SECCIÓN I - INTRODUCCIÓN

Facultad de Medicina
Genética – 1er Curso
SECCIÓN I - INTRODUCCIÓN
Tema 1. TÉCNICAS BÁSICAS DE GENÉTICA MOLECULAR
Facultad de Medicina
TEMA
Genética –
1er
Curso
1
TÉCNICAS BÁSICAS DE
GENÉTICA MOLECULAR
1.1 Tecnología del ADN recombinante.
1.2 Enzimas de restricción.
1.3 Hibridación de ácidos nucleicos. PCR. Secuenciación del ADN.
1
1.1 Tecnología del ADN recombinante
Apartados
Clonación de ADN
Vectores de clonación
Vectores de expresión
Fago lambda ()
Cósmidos
Aplicaciones de la clonación de ADN
Tecnología del ADN recombinante
EcoRI
EcoRI
Tetr
Strepr/Sulfr
EcoRI
Clonación de ADN
EcoRI
Diagrama esquemático del
primer experimento de
clonación por Boyer y Cohen
ADN Ligasa
EcoRI
EcoRI
Transformar
bacterias
Tetr/Strepr
2
Tecnología del ADN recombinante
Vectores de clonación
Plásmido pBR322, donde se aprecian:
(a)
(b)
(c)
Sitios de restricción
Genes de resistencia a antibióticos
origen de replicación
Tecnología del ADN recombinante
Vectores de clonación
Clonación de ADN foráneo
mediante los extremos
cohesivos del sitio
PstI de pBR322.
Notar que el ADN foráneo
rompe el gen de resistencia
a ampicilina
Tetr/Amps
3
Tecnología del ADN recombinante
Vectores de clonación
pUC18
pUC19
Estructura del plásmido pUC18/19, mostrando detalles
De los sitios de clonación multiple (Polilinkers)
Los MCSs mantienen la pauta de lectura del gen de la -galactosidasa
Tecnología del ADN recombinante
Vectores de expresión
MCS
4
Tecnología del ADN recombinante
Vectores de expresión
lacZ “reporter” en un embrión
GFP “reporter” en
ratones adultos
de ratón de 11.5 días
Tecnología del ADN recombinante
Fago lambda ()
 Bacteriófagos:
virus
que
infectan bacterias. Constan
de un genoma de ác.
nucleicos dentro de una
envoltura
l
proteica
d
de
protección llamada cápside.
 Ciclos de infección.
 Ha
sido
adaptado
para
usarlo
como
vector
de
clonación.
 Ventaja: el tamaño de los
fragmentos
que
pueden
clonarse es mayor que en los
plásmidos (10-20kb)
5
Tecnología del ADN recombinante
Cósmidos
 Estos
vectores
combinan
características de plásmidos sitio de clonación multiple y
resitencia a antibióticos- así
como de
d fagos
f
–secuencias cos,
responsables del empaquetamiento del fago en la cápside.
 Pueden clonarse 40-50kb.
Tecnología del ADN recombinante
YAC
YAC
YAC:
“Yeast Artificial Chromosome”
Cromosoma artificial de levadura
 Pueden clonarse 300kb-1Mb.
6
Tecnología del ADN recombinante
Aplicaciones
Importantes contribuciones a muchas áreas de investigación:
 identificación de genes implicados en enfermedades
 construcción de mapas genómicos
 producción de proteínas recombinantes
 creación de organismos modificados genéticamente.
genéticamente
Objetivos
Clonación
de ADN
1.1 Tecnología del ADN recombinante (I)
Esta técnica permite aislar y copiar secuencias de ADN individuales a partir de
mezclas complejas permitiendo el análisis detallado y la manipulación. El ADN a
clonar se recombina con un vector y se introduce en las células huésped donde
se copia. El vector recombinante se purifica de cultivos de células huésped y el
ADN clonado puede recuperarse para su análisis.
Vectores de
clonación
Son moléculas de ADN circular pequeñas encontradas en bacterias y que se
usan como vectores de clonación. Los plásmidos se purifican fácilmente y
confieren resistencia a antibióticos al huésped permitiendo la fácil
identificación de recombinantes. Otro sistema de selección consiste en la
ruptura del gen lacZ por inserción de ADN extraño.
Vectores de
expresión
Se han desarrollado muchos vectores que permiten la expresión de genes
dentro de insertos clonados mediante transcripción regulada por un fuerte
promotor en el vector. En algunos casos, p. ej. utilizando vectores de
expresión T7, una gran proporción de la proteína total en las células E.coli
puede consistir en el producto deseado.
deseado
Fago lambda ()
El bacteriófago , que infecta E. coli, ha sido adaptado como un
vector de clonación. La porción central se reemplaza con ADN ajeno.
El ADN recombinante del fago se empaqueta in vitro en cápsides que
infectan E. coli produciendo áreas claras en las placas de agar. Se
utilizan para construir librerías genómicas
7
1.1 Tecnología del ADN recombinante (y II)
Objetivos
Cósmidos
Son similares a los plásmidos, pero contienen secuencias cos de fago 
posibilitando empaquetarse en cápsides .
 Los cósmidos infectan E.
E coli y se
replican. Pueden acoger ADNs largos de 40-50kpb.
Aplicaciones de la
clonación de ADN
Esta técnica ha hecho importantes contribuciones a muchas áreas
de investigación en biología.: identificación de genes implicados en
enfermedades; construcción de mapas genómicos; producción de
proteínas recombinantes, creación de organismos modificados
genéticamente.
1.2 Enzimas de restricción
Apartados
Endonucleasas
Secuencias de reconocimiento
Extremos cohesivos
Electroforesis en gel de agarosa
Mapas de restricción
8
Enzimas de restricción
Endonucleasas
 Las endonucleasas de restricción se identificaron en los años 6070. Fue el paso clave para poder clonar ADN.
 Los sistemas de restricción-modificación se dan en muchas
bacterias, constituyendo un mecanismo de defensa contra la
introducción de ADN extraño.
extraño Consta de dos componentes:
- endonucleasa de restricción  reconoce una secuencia corta
simétrica de ADN y corta el ADN en cada hebra en un sitio
específico dentro de esa secuencia.
- metilasa  añade un grupo metil a una base C o A dentro de la
misma secuencia de reconocimiento en el ADN celular. Esta
modificación convierte al ADN en resistente a la degradación por
endonucleasas
Secuencias de reconocimiento
 Los enzimas reconocen una secuencia palindrómica entre 4-8 pb,
dando lugar a fragmentos de restricción de doble cadena con
extremos salientes en 5’/3’ o romos
Extremos cohesivos
 Los extremos con salientes son cohesivos, de modo que pueden
ligarse diferentes ADNs si presentan los mismos extremos
Enzimas de restricción
Secuencias de reconocimiento
caccgtgGAATTCacgaacaa
gtggcacCTTAAGtgcttgtt
y Extremos cohesivos
acaacgaGAATTCctttatc
tgttgctCTTAAGgaaatag
EcoRI
EcoRI
caccgtgG OH
gtggcacCTTAA
P
P
AATTCacgaacaa
HO Gtgcttgtt
acaacgaG OH
tgttgctCTTAA
P
P
AATTCctttatc
HO Ggaaatag
l
ligasa
+ ATP
P
caccgtgGAATTCctttatc
gtggcacCTTAAGgaaatag
ligasa + ATP
acaacgaGAATTCacgaacaa
tgttgctCTTAAGtgcttgtt
9
Enzimas de restricción
Extremos romos
caccgtgG
gtggcacCTTAA
AATTCacgaacaa
Gtgcttgtt
DNA pol
+ dNTPs
caccgtgGAATT
gtggcacCTTAA
AATTCacgaacaa
TTAAGtgcttgtt
ligasa + ATP
caccgtgGAATTAATTCacgaacaa
gtggcacCTTAATTAAGtgcttgtt
Enzimas de restricción
Secuencias de reconocimiento
De Sphaerotilus species
10
Enzimas de restricción
Electroforesis en gel de agarosa
Enzimas de restricción
Electroforesis en gel de agarosa
11
Enzimas de restricción
Electroforesis en gel de agarosa
-
 La
agarosa
es
un
polisacárido
derivado de algas marinas, que forma
un gel sólido cuando se disuelve en
soluciones acuosas a concentraciones
entre 0.5 y 2% (w/v).
 Aplicando un campo eléctrico al gel en
una
solución
conductora
de
electricidad, los fragmentos de ADN
migran a través del gel hacia el
electrodo positivo, dependiendo del
tamaño y forma.
+
 El ADN se tiñe con bromuro de etidio
y se visualiza por luz UV como una
banda naranja.
Enzimas de restricción
Electroforesis en gel de agarosa
10
8
10
8
6
4
3
+
0.7
6
0.5
0.4
4
3
0.3
0.2
2
1.5
1.4
2
1.5
1.4
1.0
0.7
0.1
1.0
0.7
0.5
0.5
0.05
3%
0.6%
12
Enzimas de restricción
Mapas de restricción
Enzimas de restricción
Mapas de restricción
13
Enzimas de restricción
Mapas de restricción
6 kb
5 kb
11 kb
H
12 kb
4 kb
5 kb
PstI
P
H
7 kb
PstI-A 12 kb
PstI
4 kb
5 kb
1 kb
7 kb
5 kb
5 kb
12 kb
1 kb P
PstI-B 5 kb
P
7 kb
8 kb
5 kb
7 kb
HindIII-A 11 kb HindIII-B 6 kb
9 kb
P
1 kb
H
4 kb
H
4 kb 1 kb
MAPA FÍSICO DE UN ADN DESCONOCIDO
1.2 Enzimas de restricción
Objetivos
Endonucleasas
Son enzimas bacterianos que cortan (hidrolizan) ADN en determinados
fragmentos y de modo reproducible. En la bacteria forman parte del
mecanismo de defensa restricción-modificación contra ADN extraño.
Son los instrumentos básicos de la clonación génica.
Secuencias
S
i
de reconocimiento
Extremos
cohesivos
Los extremos de cadena simple producidos por las enzimas de restricción son
cohesivos, ya que pueden volverse a unir por emparejamiento de bases a
cualquier otro fragmento con extremos complementarios.
Electroforesis
El
t f
i en
gel de agarosa
Mapas de
restricción
Los enzimas de restricción cortan el ADN simétricamente en
ambas cadenas en secuencias de reconocimiento palindrómicas,
dejando libres un 5’-P y un 3’-OH. Dejan extremos romos o
sobresalientes.
Los geles de agarosa separan el ADN lineal en base a su tamaño,
tamaño por
migración del ADN a través de su matriz bajo la influencia de un
campo eléctrico.
Mediante restricción con endonucleasas solas o en combinación, se puede
construir un diagrama, mapa de restricción, de la molécula indicando los sitios
de corte y los tamaños de los fragmentos
14
1.3 Hibridación de ácidos nucleicos.
PCR. Secuenciación del ADN
 Hibridación:
Hib id ió proceso por ell que d
dos cadenas
d
d
de
ácidos nucleicos que son complementarias se unen
para dar una molécula bicatenaria.
 La hibridación puede ser ADN-ADN, ADN-ARN.
Hibridación de ácidos nucleicos
Desnaturalización térmica
15
Hibridación de ácidos nucleicos
Renaturalización
 • La renaturalización tiene lugar enfriando la solución de
ADN
 • Enfriamiento rápido sólo permite la formación de
regiones locales de doble cadena formadas por la unión de
regiones cortas complementarias
 • Enfriamiento lento permite la complementariedad
completa de las cadenas de ADN, ya que da tiempo a que
cada cadena encuentre a la otra
 • La renaturalización de regiones complementarias entre
cadenas de ácidos nucleicos diferentes se llama hibridación
Hibridación de ácidos nucleicos
electroforesis
pocillos para
Cargar la muestra
Fragmentos de ADN
Separados por tamaño
Gel de agarosa
transferencia
papel
membrana
Gel
mecha
hibridación
Southern
 Esta fue la primera técnica analítica
basada en la hibridación de ácidos
nucleicos, desarrollada por Ed Southern
(Oxford).
 Se utiliza para analizar la estructura de
los genes.

1
2
3
4
5
6
Pasos:
– extracción de ADN
– Digestión con enzimas de restricción
– Electroforesis
– Transferencia
– Hibridación
- Autorradiografía
autorradiografía
membrana
híbridos
(emiten radiación)
Bandas correspondientes
a los fragmentos hibridados
Película de rayos X
16
Hibridación de ácidos nucleicos
Southern
Hibridación de ácidos nucleicos
Southern
ADN teñido con
bromuro de etidio
Autorradiografía con
una sonda hibridada
17
PCR
Apartados
Principio
Componentes
Cómo trabaja
Aplicaciones
PCR
Principio
Copiar y amplificar secuencias específicas de ADN
miles de millones de veces en una
simple reacción enzimática.
18
PCR
Componentes
Cuatro componentes fundamentales:
1) ADN molde conteniendo la secuencia de ADN a ser
amplificada
2) cebadores oligonucleótidos: “forward” y “reverse”
3) ADN polimerasa: Taq polimerasa
4) dNTPs: dATP,
dATP dCTP,
dCTP dGTP,
dGTP dTTP
PCR
Cómo trabaja
Ver animación “PCR”.
19
PCR
Aplicaciones
 Detección
de
enfermedades.
alteraciones
genéticas
que
causan
 Procesos de clonación del ADN.
ADN
 Secuenciación de ADN.
 Cualquier procedimiento que requiera mayor cantidad de ADN
específico que la que es posible obtener del material de
partida.
 RT-PCR: ADN complementario.
 Cuantificación de la expresión de un gen: RT-PCR + PCR-Q.
PCR
Aplicaciones
ADN complementario
 Existe un tipo de virus cuyo genoma está formado únicamente
por ARN. Para propagarse ha de transcribirse en sentido
contrario: ARN  ADN. Son los retrovirus. Posteriormente el
ADN se replica
li
y actúa
tú como molde
ld para nuevo ARN vírico.
í i
L
La
enzima que cataliza la reacción de ARN a ADN se denomina
transcriptasa inversa. Esta enzima es importante en biología
molecular, porque permite aislar rápidamente las regiones
codificantes de un gen.
 Si extraemos ARNm de un tejido, podemos sintetizar una cadena
de ADN complementario (ADNc) mediante la transcriptasa
inversa ADNc es de cadena simple y puede obtenerse doble
inversa.
cadena mediante la PCR.
 Este ADNc corresponde a los genes que estaban activos cuando
se extrajo el tejido. Como el ARNm maduro sólo contiene
exones, el ADNc equivale a los genes sin intrones.
20
PCR
Aplicaciones
ADN complementario
- Utilidad en los “microarrays”
Secuenciación del ADN
21
Secuenciación
Secuenciación
Método de secuenciación de ADN mediante el protocolo
de didesoxi nucleósido trifosfatos (ddNTP) (Sanger).
base
dNTP
3’
2’
OH
3’
H
H
base
5’
dNTP
base
3’
3
OH
2’
2
ddNTP
2’
H
base
5’
3’
3
H
OH
2’
2
H
dNTP
22
Secuenciación
Basado en la reacción de la ADN polimerasa



Cuatro reacciones separadas
Cada mezcla de reacción contiene dATP, dGTP, dCTP
y dTTP, uno de los cuales está marcado con P32
Cada reacción también contiene una pequeña
cantidad de un didesoxinucleótido: ddATP, ddGTP,
ddCTP o bien ddTTP
Secuenciación
Método de terminación de cadena



La mayoría de las veces, la polimerasa
utiliza nucleótidos normales y el ADN se
sintetiza con normalidad
Ocasionalmente, la polimerasa utiliza un
didesoxinucleótido, el cual se añade a la
cadena inhibiendo la unión de más
nucleótidos en esa cadena
L adición
La
di ió all azar de
d dd
dd-nucleótido
nucleótid
l ótidos
deja (idealmente) al menos unas pocas
cadenas terminadas en cada posición de
nucleótido
23
Secuenciación de ADN por el método de Sanger
Secuenciación
ADN molde (simple cadena)
3’-G A G T G G T C A T A C T G T A-5’
Secuencia ADN sintetizada (codificante)
5’-C T C A C C A G T A T G A C A T-3’
-
-
Reacción 2
+ddTTP
-
T
- - - - - - - T
- - - - - - - - - T
- - - - - - - - - - - - - - T
Reacción
R
ió 3
+ddGTP
- - - - - - - G
- - - - - - - - - - - G
Reacción 4
+ddCTP
C
-
Reacción 1
+ddATP
3’
5’
manual
-
-
A
-
-
-
A
- - - A
- - - - - - A
- - - - - - - - A
C
- - C
- - - C
- - - - - - - - - - - C
Secuenciación
automática
24
Secuenciador automático
Secuenciación
1.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR (I)
Objetivos
Principio
La PCR permite copiar y amplificar secuencias específicas de ADN millones de
veces en una simple reacción enzimática.
Componentes
Cuatro componentes fundamentales: ADN molde conteniendo la secuencia
de ADN a ser amplificada; 2) cebadores oligonucleótidos; 3) ADN
polimerasa; 4) dNTPs
Cómo trabaja
El ADN es amplificado en 20-40 ciclos de síntesis de ADN. Cada ciclo
tiene tres pasos que se llevan a cabo a diferentes temperaturas: 1)
desnaturalización: 90-95ºC; 2) hibridación: 40-60 ºC; 3) extensión: 72ºC.
Cada molécula de ADN sintetizada actúa como molde para las siguientes
que ésta aumenta exponencialmente
p
en los sucesivos
reacciones, de modo q
ciclos.
Aplicaciones
Extensivamente para el estudio de genes. Ha contribuido mucho al estudio
de enfermedades hereditarias y en la investigación del cáncer. También
tiene aplicaciones prácticas como diagnóstico de enfermedades hereditaras,
medicina forense y biotecnología.
25
1.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR (y II)
Objetivos
Retrovirus
Virus cuyo genoma está formado únicamente por ARN. Para propagarse su ARN
debe transcribirse en sentido contrario: ARN  ADN. Posteriormente el ADN
se replica y actúa como molde para nuevo ARN vírico.
Transcriptasa
inversa
Enzima que cataliza la reacción de ARN a ADN. Esta enzima es importante en
biología molecular, porque permite aislar rápidamente las regiones codificantes
de un gen.
ADN
complementario
ADNc: Se sintetiza mediante la transcriptasa inversa a partir de ARNm
extraído de un tejido. Es de cadena simple y puede obtenerse doble
cadena mediante la PCR.
PCR El ADNc equivale a los genes sin intrones.
intrones
26