fomento y operación del subsistema de recursos geneticos

INSTITUTO TECNOLÓGICO
Superior de Apatzingán
RESIDENCIAS PROFESIONALES
CENTRO NACIONAL DE RECURSOS GENÉTICOS
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES
FORESTALES, AGRÍCOLAS Y PECUARIAS
PROYECTO
“Fomento y Operación del Subsistema de Recursos Genéticos Forestales dentro del
Centro Nacional de Recursos Genéticos del INIFAP”
ALUMNO
José Antonio Ramírez Sánchez
NOMBRE DE LA CARRERA
Ingeniería Bioquímica
ASESOR EXTERNO
Dra. Esmeralda Judith Cruz Gutiérrez
ASESOR INTERNO
Biol. María Elisa Villaseñor Zamorano
Apatzingán Michoacán; Diciembre del 2015
Fomento y Operación del Subsistema de Recursos Genéticos Forestales dentro del Centro
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Nacional de Recursos Genéticos del INIFAP
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CONTENIDO
1.
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1
1.1
Megadiversidad ............................................................................................................. 1
1.2
Erosión genética............................................................................................................. 3
1.3
Conservación de recursos fitogenéticos. ....................................................................... 3
1.4
Subsistema de Recursos Genéticos Forestales (REGEFOR) ........................................... 4
1.5
Especie de importancia para el subsistema REGEFOR: Terminalia amazonia .............. 6
2.
JUSTIFICACIÓN....................................................................................................................... 7
3.
OBJETIVOS ............................................................................................................................. 8
3.1
Objetivo general............................................................................................................. 8
3.2
Objetivos específicos ..................................................................................................... 8
4.
PROBLEMAS A RESOLVER ...................................................................................................... 9
5.
METODOLOGÍA.................................................................................................................... 10
5.1
Recepción ..................................................................................................................... 10
5.2
Análisis de pureza ........................................................................................................ 11
5.3 Evaluación de la integridad física con el equipo de Rayos X ............................................ 11
5.4 Análisis de crecimiento fúngico y extracción de alas y testa. .......................................... 11
5.5 Desinfección superficial y establecimiento in vitro. ......................................................... 12
5.6 Enraizamiento in vitro ...................................................................................................... 14
5.7 Fase de aclimatación ........................................................................................................ 15
6.
DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS ............................................................... 15
7.
RESULTADOS ....................................................................................................................... 18
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7.1
Desinfección superficial y establecimiento In vitro. .................................................... 18
7.2
Enraizamiento. ............................................................................................................. 20
7.3
Aclimatación. ............................................................................................................... 22
8.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .............................................................................. 23
9.
COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS. ........................................................... 24
10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Y VIRTUALES ...................................................................... 25
ANEXOS ....................................................................................................................................... 31
LISTA DE CUADROS ......................................................................................................................iiii
LISTA DE DIAGRAMAS ................................................................................................................. ivv
LISTA DE TABLAS ......................................................................................................................... ivv
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Riqueza de especies para distintos grupos taxonómicos en México ....................... 22
Cuadro 2. Cuadrados medios y significancia estadística del porcentaje de contaminación y
germinación de las semillas de T. amazonia introducidas a cultivo In vitro. ............................ 19
Cuadro 3. Germinación y contaminación de semillas de T. amazonia introducidas al cultivo In
vitro. ........................................................................................................................................... 20
Cuadro 4. Cuadrados medios y significancia estadística del porcentaje de contaminación y
germinación de las semillas de T. amazonia introducidas a cultivo In vitro. ............................ 21
Cuadro 5. Efecto de concentraciones de sales en el medio de cultivo, sobre el enraizamiento
In vitro de brotes de T. amazonia. ............................................................................................ 22
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LISTA DE DIAGRAMAS
Diagrama 1. Diagrama de flujo para el desarrollo de un protocolo de establecimiento,
multiplicación y aclimatación de especies forestales In vitro. .................................................. 10
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Contaminación y germinación in vitro. ....................................................................... 31
Tabla 2. Número de raíces y longitud promedio de tratamientos para enraizamiento in vitro. 31
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1. INTRODUCCIÓN
1.1 Megadiversidad
México es un País Megadiverso, considerado entre los 17 Países con esa categoría, ocupa el
4° lugar mundial en biodiversidad, con un 10% del total de especies vivientes registradas en
la actualidad. Lo anterior, no solo es motivo de orgullo Nacional, sino que también significa
una grave responsabilidad, de cara al acelerado proceso de erosión genética que se ha
experimentado a nivel global. El nivel de esta responsabilidad se magnifica si consideramos el
hecho de que México es lugar de origen de géneros y especies animales y vegetales de
importancia económica, social, ambiental y cultural (INIFAP, 2012).
Su territorio alberga fauna y flora de dos regiones biogeográficas (neoártica y neotropical). Es
un país tropical montañoso con un elevado número de endemismos, y presenta ambientes
marinos templados en el Pacífico y tropicales en el Golfo de México y Caribe, lo cual significa
que nuestro territorio es privilegiado en cuanto a la variedad de ecosistemas y variación
genética en las especies. Asimismo, el país concentra entre 10 y 15% de las especies
terrestres en sólo 1.3% de la superficie ambiental. México ocupa el segundo lugar mundial en
cuanto al número de especies de reptiles, el cuarto lugar en anfibios, el segundo lugar en
mamíferos, el undécimo en aves y posiblemente el cuarto lugar en angiospermas (plantas
con flores). Además de ser una de las mayores del mundo, la biodiversidad de México cobra
también importancia mundial, ya que muchas de las plantas cultivadas por el hombre son de
origen mexicano (Plascencia et al., 2011).
La diversidad mexicana se resume en el Cuadro 1.
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Cuadro 1. Riqueza de especies para distintos grupos taxonómicos en México
Grupo taxonómico
Número de Especies
Invertebrados
Artrópodos
85,740
Crustáceos
4,600
Insectos
77,900
Arácnidos
3,240
Subtotal
171,480
Vertebrados
Peces
2,122
Anfibios
361
Reptiles
804
Aves
1,250
Mamíferos
478
Subtotal
5,015
Plantas
Angiospermas
22,351
Gimnospermas
145
Pteridofitas
1,026
Briofitas (musgos y hepáticas)
1,480
Algas (macroalgas)
945
Subtotal
25,947
Hongos
6,000 – 120,000
Fuente: SEMARNAT, 2005.
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1.2 Erosión genética
El término “erosión genética”, en ocasiones, se utiliza en un sentido estricto, es decir, para
hacer referencia a la pérdida de genes o alelos. También se usa en un sentido más amplio,
para referirse a la pérdida de variedades. De este modo, mientras que la erosión genética no
implica necesariamente la extinción de una especie ni de una subpoblación, sí representa
una pérdida de variabilidad y, por lo tanto, una pérdida de flexibilidad (FAO, 2011).
De acuerdo con el plan de acción del Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos para
las Especies Subvaloradas y Subutilizadas (ETSS), se requiere un esfuerzo global que permita
la revalorización y detenga la pérdida de estos recursos, con acciones concretas como
recabar y compartir información, definir prioridades de atención, promover la producción y
el uso, mantener la diversidad, acompañar la cadena de valor, fortalecer vinculaciones y
capacidades, desarrollar políticas efectivas y mejorar la conciencia en la población (IPGRI,
2002).
1.3 Conservación de recursos fitogenéticos.
La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), define a
los Recursos Fitogenéticos como: Cualquier material de origen vegetal, incluido el material
reproductivo y de propagación vegetativa que contiene unidades funcionales de la herencia,
y que tiene valor real o potencial para la alimentación y la agricultura. Abarca también
aquellas plantas que tienen valor real o potencial por sus propiedades medicinales, que son
de importancia para la industria forestal (recursos genéticos forestales), o que son
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empleados como especias, hortalizas, para usos artesanales, fabricación de muebles o como
plantas ornamentales (Maselli, 2013).
Los recursos fitogenéticos son la base de la subsistencia de la humanidad. Suplen las
necesidades básicas y ayudan a resolver problemas como la pobreza y el hambre. Debido a
su sobre explotación estos recursos se han ido agotando. Dada su vital importancia es
necesario conservarlos para beneficio de las generaciones futuras y presentes.
Los recursos fitogenéticos se pueden conservar dentro o fuera de su hábitat natural, o
combinando ambas alternativas. Fuera de su hábitat natural, los recursos fitogenéticos se
conservan en bancos y colecciones de germoplasma (Jaramillo et al., 2000).
1.4 Subsistema de Recursos Genéticos Forestales (REGEFOR)
En México el Centro Nacional de Recursos Genéticos (CNRG) resguarda recursos genéticos
agrícolas, forestales, pecuarios, acuáticos y microbianos. Cuenta con un banco de
germoplasma de semillas ortodoxas que resguarda 24100 accesiones de especies agrícolas y
forestales, mientras que el Banco de Tejidos Propagados in vitro cuenta con 390 accesiones y
9500 unidades de germoplasma. Asimismo, se resguardan 8200 muestras de ADN en el
Laboratorio de Genómicas, se conservan en el Área de Criogenia, 23600 unidades de
germoplasma pecuario y acuático y de la misma manera se resguardan 2000 cepas
microbianas de interés agrícola (INIFAP, 2012).
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Al mismo tiempo la Comisión Nacional Forestal (CONAFOR) cuyo objetivo es desarrollar,
favorecer e impulsar las actividades productivas, de conservación y restauración en materia
forestal, así como participar en la formulación de los planes, programas, y en la aplicación de
la política de desarrollo forestal sustentable, produce y distribuye semilla y material
vegetativo de procedencia conocida para la producción de planta de calidad y para el
programa de reforestación, además de fomentar la conservación, tanto in situ como ex
situ de los recursos genéticos forestales.
Ambas instituciones (CNRG y CONAFOR) implementaron el subsistema de Recursos
Genéticos Forestales con el objetivo de
realizar protocolos de establecimiento,
multiplicación y aclimatación de 39 especies forestales (19 coníferas y 20 latifoliadas), a
partir de material vegetativo y semillas obtenidas de árboles plus con mayor diversidad
genética representantes de cada especie dentro del cual se está realizando la multiplicación
masiva mediante diferentes técnicas con el fin de obtener clones que mantengan su
integridad genética para la reforestación en los diferentes estados de la Republica.
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1.5 Especie de importancia para el subsistema REGEFOR: Terminalia amazonia
Entre las especies forestales nativas de México, Terminalia amazonia (Gmel.) Excell
(sombrerete, tepesuchil, amarillón, guayabo volador,) ha generado mucho interés por su
gran potencial de rápido crecimiento, adaptabilidad a condiciones difíciles, como colinas y
planicies costeras, suelos rojos o amarillos, lateríticos profundos, derivados de materiales
aluviales o ígneos, características que la convierten en una especie clave para los programas
de reforestación (Russo y Speranza, 2001). En México esta especie está restringida a la
vertiente del golfo, desde el centro de Veracruz y norte de Oaxaca, al sur de la sierra, hasta
el norte de Chiapas y la selva lacandona, así como en la región de los Chimalapas. Es una de
las especies dominantes de la selva alta perennifolia. Su madera se emplea localmente para
construcciones pesadas como puentes o vigas de casas (Pennington y Sarukhán, 2005). A
pesar de que esta especie produce semilla sexual, presenta algunos inconvenientes como
baja existencia de árboles semilleros, bajo porcentaje de germinación, largo periodo de
germinación y semilla vana (Montero y Kanninen, 2005); en viveros la germinación comienza
a los 20 días después de la siembra y se prolonga hasta los 55 días, obteniendo hasta un 14%
de germinación, aplicando el tratamiento pregerminativo de sumersión de las semillas
durante 24 horas en agua (Escuela Nacional de Ciencias Forestales, 2003).
Como el éxito de las plantaciones forestales radica en la producción de maderas de
excelente calidad y al igual que toda actividad agrícola, la siembra de material genético
sobresaliente es el factor más decisivo en los resultados finales del proceso. Por lo tanto, la
tendencia de la forestería moderna está dirigida hacia la siembra y cultivo de especímenes
de alto rendimiento adaptados a ambientes específicos que permitan obtener los mayores
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rendimientos. La aplicación de técnicas biotecnológicas en este campo ha favorecido la
producción masiva y el establecimiento de plantaciones de algunas especies forestales
(Suárez, 2006).
La micropropagación, utilizando material seminal como punto de partida, permite la
producción de plantas con características genéticas similares (pero no idénticas) a la planta
que les dio origen, contribuyendo así a que se mantenga la variación genética necesaria para
la biodiversidad. Siendo además la micropropagación in vitro una de las técnicas más
factibles de utilizar a corto plazo en el sector forestal pues permite un rápido aumento en el
número de plantas, la producción de plántulas durante todo el año y la obtención de plantas
con elevada calidad sanitaria (Scherer, 2006).
2. JUSTIFICACIÓN
 Los recursos genéticos son un patrimonio invaluable para los países que los poseen,
pues constituyen la base biológica de sus actividades económicas como la agricultura
y producción forestal. La pérdida de ellos tendría grandes implicaciones para el
desarrollo económico, social y cultural de un país.
 Mantener la biodiversidad disponible para futuras generaciones, es de vital
importancia debido al desgaste del planeta y lo es más en cuestiones de recursos
forestales, debido a que estos tardan mayor tiempo en alcanzar el nivel fisiológico de
madurez.
 Colaboración en la producción, protección y restauración de los recursos forestales
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3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Realizar un protocolo de establecimiento, multiplicación y aclimatación de la especie forestal
Terminalia amazonia a partir de material vegetativo y semillas obtenidas de árboles plus
representantes de la especie, realizando la multiplicación masiva mediante diferentes
técnicas con el fin de obtener clones que mantengan su integridad genética para la
reforestación en los diferentes estados de la Republica.
3.2 Objetivos específicos
 Realizar protocolos de establecimiento, multiplicación y aclimatación de la especie
Terminalia amazonia.
 Determinar el método apropiado para la desinfección y el establecimiento de la
especie T. amazonia proveniente de material seminal y de material vegetativo.
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4. PROBLEMAS A RESOLVER
4.1 Contaminación en la micropropagación: Uno de los problemas principales en la
generación de protocolos de establecimiento in vitro es la contaminación del medio de
cultivo destinado al desarrollo de los tejidos vegetales. Es por esto que se debe
determinar el método adecuado para la desinfección, seleccionando los desinfectantes,
el tiempo de desinfección según las características de la especie a tratar.
4.2 Enraizamiento del tejido vegetal: La micropropagación es uno de los métodos más
eficientes para la producción masiva de especies vegetales, sin embargo el desarrollo del
tejido radical in vitro de algunas de las especies es muy escaso o nulo (tal es el caso de las
coníferas), es por ello que se deben realizar pruebas para seleccionar adecuadamente los
medios de cultivo, sus concentraciones y complementar si fuera necesario con
fitohormonas.
4.3 Aclimatación de los explantes. Los explantes desarrollados en condiciones in vitro son
muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el
proceso dependerá de la aclimatación. Es necesario formular un protocolo a seguir para
la aclimatación y desarrollo ex vitro de los explantes.
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5. METODOLOGÍA
Diagrama 1. Diagrama de flujo para el desarrollo de un protocolo de establecimiento,
multiplicación y aclimatación in vitro de especies forestales.
5.1 Recepción
La recepción son las actividades relacionadas con la llegada y entrada de las accesiones de
semilla al Laboratorio Agrícola Forestal Sección Semillas Ortodoxas. El registro es la
asignación de un número de identificación único llamado número de accesión que permite
ubicar cada muestra de semilla recibida en un banco de germoplasma y distinguirla de las
demás (Rao et al., 2007).
.
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5.2 Análisis de pureza
En el análisis de pureza; se determina el porcentaje de semilla pura (sin daños físicos),
porcentaje de material inerte y el porcentaje de otras semillas en la muestra. Para ello, se
pesó y registró la muestra total, se separó la semilla pura de la materia inerte (semillas
dañadas físicamente, cortadas, picadas, quebradas y residuos de cascarillas), se registraron y
pesaron ambas muestras. Una vez pesadas, la materia inerte se desechó y la semilla pura se
almacenó para sus análisis posteriores (Rao et al., 2007).
5.3 Evaluación de la integridad física con el equipo de Rayos X
Las semillas se sometieron a un análisis de integridad física mediante rayos X. Se colocaron
de 30 piezas en la cámara de rayos X; la integridad se evaluó mediante las imágenes
obtenidas, las cuales se observaron en la pantalla de una computadora y se clasificaron entre
semillas llenas, semillas vacías, semillas dañadas físicamente y semillas dañadas por insecto.
Al final se seleccionaron solo las semillas llenas y se desecharon las vacías (ISTA, 2014).
5.4 Análisis de crecimiento fúngico y extracción de alas y testa.
Se eligieron 20 semillas al azar y se visualizaron bajo un estereoscopio cortes internos y
externos para analizar el porcentaje del posible crecimiento de hongos, y así seleccionar el
mejor pretratamiento de desinfección. Una vez determinado un alto porcentaje de
crecimiento fúngico (80%) en las muestras se optó por retirar ala y testa componentes de la
semilla de Terminalia amazonia, para así reducir su carga microbiana.
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5.5 Desinfección superficial y establecimiento in vitro.
Para determinar el mejor método de desinfección superficial, se evaluó el efecto de un
tratamiento control absoluto consistente de un enjuague con agitación constante de
detergente Útil® a una concentración de 5 g L-1 en agua bidestilada estéril por 10 minutos,
seguido de una inmersión con agitación constante en el fungicida selectivo comercial
Amistar® a una concentración de 3 g L-1 suplementados con 5 gotas de Tween 20® L-1.
Posteriormente se evaluó el efecto en la germinación y contaminación a dos tiempos (15 y 24
días) en 20 repeticiones y ocho tratamientos de desinfección, el control de contaminación y
un control de germinación el cual se llevó a cabo colocando la semilla en cajas Petri de
plástico con papel absorbente humedecido con agua bidestilada a razón de 5 semillas por
caja. La exposición de las semillas con los reactivos fue en constante agitación y en
condiciones asépticas en el interior de una cámara de flujo laminar, después de la utilización
de cada reactivo se realizaron dos enjuagues con agua bidestilada estéril. Los tratamientos de
desinfestación utilizados se muestran a continuación.
Tratamiento 1.
a) Inmersión en NaClO al 20% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L -1 durante 20
minutos.
b) Inmersión en Etanol 70% v/v durante 1 minuto.
Tratamiento 2.
a) Inmersión en NaClO al 20% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L -1 durante 20
minutos.
b) Inmersión en Etanol 90% v/v durante 1 minuto.
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Tratamiento 3.
a) Inmersión en NaClO al 20% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L -1 durante 20
minutos.
Tratamiento 4.
a) Inmersión en NaClO al 25% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L -1 durante 20
minutos.
b) Inmersión en Etanol 70% v/v durante 1 minuto.
Tratamiento 5.
a) Inmersión en NaClO al 20% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L -1 durante 20
minutos.
b) Inmersión en Etanol 90% v/v durante 1 minuto.
Tratamiento 6.
a) a) Inmersión en NaClO al 25% v/v suplementado con 5 gotas de Tween 20® L-1 durante 20
minutos.
Tratamiento 7.
a) Inmersión en Etanol 70% v/v durante 1 minuto.
Tratamiento 8.
a) Inmersión en Etanol 90% v/v durante 1 minuto.
El material seminal tratado fue establecido en medio de cultivo descrito por Lloyd y McCown,
(WPM) (1980) al 100 % de fuerza iónica, complementados con 2 % p/v de sacarosa, 1 mL L -1
de Plant Preservative Mixture (PPM)TM (Plant Cell Technology, Washington DC, USA), 1 g L-1
de Polivinil Pirrolidona (PVP)TM (Sigma, St. Louis, MO, USA) y solidificados con 7.5 g L-1 de
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AgarTM. El pH de los medios se ajustó a 5.8 antes de la esterilización en autoclave (121˚ C, 18
psi, durante 15 min). Cada semilla fue establecida en tubos de vidrio de 40 mL de capacidad
conteniendo aproximadamente 5 mL de medio de cultivo a razón de una por tubo;
posteriormente los tubos fueron cubiertos con tapas de plástico, sellados con Parafilm®, su
rango de temperatura ideal está entre los 21 a 24 °C (Torres, G., Luján, R y Barca, S. A. 2002)
es por ello que fueron almacenados a una temperatura de 24°C ± 1 con una intensidad
lumínica de 40 µmol m-2 s-1 por un período de 16 horas diarias suministrada con lámparas de
luz blanca fluorescente.
5.6 Enraizamiento in vitro
Una vez germinado y evaluado el material seminal, los explantes fueron transferidos a
condiciones ambientales similares pero en un medio control absoluto WPM y tres diferentes
porcentajes de fuerza iónica (100%, 50% y 25%) adicionados con 2 % p/v de sacarosa, 1 mL L1
PPMTM, 1 g L-1 de PVPTM y solidificados con 7.5 g L-1 de AgarTM. El pH de los medios se ajustó
a 5.8 antes de la esterilización en autoclave (121 C, 18 psi, durante 15 min). Los tratamientos
fueron distribuidos utilizando un diseño completamente al azar y después de tres semanas
de cultivo, se registró el número de explantes que produjeron raíces y el número promedio
de raíces producidas por cada explante.
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5.7 Fase de aclimatación
Después de ser evaluada la etapa de enraizamiento, las plantas enraizadas fueron
trasladadas hacia una cámara de aclimatación, donde se destaparon los frascos y se removió
el agar de las raíces con agua corriente. Las plántulas fueron transferidas al azar a charolas de
germinación de plástico con 48 compartimentos, conteniendo cada compartimento 30 g de
sustrato estéril y húmedo compuesto de una mezcla de tres partes de peat moss, una parte
de agrolita y una parte de vermiculita. Cada plántula trasplantada, se cubrió con un frasco de
plástico (10 cm3) transparente para después almacenarse en la cámara a una temperatura
de 26°C ± 1 y una humedad relativa del 70 % y a los siete días se removió el frasco. La
aclimatación, se evaluó en el porcentaje de supervivencia y el desarrollo de las plantas.
6. DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS
Análisis de Pureza: Se realizó el análisis de pureza en las especies Terminalia amazonia y
Pseudotsuga menziesii. En este paso, se pesa la muestra inicial o accesión, con la ayuda de un
diafanoscopio se separan en semilla pura, material inerte y otras semillas. Se registraron los
resultados en formatos propios del CNRG.
Evaluación de la integridad física mediante rayos X: Se usó un equipo de rayos X Faxitron®
con la siguiente configuración; tiempo: 300 s; kV: 20. La mayoría de las semillas de las
especies forestales tuvieron un tamaño medio y se colocaron en la tercera rejilla de la
cámara de rayos X.
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Elaboración y esterilización de medio de cultivo Lloyd y McCown, (WPM) (1980)
Se elaboró medio de cultivo Lloyd y McCown, (WPM) (1980) a diferentes porcentajes de
fuerza iónica (150, 100, 50 y 25%) complementados con 2 % p/v de sacarosa, 1 mL L-1 de
Plant Preservative Mixture (PPM)TM (Plant Cell Technology, Washington DC, USA), 1 g L-1 de
Polivinil Pirrolidona (PVP)TM (Sigma, St. Louis, MO, USA) y solidificados con 7.5 g L-1 de AgarTM.
El pH de los medios se ajustó a 5.8 utilizando concentraciones de ácido sulfúrico e hidróxido
de sodio, ambas soluciones a 0.1 y 0.01 N, la esterilización se llevó a cabo en autoclave
automática a 121˚ C y 18 psi durante 15 min.
Desinfección superficial y establecimiento de material vegetal in vitro: Para la desinfección
superficial se utilizó un tratamiento control absoluto para todas las muestras consistente en
lavado con detergente comercial Útil® y posteriormente una inmersión en el fungicida
selectivo Amistar®. Posteriormente se evaluó el efecto de diferentes tratamientos de
desinfección para identificar el más adecuado para cada muestra, todos en cámara de flujo
laminar. Se utilizaron dos concentraciones de cloro comercial (20 y 25% v/v) a un tiempo y en
combinación con dos concentraciones de etanol (70 y 90% v/v). Para el establecimiento se
utilizaron tubos de vidrio (10 cm3) con medio WPM previamente elaborados y esterilizados,
en donde se colocaron las semillas a razón de una por tubo, posteriormente se sellaron con
Parafilm® y se rotularon, todo lo anterior en ambiente aséptico dentro de una cámara de
flujo laminar.
Subcultivos de explantes cultivados in vitro a nuevos medios: Cuando un tejido cultivado in
vitro alcanzaba su fase de explante y llegaba al tope del recipiente en el que se encontraba
era momento de cortarlo y pasarlo a medio de cultivo nuevo, esto se hacía extrayendo el
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explante y cortando todas sus partes nodales, posteriormente cada parte nodal se colocaba
en un nuevo tubo con medio para continuar con su desarrollo, todo esto en cámaras de flujo
laminar.
Esterilización de material contaminado: Semanalmente se extraía de las cámaras de
almacenamiento de tejido in vitro todo el material que no paso la prueba de desinfección y
se contaminó, bien fuera por hongo o por bacteria; se colocó todo el material en el autoclave
y se le dio un ciclo de esterilización a 121°C y 18psi durante 25 minutos. Posteriormente
fueron desechados los residuos y se pasó al lavado del material.
Limpieza del material utilizado: Cada vez que se dejaba de utilizar, se lavó el material de
cristalería y material de laboratorio.
Registro de resultados: Los resultados de las pruebas evaluadas durante los 4 meses de
estancia de residencias profesionales, se registraron en tablas de Excel y se presentan en el
apartado de anexos mismos que se resumieron en los gráficos que se presentan en el
apartado de resultados.
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7. RESULTADOS
Durante el análisis de la semilla de T. amazonia bajo el estereoscopio, se encontró que
presentaban un endocarpio fibroso, además de que en un 90% de las semillas se observó
crecimiento de tejido fúngico (hifas, micelios y esporangios), es por esto que se optó por
retirar los endocarpios fibrosos y utilizar un fungicida sistémico ya que éste afecta al hongo
en varias etapas de su desarrollo, reduciendo así la carga microbiana antes de pasar a In
vitro. En éste estudio se utilizaron cloro y
etanol como desinfectantes en diferentes
concentraciones ya que han probado ser muy efectivos para la eliminación de hongos y otros
microorganismos (CIAT, 1991).
7.1 Desinfección superficial y establecimiento In vitro.
La semilla de T. amazonia se encuentra en el centro del endocarpio separado de éste por una
delgada capa de aire, misma que brinda el espacio idóneo para la formación de ciertos tipos de
hongos endógenos difíciles de eliminar si no se retira el mismo endocarpio. Esta característica
particular de la especie hace suponer que en estado natural, en la estructura externa de la
semilla se encuentran libres hongos y bacterias que la desintegran facilitándole el paso a la
humedad, por lo tanto, si se extraen e inoculan en condiciones asépticas podrían germinar y
desarrollarse in vitro sin peligro de contaminación. Sin embargo, carente de la protección que
le brinda el endocarpio, la desinfección con agentes desinfectantes como el cloro puede afectar
en el desarrollo y la germinación normal de la semilla. Los datos se analizaron con el paquete
estadístico de SAS (SAS Institute Inc. 2013).
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Cuadro 2. Cuadrados medios y significancia estadística del porcentaje de contaminación y
germinación de las semillas de T. amazonia introducidas a cultivo in vitro.
FV
GL
CONT
GER
TRATAMIENTO
9
0.957777**
1.538333**
190
0.03210526
0.18710526
223.9743
77.93814
(TE)
ERROR
C.V. (%)
FV = Fuentes de variación; GL = Grados de libertad; CONT= Porcentaje de
contaminación; GER = Porcentaje de germinación; *, ** = Significativo con Pr ≤ 0.05 y
con Pr ≤ 0.01, respectivamente; ns = No significativo.
Entre los tratamientos de desinfección evaluados (Cuadro 2), se encontró una diferencia
altamente significativa en cuanto a contaminación de la semilla (Probabilidad estadística (Pr)
< 0.0001), donde los tratamientos más efectivos fueron en los que se utilizó solo Hipoclorito
de Sodio a concentraciones 20 y 25% y solo etanol al 70 y 90% (T3, T6, T7 y T8) ya que
permitieron el menor porcentaje en contaminación y el mayor porcentaje en cuanto a
germinación (Cuadro 3), los demás tratamientos (T1,T2,T4 y T5) presentaron diferencia
altamente significativa en cuanto a contaminación; sin embargo, no presentaron significancia
ante la germinación .
El índice de contaminación para los tratamientos con mayor efectividad se considera
aceptable con respecto al control de contaminación (T9), sin embargo, con respecto al análisis
Tukey en el programa estadístico SAS nos da como resultado que el mejor tratamiento con
mayor índice de germinación y menor índice de contaminación fue el numero 7 (etanol 70%).
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Cuadro 3. Germinación y contaminación de semillas de T. amazonia introducidas al cultivo
in vitro.
Tratamiento
Semillas
Germinadas
Semillas
Contaminadas
(%)
(%)
T1 (CLORO 20+ALCOHOL 70)
30 d
0a
T2 (CLORO 20+ALCOHOL 90)
35 d
0a
T3 (CLORO 20)
75 a
0a
T4 (CLORO 25 +ALCOHOL 70)
30 d
0a
T5 (CLORO 25 +ALCOHOL 90)
25 d
5d
T6 (CLORO 25)
70 a
0a
T7 (ALCOHOL 70)
80 a
0a
T8 (ALCOHOL 90)
85 a
5a
CONTROL CONTAMINACIÓN
30
70
CONTROL GERMINACIÓN
95
0
(Pr < 0.0001)
7.2 Enraizamiento.
Para las diferentes especies forestales se reportan diferentes concentraciones óptimas de
macroelementos, microelementos y hierro. En Pinus counterei se observó un mayor índice en
formación de brotes radicales con 1.5X la concentración normal de sales MS, mientras que
en P. taeda este óptimo se alcanza con 0.5X (Bonga y Durzan 1985). En cipresillo
(Prumnopitvs standleyi) su crecimiento no se vio afectado al inocularse en el medio MS con
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1X, 0.5X ó 0.25X la concentración de sales (Gamboa y Gamboa 1997). Esto confirma que
muchas especies forestales requieren de una concentración específica de sales inorgánicas.
En ésta etapa del proyecto, se determinó el efecto de la concentración de sales inorgánicas en
el medio de cultivo sobre el enraizamiento del material. Se tomó como control el tratamiento
con 0% WPM. Este se comparó con los tratamientos en que se aumentó la concentración de
sales en el medio de cultivo, conforme éste se hizo más pobre en elementos minerales (Cuadro
5), el valor de las variables evaluadas disminuyo, obteniéndose una diferencia altamente
significativa (Pr < 0.0001) en el número de raíces y su longitud promedio de los diferente
tratamientos (Cuadro 4).
Cuadro 4. Cuadrados medios y significancia estadística del porcentaje de contaminación y
germinación de las semillas de T. amazonia introducidas a cultivo In vitro.
FV
GL
N RAIZ
LONG
TRATAMIENTO
4
5.920000**
3423.66027**
45
0.66666667
51.04037
39.25464
15991.45764
(TE)
ERROR
C.V. (%)
FV = Fuentes de variación; GL = Grados de libertad; N RAIZ= Número de raíces; LONG =
Longitud promedio por raíz.*, ** = Significativo con Pr ≤ 0.05 y con Pr ≤ 0.01,
respectivamente; ns = No significativo.
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Cuadro 5. Efecto de concentraciones de sales en el medio de cultivo, sobre el
enraizamiento in vitro de brotes de T. amazonia.
CONCENTRACIÓN MEDIO
RAÍCES/BROTES
LONGITUD PROMEDIO DE
WPM (%)
(#)
RAÍCES(mm)
T4 (150)
3a
45.241 a
T3 (100)
2.6 a
42.302 a
T2 (50)
2.2 a
42.085 a
T1 (25)
1.4 b
37.715 a
C (0)
1.2 b
0.98 b
Pr < 0.0001
7.3 Aclimatación.
Los inhibidores o los cambios dramáticos en el pH del sustrato a donde se van a transferir los
explantes enraizados in vitro pueden afectar adversamente el desarrollo de las raíces y el éxito
en el trasplante, es por eso que uno de los sustratos más utilizados es el Peat Moss, mezclado
con otros materiales que se degradan menos con el tiempo ya que su pH tiene menor
variación (Chen, 1992-1993).
Utilizando la mezcla 3:1:1 Peat Moss, vermiculita y agrolita respectivamente, se obtuvo un
90% de supervivencia en condiciones de invernadero, lo cual indica que fueron capaces de
superar los cambios del lugar in vitro (condición heterótrofa) a las condiciones naturales de ser
autótrofas. Aunque la aclimatación fue gradualmente acondicionada al invernadero, también
existe el uso de micorrizas para optimizar su aclimatación (Alarcón et al. 2001).
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8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
 El tratamiento más efectivo para el establecimiento in vitro, con un efecto negativo
mínimo en el índice de germinación y controlando la contaminación, consistió en
retirar los endocarpios, lavar con detergente Útil® 5g L-1 durante 5 minutos, inmersión
en Amistar® a una concentración de 3 g L-1 suplementados con 5 gotas de Tween 20®
L-1 durante una hora y sumergir en etanol 70% por 1 min seguido de 2 enjuagues en
agua bidestilada estéril, todo en constante agitación y en cámara de flujo laminar.
 El mayor número de raíces por explante y longitud promedio por raíz, se presentaron
a mayor concentración de medio WPM. Para un enraizamiento rápido la mejor
concentración fue de 150% la concentración normal del WPM.
 El 90% de las plántulas enraizadas in vitro lograron adaptarse a condiciones de
invernadero utilizando una mezcla de Peat Moss, vermiculita y agrolita 3:1:1
respectivamente.
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9. COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS.
En el siguiente listado se mencionan las competencias desarrolladas y aplicadas durante el
periodo del
proyecto “Fomento Y Operación Del Subsistema De Recursos Genéticos
Forestales Dentro Del Centro Nacional De Recursos Genéticos Del INIFAP ” en el Laboratorio
Agrícola Forestal Sección cultivo de tejido in vitro y criopreservación, los cuales engloban
temas de distintas materias como: Estadística, Aseguramiento de la Calidad, Química a
Analítica, Taller de investigación, Biología, Microbiología, Bioquímica, Instrumentación y
Control, Fisicoquímica, entre otras.
 Preparación de soluciones porcentuales
 Consulta a fuentes de información primaria y secundaria.
 Manejo de gravimetría y volumetría.
 Manejo de temperaturas, luz, humedad absoluta y humedad relativa en quipos de
laboratorio y tejido vegetal.
 Control microbiológico.
 Conocimiento en fisiología de tejido vegetal.
 Conocimiento de calidad de semillas y recursos genéticos.
 Diseños Experimentales y análisis estadístico de resultados.
 Buenas prácticas de laboratorio.
 Asepsia en el área de trabajo.
 Manejo de equipo de rayos X e interpretación de imágenes.
 Manejo de equipos de disección en cámaras de flujo laminar.
 Bioquímica de la respiración y metabolismo del tejido vegetal.
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ANEXOS
Anexo 1. Resultados de tratamientos de establecimiento y enraizamiento in vitro.
Tabla 1. Contaminación y germinación in vitro.
Tratamientos
1
2
3
4
5
6
7
8
CONTROL CONTAMINACIÓN
CONTROL GERMINACIÓN
Contaminación (%)
0
0
0
0
5
0
0
5
70
0
Germinación (%)
30
35
75
30
25
70
80
85
30
95
Tabla 2. Número de raíces y longitud promedio de tratamientos para enraizamiento in
vitro.
Tratamiento
Control
Control
Control
Control
Control
Control
Control
Control
Control
Control
1
1
1
1
Repetición
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
Número de raíces
1
1
1
1
1
1
2
1
1
2
2
2
1
1
Longitud promedio (mm)
1.91
0.85
0.52
1.10
0.40
1.73
0.79
1.34
0.72
0.44
32.75
28.56
41.48
17.14
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1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2
1
1
1
1
2
2
2
2
3
4
1
2
2
2
2
4
3
3
2
3
3
3
2
2
1
6
2
3
2
4
2
3
3
2
3
40.65
21.72
51.39
46.52
58.85
38.09
35.57
41.12
43.24
48.68
42.35
50.24
39.15
33.57
39.61
47.32
49.40
45.75
37.06
44.28
41.10
35.20
44.00
41.64
40.31
47.28
36.84
42.49
48.48
46.43
46.28
49.51
48.38
47.94
52.88
36.18
32