimas de trabajo
de las enzimas usadas para la hidrólisis enzimática de
almidón de yuca.
Grafico 3. Glucoamilasa. Actividad Vs pH.
* OX F R D P LOD V D
$ F W LY LG D G Y V S +
49
Tabla 7. Condiciones óptimas de la Alfa-amilasa y
Glucoamilasa.
48
47
46
45
44
43
42
3. 9
4. 2
4. 5
4. 8
5. 1
pH
Comportamiento de la Actividad de la Enzima con
la Variación de Temperatura
La amiloglusidasa (AMG de Novo Nordisk) presento
una mayor actividad a Temperatura 65ºC como se
muestra en la Tabla 6, Las actividades presentan %
bajos de conversión a glucosa, debido al tiempo de
hidrólisis. El análisis de promedios DMS corrobora
este comportamiento al no encontrar diferencias significativas entre los tratamientos a temperatura 60ºC y 70
ºC, entre 60ºC y 75ºC, entre 70ºC y 75 ºC. (Ver
grafico 4)
Tabla 6. Glucoamilasa. Actividad Vs Temperatura.
S+
7HPSHUDWXUD
&RQFHQWUDFLyQ
(Q]LPD
7LHPSRGH
5HDFFLyQ
D DPLODVD
ž&
JHQ]JVXVW
PLQ
JOXFRDPLODVD
ž&
JHQ]JVXVW
K
CONCLUSIONES
El modelo experimental aplicado completamente al azar
se ajusta a las unidades experimentales obtenidas. Esto
indica que los tratamientos difieren en forma significativa y señala cual es mejor comportamiento.
La relación amilosa/amilopectina determinada es alta,
influyendo en la hidrólisis y el rompimiento de los enlaces alfa-D, 1,4 y Alfa-D, 1,6 Glucosidicos en el almidón
de yuca.
El tiempo de cinética empleado para la glucoamilasa
(AMG) presento rendimientos bajos, indica que se debe
someter una hidrólisis mas prolongada.
$ OI D $ P LOD V D $ F W LY LG D G Y V 7 H P S H U D W X U D
85
La enzima alfa amilasa (BAN) presento un buen comportamiento en la cinética de reacción.
80
75
Se determino que el pH fue la variable más importante
en el procesos hidrolítico enzimático.
70
50
55
60
65
70
75
80
T e m p e r a t u r a °C
REFERENCIAS
Grafico 4. Glucoamilasa. Actividad Vs Temperatura.
7HPSHUDWXUD
ž&
5
$FWLYLGDG
5
5
3URP
(1) Carrera, Jorge, Módulos de Biotecnología.
Enzimas industriales, Universidad del Cauca, Primer edición 2002.
(2) Farmacopea USP 25, Páginas, año 2000.
(3) Fennema, O. Química de los Alimentos. Acribia
S.A., España. 1993.
(4) Novo Nordisk. Product Sheet Termamyl 120 L,
Fungamyl, AMG. Enzyme Business, Bagsvaerd,
Denmark. 1997.
88
(5) Pozueta, L. Métodos Estadísticos. Ediciones UPC,
España. 1994.
(6) Procedimientos estandarizados de Enzyme's
Biotechnology, 1999.
(7) Rosendal, P. y Nielsen, B. Stability of Bacterial ?Amylase in the Starch Liquefaction Process.Starch/
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Vol 1 No.1 Marzo 2003
Stärke. Vol. 32, No. 11, Germany. 1979. 357-362.
(8) Schenck, F. y Hebeda, R. Starch Hydrolysis
Products. VCH, USA. 1994.
(9) Starch Conversion Technology. G.M.A.
Vanbeynum. Edit. Marcel Dekker Inc. New York,
1985.