3. Aplicaciones

3. Aplicaciones
3.1.
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR
LA RESISTENCIA A PLAGAS Y ENFERMEDADES
Las plantas, como otros seres vivos, se encuentran sometidas a condiciones ambientales cambiantes, en muchas ocasiones a condiciones desfavorables, ante las
cuales deben adaptarse para sobrevivir. Son muchos los organismos
potencialmen-te perjudiciales para la planta, desde agentes infecciosos (virus,
viroides, bacterias, hongos), hasta organismos consumidores de vegetales (insectos,
nematodos). En la figura 1, se ilustran las grandes diferencias que se observan al
comparar el tamaño de posibles organismos patógenos para las plantas con el
tamaño de una célula vegetal. Cualquiera de estos organismos es capaz de
interferir de una u otra manera en los procesos normales del desarrollo,
crecimiento o reproducción de una planta.
En la naturaleza, sin embargo, la situación más frecuente es aquella en la que
una planta no es el huésped natural de un organismo potencialmente patógeno,
con lo cual no se produce ningún efecto perjudicial en la planta. Por el contrario,
cuando una planta es huésped natural, se establece una interacción entre ambas
partes, planta y patógeno, que puede concluir bien en el desarrollo de una enfermedad (interacción planta-patógeno de tipo compatible), bien en una resistencia
frente al patógeno agresor (interacción planta-patógeno de tipo incompatible).
Las enfermedades causadas por patógenos y plagas son la causa más importante de pérdidas en las cosechas, pudiendo representar hasta el 30-40% de
las pérdidas en todo el mundo, y si a esto se añaden las pérdidas que se producen en periodos postcosecha, el porcentaje asciende al 60-70%. No hay que olvidar que existe una limitación en la superficie cultivable de la tierra, por no decir una reducción progresiva de la misma a causa de la erosión del suelo,
acumulación de productos tóxicos, etc. Por otra parte, la población mundial sigue en continuo crecimiento. Ello hace que sea imprescindible la utilización de
nuevas variedades de especies vegetales, sobre todo en aquellas especies destinadas a la alimentación, variedades que resulten más productivas, mejor adaptadas al entorno, o más resistentes al ataque de patógenos y plagas.
* Blanca San Segundo. Departamento de Genética Molecular. Instituto de Biología
Molecular de Barcelona. Centro de Investigación y Desarrollo (CID). Consejo Superior
de Investigaciones Científicas. Barcelona.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
Evidentemente, el control de enfermedades en plantas puede y debe abordarse contemplando diferentes estrategias, el éxito o fracaso de cada una de ellas
dependerá del problema concreto frente al que nos enfrentemos. Históricamente,
la solución al problema de las enfermedades y las plagas se ha abordado con diferentes estrategias. En muchos casos la utilización de las técnicas tradicionales
de entrecruzamiento de especies para la obtención de variedades resistentes ha
resultado útil para la mejora genética de especies concretas. Hasta finales el siglo XIX, los agricultores dependían exclusivamente de prácticas de cultivo organizadas, esto es, de la alternancia de cultivos. El tratamiento con agentes químicos se inicia en la década de 1870 con la utilización de insecticidas (compuestos
Figura 1.
Diagrama ilustrativo de los posibles patógenos de plantas y su relación con el tamaño de
una célula vegetal. Tomado de Plant Pathology (1988).
APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA...
81
derivados del cobre y arsénico). Un hito importante fue la aparición del DTT
(diclorodifeniltricloroetano), momento a partir del cual las compañías químicas
rápidamente expandieron sus áreas de investigación hacia el desarrollo de
pes-ticidas sintéticos. Estos agentes fueron extensamente utilizados en el periodo
de 1940 a 1960. Fue entonces cuando surgió la crisis de los pesticidas, como
consecuencia directa del uso indiscriminado de estos agentes, los cuales estaban
siendo responsables de la aparición de resistencias en los organismos que se
pretendían combatir, de la destrucción de poblaciones naturales beneficiosas, y
de la deterioración progresiva del medio ambiente, además del impacto
negativo que se observaba en la alimentación humana. Una nueva solución
surgió, esta vez por parte de la comunidad de entomólogos, con el uso de
programas integrados para el control de plagas (IPM, «Integrated Pest
Management»). De esta manera, las plagas que afectan a los cultivos pueden
ser combatidas mediante el empleo de enemigos naturales, es decir, mediante el
empleo de organismos que son depredadores naturales del organismo
perjudicial (lucha biológica o control biológico de plagas).
En la actualidad, son muchos los programas que se han desarrollado para el
control de plagas y enfermedades. Por citar un ejemplo, mencionar el importante
papel que los ácaros fitoseidos desempeñan en el control biológico de las poblaciones de ácaros fitófagos en cultivos de vid y frutales. En el caso del control de enfermedades producidas por hongos, probablemente el ejemplo que mejor ilustra
esta estrategia es el empleo de cepas del hongo Trichoderma para combatir hongos fitopatógenos. No obstante, el diseño de programas para el control integrado
de plagas es lento en cuanto a su desarrollo y además resulta de difícil implantación en la comunidad de agricultores. Para un agricultor resulta más complejo introducir un programa diseñado para el control biológico de una plaga concreta que,
por ejemplo, seguir un calendario predeterminado de tratamientos químicos.
Fue a mediados de la década de los 90 cuando los avances de la biología molecular se vieron reflejados en la agricultura. En la actualidad, la Biotecnología
Vegetal, integrada de una manera adecuada con los sistemas de mejora genética tradicionales, representa una herramienta de gran utilidad para la obtención
de variedades resistentes al ataque por patógenos o plagas. Una de las mayores
ventajas de la Biotecnología Vegetal es que permite diseñar múltiples estrategias para la mejora genética de plantas, estrategias que además pueden ser aplicadas a muy diferentes especies cultivables. Sin embargo, para llegar a este punto, esto es a la posibilidad de obtener plantas transgénicas resistentes a
enfermedades, ha sido necesario recorrer un largo camino en el estudio de los
procesos naturales por los cuales una planta se protege frente a organismos perjudiciales. En otras palabras, el esclarecimiento de los mecanismos moleculares
asociados a la respuesta natural de defensa de las plantas y de los compuestos y
proteínas que participan en este proceso, ha sido la clave del éxito de la moderna biotecnología aplicada a la mejora genética de las plantas.
82
3.1.1.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
Mecanismos de defensa en plantas
Las plantas presentan diferentes tipos de defensas. Entre ellas se encuentran
las defensas «pasivas», que consisten en acumular en sus tejidos compuestos que
pueden resultar tóxicos para microorganismos o fitófagos. Así, en muchos órganos (frutos, hojas, tubérculos) se acumulan compuestos fenólicos y taninos en elevadas concentraciones, compuestos que poseen propiedades antifúngicas frente
a fitopatógenos {Botrytis, Phytophthora, Fusarium). Las saponinas son un ejemplo de metabolitos con propiedades antifúngicas ampliamente distribuidas en el
reino vegetal. No está claro, sin embargo, que una planta sea resistente a un patógeno concreto por el mero hecho de acumular este tipo de compuestos.
En la mayoría de los casos, sin embargo, se produce una respuesta de defensa
«activa» por parte de la planta, respuesta que está asociada a importantes cambios
en la expresión génica.Todo ello conduce a la puesta en marcha de una serie de procesos bioquímicos, que constituyen lo que se ha definido como resistencia inducida.
En algunas interacciones planta-microorganismo se observa una resistencia
que viene determinada genéticamente, basada en el modelo gen-a-gen descrito
por Flor ya en 1971. Estas resistencias presentan una alta especificidad en lo que
hace referencia a los genotipos de ambas partes (cultivar en la planta huésped y
raza del patógeno), ya que dependen de la interacción entre el producto de un
gen de resistencia en la planta (gen R) con el producto de un gen de avirulencia
complementario (gen avr) en el patógeno. En 1984 se clonó el primer gen de avirulencia de un patógeno (Pseudomonas syringae pv glycinea race 6), lo cual representó la primera evidencia molecular que corroboraba el modelo gen-a-gen.
Hubo que esperar casi diez años, hasta que se identifico el primer gen de resistencia, el gen Pío de tomate, que codifica para una quinasa serina/treonina. Desde entonces, se han identificado numerosos genes de resistencia, tanto en
mono-cotiledóneas como en dicotiledóneas, cuyos productos génicos
correspondientes presentan una serie de características estructurales en común:
repeticiones ricas en leucina, cremalleras de leucina, dominios de unión a
nucleótidos, dominios transmembrana, dominios quinasa. La existencia de
estos dominios estructurales, que se sabe participan en interacciones
proteína-proteína, apunta a una función de los productos de los genes de
resistencia como intermediarios en la serie de reacciones en cascada, muy
probablemente dentro de la ruta de señalización para la activación de genes que
participan en la respuesta general de defensa de la planta. Resulta
particularmente interesante el hecho de que, además de la conservación que se
observa entre los diferentes genes de resistencia vegetales descritos hasta la
fecha, existe un subgrupo de genes de resistencia vegetales que presentan una
gran similitud con dos proteínas animales, la proteína Toll de Dro-sophila y el
receptor de interleukina-1, proteínas que están implicadas en el proceso de
immunidad innata de insectos y mamíferos, respectivamente. Ello apunta a que
plantas y animales pueden haber desarrollado mecanismos similares para
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA...
83
defenderse de patógenos. Desde un punto de vista práctico, la elevada especificidad que presentan las resistencias basadas en el modelo gen-a-gen, hace que en
muchos casos no se disponga de variedades comerciales resistentes a cepas de
patógenos establecidos localmente. Sin embargo, la disponibilidad de genes de
resistencia tiene una clara aplicación para la mejora de las propiedades de resistencia en plantas transgénicas. Por citar un ejemplo, la introducción del gen de
resistencia N de tabaco (el gen N que confiere resistencia al virus TMV en tabaco) en plantas de tomate ha permitido obtener líneas de tomate resistentes a
TMV. Otro éxito de la biología molecular ha sido la aplicación de las técnicas de
marcadores moleculares ligados a genes de resistencia para la identificación y selección temprana de genotipos en programas de mejora vegetal.
La situación más frecuente en la naturaleza es aquella en la cual la planta
manifiesta resistencia frente a un patógeno o a un fitófago (insectos o
nemato-dos) en función de la activación de mecanismos generales de defensa,
o resistencia inducida. Este es un proceso complejo y a su vez altamente
coordinado que está asociado a importantes alteraciones de la expresión génica
en la planta huésped. En definitiva, se basa en la inducción de la expresión de
genes de defensa, proceso que se desencadena como consecuencia directa del
ataque por patógenos o predadores. En estas situaciones, no se trata de
resistencias condicionadas genéticamente, y por tanto no presentan
especificidad en cuanto a los genotipos del huésped y del patógeno. Es
importante por tanto diferenciar un gen de resistencia de un gen de defensa
vegetal.
3.1.2.
Resistencia inducida frente a patógenos y fitófagos
Durante varias décadas, entomólogos y fitopatólogos han investigado de
manera independiente las respuestas de las plantas bien frente a fitófagos bien
frente a patógenos. A medida que se van conociendo los mecanismos moleculares por los cuales las plantas se protegen frente a estos organismos, resulta cada vez más claro que se trata de procesos relacionados entre si.
La resistencia inducida en plantas presenta una serie de características generales. Un primer aspecto a considerar, es que en el proceso de resistencia inducida participan múltiples mecanismos y vías metabólicas, todo ello integrado
de una manera sumamente coordinada. Un segundo aspecto, es la falta de especificidad que se observa tanto en cuanto a los agentes inductores como a los
organismos que resultan afectados por la respuesta de la planta. Como se verá
a lo largo de este capítulo, esta idiosincrasia en la respuesta defensiva de las plantas es lo que en cierto modo permite modificar las propiedades de resistencia de
una planta frente a patógenos y plagas mediante transformación genética. Se desarrollan a continuación con más detalle cada uno de estos aspectos.
1. La resistencia inducida en plantas viene determinada por diferentes
vías y mecanismos. Frecuentemente, la resistencia frente a
determinados pa-
84
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
tógenos se manifiesta mediante la respuesta hipersensible. En este caso,
las células que se encuentran en la proximidad del foco de infección sufren una muerte controlada, hecho que contribuye a limitar la progresión
de la infección del tejido. Hay un aparente paralelismo entre el fenómeno de muerte celular programada que se produce en la respuesta hipersensible con el proceso de apoptosis en el sistema animal. Sin embargo, en
muchos sistemas planta-patógeno la resistencia se produce en ausencia de
esta respuesta hipersensible. Por otra parte, la resistencia puede ser localizada, esto es, limitada al punto de infección o de ataque por un fitófago;
en otros casos, se observa una resistencia sistémica, en zonas de la planta
alejadas del punto de infección. Frecuentemente, se observa un efecto de
Ímmunización en la planta según el cual una planta que ha estado expuesta
y, ha superado una infección, se encuentra protegida frente a infecciones
posteriores y no únicamente frente al patógeno inicial sino también frente a otros patógenos. Asimismo, esta protección se manifiesta no sólo en
el tejido inicialmente infectado, sino también en puntos distantes de la
planta. Este fenómeno es conocido como resistencia sistémica adquirida
(SAR, «Systemic Acquired Resistance»). Por último, mencionar que algunas respuestas defensivas se desencadenan rápidamente, en cuestión de
minutos u horas; otras por el contrario, se producen al cabo de varios días después de la inducción. Esta diversidad de fenómenos y respuestas pone de manifiesto que la resistencia frente a patógenos y fitófagos se basa
en la expresión de múltiples mecanismos que se integran en un proceso
general coordinado de resistencia inducida.
Las respuestas de defensa inducidas presentan una sorprendente falta de
especificidad, no solo en lo que se refiere a las señales a las que la planta
responde, sino también a los efectos que su respuesta produce. Son muchos los organismos capaces de desencadenar una respuesta defensiva en
la planta, tales como virus, bacterias, hongos o tratamientos con agentes
químicos, además de predadores, insectos y nemátodos. En determinados
casos, patógenos y fitófagos pueden activar las mismas respuestas en la
planta, mientras que en otros se activan respuestas diferentes. A pesar de
esta multiplicidad de respuestas, resulta sorprendente el hecho de que el
reconocimiento planta-patógeno sea un proceso altamente específico.
Una vez la planta ha activado sus mecanismos de defensa en respuesta
a un agente agresor concreto, se da la circunstancia de que estos mecanismos pueden estar dirigidos, y ser efectivos, frente a una gran variedad
de organismos. Esta respuesta de defensa de las plantas sólo se explica
por la existencia de múltiples vías de señalización que desencadenan
múltiples respuestas que pueden ser efectivas frente a un amplio espectro de organismos. Algunos de los componentes individuales que se
producen pueden ser específicos mientras que otros pueden no serlo.
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA...
3.1.3.
85
Las plantas sintetizan compuestos con actividad antimicrobiana o
insecticida
Las plantas desarrollan diferentes estrategias defensivas que van dirigidas
a contrarrestar el paso o penetración del patógeno, o el consumo de las mismas
por fitófagos. Una primera línea de defensa frente a patógenos es la creación de
barreras físicas, a través del reforzamiento de la pared celular. Por ejemplo, se
sabe que el metabolismo de los fenilpropanoides desempeña un papel importante en la respuesta de defensa frente a patógenos (la incorporación de compuestos fenólicos en la pared celular es una de las reacciones de defensa que
ocurre más rápidamente). La lignificación, junto con la incorporación de proteínas estructurales en la pared (proteínas ricas en hidroxiprolina, proteínas ricas
en glicina), tiene como resultado el reforzamiento de la pared vegetal y por lo
tanto tiene un efecto obstaculizador a la penetración del patógeno. La formación de depósitos de callosa en papilas, es una reacción que se observa frecuentemente, tanto en respuesta al ataque por patógenos como en respuesta a herida (efecto que se produce cuando un fitófago se alimenta de la planta).
Asimismo, las plantas tienen la capacidad de sintetizar compuestos,
metabo-litos o proteínas, que poseen ya un efecto nocivo directo sobre el
organismos agresor, esto es, compuestos con actividad antimicrobiana o
insecticida. Desde el punto de vista bioquímico, estos compuestos son de
naturaleza muy heterogénea. Las fitoalexinas, compuestos de bajo peso
molecular con actividad antimicrobiana, son también productos del metabolismo
de los fenilpropanoides. Cada especie vegetal produce fitoalexinas características,
cuya síntesis depende de la activación transcripcional de los genes que codifican
para los diferentes enzimas involucrados en su biosíntesis (fenilalanina.amonio
liasa, 4-cumarato:CoA ligasa, etc). Por citar unos ejemplos, la camalexina y la
pisatina son fitoalexinas producidas por Arabidopsis y guisante, respectivamente.
La síntesis y acumulación de fitoalexinas en los puntos de infección es una
respuesta rápida por parte de la planta.
En líneas generales, dentro de la respuesta de defensa que conduce hasta la
síntesis y acumulación de productos con actividad antimicrobiana o insecticida
pueden distinguirse diferentes etapas:
— Iaetapa: Reconocimiento del organismo agresor por parte de la célula vegetal. Una respuesta defensiva eficiente frente a un patógeno es dependiente de la detección rápida de su presencia. Ello se produce a través de
la unión de moléculas inductoras a receptores específicos localizados en
la membrana de la célula vegetal. Estas moléculas, de naturaleza química
muy diversa, pueden tener un origen externo (moléculas provenientes del
patógeno), o interno (moléculas derivadas de la pared celular del huésped como consecuencia de la actividad degradadora por parte del patógeno). El resultado de este reconocimiento, es la puesta en marcha de una
serie de reacciones en cascada, en la propia membrana plasmática y lúe-
86
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
go en el citoplasma, que culminan en el núcleo de la célula vegetal con la
inducción de la expresión de genes de defensa (Fig. 2). Las primeras reacciones que se observan son
alteraciones en el flujo de iones a través de
la membrana (entrada de H+ y Ca 2+, salida de K+ y Cl~), y producción de
moléculas reactivas de oxígeno (por la acción del complejo de oxidasas
dependientes de NADPH , y peroxidasas). Más recientemente, se ha podido comprobar como el óxido nítrico, un poderoso activador de la respuesta inmune animal, tiene una función importante en la respuesta defensiva de las plantas frente a patógenos. Estas moléculas (especies
reactivas de oxígeno, óxido nítrico), no sólo pueden tener un efecto tóxico directo sobre el patógeno, sino que además pueden actuar como moléculas señalizadoras para la activación de mecanismos de defensa (respuesta hipersensible, activación de la expresión de genes de defensa).
— 2a etapa: Transmisión de la señal hasta el núcleo de la célula vegetal. El
proceso que se desencadena con el reconocimiento del organismo agre
sor al nivel de la membrana citoplasmática, hasta la activación transcripcional de genes de defensa, tiene todavía muchos puntos oscuros. Se
sabe que participan procesos de fosforilación y defosforilación de pro
teínas, procesos que son dependientes de los niveles de Ca++ citoplasmático (Fig. 2). Por otra parte, se han identificado factores de transcrip
ción que participan en la regulación de la expresión de genes de defensa
concretos. La acumulación de los transcritos correspondientes a genes
de defensa se detecta ya desde los minutos hasta las primeras horas, en
el caso de aquellos genes cuya expresión se activa localmente en torno
al lugar de infección o del ataque por un fitófago. En el caso de genes
que se expresan sistémicamente, la acumulación de los transcritos de ge
nes de defensa se observa desde las primeras horas hasta varios días más
tarde. Quedan, sin embargo, muchos aspectos por aclarar para poder co
nocer como se integran todos estos procesos dentro de la célula vegetal.
— 3a etapa: Acumulación de compuestos capaces de contrarrestar la pene
tración de un patógeno o el consumo por fitófagos. Además de los com
puestos anteriormente mencionados, tales como las fitoalexinas, las plan
tas sintetizan y acumulan una serie de proteínas que de una manera
genérica se han denominado proteínas asociadas a la patogénesis, o pro
teínas PR (Pathogenesis-Related). Las proteínas PR son proteínas de la
planta huésped cuya expresión se induce en situaciones de patogénesis,
o en situaciones relacionadas. Las situaciones de patogénesis incluyen la
infección por diferentes tipos de patógenos, virus, viroides, bacterias y
hongos. Por situaciones relacionadas se entiende la herida (efecto aso
ciado al ataque por predadores) y el tratamiento con agentes químicos u
otros agentes inductores. El sistema mejor caracterizado en cuanto a la
expresión de proteínas PR es el de la interacción de tabaco con el virus
APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA...
Pcroxinlh'ico _ _ _-..
87
Rcsistencia Sistemica Adquirida
( mediada por Acido Salicilico )
r
Oxido
Nitrico
Membrana
plasmatica
Acido IInoleico
Figura 2. Co mponentes principaLes de La cadena que se inicia con el reconocimiento del pat6geno par receptores especfficos de la membrana pLasmatica y conduce hasta La activaci6n de La expresi6n de genes de
defensa en el nucleo de la celula vegetal. Adaptado a partir de Somssich y Hahlbrock (1998).
TMV (TMV, «Tobacco Mosaic Virus»). La informacion recogida en el
campo de las protefnas PR en muy diferentes sistemas de interaccion
planta/patogeno ha permitido agrupar estas protein as en familias independientes, atendiendo a sus secuencias nucleotidicas 0 proteicas, relaciones serologicas 0 a su funcion (Tabla 1). Se ha demostrado la actividad antifungica, tanto in vitro como in vivo (plantas transgenicas), para
varias protein as PRo Este serfa el caso de las quitinasas, ~-1,3-glucanasas,
defensinas, tioninas y proteinas transportadoras de Ifpidos. Dentro de las
proteinas PR, se ha incluido una familia de proteinas, los inhibidores de
proteinasas (PR 6), cuya funcion esta directamente relacionada con la
proteccion frente al ataque por predadores (insectos, nematodos).
4 a etapa: Transmision de la sefial para la activacion de la respuesta de defensa en la planta entera. Las plantas activan sus defensas no solo en el
punto concreto en el cual se produce la infeccion 0 el ataque por el fitofago (respuesta local), sino tambien en puntos distantes de la planta (respuesta sistemica). Se han descrito diferentes moleculas que, de una manera u otra, estan implicadas en la activacion de los mecanismos de defensa
a escala sistemica. Asi por ejempl0, se sabe que el acido salicflico estimula la respuesta local de defensa de la planta, siendo ademas necesario que
se acumule en niveles importantes en los tejidos de la planta para que se
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
manifieste la respuesta sistémica adquirida. La posible función de la vía
mediada por el ácido salicílico frente a fitófagos es un aspecto más desconocido. Aunque el ácido salicílico es necesario para que se manifieste
la respuesta sistémica adquirida, se piensa que no es la molécula señalizadora que se mueve a través de la planta. Algunas rizobacterias no patogénicas activan una respuesta diferente, no mediada por ácido salicílico, y que también protege a la planta frente a virus, bacterias y hongos
patogénicos. La particularidad de este mecanismo es que no va asociado
a la reacción hipersensible ni a la producción de proteínas PR. Esta respuesta ha sido definida como resistencia sistémica inducida (ISR, «Induced Systemic Resistance») para diferenciarla del fenómeno de resistencia
sistémica adquirida (SAR, «Systemic Adquired Resistance»). Otra vía de
señalización de la respuesta de defensa a escala sistémica esTABLA 1 Familia de proteínas PR
(«Pathogenesis-Related»)
Familia
Representante
Propiedades/actividad
PR-1
PR-la de tabaco
Desconocida
PR-2
PR-2 de tabaco
(3-1,3-glucanasa
PR-3
Proteína P, Q de tabaco
Quitinasa tipo I, II, IV, V, Vi y VII
PR-4
Proteína R de tabaco
Quitinasa I y II
PR-5
Proteína S de tabaco
Tipo taumatina
PR-6
Inhibidor I de tomate
Inhibidor de proteinasas
PR-7
Proteína P69 de tomate
Endoproteinasas
PR-8
Quitinasa de pepino
Quitinasa tipo III
PR-9
Peroxidasa de tabaco
Peroxidasa
PR-10
Proteína PR1 de perejil
Tipo ribonucleasa
PR-11
Quitinasa clase V de tabaco
Quitinasa tipo I
PR-12
Proteína Rs-AFP3 de rábano
Defensina
PR-13
Proteína THI2.1 de Arabidopsis
Tionina
PR-14
Proteína LTP4 de cebada
Proteína transportadora de lípidos
Tomado de von Loon y col. (1999).
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA...
89
ta mediada por el etileno. Así, en respuesta a infección o herida se observa una producción importante de etileno en la planta, seguido de un
incremento de una serie de compuestos de defensa (lignina, proteínas
PR, etc.). El ácido jasmónico. un regulador del crecimiento vegetal, también interviene en la respuesta de defensa de la planta frente a fitófagos
y microorganismos. La sistemina. una hormona polipeptídica vegetal, y
no el ácido jasmónico, es la molécula señalizadora que se transporta a
través de la planta, activando la producción de jasmonatos. Por último, el
ácido abscísico. otra fitohormona reguladora de diferentes procesos fisiológicos de la planta implicada en estrés abiótico (p.e. sequía), también
participa en la respuesta de defensa de las plantas frente a herida, probablemente en una etapa anterior a la vía del ácido jasmónico. Dependiendo de la especie vegetal, se observan diferencias en cuanto a la participación de cada una de las posibles rutas de señalización indicadas.
En definitiva, frente al ataque por patógenos y fitófagos se produce un reajuste importante en los procesos fisiológicos de una planta en el que participan
múltiples vías de señalización mediadas por hormonas. Estas mismas hormonas,
realizan funciones reguladoras de los procesos fisiológicos propios del desarrollo de la planta. Por lo tanto, estas hormonas adquieren nuevas funciones con el
fin de proporcionar a la planta una defensa rápida y efectiva.Un hecho comprobado es que las diferentes rutas de señalización interaccionan entre ellas, interacciones que pueden tener un efecto de sinergismo o de antagonismo. Por
ejemplo, en tabaco se observa un efecto sinérgico entre etileno y
metiljasmona-to en cuanto a la indución de genes PR. Por otra parte, se ha
descrito que el ácido salicílico inhibe la ruta del ácido jasmónico y la
acumulación de inhibidores de proteinasas. La existencia de esta multiplicidad
de vías de señalización y de conexiones entre las mismas explicaría los efectos
de resistencia cruzada que se observan frente a diferentes organismos,
patógenos o fitófagos.
3.1.4.
Respuesta de defensa frente a insectos
La respuesta que las plantas desarrollan frente al ataque por insectos es una respuesta altamente sofisticada. Por una parte, se produce una respuesta directa según
la cual la planta sintetiza y acumula en sus tejidos proteínas con actividad «insecticida». Este es el caso de los genes para inhibidores de proteinasas. Estos inhibidores de
proteinasas se acumulan de modo natural en órganos de reserva (tubérculo de patata) y en semillas, pero además su expresión se induce en hojas como respuesta a herida (ataque por insectos). La función defensiva de estas proteínas reside en su capacidad para inhibir actividades proteoliticas de origen animal o microbiano, pero no
de proteinasas vegetales. Así, éstos inhibidores de proteinasas inhiben las actividades
proteoliticas digestivas de las larvas de insectos, cuando éstas se alimentan de la plan-
90
BIOTECNOLOGÍA APLICADA ALA AGRICULTURA
ta, disminuyendo de esta manera la calidad nutricional del material del que se alimentan. Ello, además de producir un efecto disuasorio tal que el insecto deja de alimentarse, en muchos casos conduce a retrasos importantes en el crecimiento e incluso a la muerte del insecto. La inducción de la expresión de los genes de inhibidores de
proteinasas se observa tanto a escala local como sistémica. De hecho, este ha sido el
modelo más exhaustivamente estudiado en relación con las moléculas señalizadoras
implicadas en la respuesta sistémica frente a herida en plantas (ácido abscísico, ácido
jasmónico y sistemina). Estos estudios se han realizado fundamentalmente en solanáceas (patata, tomate). Resulta interesante el hecho de que la ruta biosintética que
conduce hasta la síntesis del ácido jasmónico en plantas (ruta de los octadecanoides)
es similar a la ruta de biosíntesis de prostaglandinas y leucotrinas en animales. De nuevo nos encontramos ante un paralelismo entre animales y plantas.
Pero además, las plantas se protegen frente a insectos por una vía indirecta,
que consiste en la emisión de compuestos volátiles capaces de atraer a depredadores o parásitos que son enemigos naturales del fitófago que se encuentra atacando a la planta (Fig. 3). Además, la emisión de estos compuestos al entorno es
capaz de activar las respuestas de defensa en las plantas vecinas. Más concretamente, se ha podido comprobar que en la saliva de determinados fitófagos se encuentran compuestos, p.e. la volicitina de las larvas de la polilla Spodoptera exigua, que son capaces de inducir la emisión de compuestos volátiles atrayentes de
avispas depredadoras cuando las larvas se alimentan de plantas de maíz. De todo ello se desprende el hecho de que una planta es capaz de discriminar entre
una herida mecánica y el mordisco de un fitófago. Si bien los mecanismos por los
cuales la planta regula la síntesis de estos compuestos volátiles no son del todo
conocidos, se piensa que la vía de los octadecanoides, vía que la planta utiliza para
regular la expresión de los inhibidores de proteinasas, también está implicada en
este proceso de liberación de compuestos volátiles al medio ambiente.
3.1.5.
Aplicaciones de la resistencia inducida en agricultura
Una práctica común en medicina preventiva es la vacunación o inmunización
de pacientes por inoculación con cepas atenuadas de patógenos. Técnicas de «inmunización» han sido aplicadas para la protección de especies vegetales frente a
enfermedades, si bien, ésta no es una práctica generalizada. En esta dirección, existe la posibilidad de inducir una resistencia de manera artificial en plantas mediante
la aplicación de agentes químicos capaces de actuar como inductores de la respuesta defensiva. La actividad de estos agentes inductores, no es una actividad
an-tibiótica propiamente dicha, ni tampoco se debe a una modificación de los
mismos hasta compuestos con actividad antimicrobiana. Por el contrario, estos
agentes tienen la propiedad de producir un efecto de «vacunación» a través de la
inducción de la expresión de los mecanismos naturales de defensa de la planta.
De esta manera, la planta se hace más resistente frente a posteriores infecciones
por pa-
APLICACIONES BIOTE CNOL6GlCAS PARA MEJORAR LA RESISTEN CIA ...
91
t6genos. Como ejemplo, cabe citar compuestos como el BTH y eIINA, inductores de la respuesta mediada por acido salicflico, capaces de desencadenar respuestas simi lares a la que se observan en respuesta a infecci6n por pat6genos. Eslas moleculas son ademas inductoras de la resistencia sistemica adquirida y
producen un efecto protector frente a un amplio espectro de pat6genos. La utilizaci6n de elicitores qufmicos frente a fit6fagos se encuentra en una fase menos
f-M ,rAe
Avispas deprcdadoras
. ...
-Je' M'
-.'
Com puestos vohi tiles
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Hedda
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Ruta
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Figura 3. R espues ta de defensa de las plantas frent e al ataque por fit6fagos. En respues la a l ataque por
insectos fit6fagos y a la herida se induce la expresi6n de genes que codifican para inhibidores de prole inasas. Estos inhibid ores lienen efectos nocivos en el proceso digestivo del insecto. causando el retra so
en el crecimiento e incluso la mu erte d e imismo. Ademas la planta que est a siendo atacada e mile una serie de compuestos vo lati les que atrae a avis pas, que so n enemigos natural es del fit6fa go qu e se esta alime ntando de la planta. Adaptado a partir de Pare y Tumlinson (1999) .
92
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
desarrollada. Recientemente, se ha comprobado como la aplicación exógena de
ácido jasmónico induce resistencia frente a fitófagos en plantas de tomate.
La «vacunación» de una planta con organismos vivos (agentes de control biológico) tiene la ventaja de que proporciona todas las señales ante las cuales la planta reacciona. Sin embargo, la situación más frecuente es que la aplicación de organismos vivos puede resultar de difícil control. De ahí el interés que tiene el desarrollo
de métodos de inmunización basados en la utilización de compuestos inductores de
la respuesta defensiva en lugar de organismos vivos. A medida que se vaya ampliando
nuestro conocimiento acerca de las rutas implicadas en la activación de las respuestas
defensivas de las plantas, sin duda se ampliarán las posibilidades para la utilización
de inductores químicos en la protección frente a patógenos y/o fitófagos. En último
término, la aceptación de agentes químicos como inductores de resistencias en plantas por los agricultores vendrá determinada por consideraciones económicas, esto
es, dependerá del coste que la utilización de esta estrategia implica para el agricultor y de los beneficios que ello representa para las compañías que producen y comercializan estos compuestos. Un aspecto negativo acerca del uso de estos compuestos en agricultura es que su utilización extensiva podría tener consecuencias
negativas desde el punto de vista medioambiental.
Sin duda, la utilización de genes de defensa para la transformación de plantas y obtención de variedades resistentes a plagas y enfermedades, ha tenido el
impacto más importante en la agricultura moderna.
3.1.6.
Obtención de variedades transgénicas resistentes a
plagas y/o patógenos
Las técnicas de la biología molecular han contribuido enormemente al desarrollo y obtención de variedades que presenten mejoradas sus propiedades de resistencia frente a infección por patógenos, o frente al ataque por depredadores
(insectos, nematodos). En el transcurso de los últimos años se ha recogido una
gran cantidad de información acerca de los procesos de defensa naturales de las
plantas y se han identificado una colección importante de genes que participan en
dichos procesos. Es ahora cuando se están obteniendo los resultados prácticos del
trabajo anterior, al aplicarse toda esta información y elementos de trabajo para la
mejora genética de especies vegetales de interés en el sector agroalimentario.
De las propias características de la respuesta natural de defensa de las plantas, se desprende el hecho de que los genes de defensa vegetales resulten herramientas de utilidad en la mejora genética de especies vegetales. Tal y como se ha
comentado anteriormente, la expresión de genes PR se induce de manera
ines-pecífica no sólo con respecto al agente inductor sino también en cuanto al
efecto que producen sobre el organismo agresor. Ello explica el hecho
repetidamente observado de que un gen PR obtenido a partir de un sistema de
interacción planta-patógeno concreto pueda ser utilizado con éxito para obtener
resistencias
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA...
93
frente a otro tipo de patógeno, y ello no únicamente en la especie de la cual proviene dicho gen sino también en otras especies. El ejemplo que mejor ilustra estos aspectos es la utilización de genes que codifican para quitinasas y
|3-l,3-giu-canasas de tabaco, genes cuya expresión se induce en respuesta a
infección por el virus del mosaico del tabaco (TMV), y que han sido utilizados
para la obtención de resistencias frente a hongos en otras especies, por ejemplo
tomate.
Por otra parte, se sabe que la expresión de genes que codifican para proteínas de defensa se induce tanto en interacciones de tipo incompatible (resistencia
frente al patógeno, incluyendo en respuesta hipersensible) como de tipo compatible (susceptibilidad frente al patógeno). Por lo tanto, la resistencia o la susceptibilidad frente a un patógeno, es dependiente de diferencias en: a) la intensidad
con que se expresan estos genes de defensa; b) el momento o el tiempo durante
el cual se expresan; c) los tejidos que los están expresando (expresión local o
sis-témica), y d) la correcta combinación de genes que se expresan en cada caso.
Por consiguiente, la modificación de cualquiera de estos parámetros (p.e. la
sobreex-presión de un gen concreto en la propia planta) nos permite mejorar las
propiedades de resistencia de una planta frente a patógenos o ataque por
insectos.
La utilización de genes de defensa para la obtención de plantas transgenicas
empezó a dar sus frutos en especies dicotiledóneas, debido a la facilidad con que
estas especies pueden ser transformadas por una bacteria del suelo, Agrobacteñum.
Esta bacteria, que infecta de modo natural muchas especies de plantas dicotiledóneas, es capaz de integrar en el genoma de la planta huésped fragmentos de ADN,
es decir, que lleva a cabo un proceso de transformación genética en la planta huésped. Las especies monocotiledóneas, y dentro de ellas especies de evidente interés
agro-económico como son los cereales, han sido tradicionalmente especies más difíciles de transformar. Así pues, durante varios años la posibilidad de obtener plantas transgenicas resistentes de especies monocotiledóneas estuvo frenada por la
metodología de la transformación propiamente dicha y por la dificultad de regenerar plantas fértiles a partir del material transformado. La técnica de bombardeo
con microproyectiles ha venido a solucionar muchos de estos problemas. Así, la posibilidad de introducir ADN directamente en células, tejidos u órganos
regenera-bles proporciona un método adecuado para la transformación de
especies de cultivo. Simultáneamente, se han ido desarrollando las técnicas de
transformación mediadas por Agrobacteñum, de manera que se ha ampliado
significativamente el número de especies susceptibles de ser transformadas por
esta metodología. Por ejemplo, se ha conseguido ya que Agrobacteñum
transforme cereales (arroz).
En la literatura son muchos los ejemplos descritos, que demuestran que los
genes PR son útiles para la obtención de plantas transgenicas mejoradas en sus
propiedades de resistencia frente a patógenos, hongos y bacterias fundamentalmente. En general, la expresión simultánea de estos genes de defensa, por
ejemplo quitinasas junto con [3-1,3-glucanasas, tiene un efecto protector superior al que aporta la expresión individual de cada uno de ellos. En el caso de qui-
94
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
tinasas y |3-l,3-glucanasas el mecanismo por el cual se consiguen las resistencias
a hongos está claro, ya que los substratos naturales de estas hidrolasas, quitina
y [3-1,3-glucano, son los componentes estructurales mayoritarios de la pared de
muchas familias de hongos. Para otras proteínas PR, se desconoce el mecanismo exacto por el cual se produce esta resistencia.
Mientras que en el campo de las resistencias frente a hongos o bacterias ya
se han obtenido resultados importantes mediante manipulación de la expresión
de genes que codifican para proteínas de defensa de origen vegetal, no es éste
el caso para las resistencias frente a virus. Únicamente, una proteína de la familia de las proteínas inactivadoras de ribosomas (proteínas RIP, o «Ribosome
Inactivating Protein»), al ser introducida en plantas de tabaco y patata protege
parcialmente frente a varios virus no relacionados. Desgraciadamente, las plantas transgénicas muestran fenotipos anormales, aparentemente a causa de efectos tóxicos del producto del transgén. Más recientemente se ha comprobado que
la expresión en plantas de tabaco de una forma mutada de esta proteína RIP tiene efectos protectores frente a virus sin que cause efectos tóxicos para la planta. Los logros más espectaculares obtenidos en la protección frente a virus provienen de estrategias diferentes. En este campo, se han conseguido muy buenos
resultados en las resistencias definidas como «resistencias derivadas de patógeno» («Pathogen Derived Resistance») basadas en la introducción de material genético viral en el genoma de la planta huésped. Así, en 1986 se demostró por primera vez que plantas transgénicas que expresan la proteína de la cubierta del
virus del mosaico del tabaco (TMV) mostraban resistencia frente aTMV. Este
mecanismo de resistencia determinado por la expresión de la proteína de cubierta ha sido observado para otros diferentes virus (CMV, «Cucumber Mosaic
Virus», etc.). Se han descrito además resistencias mediadas por la introducción
de otras secuencias virales, tanto secuencias codificantes (replicasas, proteínas
de movimiento) como secuencias no codificantes (secuencias antisentido,
ge-nomas defectivos y secuencias de ARN satélite). Se sabe ahora que en
muchos casos estos mecanismos de resistencia se encuentran mediados por
ARN. Se trata de procesos de degradación específica de las moléculas de ARN
virales como consecuencia de la formación de moléculas híbridas (doble
cadena de ARNs), mecanismos similares al fenómeno de cosupresión o
silenciamiento post-trans-cripcional de genes endógenos por parte de la célula
vegetal.
Sin embargo, las estrategias basadas en la utilización de genes que codifican para proteínas con actividad antimicrobiana de origen vegetal no han permitido hasta la fecha poder obtener variedades de interés comercial con mayor
resistencia a patógenos o plagas, debido sobre todo al limitado espectro de hongos fitopatógenos frente a los cuales la planta resulta protegida. Muy probablemente, ello se debe a que no se conoce todavía cuál es la combinación adecuada, dentro del conjunto de genes que participan en la defensa, que es efectiva
para combatir un número importante de patógenos. Es por ello, que en la ac-
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA...
95
tualidad se está dedicando un esfuerzo importante hacia la identificación de genes de defensa de origen no vegetal para la mejora genética de plantas.
La idea de utilizar genes que codifican para proteínas o péptidos con actividad antimicrobiana, que se producen en la respuesta natural de defensa de
otros organismos para aumentar las propiedades de resistencia en plantas amplia las posibilidades, y representa una estrategia alternativa a la utilización de
genes de defensa de origen vegetal. Los organismos que potencialmente pueden
resultar de mayor interés como fuente suministradora de genes antimicrobianos pueden ser hongos antagonistas o micoparásitos, como es el caso de
Tri-choderma spp.. Estos hongos, que por otra parte son frecuentemente
utilizados como controladores biológicos de hongos patógenos, han
evolucionado específicamente para atacar a otros hongos del suelo, pero no a
las plantas. Los genes que codifican para péptidos que participan en la
respuesta inmune de insectos (defensinas, cecropinas) son también candidatos
válidos para ser utilizados como transgenes en la mejora genética de plantas.
A diferencia de lo que se observa con los genes de defensa de origen vegetal, los
resultados ya obtenidos con la introducción de genes de defensa de origen no
vegetal en plantas indican que las plantas transgénicas quedan protegidas frente
a un espectro más amplio de patógenos.
La utilización de genes de origen no vegetal es precisamente una de las estrategias que ha dado mejor resultado en relación a la protección frente al ataque por insectos. Este es el caso de los genes que codifican para toxinas con actividad insecticida de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis (genes Sí). Así
por ejemplo, los genes Bt han sido expresados en diferentes plantas dicotiledóneas, tabaco, tomate, patata, así como en monocotiledóneas, maíz y arroz. De hecho, es bien conocido el caso del maíz Bt, cultivo protegido frente al taladro, y
uno de los primeros cultivos transgénicos que han sido comercializados.
Se han obtenido también resistencias frente a insectos mediante la introducción de genes concretos de origen vegetal, genes que codifican para inhibidores de proteinasas (familia 6 de las proteínas PR). Así por ejemplo se han obtenido plantas transgénicas de arroz en las que se ha introducido el genpin2 (gen
que codifica para un inhibidor de serín proteinasas de patata) bajo control de
su propio promotor (inducible por herida), plantas que muestran resistencia a
Sesamia inferens (lepidóptero minador del tallo). Sin embargo, el efecto de protección observado tras introducir el gen de un inhibidor de proteinasas en una
planta parece ser transitorio, en el sentido de que con el paso del tiempo los insectos han demostrado una capacidad de adaptación a la presencia del transgén
en la planta huésped. Esta adaptación resulta del incremento en la producción
de actividades proteolíticas no susceptibles de inhibición por el inhibidor
so-breexpresado, y que compensan el efecto inhibidor inicial. Ello apunta a que
deben emplearse estrategias que garanticen un efecto de protección más
duradero, como puede ser la introducción de varios inhibidores de
proteinasas que
96
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
presenten diferentes propiedades inhibitorias, es decir que inhiban diferentes
tipos de actividades proteolíticas digestivas de los insectos.
La línea de investigación más actual va en la dirección de poder manipular
mediante transformación genética vías concretas de señalización para la activación de las respuestas de defensa. Ello permitirá regular la expresión de varios
genes de defensa simultáneamente. La utilización de esta estrategia requiere no
obstante un conocimiento preciso de la ruta de señalización que se desea modificar, así como, de las posibles rutas secundarias que puedan resultar afectadas.
3.1.7.
Nueva generación de plantas transgénicas
Son relativamente pocos los años que han transcurrido desde que se introdujo en el mercado mundial el primer cultivo modificado genéticamente (1995).
En el año 1996, agricultores de Estados Unidos y Canadá sembraron maíz tolerante al taladro, el maíz Bt. En 1999, aproximadamente el 50% del maíz, algodón
y soja cultivado en Estados Unidos ha sido modificado genéticamente (bien para
producir la proteína insecticida Bt, bien para introducir resistencia a herbicidas).
Los cultivos transgénicos con los que más ensayos de campo se han realizado son
algodón, maíz, cañóla, melón, patata, soja, tomate y tabaco. Las ventajas que se
derivan de la utilización de estas variedades modificadas genéticamente incluyen
el incremento en la producción y la reducción en el uso de productos químicos en
el campo (pesticidas), con el consiguiente beneficio que ello supone para la conservación del medio ambiente y la reducción de los costes de producción.
Paralelamente, durante este corto periodo de tiempo, la biotecnología vegetal aplicada a la mejora de plantas ha sufrido un espectacular avance. Las características de las nuevas variedades de plantas transgénicas, están significativamente mejoradas con respecto a las que se liberaron inicialmente. Se han
superado así algunos de los aspectos criticados sobre la producción de plantas
transgénicas que han sido el origen de importantes debates públicos que, en mayor o menor grado, dificultan la aceptación de estas tecnologías por la sociedad.
En la percepción pública de los cultivos modificados genéticamente existen dudas y preocupaciones, en aspectos que quizás la comunidad científica no ha contribuido a aclarar suficientemente, pero ante los cuales existen soluciones con
una base científica bien fundada. Sin entrar en detalles técnicos, examinaremos
algunos de los aspectos considerados negativos en las plantas transgénicas de
primera generación y las soluciones encontradas para cada uno de ellos.
Partiendo de la base de que se dispone de un gen concreto cuyo producto se
sabe es efectivo para combatir un patógeno o plaga determinada, y que por tanto
su utilización como transgen resulta de interés, el primer objetivo a conseguir es
que el gen en cuestión se exprese en niveles adecuados y suficientes para conferir
resistencia a la planta transgénica. Este objetivo anteriormente se conseguía mediante la utilización de promotores (secuencias que dirigen la expresión de un gen)
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA...
97
constitutivos capaces de dirigir la expresión de genes antifúngicos o insecticidas en
niveles importantes en los diferentes tejidos de la planta transgénica. Por el contrario, la nueva generación de plantas transgénicas se basa en la utilización de promotores inducibles. De esta manera, el gen se expresará únicamente en aquellos
momentos en los que es requerida la presencia de su producto (proteína
antifún-gica o insecticida), o sea, cuando la planta se encuentra infectada por un
patógeno o cuando es atacada por un fitófago. También con relación al promotor
que se emplea para la transformación, otro aspecto al que se presta una atención
especial es que el promotor confiera una expresión de tejido controlada, y no una
expresión generalizada en todos los tejidos de la planta. Ello permite que la
proteína antimicrobiana o insecticida se produzca únicamente en los tejidos de la
planta que son susceptibles de ser atacados por el agente agresor, pero no en
tejidos u órganos que se destinan al consumo humano. Por citar un ejemplo, es
posible obtener una planta transgénica de maíz o arroz que exprese un gen
insecticida (gen Bt, gen para un inhibidor de proteinasas) en las hojas y el tallo,
tejidos de los que se alimentan las larvas de insectos, pero que dicho gen no se
exprese en el grano.
Una crítica muy generalizada en la opinión pública es la incorporación de genes que confieren resistencia a antibióticos en el genoma de las plantas transgénicas. La función de estos antibióticos es esencial en la etapa inicial del proceso para
la obtención de plantas transgénicas ya que permiten la selección del material que
ha sido transformado (permite el crecimiento de las células transformadas,
frente a las que no lo han sido, en medios apropiados). Dejando aparte el hecho de
que no se ha podido demostrar la existencia de transferencia génica horizontal, esto es de que un gen de una planta pueda ser transferido a otros microorganismos,
se han desarrollado estrategias que permiten prescindir de la utilización de genes
de resistencia a antibióticos. Así por ejemplo, se pueden utilizar genes de selección
que confieren resistencia a herbicidas o genes que producen fitohormonas. Otra
alternativa válida es llevar a cabo la co-transformación del material vegetal con
dos vectores diferentes, uno portador del gen de interés (antifúngico, insecticida)
y el otro portador del gen para la selección del material transformado. De esta manera, los genes se integran independientemente en el genoma de la célula vegetal
para dar lugar a transformantes primarios portadores de ambos genes. Por tanto,
es posible segregar (eliminar) el gen de selección de una línea transgénica, quedando únicamente presente en su genoma el gen de interés, en generaciones posteriores. En definitiva, se trata de utilizar técnicas de transferencia de ADN más
depuradas, que permitan introducir el gen de interés (angifúngico, insecticida) pero no genes indeseables (p.e. genes de resistencia a antibióticos).
Otra preocupación general en el tema de las plantas transgénicas hace referencia a la posibilidad de transmisión de un transgén a través del polen hasta
variedades salvajes relacionadas. Sin embargo, existen metodologías que permiten eliminar este posible factor de riesgo, como es el caso de la transformación cloroplástica (introducción del gen de interés en el genoma del cloroplas-
98
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
to). El genoma de cloroplasto se hereda por vía maternal, de manera que el polen no contiene ADN de cloroplastos.
Por último, el progreso que se observa en los programas de secuenciación
de genomas (Arabidopsis, arroz) así como en la cartografía génica en especies
vegetales, van a permitir en muy corto plazo de tiempo identificar nuevos genes,
tanto genes de defensa como genes de resistencia, además de genes implicados
en la regulación de la expresión de los mismos, y que sin duda van a ser de interés para la mejora de especies vegetales de interés comercial. El reto que nos
presenta ahora el siglo XXI es el ser capaces de llevar a cabo la transición hacia
una agricultura sostenible que sincronice el nivel de producción agrícola con las
necesidades de la población mundial, tanto en los países actualmente desarrollados como en países subdesarrollados. La diversidad de recursos a nuestra disposición, junto con las nuevas técnicas biotecnológicas, nos permiten ser optimistas con respecto a la necesidad de alimentos a la que nos enfrentamos. Va a
ser necesaria la utilización efectiva y combinada de todos nuestros materiales y
recursos tecnológicos para superar este reto. Ello, además de exigir una dedicación al tema dentro de la propia comunidad científica, implica la creación de
programas para la formación de personal científico y técnico de manera que esta metodología pueda introducirse en países en vías de desarrollo.
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
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Plant-Microbe Interactions». Science 276: 726-733.
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activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins». Physiol. Mol. Plant Pathol. 55:85-97.
3.2.
APROXIMACIONES BIOTECNOLOGÍAS PARA MEJORAR
LA RESISTENCIA DE LAS PLANTAS A CONDICIONES
AMBIENTALES EXTREMAS*
La disminución en el rendimiento de los cultivos se debe
mayoritariamen-te al estrés, que puede ser de tipo biótico (ataque de insectos
o patógenos) o abiótico (temperaturas extremas, sequía y salinidad). Este último
es, con mucho, el responsable de las mayores pérdidas en la productividad
agrícola (Fig. 1). La salinidad y la sequía son problemas especialmente
importantes para la agricultura de tierras áridas y semiáridas. Por ejemplo, el
problema de la salinidad afecta a 340 millones de hectáreas de suelo cultivado.
Los efectos de la sal son lentos y acumulativos, apreciables en plazos que
varían desde décadas hasta siglos, y difícilmente reversibles. Solamente el 10%
de los terrenos de cultivo en todo el mundo se considera libre de todo tipo de
estrés abiótico.
Una manera de incrementar los recursos agrícolas existentes es el empleo
de nuevos tipos de cultivo que sean más resistentes a sequía, salinidad, y temperaturas extremas, así como la adaptación de nuevos terrenos para el cultivo
que permita aumentar la productividad de las especies de interés agronómico.
La mayor dificultad que presenta el abordaje de este problema mediante
las técnicas de mejora genética tradicional de las especies es que se trata de un
proceso largo y laborioso y que no siempre es posible modificar un carácter determinado. Sin embargo la ingeniería genética podrá en breve utilizarse como
un método rápido y preciso para conseguir un aumento en la tolerancia al estrés de la planta. Para ello es necesario conocer los mecanismos básicos que rigen la defensa de las plantas frente al estrés y desarrollar estrategias adecuadas
para mejorar esta capacidad (Fig. 2).
3.2.1.
Respuesta de las plantas al estrés
La sequía, la salinidad y las temperaturas extremas producen en la planta
un estrés osmótico directo, mientras que la hipoxia causa un estrés osmótico indirecto debido a alteraciones en la captación y pérdida del agua. La respuesta
* Montserrat Pages. Departamento de Genética Molecular. Instituto de Biología Molecular de Barcelona. Centro de Investigación y Desarrollo. CSIC. Barcelona.
100
BlOTECNOLOGIA APLICADA A LA AGRICULTURA
Salinidad
~----~---,
lones toxicos
Figura J. Los distintos tipos de est res abi6tico son los responsables de las mayo res perdidas en la productiviclad agrico la.
fisiol6gica de la planta al estres osm6tico puede producirse mediante cambios
ffsicos a escala celular, como disminuci6n de la turgencia , cambio en el volumen
de la celula 0 en el contenido en solutos del citoplasma. Estos cambios activan
una ruta de transducci6n de sefial, transformando un estres ffsico en una respuesta bioqufmica. Por la ruta de transducci6n se envfa el mensaje a traves de
una cadena molecular en la que intervienen mensajeros secundarios (calcio) , y
otros intermediarios como quinasas y fosfatasas, hasta los factores de transcripci6n, que regularan la expresi6n de los genes encargados de la respuesta al
estres. La hormona vegetal acido abscfsico (ABA) juega un papel importante en
la sefializaci6n del estres osm6tico. Los niveles de ABA aumentan en respuesta
al estres hfdrico y participan en la tolerancia de las plantas a sequfa, salinidad y
frio. La expresi6n de un gran numero de genes es inducida por ABA y/o estres.
El estudio de promotores ha identificado un numero limitado de elementos
cis importantes para la regulaci6n del gen. Entre ellos destacan dos tipos: el elemento ABRE (ABA response element), de respuesta a ABA, y el elemento DRE
(Drought Response Element) , de respuesta a sequfa pero independiente de ABA
y que tienen un papel preponderante en la regulaci6n genica. El elemento ABRE,
esta definido por la secuencia central ACOT y a eJ se linen protefnas del tipo cremallera de leucina (b-Zip). Fue identificado por primera vez en el gen Em del trigo, y se ha demostrado que este elemento es funcional en mafz, trigo, arroz, tabaco y Arabidopsis. Sin embargo, el motivo ACOT se encuentra tambien en otros
elementos cis responsables de la respuesta a distintos estfmulos, como luz, auxinas
, acido jasm6nico y acido salicflico. Es plies importante determinar los elementos
responsables de la especificidad de la respuesta. Es po sible que las secuencias que
flanquean la caja ACOT determinen esta especificidad pues diferentes protefnas
del tipo bZip, que reconocen la secuencia ACOT, interaccionan con distinta afini-
APROXIMACIO NES BTOTECNOLO G ICAS PARA MEJO RAR LA RES ISTENCIA...
101
Elegir organismo 0 tejidos
que toleren situaciones extremas
•
•
•
•
Aislar y clonar genes
que confieran tolerancia al estres
Caracterizar el producto genico
y analizar su expresi6n
Introducir el gen en una planta modelo.
Analisis en situaciones de estres
Pruebas de campo
en cultivos transgenicos
Figura 2. E squema de L1na aproximaci6n exp e rimental para la obtenci6n de plantas tran sgenicas mejor adaptadas a condiciones ambientales adversas.
dad con las secuencias que contienen esta caja. En otros casos la especifidad de la
respuesta se debe a un segundo elemento de ADN, Hamado CE (coupling element),
requerido para la respuesta a ABA. Dos elementos de este tipo se identificaron
por primera vez en promotores de genes de cebada. El elemento de respuesta a la
sequfa, el elemento DRE (Drought Response Element), fue descrito y caracterizado en un gen de Arabidopsis thaliana cuya expresi6n se induce par estres hfdrico, salinidad y baja temperatura y al que regula mediante una ruta independiente
de ABA. En esta especie, se han aislado distintos factores de transcripci6n que se
unen ala secuencia DRE y contienen el motivo AP2. Hay otros motivos importantes en la regulaci6n de genes relacionados con el estres osm6tico que han sido
descritos en distintos sistemas y se estan caracterizando.
Los productos proteicos de los genes que se inducen par el estres se pueden clasificar en dos grupos, aquellos que protegen directamente del estres ambiental y aquellos que intervienen en la regulaci6n de la expresi6n genica y la
transducci6n de la seiial en la respuesta al estres. El primer grupo incluye protefnas que funcionan protegiendo a las celulas contra la deshidrataci6n como
por ejemplo las enzimas responsables de la sfntesis de moleculas osmoprotec-
102
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
toras (osmolitos), proteínas de la embriogénesis tardía LEA (late
embryogene-sis abundant), chaperonas, proteínas anticongelantes, y enzimas
detoxificantes. El segundo grupo de productos génicos incluye factores de
transcripción, proteína quinasas y enzimas involucradas en el metabolismo de
los fosfoinosítidos.
3.2.2. Mejora de la tolerancia al estrés en plantas
Para mejorar la tolerancia de la planta al estrés mediante la ingeniería genética se han utilizado genes que incrementan su expresión en condiciones de sequía y salinidad, y codifican proteínas relacionadas con la protección de las células frente al estrés. Entre ellos se incluyen genes que codifican enzimas que
catalizan la conversión de substratos naturales en productos con propiedades
os-moprotectoras, enzimas modificadores de las propiedades de la membrana,
proteínas inducidas durante el estrés hídrico etc. Sin embargo, la adaptación al
estrés implica cambios en distintos procesos fisiológicos y es por tanto
improbable que un único producto génico sea suficiente para solucionar el
problema. Como veremos a continuación, en la práctica se han obtenido
tolerancias parciales en plantas transgenicas sobreexpresando un único gen
protector, por lo que parece que será necesario introducir un grupo de genes en
la planta transgénica para conseguir un nivel más elevado de tolerancia al estrés.
En principio, la activación simultanea de varios genes involucrados en la
resistencia al estrés se puede conseguir mediante la obtención de una planta
transgénica que sobre exprese un único gen regulador como una quinasa, una
fosfatasa o un factor de transcripción. En este contexto, para aproximaciones
biotecnológicas cualquier proteína reguladora de la ruta de transducción desde el
receptor de la señal de estrés hasta los factores de transcripción inducibles son
potencialmente interesantes. También los genes que controlan el metabolismo
del ABA son importantes pues un aumento hormonal puede desencadenar la
inducción de los genes involucrados en la tolerancia al estrés. Experimentos
recientes utilizando estas estrategias han conseguido resultados importantes que
se describen a continuación (Fig. 3 y Tabla 1).
3.2.3. Aumento de la producción de compuestos osmoprotectores
Los compuestos osmoprotectores u osmolitos son compuestos de bajo peso molecular que permiten equilibrar el balance hídrico y protegen
macromo-léculas, como proteínas y lípidos, del estrés salino, hídrico y térmico,
facilitando su estabilización. Estos compuestos pueden acumularse en
concentraciones elevadas sin afectar el normal funcionamiento enzimático ni
las funciones celulares básicas. Pueden clasificarse en varios grupos: azúcares
no reductores, polio-Íes, compuestos de amonio cuaternarios, iones (K+) y
compuestos azufrados. En general, son compuestos con carga eléctrica no muy
elevada, polares, altamente solubles y con una gran cubierta hídrica en solución.
Dos son los mecanismos de protección que se les atribuyen: el aumento del
potencial osmótico de la célula (su acumulación retiene el agua, manteniendo la
turgencia y el volumen ce-
APROXIMACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA...
103
Gen protector
Tolerancia al estn3s
Tolerancia al est res
Figura 3. Dos tipos de estrategia para mejorar la tolerancia de la planta a condicones ambientales adversas (Busk, P.; Figueras, M.; Je sso p, A .; Goday, A .. y Pages, M. 1998. Regulation of abscisic acid and water slI'ess response genes. Genetic and environmental manipulation of horricultural crops (Cockshull, K.E. ;
Seymour, G.B.. yThomas, B. , editores) . pp.143-156. CAB International UK.
lular) y su habilidad para estabilizar membranas y/o estructuras macromoleculares. Debido a la relativa simplicidad de las rutas de sfntesis de los osmolitos,
su alteraci6n en plantas transgenicas se ha realizado en distintas especies y ha
dado lugar a la obtenci6n de fenotipos con mayor tolerancia a estres. Sin embargo, las concentraciones de solutos alcanzadas no son suficientes para explicar el efecto osmoprotector como unico factor en la tolerancia.
En tabaco se introdujo el gen mltd 1 (manitol-l-fosfato deshidrogenasa) de
E. coli, obteniendose una acumulaci6n de 100 mM manitol y una tolerancia moderada a salinidad. Dado que la concentraci6n de manitol alcanzada no es suficientemente alta para explicar un ajuste osm6tico, la tolerancia se atribuy6 a las
propiedades osmoprotectoras de este compuesto. Muchos organism os acumuIan prolina en respuesta al estres. La expresi6n en tabaco de I-pirrolina-5-carboxilato sintetasa (P5CS) de Vigna aconitifolia dio como resultado un incremento
de prolina y un aumento en la resistencia al estres hfdrico. EI mecanismo por el
que la prolina confiere tolerancia a la desecaci6n no ha sido aclarado. Una posible explicaci6n es que la prolina sirva como almacen de carbona y nitr6geno
y que facilite la recuperaci6n de las plantas tras el estres. Plantas transgenicas
de tabaco que expresan el gen sacB de Bacillus subtilis, que codifica una fructosil transferasa, muestran acumulaci6n de fructanos y un aumento de biomasa
que confiere una mayor tolerancia en condiciones de estres hfdrico. La expresi6n heter610ga en plantas de tabaco del gen TPSI (trehalosa-6-fosfato sintetasa) de Saccharomyces cerevisiae produce la acumulaci6n de trehalosa pero en
cantidades que no explican la tolerancia como un mero ajuste osm6tico. Las
plantas transgenicas presentan alteraciones de varios caracteres (reducci6n en
tamafio, hojas lanceoladas, menor contenido en sacarosa) y tolerancia al estres
hfdrico. Esto apoya la hip6tesis de que, al margen de una posible funci6n osmoprotectora, la introducci6n en tabaco del gen TPSI altera el metabolismo de carbohidratos y las rutas de sefializaci6n relacionadas con el estres abi6tico.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
104
TABLA 1
Transgenes utilizados en plantas transgénicas para mejorar su tolerancia
a distintos tipos de estrés
Síntesis de manitol
1992 Protección contra estrés por salinidad
Acumulación de fructano
1995 Aumento de la tolerancia a sequía
Acumulación de prolina
1995 Aumento de la tolerancia al estrés por salinidad
Síntesis de glicina betaína
1997 Aumento de la tolerancia al estrés por temperatura y salinidad
Síntesis de proteínas LEA
1996 Protección al estrés por salinidad y sequía
Transportador de potasio
1994 Aumento de la discriminación Na+/K+ en levadura
Síntesis de trehalosa
1996 Aumento de tolerancia a sequía
Aumento de glutatión
1996 Protección contra salinidad y baja temperatura
Acumulación de ononitol
1997 Aumento de tolerancia a sequía y salinidad
Acumulación de sorbitol
1998 Alta acumulación de sorbitol, lesiones necróticas en hojas
Sobre expresión de
factores de transcripción
1999 Aumento simultáneo de la tolerancia a distintos tipos de estrés;
sequía, frío y salinidad
Adaptado de Bohnert, H.J.; Su, H., y Shen, B. (1999). Molecular mechanisms of salinity tolerance. Molecular responses to cold, drought, heat and salt stress in higher plants. Shinozaki, K., y Yamaguchi-Shinozaki, K., editores,
pp. 29-62. R.G. Landes Company Austin, Texas, USA.
3.2.4.
Sobreexpresión de proteínas inducidas por estrés
Los genes LEA {Late Embryo genesis Abundant) se identificaron por su expresión durante la maduración y desecación de la semilla. La semilla de la planta
presenta el mayor grado de tolerancia a la desecación pudiendo perder más de
un 80% de su peso en agua. Un dato importante que permitió considerar las
proteínas LEA como posibles protectores de la estructura celular durante la desecación, se obtuvo al estudiar su regulación en condiciones de sequía. Se comprobó que los genes LEA también se expresan en tejidos vegetativos en periodos de pérdida de agua como consecuencia de estrés hídrico, salino y de frío. Las
proteínas LEA se acumulan en concentraciones muy elevadas y han sido detectadas en muchos tipos celulares. Su localización subcelular es predominantemente citosólica, aunque algunas de ellas se encuentran en el núcleo o en el
nucléolo. Su función es, en la mayoría de los casos, desconocida.
Una característica general de las proteínas LEA es su composición peculiar en
aminoácidos, con ausencia de cisterna y triptófano y abundancia de residuos
hidro-fílicos que junto a las características estructurales han permitido asignarles
funciones hipotéticas de protección celular. Este posible efecto protector se
comprobó con la introducción por ingeniería genética de los genes LEA en
distintas especies ve-
APROXIMACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA...
105
getales. Las plantas transgénicas obtenidas al introducir el gen HVA1 de cebada en
arroz, expresan cantidades elevadas de la proteína HVA1 en hojas y presentan una
mayor tolerancia al estrés osmótico. El grupo de proteínas LEA al que pertenece
HVA1 presentan repeticiones de un motivo compuesto por 11 aminoácidos. Se supone que este motivo forma una hélice antipática, la cara hidrofóbica forma probablemente un homodímero, mientras que la cara hidrofílica se encargaría del secuestro de iones por lo que su función podría ser la de retener los iones que se
acumulan en condiciones de deshidratación celular. Este motivo de 11 aminoácidos
se encuentra también presente en proteínas que se inducen por frío y que presentan similitud con las proteínas AFPs {antifreezeproteins), aisladas de algunos peces
del ártico (platijas), cuya función es la de impedir la formación de cristales de hielo en la célula. Sin embargo no se ha conseguido evidenciar una mayor protección
a la helada en plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresan AFPs.
Las proteínas LEA del grupo 2, también llamadas rab (Responsive to ABA)
o dehidrinas, poseen un motivo altamente conservado de 15 aminoácidos. Se ha
propuesto que puedan tener un papel de agentes solubilizantes con propiedades
de chaperonas. En el maíz la proteína rabl7 está fosforilada, y su papel podría
ser de mediadora en el transporte de proteínas específicas al núcleo en situaciones de estrés. Las plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan la proteína rabl7 del maíz en cantidades elevadas en embrión y hojas, presentan una
mayor tolerancia al estrés osmótico en las primeras etapas de la germinación.
3.2.5.
Mejora de la flexibilidad de la membrana
Existe una alta correlación entre la sensibilidad al frío y el grado de
insatura-ción de los ácidos grasos de las membranas plastídicas en plantas superiores.
La presencia de dobles enlaces cis en los lípidos de las membranas disminuye la
temperatura de transición a 0°C. Así, introduciendo enzimas capaces de catalizar la
formación de dobles enlaces en ácidos grasos saturados o mono-saturados, se puede
conseguir un fenotipo tolerante a las temperaturas bajas. Esto se comprobó con
distintas plantas transgénicas portadoras de dichos enzimas. Plantas transgénicas
de tabaco expresando una desaturasa co3 cloroplástica (Fad7) son más resistentes
a las temperaturas bajas. Por otra parte, la expresión en plantas transgénicas de una
desaturasa inespecífica aislada de Anacystis nidulans que introduce dobles enlaces
en distintos lípidos de membrana resultó en un incremento de ácidos grasos
D9-monosatura-dos y cuando las plantas transgénicas de tabaco se expusieron a
1°C durante 11 días no se observaron signos de clorosis como sucede en plantas
control.
3.2.6.
Eliminación de moléculas reactivas
La sequía, salinidad y el frío generan intermediarios tóxicos que dañan membranas y macromoléculas y producen un estrés oxidativo. Por ello existe una relación entre tolerancia al estrés y el desarrollo de defensas antioxidantes. Du-
106
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
rante el estrés hídrico, la pérdida de agua en las hojas y el subsiguiente cierre de
los estomas dan lugar a una disminución del CO2 disponible y a la producción
de especies activas de oxígeno, como radicales superóxido. El aumento de la actividad fotorespiratoria se acompaña también de elevados niveles de actividad
glicolato oxidasa, lo cual da lugar a la producción de H2O2. Plantas transgénicas
que sobreexpresan genes relacionados con la respuesta a estrés oxidativo, como
peroxidasas, catalasas, glutation reductasas (GR) y superóxido dismutasas
(SODs) presentan distintos grados de protección al estrés oxidativo y en algunos casos se ha observado una mayor tolerancia al estrés abiótico. Esto puede
explicarse como consecuencia de una protección cruzada. Plantas transgénicas
que sobreexpresan enzimas detoxificantes presentaron un mejor rendimiento y
tolerancia a estrés abiótico en las pruebas de campo debido a un aumento general del sistema de defensa, provocado por el peróxido producido, que también
induce la expresión de varios genes que confieren resistencia al estrés hídrico.
3.2.7. Sobreexpresión de componentes de la ruta de transducción de señal
Las rutas de transducción de señal se han estudiado siguiendo estrategias diferentes: por un lado, la identificación de componentes moleculares mediadores entre la percepción del estrés por la célula hasta la inducción de los genes de tolerancia a dicho estrés y por otro la caracterización de los factores de transcripción
específicos que se unen a secuencias clave de los promotores y regulan la expresión
del gen. La obtención de plantas mutantes con mayor sensibilidad o bien con un incremento en la resistencia al estrés, así como la sobreexpresión de proteínas inducidas por el estrés, ha permitido identificar genes esenciales en la adquisición de tolerancia y moléculas diana en la transducción de señal de las rutas de protección.
El proceso de transducción de la señal es complejo y hasta el momento al
menos cuatro rutas distintas han sido identificadas, 2 que dependen de ABA y
otras 2 independientes de esta hormona. También determinados genes son capaces de responder a varios tipos de estrés y por tanto pueden ser activados a
través de distintas rutas señalizadoras. Las distintas rutas incluyen elementos
comunes y otros específicos para cada tipo de estrés. Entre las proteínas identificadas se encuentran factores de transcripción, quinasas, fosfatasas, y una
fos-folipasa C específica de fosfatidilinositoles, enzima involucrado en la síntesis
de inositol 1,4,5-trifosfato. El inositol trifosfato estimula la liberación de calcio
de su almacenaje intracelular, permitiendo su actuación como segundo
mensajero.
La posibilidad de aumentar simultáneamente la tolerancia a distintos tipos
de estrés como sequía, salinidad y bajas temperaturas en una planta
transgéni-ca se ha intentado recientemente con éxito en Arabidopsis, mediante
la transferencia de un único gen que codifica un factor de transcripción
inducible por estrés y que regula a su vez la expresión de varios genes, cuyos
productos juegan papeles importantes en la tolerancia al estrés. Factores de
transcripción que
APROXIMACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA...
107
se unen a la secuencia de respuesta a sequía (DRE), aislados de Arabidopsis, al
ser sobreexpresados aumentan la tolerancia a distintos tipos de estrés en la planta
transgénica: CBF1 aumenta la tolerancia a la helada, DREB1A aumenta la
tolerancia a sequía, salinidad y frío. Esta tolerancia se consigue por efecto del
exceso del factor de transcripción que induce la expresión simultanea de varios
genes que contienen el elemento al que el factor se une en la planta transgénica. También la sobreexpresión de otro tipo de factores ha producido resultados
interesantes, así plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan el factor ATHB6, también inducible por ABA, muestran un aumento en su resistencia a la desecación. La sobreexpresión del factor alfinl en alfalfa aumenta la tolerancia a salinidad y la del heat shock factor HSF3 aumenta la termo tolerancia.
3.2.8.
Perspectivas de futuro
Los recientes avances en el conocimiento de los mecanismos moleculares
involucrados en la respuesta de las plantas a las condiciones ambientales extremas, así como la gran variedad de técnicas que permiten tanto la identificación
y aislamiento de genes de respuesta al estrés como su introducción por manipulación genética en la planta, permiten augurar un avance importante en la obtención de plantas mejor adaptadas a condiciones ambientales extremas en un
futuro próximo. Uno de los puntos importantes a resolver es el mecanismo de
percepción del estrés por la planta, el aislamiento y caracterización de los receptores hormonales involucrados, así como la identificación de nuevas moléculas integrantes de las rutas de transducción de señal e inducción de la expresión génica. También es importante que la activación génica se pueda limitar a
aquellos genes que son activados de modo natural en la planta lo que evitará
efectos secundarios no deseados. En este sentido un problema técnico importante con el que nos encontramos es la elección del promotor que dirige la expresión del transgén. La utilización de promotores constitutivos del tipo 35S (del
virus del mosaico de la coliflor) puede causar efectos no deseables (floración
temprana, retraso del crecimiento, y graves alteraciones en el fenotipo de la planta) como consecuencia de la expresión constitutiva y ectópica del transgén. Es
pues de gran importancia poder controlar tanto el nivel como el momento y tejido en el que se exprese el transgén. La utilización de promotores inducibles
por estrés o ABA parece ser importante para aumentar la tolerancia al estrés
sin afectar el crecimiento normal de la planta. Finalmente, la obtención de plantas transgénicas portadoras de un único gen regulador bajo el control de un promotor inducible que dirija la expresión de varios genes involucrados en la resistencia al estrés abre una de las perspectivas de futuro para la que se prevé una
mayor aplicabilidad en agricultura. En este contexto las nuevas aproximaciones
de la genómica funcional serán de gran ayuda para el descubrimiento de nuevos
genes y la determinación de sus funciones en la tolerancia al estrés en la planta.
108
3.2.9.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
Agradecimientos
Mi agradecimiento a Laura Frególa y Ángel Sánchez por su ayuda en la elaboración de este manuscrito. El trabajo de investigación en el estudio de los genes regulados por estrés osmótico en el maíz está financiado por el Plan Nacional de Investigación Científica y Desarrollo Tecnológico con el proyecto BIO 97
1211, por la CIRIT de la Generalitat de Catalunya en el proyecto Suport a Grups
de Recerca Consolidats. 1999SGR 00191, y por la Comisión de las Comunidades Europeas en el programa BIOTECH con el proyecto BI04- CT96-0062.
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
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3.3.
INTERACCIONES BENEFICIOSAS ENTRE PLANTAS
Y MICROORGANISMOS*
La vida de las plantas está condicionada por la existencia de una amplia gama de microorganismos que viven asociados con ellas. Estos microorganismos,
actuando principalmente desde la rizosfera, condicionan la nutrición y la salud
de las plantas, y por tanto el correcto funcionamiento de toda la biosfera. La rizosfera se define como aquella zona de intensa actividad microbiana alrededor
de las raíces cuya influencia estimula el crecimiento y aumenta la densidad de
microorganismos respecto al resto del suelo. Los microbios en esta zona se pueden agrupar según su relación con la planta en: a) organismos perjudiciales, incluyendo los patógenos que invaden y matan a las plantas y los simplemente
oportunistas; b) organismos beneficiosos, a veces simbióticos, que aumentan la
fertilidad, estimulan el crecimiento o protegen contra los patógenos, y c) microorganismos sin efecto directo en las plantas, que incluye, entre otros organismos neutros, los organismos saprofíticos que viven sobre material vegetal
muerto. Todos estos microbios compiten entre sí por los nutrientes y por el espacio, convirtiendo la rizosfera en un campo de batalla donde los mejores estrategas metabólicos se adaptan, se imponen y medran en un ambiente que cambia por efecto de las raíces y de la propia actividad microbiana. Una parte de
estos microorganismos ha desarrollado la habilidad de colonizar la raíz, y se conocen en su conjunto como rizobacterias. Las rizobacterias beneficiosas que promueven el crecimiento de las plantas, bien específicamente mediante la secreción de hormonas o indirectamente inhibiendo organismos fitopatógenos o
mejorando la asimilación de nutrientes, principalmente fósforo y nitrógeno, se
conocen como PGPR (del inglés «plant growth promoting rhizobacteria»).
Aunque la interacción de algunos grupos particulares de rizomicrobios con
las plantas ha sido intensamente estudiada, sólo estamos empezando a entender
las complejas interrelaciones metabólicas y ecológicas entre los microorganisI mos de la rizosfera y el lenguaje de su comunicación con las plantas que resul* Tomás Ruiz-Argüeso. Departamento de Biotecnología. ETS de Ingenieros Agrónomos. Universidad Politécnica de Madrid.
110
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
ta al final en efectos beneficiosos o perjudiciales para las cosechas. Uno de los
mayores retos de los estudiosos de las interacciones planta-microorganismos es
el conseguir una descripción precisa y completa de estos complejos sistemas. Este conocimiento permitiría responder a la pregunta de mayor interés práctico:
¿podemos manipular los microorganismos o las plantas para conseguir una óptima asociación que resulte en mejoras de la productividad y salud de las cosechas? A continuación se analizarán las posibilidades biotecnológicas relativas a
la mejora de la interacción entre plantas y microorganismos de la rizosfera en
cuatro aspectos distintos: fijación biológica de nitrógeno, biocontrol de enfermedades, absorción de nutrientes por asociaciones micorrícicas, y estimulación
del crecimiento por rizobacterias,
3.3.1. Fijación biológica de nitrógeno
El espectacular incremento de los rendimientos de cereales en países desarrollados entre 1960 y 1990 es atribuible directamente a un incremento de diez veces en el uso de fertilizantes nitrogenados. En gran parte este aumento se debió
al desarrollo de genotipos vegetales con una alta respuesta a la fertilización química, sobre todo la nitrogenada. Sin embargo este uso masivo de fertilizantes nitrogenados ha generado toda una serie de problemas de contaminación ambiental que junto a una creciente preocupación social por la conservación del medio
ambiente, han provocado que el objetivo de conseguir una agricultura sostenible
sea tan atractiva como el conseguir incrementos de rendimientos y productividad.
En esta corriente se embarca el renovado interés por sistemas agrícolas que acumulan alto contenido de nitrógeno mayormente derivado de fijación biológica.
Entre estos sistemas la simbiosis entre plantas leguminosas y rizobios tiene cuantitativamente el mayor potencial y el mayor impacto en agricultura y en el ciclo
del nitrógeno. Se estima que aproximadamente 100 leguminosas agrícolamente
importantes contribuyen anualmente con casi la mitad del total de nitrógeno fijado biológicamente. En el mundo se estima que sólo las leguminosas grano ocupan cerca de 150 millones de Ha con una producción anual de 200 millones de toneladas. Durante más de un siglo, la inoculación de las leguminosas con cultivos
seleccionados de rizobios ha sido una práctica agrícola común. No obstante otros
sistemas fijadores de nitrógeno tienen también potenciales significativos para sustituir a los fertilizantes nitrogenados y contribuir así a la sostenibilidad de los sistemas agrícolas. Brasil es tal vez el país líder en el mundo en la sustitución de fertilizantes nitrogenados. La contribución de la fijación biológica de nitrógeno al
cultivo de cosechas importantes como soja, cereales y la caña de azúcar determinan que este país exhiba las menores dosis de aplicación de nitrógeno mineral (10
kg/Ha), haciendo de Brasil uno de los países menos contaminados por nitratos.
Los rizobios tienen la capacidad de infectar muchas plantas leguminosas y
alguna no leguminosa y establecer simbiosis fijadoras de nitrógeno. El resulta-
INTERACCIONES BENEFICIOSAS ENTRE PLANTAS Y MICROORGANISMOS
111
do de esta interacción es la formación de un nuevo órgano, el nodulo, donde tiene lugar el proceso de reducción de nitrógeno. Esta simbiosis ha sido objeto de
detallados estudios a nivel fisiológico, bioquímico y molecular, de los cuales ha
resultado un espectacular avance en el conocimiento del funcionamiento de esta
simbiosis y ha servido de catapulta para progresar en el conocimiento de otras
interacciones planta microrganismos, principalmente las fitopatogénicas. Varias
características intrínsecas a ambos socios de la simbiosis, la bacteria y la planta,
y diversos factores ambientales limitan el funcionamiento óptimo de la asociación. La presencia en el suelo de cantidades adecuadas de rizobios efectivos y
específicos de cada leguminosa es el primer requerimiento para establecer una
simbiosis eficiente. Además, para que la bacteria exprese su plena capacidad para fijar nitrógeno, es necesario que el vigor de la leguminosa no esté limitado
por factores ambientales adversos como salinidad, pH desfavorable, deficiencia
nutricional, toxicidad mineral, temperatura extrema, baja o excesiva humedad,
fotosíntesis inadecuada, enfermedades, etc.
A pesar del altísimo nivel de detalle con que se conoce la fisiología y genética de algunas especies de rizobios (Sinorhizobium meliloti, Rhizobium
legu-minosarum o Bradyrhizobium japonicum) no se ha progresado
proporcional-mente en la mejora de la inoculación de las leguminosas, y
existen cuellos de botella en la producción y aplicación de inoculantes que
limitan todavía el uso eficiente y extensivo de esta tecnología. Aunque los
mayores esfuerzos para mejorar la simbiosis se han realizado con el componente
bacteriano, los investigadores son cada vez más conscientes que una mejora de
la simbiosis vendrá por manipulación de la planta hospedadora, y por ello se
están realizando crecientes esfuerzos en elucidar a nivel básico los
componentes genéticos de la planta que determinan la interacción. A
continuación se revisan sucintamente aquellas áreas de investigación de las que
se esperan aplicaciones biotecnológicas a medio y corto plazo para mejorar la
fijación de nitrógeno por la simbiosis o para extenderla a plantas no
leguminosas. Asimismo se analizan los esfuerzos dirigidos a explorar las
posibilidades prácticas de otras asociaciones fijadoras de nitrógeno entre
microorganismos y plantas.
3.3.1.1. Mejora de la simbiosis con leguminosas
El objetivo biotecnológico a perseguir es la consecución de inoculantes con
cepas de rizobios con un comportamiento óptimo en simbiosis con las leguminosas a las que se va a aplicar y que compitan con las cepas nativas en un suelo
y un clima dados. A pesar del espectacular avance en la fisiología y biología molecular de la simbiosis RhizobiumAegum'mosas se dispone de pocas posibilidades para mejorar la producción de inoculantes. Las perspectivas más prometedoras de construir mejores inoculantes se centran en la aplicación de la genética
molecular a dos estrategias diferentes: primera, mejora de las cepas de rizobios
112
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
por su capacidad de fijación de nitrógeno, segunda, mejora de la competitividad
por la nodulación de las leguminosas en condiciones de campo.
3.3.1.1.1. Mejora de la eficiencia energética
El ejemplo mejor caracterizado es la construcción de cepas con la capacidad de oxidar hidrógeno. Debido a la reducción de protones catalizada por la
nitrogenasa, los organismos diazotróficos desprenden gran cantidad de hidrógeno. En la simbiosis (Brady)Rhizobium-legum'mosas la producción de hidrógeno por los nodulos representa una pérdida de energía y la mayor fuente de
ineficacia de la simbiosis. Un método de aumentar la eficiencia energética, y por
tanto mejorar la productividad de las leguminosas, es construir cepas con
hi-drogenasas oxidativas que reciclan el hidrógeno que de otra forma se
perdería en el aire. Los determinantes genéticos del sistema de oxidación de
hidrógeno (genes hup) se han aislado y caracterizado en B. japonicum y en R.
leguminosa-rum. Además de los genes estructurales, otros 16 genes accesorios
son necesarios para la síntesis de la hidrogenasa, una metaloenzima que porta
Ni y Fe en el centro activo. Mediante la transferencia de la agrupación génica
hup completa (fragmento de ADN de aproximadamente 18 kb) a cepas que
carecen de la capacidad de oxidar hidrógeno, se han generado cepas hidrogenasa
positivas significativamente más eficientes que las cepas parentales en simbiosis
con sus respectivas leguminosas hospedadoras (Patente N° P9902189, España).
La construcción de cepas capaces de reciclar hidrógeno eficientemente se
enfrenta todavía a diversos problemas no resueltos entre los cuales se incluyen
la regulación de la expresión de los genes hup en fondos heterólogos y una
apropiada provisión de Ni en los bacteroides.
3.3.1.1.2. Otras estrategias para mejorar la efectividad
Además de los genes hup, se han descrito también otros genes que mejoran
la actividad nitrogenasa o la productividad de las leguminosas. Por ejemplo, se
han seleccionado mutantes de B. japonicum generados por mutagénesis química con capacidades fijadoras de nitrógeno superiores a las cepas silvestres. Utilizando alteraciones génicas mas precisas se ha construido una cepa de R.
legu-minosarum bv. trifolii tolerante a la acidez que fija cantidades
significativamente mayores de nitrógeno que la cepa parental sensible.
También se ha propuesto que incrementando la expresión de los genes nifA y
dctA y ciertos genes de nodulación se puede incrementar la fijación de
nitrógeno en alfalfa aunque no se ha publicado una demostración definitiva de
estas posibilidades. Asimismo, se ha generado un gen nodD híbrido que no
requiere flavonoides para inducir la expresión de los genes nod, y la cepa de
Rhizobium que contiene este gen híbrido exhibe una mayor actividad
nitrogenasa en los nodulos. En la misma dirección, la adición exógena de
flavonoides a los inoculantes para incrementar la
INTERACCIONES BENEFICIOSAS ENTRE PLANTAS Y MICROORGANISMOS
113
nodulación de ciertas leguminosas aparece como un método prometedor y barato de aumentar la eficacia de inoculantes comerciales.
La posibilidad de mejorar la fijación de nitrógeno por manipulación genética sigue animando a los investigadores a la búsqueda de genes que codifican
pasos limitantes en la efectividad de la simbiois. Así, recientemente se ha demostrado que la mutación de genes de ciertos citocromos de R. leguminosarum
y R. etli aumenta espectacularmente la capacidad de fijación de nitrógeno de las
cepas alteradas respecto a las cepas silvestres. El efecto es probablemente debido a una canalización del poder reductor en los bacteroides a través de cadenas respiratorias energéticamente más eficientes en el ambiente microaeróbico
de los nodulos. En la mayoría de los casos mencionados la capacidad simbiótica superior de las cepas alteradas se ha demostrado en ausencia de cepas nativas de rizobios. Sin embargo su comportamiento en condiciones de campo se
desconoce en la mayoría de los casos y por tanto su verdadero valor agrícola
puede estar limitado por su capacidad de competir con poblaciones de rizobios
nativos.
3.3.1.1.3.
Competitividad por la nodulación
El valor agrícola de una cepa rizobiana, previamente seleccionada por su
capacidad de fijación de nitrógeno, depende de su habilidad para establecer una
nodulación efectiva con la leguminosa a la que se aplica en condiciones de campo. La inoculación fracasa frecuentemente por la presencia en el suelo de cepas
nativas que compiten con la cepa introducida en la nodulación de la leguminosa huésped. La capacidad de competir con otras cepas por la nodulación de las
raíces se conoce con el nombre de competitividad y es un proceso complejo que
depende de múltiples factores y cuyas bases moleculares se desconocen en gran
medida. Para resolver el problema económicamente importante de la competitividad de los rizobios se están siguiendo diversas estrategias que se recogen en
revisiones recientes. La mayoría se basa en el uso de técnicas de genética molecular y enfocan el problema desde dos perspectivas diferentes.
Nodulación restringida por la leguminosa hospedadora
Implica la caracterización de los genes que determinan en los rizobios y en
las leguminosas hospedadoras la especificidad por la nodulación con el fin de
construir leguminosas que restrinjan la nodulación de cepas nativas y permitan
la nodulación por las cepas inoculadas. Persiguiendo esta estrategia se han identificado parejas de genes en los rizobios y en las leguminosas que interaccionan
de forma sorprendentemente similar a la interacción «gen a gen» descrita en
muchos sistemas patogénicos. Por ejemplo, un gen de guisantes, sym2,
interac-ciona con un gen, nodX, presente sólo en cepas de R. leguminosarum bv.
viciae que nodulan la variedad Afganistán. Similarmente, dos loci de la cepa R.
legu-
114
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
minosarum bv trifoliTAl,nodMy csn-7, interaccionan con un gen recesivo,rwt,
de la variedad Woogenellup de trébol restringiendo su nodulación por esta cepa a 28°C. También, se han identificado genotipos de soja que restringen la nodulación de cepas de B. japonicum del serotipo 123 y otros serotipos. La restricción es causada por el alelo Rj4 presente en estos genotipos de soja, y se sabe
que la restricción del serogrupo 123 puede ser salvada por la presencia del gen
rizobiano nolA, que es un regulador negativo de los genes nod en la cepa
US-DA110 de B. japonicum.
Genes bacterianos implicados en competitividad
Se han identificado múltiples genes de bacterias endosimbióticas que parecen determinar de alguna forma la capacidad competitiva por la nodulación
de las leguminosas. Entre ellos, genes implicados en la síntesis de componentes
celulares de superficie como los exopolisacáridos (EPS) y lipopolisacáridos (LPS)
de las membranas externas, genes de movilidad, genes de eficiencia (nfe) y velocidad de nodulación, genes de utilización de prolina, y sobre todo genes de antibiosis. La posibilidad de utilizar cepas que producen antibióticos para inhibir
la nodulación por cepas nativas de rizobios ha sido explorada frecuentemente.
El sistema mejor caracterizado es la producción de trifolitoxina por la cepa inefectiva pero muy competitiva T24 de R. leguminosarum bv. trifolii. Este antibiótico inhibe el crecimiento de distintos grupos de oc-proteobacterias, incluyendo Rhizobium y Agrobacterium. Los genes que determinan la síntesis de
trifolitoxina han sido aislados, y se ha demostrado que su transferencia a cepas
efectivas de rizobios aumenta la competitividad de las cepas receptoras en suelo estéril y, lo que es más prometedor, también en condiciones de campo como
indican ensayos recientes con el sistema R. etli /judías. Sin embargo, una seria
objeción al uso de este sistema radica en su impacto en las poblaciones microbianas de la rizosfera ya que se ha observado un efecto inhibidor sobre otros
grupos de bacterias Gram-negativas beneficiosas para el agroecosistema.
La capacidad de algunas cepas de metabolizar compuestos secundarios excretados por las raíces o nodulos de ciertas leguminosas constituye una estrategia prometedora para competir con las poblaciones nativas de rizobios por los
sitios de nodulación. El mejor ejemplo es la producción y catabolismo de
rizo-pinas por el 10% de las cepas nativas ensayadas de S. meliloti y el 14% de
las cepas de R. leguminosarum. Las rizopinas son carbohidratos derivados del
inosi-tol que son producidos en los nodulos y utilizados por las correpondientes
cepas en vida libre en la rizosfera o en los hilos infectivos. Se han aislado los
genes responsables de la síntesis de rizopina (genes mos) y de su catabolismo
(moc), y se ha demostrado que los mutantes en estos genes, que se localizan en
el plásmido simbiótico, son menos competitivos que las cepas silvestres. Al
menos teóricamente debe ser posible mejorar la competitividad y persistencia
de inoculantes
INTERACCIONES BENEFICIOSAS ENTRE PLANTAS Y MICROORGANISMOS
115
rizobianos en el suelo mediante la incorporación a los mismos de los genes mos
y moc. Otros metabolitos secundarios producidos por leguminosas y utilizados
por cepas de rizobios como fuente de energía durante el proceso de infección
son la mimosina, una toxina antimitótica excretada por raíces, hojas y semillas
de Leucaena, y la trigonellina, una betaína excretada por raíces de muchas leguminosas. Se conocen los genes del catabolismo de la trigonellina en cepas de
5. meliloti y se sabe que están ligados a otros genes simbióticos y que se inducen
en todas las fases de infección de raíces de alfalfa.
3.3.1.2.
Extensión de la fijación de nitrógeno a cereales
En suelos deficientes en nitrógeno, las plantas que tienen la capacidad de
formar endosimbiosis diazotróficas tienen una gran ventaja sobre las que no forman nodulos fijadores de nitrógeno. Sin embargo en la mayoría de las cosechas
importantes, como los cereales, la fijación simbiótica no ocurre de forma natural. Por ello, la consecución de cereales fijadores de nitrógeno es un viejo sueño. Aunque todavía es muy pronto para acometer este objetivo directamente, la
aparición de datos nuevos sobre la interacción de rizobios con leguminosas y el
descubrimiento de nuevas asociaciones diazotróficas naturales de bacterias
en-dotróficas con cereales mantienen viva la investigación con este objetivo.
3.3.1.2.1.
Explotación de asociaciones naturales de bacterias diazotróficas
Bacterias epifíticas
El potencial efecto beneficioso de ciertas bacterias diazotróficas de la rizosfera, como Azospirillum sp., que viven asociadas a las raíces de gramíneas
tropicales, incluyendo algunos cereales, fue inicialmente propuesto por el grupo de Johanna Dobereiner en Brasil. Desde entonces se han aislado cepas de al
menos 11 géneros diferentes a partir de gramíneas tropicales, de regiones subtropicales y de zonas templadas, incluyendo cereales. En esta asociación, conocida cono simbiosis asociativa o rizocenosis, las bacterias colonizan la superficie de las raíces donde aprovechan azúcares y otros compuestos exudados por
la planta y en el ambiente microaeróbico de la rizosfera fijan ciertas cantidades
de N que eventualmente son asimiladas por la planta. Su contribución agrícola
ha sido analizada en muy diversas condiciones de cultivo y áreas geográficas, y
la conclusión general es que su mayor efecto sobre el crecimiento de las plantas
se debe a su capacidad de producción de fitohormonas y estimulación del crecimiento radicular más que a su diazotrofía. Un intento de mejorar este tipo de
asociación consiste en forzar la adhesión de las bacterias a las raíces mediante
la manipulación de genes de lectinas en las plantas. El interés por este tipo de
asociación se ha incrementado al demostrarse un efecto positivo sobre el crecimiento de leguminosas por la co-inoculación de Rhizobium y Azospirillum. El
116
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
efecto parece derivar de un mayor desarrollo radicular, del aumento de la
no-dulación y de la fijación de nitrógeno como resultado de la doble
inoculación.
Bacterias endofiticas
Un mayor interés ha despertado el descubrimiento de un creciente número
de bacterias diazotróficas que penetran y viven en el interior de gramíneas en
contraste con la vida epifítica de las bacterias anteriores. Bacterias endofiticas
son potencialmente todas aquellas que permanecen en las raíces después de su
esterilización superficial. En general estas bacterias colonizan espacios intercelulares pero no penetran en células vivas por lo que no puede hablarse de
endosimbiosis. Primero se identificaron varias cepas de Acetobacter y
Herbas-pirillum que son endofitos de la caña de azúcar y contribuyen
significativamente a la economía nitrogenada de estas plantas. A.
diazotrophicus vive en la solución azucarada de los espacios intercelulares
de la caña de azúcar y probablemente se mueve por los vasos del xilema.
Similarmente, las bacterias del género Azoarcus son capaces de invadir las raíces
de la pratense Kallar (Lep-tochloafusca),y del arroz, especialmente la zona de
elongación y diferenciación. La bacteria invade los espacios intercelulares de la
corteza de estas plantas sin que se produzca reacción marcada de
hipersensibilidad. También se ha descubierto recientemente que Azorhizobium
caulinodans, una bacteria capaz de formar nodulos aéreos y radiculares en la
leguminosa tropical Sesbania rostrata, invade las raíces de cereales como el
trigo, penetrando a través de grietas y colonizando los espacios
intercelulares y ciertas células muertas debajo de la epidermis. Cuando se
realizaron ensayos de campo con trigo inoculado con esta bacteria se
obtuvieron sorprendentes incrementos de los rendimientos de grano respecto a
los controles, lo que ha despertado fundadas expectativas sobre su potencial.
Se han descrito recientemente otras bacterias diazotróficas potencialmente
endofiticas de plantas de arroz. Entre ellas se han identificado cepas de
Burkholderia, una bacteria que además de endofito del arroz y otras gramíneas, forma endosimbiosis con hongos micorrícicos, y varias cepas de R.
legu-minosarum bv. trifolii, el microsimbionte natural del los tréboles. Algunas
de estas cepas de Rhizobium aumentan la productividad de ciertas variedades de
arroz en condiciones agronómicas, y existe un razonable optimismo de que se
pueda reducir el uso de fertilizantes nitrogenados en el arroz a través de la
manipulación de este tipo de asociaciones naturales.
Todas las asociaciones de gramíneas con bacterias diazotróficas endofiticas
tienen un gran potencial práctico y pueden servir de guía para el futuro desarrollo de sistemas similares con cereales de importancia agronómica. Sus ventajas sobre la fijación asociativa radican en que sufren menor competencia por nutrientes, y están mejor protegidas de cambios en el medio ambiente. Sin embargo
muchas de las preguntas que la identificación de estas bacterias plantea sobre su
INTERACCIONES BENEFICIOSAS ENTRE PLANTAS Y MICROORGANISMOS
117
ecología, la naturaleza de la interacción y sobre todo su contribución real a la
productividad de las gramíneas todavía carecen de respuesta. Para mejorar su
aplicación a cosechas importantes es crucial entender su interacción con la planta hospedadora, en particular el mecanismo de su especificidad, invasión y compatibilidad, así como definir los nichos colonizados dentro de la planta. El uso de
marcadores delatores para detectar la presencia de las bacterias y la expresión
génica puede ayudar sustancialmente en esta tarea. Algunas, como Azoarcus o
Acetobacter diazotrophicus nunca se han aislado del suelo, mientras que otras,
aisladas de maíz o algodón, son habitantes normales del suelo. La evidencia de
que su diazotrofía contribuye a la economía nitrogenada de las gramíneas es todavía circunstancial. Sería necesario comparar el crecimiento de plantas infectadas con cepas silvestres y con mutantes deficientes en genes de la fijación de
nitrógeno. Posiblemente la disponibilidad de oxígeno y las variaciones de su concentración dentro de la planta para la generación de energía y para el funcionamiento de la nitrogenasa son cruciales en su fisiología. Dado que existen claras
diferencias varietales en la respuesta de las gramíneas a la infección es probable
que la eficiencia de la asociación se pueda mejorar por cruces y selección. Finalmente, no debe olvidarse que en el campo de la moderna ecología se conoce que
muchos de los microorganismos existentes no se pueden cultivar por los métodos conocidos (bacterias viables pero no cultivables). Esta observación parece
ser también cierta para las bacterias asociadas con plantas ya que, por ejemplo,
en raíces de arroz se identifican secuencias de nitrogenasa que no corresponden
con ninguno de los aislamientos diazotróficos obtenidos de estas raíces.
3.3.1.2.2. Creación de nuevas simbiosis: Nodulación de cereales
Es posible que la estrategia más racional para conseguir un cereal fijador
de nitrógeno sea la formación de estructuras similares a nodulos ya que sólo en
tales estructuras se suministran simultáneamente bajos niveles de oxígeno, energía y una eficiente conversión y transferencia del nitrógeno a la planta. Sin embargo, el establecimiento de endosimbiosis con bacterias diazotróficas y cereales similares a los nodulos de las leguminosas con rizobios implica el
conocimiento previo de una serie de cuestiones básicas sobre la biología de la
planta. La primera es tal vez por qué los factores de nodulación no inducen morfogénesis en plantas no leguminosas a excepción de Parasponia andersonni, la
única no-leguminosa nodulada por Rhizobium. A este respecto es muy interesante la observación reciente hecha con plantas mutantes que indica que ciertos genes esenciales para la nodulación por Rhizobium son también necesarios
para la formación de una micorriza vesiculo-arbuscular. Dado que los mismos
hongos son capaces de micorrizar plantas no-leguminosas, esta observación implica que al menos varios genes de nodulación están también presentes en cereales como el arroz o el trigo. Además, al menos el arroz parece que contiene
118
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
también parte del mecanismo de transducción de la señal de nodulación como
se deduce de experimentos llevados a cabo por varios grupos de investigadores.
En estos experimentos se transfirió un gen de nodulina de alfalfa (enodl2), fusionado a un gen delator (gus), a plantas de arroz y se observó que se expresaba en las raíces de las plantas transgénicas en respuesta al tratamiento con factores de nodulación y en presencia de la auxina 2,4-D que genera raíces
engrosadas. Este resultado indica que el arroz posee una cadena de reconocimiento de los factores de nodulación y transducción de la señal que conduce a
la expresión del gen de la nodulina EÑOD12.
Otras preguntas básicas se refieren al modo de acción de las fitohormonas
en plantas no leguminosas respecto a leguminosas y a las reacciones de
hiper-sensibilidad patogénica. La primera porque la iniciación del nodulo
requiere división celular y ésta es mediada por el balance de fitohormonas. La
segunda porque en condiciones normales la célula hospedadora infectada es
destruida o porque la bacteria no sobrevive en la célula infectada. Si el
microsimbionte pudiera ser encerrado en un compartimento como la
membrana peribacteroidal de los simbiosomas, esta reacción antimicrobiana
podría evitarse.
Una estrategia alternativa para nodular plantas no leguminosas consistente
en forzar el establecimiento de asociaciones simbióticas no ha producido todavía resultados satisfactorios. El tratamiento de las raíces con auxinas, particularmente con 2,4-D, y posterior infección con ciertas cepas de Rhizobium,
Azospi-rillum o Azorhizobium conduce a la formación de estructuras nodulares
conocidas como pseudonódulos o paranodódulos. Algunas de estos
paranódulos reducen acetileno, pero no existe evidencia de que las células
infectadas sobrevivan o de que se forme una membrana peribacteroidal.
Similarmente, las expectativas de éxito se han diluido también en aquellas
estrategias que utilizaban tratamientos de raices con celulasas y pectinasas antes
de la infección con rizobios, incluyendo aquellos que nodulan plantas
no-leguminosas como Parasponia.
3.3.1.2.3.
Transferencia de los genes nif
Aunque no parece que existan razones definitivas por las que las plantas no
puedan fijar su propio nitrógeno, no es posible predecir cuántos obstáculos deben salvarse para conseguir este fin. La construcción de un cereal fijador es una
tarea extremadamente compleja que requiere la expresión coordinada y regulada de al menos 16 genes de la fijación (genes nif) en un ambiente celular apropiado. Aunque este ambicioso objetivo no pueda alcanzarse a corto plazo, sí se
están realizando esfuerzos en la consecución de aspectos parciales como la expresión de los genes nif en células vegetales. Dos grupos de investigadores han
conseguido recientes éxitos en la expresión de genes nif en procariontes. Los grupos de I. Potrycus en Zurich y R. Dixon en Norwich consiguieron expresar la
di-nitrogenasa reductasa en cloroplastos de Chlamydomonas reinhardtii
mediante
INTERACCIONES BENEFICIOSAS ENTRE PLANTAS Y MICROORGANISMOS
119
la sustitución del gen chlL por nifH de Klebsiella pneumoniae. La idea de utilizar cloroplastos como nicho para la expresión de actividad nitrogenasa se basa
en el modelo del heterocisto, células especializadas de cianobacterias filamentosas donde la fijación de nitrógeno tiene lugar al lado de células fotosintéticamente
activas. Los cloroplastos pueden generar abundante ATP y poder reductor y sus
genes codifican para metaloproteinas parecidas a las de la nitrogenasa.
3.3.2. Control microbiano de enfermedades de las plantas
El control de las enfermedades de las plantas es una necesidad apremiante
para la agricultura del siglo XXI. Las prácticas actuales para combatirlas se basan mayormente en conferir resistencia genética a la planta o en el uso de
pes-ticidas químicos. Obviamente es necesario aportar nuevas soluciones que
suministren un control efectivo de las enfermedades a la vez que minimizan
las consecuencias negativas para la salud y el medio ambiente. El control
biológico, usando microorganismos para suprimir el efecto deletéreo de los
patógenos, constituye una poderosa alternativa al uso de pesticidas sintéticos.
Dada la diversidad metabólica del mundo microbiano, el potencial de los
microorganismos como agentes de biocontrol es enorme. Basta con
incrementar la densidad de una cepa particular en la rizosfera o en vecindad de
tallos, hojas o frutos para suprimir una enfermedad sin producir efectos
persistentes en la comunidad microbiana o en otros organismos del ecosistema.
Cerca de 40 productos están actualmente disponibles comercialmente para
el
control
de
organismos
fitopatógenos
(visitar
www.barc.usda.gov/psi/bpdl/bpdl-prod/bioprod.htm/). Los microorganismos
implicados se recogen en la tabla 1, e incluyen especies de hongos y bacterias.
3.3.2.1. Pseudomonas
De entre los microorganismos usados en biocontrol, los pseudomonas fluorescentes son los mejor caracterizados, produciendo una amplia gama de metaTABLA 1
Lista de organismos usados en biocontrol
Hongos
Ampelomyces
Candida oleophila
Coniothyrium minitans
Fusarium oxysporum
Gliocladium virens
Phlebia gigantea
Pythium oligandrum
Trichoderma harzianum y otras especies
Bacterias
Agrobacterium radiobacter
Bacillus subtilis
Burkholderia cepacia
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas syringae
Streptomyces griseoviridis
120
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
bolitos con capacidad antimicrobiana. Los mecanismos usados por las PGPR
para suprimir enfermedades se basan fundamentalmente en tres estrategias:
competencia por nutrientes, inducción de resistencia en la planta y antibiosis.
En la primera, la producción de compuestos que secuestran hierro, llamados
si-deróforos, es el proceso mejor caracterizado. El grupo de pseudomonas
producen una amplia gama de sideróforos, algunos de los cuales, como las
pseudo-bactinas de P. putida que son fluorescentes y específicos, no pueden ser
usados por microorganismos patógenos ni por otros pseudomonas. Su función
en bio-control está bien demostrada por evidencias genéticas y bioquímicas, y
su mayor potencial se manifiesta en la rizosfera en condiciones de bajo hierro,
donde compiten eficientemente por este nutriente con los patógenos.
La inducción de resistencia sistémica en plantas por bacterias, y en particular por diferentes cepas PGPR del género Pseudomonas spp, está bien documentada en la literatura pertinente. La resistencia se dispara por componentes
del lipopolisacárido de las membranas externas de la pared de los pseudomonas. Aunque existe especificidad, algunos pseudomonas fluorescentes inducen
resistencia sistémica en una amplia gama de cultivares con diferente susceptibilidad a la enfermedad y en más de una especie cultivada contra varios patógenos. La inducción microbiana de resistencia sistémica en plantas es muy atractiva desde un punto de vista medioambiental ya que no inhibe o mata el patógeno
directamente con un metabolito tóxico, sino que restringe su penetración en la
planta optimizando su sistema de defensa.
La tercera estrategia, producción de antibióticos, es frecuente entre bacterias de la rizosfera y en particular en el grupo de pseudomonas fluorescentes.
Entre los compuestos antimicrobianos producidos destacan las fenazinas,
2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG), pioluteorina y ácido cianhídrico, efectivos
contra diversas enfermedades fúngicas como el mal del pie del trigo, la caída de
plántula en la remolacha y el algodón, causados por especies de Pythium, o
la podredumbre negra de la raíz del tabaco causada por Thielaviopsis
basteóla.
El uso de mezclas de cepas nativas y la generación de cepas genéticamente
modificadas para alterar la producción de metabolitos antimicrobianos importantes son las dos estrategias más atractivas para mejorar la capacidad de las
PGPR como agentes de biocontrol. Respecto a la primera, la existencia de efectos sinergísticos de las mezclas de cultivo en el control de ciertos patógenos está
demostrada por numerosas publicaciones. Respecto a la segunda, se han utilizado técnicas genéticas y de ADN recombinante para construir, por ejemplo,
mutantes desregulados con un fenotipo constitutivo, independiente de la concentración de hierro, para la producción de sideróforos, o cepas
superproduc-toras de DAPG y pioluteorina, derivadas de cepas nativas P.
fluorescens (CHAO, F113) que son más efectivas en la supresión del mal de pie
del trigo y la caída de plántula de la remolacha, respectivamente, que las cepas
silvestres. Aunque el análisis de los determinantes genéticos de las rutas
metabólicas que condu-
INTERACCIONES BENEFICIOSAS ENTRE PLANTAS Y MICROORGANISMOS
121
cen a la producción de antimicrobianos en PGPR y la regulación de su expresión está todavía en sus inicios, los resultados obtenidos son prometedores.
3.3.2.2. Bacterias Gram positivas
Frente a la atención predominante que se ha dedicado en la literatura a los
pseudomonas fluorescentes como agentes de biocontrol, las bacterias Gram positivas del género Bacillus y Streptomyces han recibido menor atención en parte
debido a las dificultades de manipulación genética y al desconocimiento de los
mecanismos de biocontrol. En la búsqueda de nuevos agentes de biocontrol a
partir de bacterias del suelo, y de la rizosfera en particular, se han identificado
nuevas cepas de estos géneros que poseen una eficacia notable para suprimir
enfermedades de las plantas. Aparte de B. thuringensis, un agente de biocontrol
tradicional en los últimos 25 años que representa actualmente el 90% del mercado de bioinsecticidas mundial, otras especies de Bacillus forman parte de productos de biocontrol que han llegado también al mercado. Bacillus subtilis incluye cepas efectivas contra patógenos de Fusarium y Rhizoctonia, y cepas de
Bacillus cereus se han revelado como agentes eficaces en el tratamiento del marchitamiento de la alfalfa y la podredumbre radicular de la soja producidos por
cepas de Phytophthora.
Entre los estreptomicetos del suelo, varias cepas de Streptomyces suprimen
eficazmente la roña de la patata producida por cepas de una especie próxima,
Streptomyces scabies. La mayoría de estas bacterias Gram positivas producen
antibióticos como mecanismo de control de la enfermedad. Sin embargo, la interacción con el patógeno y el proceso de biocontrol parece diferir del establecido para pseudomonas. Así, la densidad de la población en el suelo y el nivel de
inhibición del patógeno observada «in vitro» no son suficientes para explicar su
efectividad supresora de la enfermedad. Bacillus cereus es más efectivo cuando
coloniza las raíces a bajas densidades, y combinaciones de cepas de Streptomyces son más eficaces que formulaciones con una sola cepa debido a incrementos
en la producción de antibiótico que dependen del intercambio de complejas señales de comunicación entre las cepas. Estas observaciones deben estimular la
investigación sobre bacterias Gram positivas que interaccionan con plantas para mejorar nuestro conocimiento de la interacción y poder diseñar productos
nuevos de biocontrol de patógenos en el agroecosistema.
El éxito en la utilización de un microorganismo potencialmente útil en biocontrol es frecuentemente impredecible. Una de las razones más frecuentes del
fracaso es la falta de conocimiento del mecanismo de antagonismo con el patógeno y la interacción del agente de biocontrol con la planta, la comunidad microbiana y el ambiente. Este conocimiento es necesario para poder manipular
el agente de tal forma que exprese su máximo potencial de biocontrol. A veces
es la capacidad del agente de biocontrol para colonizar las raíces o la rizosfera
122
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
el factor limitante; pero otras lo son factores extrínsecos como la sensibilidad a
inhibidores de las semillas en el caso de Bacillus cereus UW85. Otra de las razones de frecuentes fracasos es la dificultad en encontrar una formulación adecuada para su aplicación. Lo más habitual es utilizar polvos o granulos aplicables bien en suelo, semillas o sistemas de irrigación. Los microorganismos que
esporulan, como los Gram positivos del género Bacillus, pueden formularse fácilmente como polvos por la tolerancia de las esporas al calor y la sequía. En
cambio para asegurar la viabilidad de las bacterias Gram negativas como
Pseu-domonas sp. se requieren preparados celulares concentrados y congelados
y almacenamiento en hielo seco.
3.3.3. Hongos micorrícicos
3.3.3.1. Naturaleza de la simbiois
En la naturaleza la mayoría de las plantas no sólo tienen raíces sino también micorrizas, una asociación mutualista-simbiótica entre hongos del suelo y
las raíces. Los hongos micorrícicos, presentes en casi todos los suelos, colonizan
la raíz y forman un manto externo de hifas que conecta la planta con el
micro-hábitat que rodea las raíces. Esta asociación es crucial en la asimilación
de nutrientes y en la protección contra efectos ambientales adversos, bióticos y
abió-ticos. Entre los cinco tipos diferentes de micorrizas conocidos, las
ectomicorrizas y las endomicorrizas arbusculares son las de mayor importancia
agroforestal. Los hongos de las ectomicorrizas son Basidiomycetos y
Ascomycetos que colonizan el tejido cortical de las raíces de un 3% de las
plantas superiores, principalmente árboles forestales, y se caracterizan por una
falta de penetración in-tracelular.
La mayoría de las plantas de importancia en sistemas agrícolas forman micorrizas vesículo-arbusculares (VAM). En este tipo de micorrizas, ciertos hongos biotrofos obligados del orden Glomales crecen hacia las células internas de
la corteza donde se diferencian en estructuras ramificadas conocidas como arbúsculos que penetran en las células a la vez que mantienen una estructura
mi-celiar en el exterior de la planta. Esta organización permite conectar el
interior de la planta con el suelo y facilitar la toma de agua y nutrientes de baja
movilidad o de baja concentración en el suelo, principalmente fósforo, amonio, y
algunos micronutrientes. Dado que además la simbiosis VAM favorece el
desarrollo radicular y la salud de las plantas, existe un interés creciente en
evaluar su efectividad en sistemas agrícolas concretos y en explorar su posible
manipulación para asegurar su eficaz funcionamiento mediante prácticas
agrícolas normales.
El establecimiento de la simbiosis micorrícica se visualiza hoy,
similarmen-te a la simbiosis de rizobios con leguminosas, como el resultado de
un diálogo molecular entre el hongo y la raíz. El resultado de este diálogo,
mediado por intercambio de señales de reconocimiento y aceptación, depende
en último tér-
INTERACCIONES BENEFICIOSAS ENTRE PLANTAS Y MICROORGANISMOS
123
mino de la expresión de genes de ambos socios. Desafortunadamente, ninguna
cepa de las cerca de 150 especies sistematizadas del orden Glomales ha podido
ser cultivado axénicamente, lo cual ha dificultado su manejo y análisis biológico. La consecuencia práctica más importante de estas peculiaridades es la dificultad encontrada en la preparación de inoculantes comerciales.
3.3.3.2.
Inoculantes micorrícicos
Dados los efectos de las VAM como biofertilizantes y bioprotectores de los
cultivos, se asume que el manejo apropiado de esta simbiosis puede reducir el
uso de fertilizantes químicos y fitofármacos. La posibilidad de utilizar masivamente inoculantes micorrícicos está alimentada por la creciente preocupación
social por la contaminación ambiental asociada a una agricultura intensiva y se
integra en el concepto de una agricultura más sostenible. Además, un interés
añadido a la utilización de inoculantes micorrícicos es la capacidad de las plantas micorrizadas para superar situaciones de estrés sobre todo en suelos degradados por procesos erosivos, incendios forestales, laboreo excesivo y agotamiento
de nutrientes, sequía, salinidad, contaminación industrial o minera, etc. La
mi-corrización aparece así como una atractiva práctica para recuperar
(biorreme-diación) suelos degradados mediante la introducción de plantas
mejor capacitadas para la adaptación a esos suelos.
Debido al carácter de simbiontes obligados y a las dificultades para su cultivo axénico, la multiplicación de los hongos micorrícicos y la producción de inoculantes de alta calidad requiere procedimientos específicos, y esto ha constituido una limitación importante para la aplicación de las VAM. Los mayores
beneficios sólo se obtendrán tras una cuidadosa selección los hongos más eficientes y de combinaciones planta/hongo/substrato. Estas limitaciones y las experiencias preliminares disponibles hacen esperar los mayores éxitos en cultivos en los que es necesaria una fase de transplante, como el caso de Fruticultura,
Horticultura y Floricultura. Las limitaciones mas importantes afectan a la selección del hongo, producción del inoculo y su aplicación.
a) Selección del hongo. Aunque no existe una especificidad parecida a la
de los rizobios y cualquier cepa del orden Glomales puede infectar una
planta susceptible, la experiencia indica que existen grandes diferen
cias entre cepas en el establecimiento de la simbiosis y en la efectivi
dad de la respuesta de la planta. La selección implica el aislamiento de
hongos de plantas micorrizadas y el planteamiento de experimentos de
invernadero aplicando los criterios de compatibilidad funcional.
b) Producción de inoculo. Desde un punto de vista comercial la clave es
ta en la producción masiva de un inoculo de alta calidad que sea fácil
mente transportable y aplicable. Dado que los hongos micorrícicos no
pueden multiplicarse en laboratorio como las bacterias endosimbióti-
124
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
cas, es necesario ineludiblemente utilizar una planta hospedadora. El
substrato sobre el que se cultiva la planta debe asegurar además de un
aceptable crecimiento de la misma, la producción por el hongo de abundantes propágulos, esporas y micelio, que produzcan una adecuada
mi-corrización cuando, mezclados con las raíces, se utilicen como inoculo.
En la corta experiencia de uso de las AM en la práctica, los cultivos
ae-ropónicos y los cultivos sobre substratos sólidos han dado los mejores
resultados. El método de cultivos aeropónicos requiere crecer las raíces
en la oscuridad alimentadas con pulverizaciones de solución nutritiva, lo
cual demanda una técnica sofisticada y mano de obra especializada. El
inoculo que se obtiene después del procesamiento y fragmentación fina
de las raíces resulta con un precio elevado y justificable solo en casos
concretos. Por ello, los métodos basados en el uso de soportes sólidos son
más comunes. Se usan bien suelo o substratos alternativos más ligeros
entre los que se incluyen vermiculita, perlita, arcillas calcinadas o
expandidas, material de origen volcánico (picón). La mezcla triturada de
estos substratos sobre los que ha crecido la planta contiene fragmentos de
raíces micorrizadas, esporas y fragmentos de micelio. Utilizando este tipo
de inóculos en ensayos experimentales se han micorrizado con éxito
plantas de cítricos, aguacates y olivos. c) Aplicación del inoculo. El
principal problema es hacer compatible la micorrización con los
protocolos de producción de planta así como con los intereses económicos
de los viveristas. Algunos de los factores a considerar incluyen i)
adaptación a las operaciones de transplante del material vegetal,
realizándose preferencialmente la micorrización al inicio de la formación
de las raíces tróficas, y ii) evitar el contacto del inoculo con dosis
agronómicas de fertilizantes, particulamente fosforados, y fitosanitarios,
en especial antifúngicos, que inhiben la micorrización o antagonizan con
los hongos micorrícicos.
Parece recomendable utilizar conjuntamente micorrizas y otros microorganismos con efectos antifitopatogénicos para suministrar una acción integrada de fertilización y protección de las plantas. Entre estos últimos se ha mostrado especialmente eficaces algunas PGPR particularmente ciertas bacterias
(Pseudomonas, Bacillus etc.) y hongos (Trichoderma, Glyocadium, etc.).
3.3.4.
Microorganismos productores de reguladores del crecimiento vegetal:
fitoestimuladores
Aunque como definimos anteriormente, bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) incluyen todas aquellas rizobacterias que de forma
directa o indirecta estimulan el crecimiento de las plantas, en esta sección nos
concentraremos en aquellos microorganismos que primariamente actúan esti-
INTERACCIONES BENEFICIOSAS ENTRE PLANTAS Y MICROORGANISMOS
125
mulando el crecimiento por la excreción de fitoreguladores. Muchos de estos
microrganismos fitoestimuladores tienen también efecto contra microrganismos
patógenos y son útiles como agentes de biocontrol, y eventualmente contribuyen también a la asimilación de nutrientes, como fósforo, o a la fijación de nitrógeno. Los reguladores del crecimiento vegetal son sustancias naturales que
afectan a procesos fisiológicos a concentraciones mucho menores que los nutrientes y las vitaminas. Pueden ser producidos endógenamente por las plantas,
en cuyo caso se habla de fitohormonas, o externamente por la microbiota de la
rizosfera, denominándose entonces reguladores del crecimiento vegetal (PGRs).
Existen cinco clases bien definidas de PGRs (auxinas, giberelinas, citoquininas,
etileno y ácido abscísico) y la mayoría de las rizobacterias son capaces de producir «in vitro» una o mas de estas PGRs. Aunque esta observación sugiere que
estas sustancias está implicadas en la interacción planta-microorganismos, su
producción en la rizosfera está poco documentada.
Los géneros mejor estudiados para la producción de fitohormonas son
Azo-tobactex y Azospirillum, pero esta capacidad se ha demostrado también en
especies de muchos otros géneros como Pseudomonas, Acetobacter,
Burkholderia, Alcaligenes, Klebsiella, Enterobacter, Herbaspirillum,
Xanthomonas y Bacillus. La produción de reguladores del crecimiento vegetal
se ha demostrado también en organismos simbióticos como rizobios y hongos
micorrícicos, y parecen jugar un importante papel en las simbiosis. Sin
embargo la pregunta pertinente es si la producción de fitohormonas por estas y
otras rizobacterias incrementa el crecimiento de las plantas. Existe una
considerable cantidad de información sobre la capacidad de mejorar el
crecimiento y desarrollo de las cosechas mediante inoculación con
Azotobacter y múltiples especies de Azospirillum y otras rizo-bacterias así
como también en la inoculación de árboles de interés forestal. Varias cepas de
Bacillus se han usado comercialmente en China desde los años 80 para
incrementar la productividad y se han aplicado a más de 40 millones de Ha. Las
especies más frecuentes son B. cereus y B. subtillis.
Inicialmente se supuso que el efecto estimulador del crecimiento asociado
a la inoculación con Azotobacter y Azospirillum sp. se debía al aporte nitrogenado suministrado por estos diazotrofos, pero hoy se piensa que es debido a la
producción de compuestos biológicamente activos. Entre ellos está bien documentada la producción de auxinas, giberelinas y citoquininas por estas bacterias. Varias rutas metabólicas conducen a la producción de acido indol acético
(AIA) desde L-triptófano, y los genes implicados han sido aislados en múltiples bacterias, por ejemplo en A. brasilense y P. fluorescens. Aunque se dispone de mutantes en estos genes, no es fácil aislar mutantes completamente deficientes en la producción de AIA debido a las múltiples rutas metabólicas,
algunas de las cuales son independientes de triptófano, y por ello es difícil relacionar directamente los efectos beneficiosos observados con la producción
bacteriana de AIA.
126
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
Por manipulación genética se ha conseguido crear cepas superproductoras
de AIA en Pseudomonas fluorescens y A. brasilense, pero la conclusión de los
experimentos dirigidos a demostrar el efecto sobre el crecimiento vegetal son
que el rango de concentraciones de AIA a las que este efecto es positivo es muy
estrecho (del orden nM). Altas concentraciones de AIA (microM), producidas
por las cepas superproductoras y supercolonizadoras, tienen claros efectos negativos sobre el crecimiento radicular. Este hecho limita el potencial de mejora
del valor agrícola de las rhizobacterias manipuladas genéticamente para
sobre-producir AIA.
Numerosos aspectos importantes de la respuesta de las plantas a los
fitore-guladores de origen microbiano son todavía deconocidos. Entre ellos se
incluyen los factores ambientales que afectan a su síntesis en la rizosfera, la
relación entre su concentración y respuesta de la planta, su estabilidad física y
biológica en el suelo, y su efecto sobre otras sustancias biológicamente activas y
sobre las comunidades microbianas. Es necesario disponer de mutantes de plantas
y de PGPR deficientes en la síntesis de fitohormonas para poder elucidar el
mecanismo de acción de las fitohormonas microbianas y su interacción con las
plantas.
3.3.5.
Conclusión y perspectivas
Durante los últimos 15-20 años se han realizado considerables esfuerzos para
identificar microorganismos rizosféricos beneficiosos, incluyendo PGPR y
mi-corrizas, y los mecanismos por los que estos organismos promueven el
crecimiento de las plantas. En el contexto de una agricultura sostenible este
esfuerzo ha despertado un gran interés comercial y, aunque todavía se dispone
de pocos productos en el mercado, es de esperar que su número aumente en los
próximos años.
Como ha evidenciado esta revisión, los organismos de la rizosfera que forman asociaciones beneficiosas con plantas son funcional y filogenéticamente
muy diversos. Esta diversidad aumentará probablemente con la identificación
de nuevos microorganismos asociados a plantas ya que la exploración de nuevas interacciones planta-microorganismos es uno de los retos futuros del campo. Otros objetivos incluyen: a) Esclarecimiento de los mecanismos de la interacción a nivel molecular. El análisis genómico de la planta hospedadora y del
componente microbiano permitirá identificar los genes implicados en la interacción así como sus funciones. Este objetivo puede verse facilitado por la existencia de aspectos comunes en los diferentes interacciones como la existencia
de señales moleculares similares en la simbiosis Rhizobium-legummosas y
mi-corrizas o el papel predominante que juegan la capacidad competitiva y la
capacidad de colonización de los microbios en diversas interacciones, b)
Evaluación precisa de las respuestas de las plantas a la asociación con los
microorganismos como base para la manipulación y explotación de esta interacción. De nuevo la identificación de genes claves de la interacción ha de faci-
INTERACCIONES BENEFICIOSAS ENTRE PLANTAS Y MICROORGANISMOS
127
litar esta labor proporcionando mutantes mejorados de cepas PGPR existentes
y la construcción por ingeniería genética de nuevas cepas con características superiores. Un último obstáculo a salvar antes de la explotación comercial de un
microorganismo con interés agrícola es la formulación de un inoculante y su aplicación de forma que permitan predecir su efecto en condiciones de campo.
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
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3.4.
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA LA MEJORA
DE LA CALIDAD DE LOS PRODUCTOS AGRARIOS*
Los primeros logros de la Biotecnología de Plantas han sido el incremento
en la producción de las cosechas y la disminución en el uso de plaguicidas y herbicidas. Los primeros beneficiados aparentes de estos logros han sido los agricultores, aunque el conjunto de la sociedad también se ha beneficiado al disponer de mayor cantidad de alimentos, más económicos, y con un sistema de
producción más limpio desde el punto de vista medioambiental. Sin embargo, la
presión social está determinando que los objetivos de mejora por ingeniería genética se dirijan a aspectos que incidan de forma más directa en el beneficio de
los consumidores. Estos objetivos no son otros que la obtención de productos
con menos contaminantes agroquímicos y de mejor calidad. En estos casos los
beneficios se distribuyen a otros sectores de la sociedad, como son los productores, los distribuidores y la industria relacionada con el procesamiento y transformación de los alimentos. La calidad de un producto viene determinada no sólo por sus propiedades intrínsecas sino también por su apariencia externa y su
capacidad de conservación, entre otros aspectos. De todos ellos trata el presente capítulo, si bien de forma resumida, habida cuenta del amplio abanico de posibilidades que entraña el término calidad y de los numerosos avances que la
Biotecnología de Plantas ha conseguido en este campo.
3.4.1.
Mejoras en el valor nutritivo de los alimentos
Uno de los primeros casos de aplicación en este aspecto ha sido el cambio
en la composición de aminoácidos de las proteínas presentes en los productos
de origen vegetal que se utilizan como alimentos, tanto humanos como animales. Se sabe que algunos de los 20 aminoácidos que forman parte de las proteínas no son sintetizados por algunos mamíferos, entre los que se encuentra la especie humana. Estos aminoácidos se denominan aminoácidos esenciales y deben
ser ingeridos en la dieta. Así pues, el valor nutritivo de la dieta proteica aumen* Victoriano Valpuesta. Departamento de Biología Molecular y Bioquímica. Universidad de Málaga. Málaga.
BIOTECNOLOGIA APLICADA A LA AGRICULT URA
130
tara en la medida que es mayor el contenido en aminoacidos esenciales, tales como por ejemplo lisina y metionina. Un caso de aplicaci6n de la biotecnologfa en
este campo ha sido la obtenci6n de un aumento en el contenido de lisina en las
semillas de una especie tan importante como es la soja. La lisina se sintetiza en
una via metab61ica que se inicia en otro aminoacido, el acido aspartico. Los pasos metab61icos se indican de forma esquematica en la figura 1. Dos enzimas de
dicha via, la aspartato quinasa (AK) y la dihidropicolinato sintasa (DHDPS) son
inhibidas por el producto final, lisina, en un mecanismo bastante comun de regulaci6n de vias metab6licas. Para aumentar el contenido de lisina era suficiente abolir la inhibici6n de estas enzimas por el producto final, la lisina. Asi se ha
conseguido en soja cuando esta especie se transform6 con un vector binario cuya regi6n T con tenia los siguientes genes: el gen lysCM4 de E. coli que es una
versi6n mutada del gen que codifica la enzima AK de esta bacteria y cuya mutaci6n la hace insensible a la inhibici6n por lisina, y el gen dapA de Corynebacterium que codifica la enzima DHDPS de este organismo que no es sensible a la
inhibici6n por lisina. El resultado es que la planta transformada tenia una via
metab6lica de sintesis de lisina duplicada, una de ella desregulada al ser insen sible a la inhibici6n por lisina. La soja transgenica obtenida con tenia hasta 100
veces mas lisina libre en sus semillas.
Ademas de los aminoacidos, los lfpidos con componentes importantes de la
dieta y se ingieren en forma de margarinas, aceites 0 ingredientes alimentarios.
Aspartato
~ Af<
~-aspartartil
~
~-semialdehfdo
..... -- ---------- ------------------ --- ----- -- ---,
fosfato
aspartico
. ------'1 L----. ~~;---~~~i-~~~~i~~~i-~~;~------------l
Metionina ......
Treonina
j
l~ Metionina
~
l
Lisina ______ ___ ___________ 1
~
Isoleucina
Figura 1. Ruta metab61ica de biosfntesis de los aminoacidos isoleucina , metionina y Iisina a partir del
aminoacido aspartato. Las lfneas discontinuas indican inhibici6n por la lisina de los pasos que conducen
a su sfntesis. AK : aspartato quinasa. DRDPS: dihidropicolinato sintasa.
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA LA MEJORA DE LA CALIDAD...
131
El consumo de grasas de origen vegetal aumenta de forma continua en detrimento de las grasas de origen animal. Los ácidos grasos son componentes esenciales de estas grasas, siendo los principales los ácidos palmítico, esteárico,
olei-co, linoleico y linolénico, los dos primeros saturados y los tres últimos
insaturados. La insaturacion, presencia de dobles enlaces en los ácidos grasos, se
ha asociado a una mayor calidad de los alimentos debido a su efecto
beneficioso en el mantenimiento de la integridad celular y la prevención de
enfermedades de tipo cardiovascular. La insaturacion de un ácido graso ocurre
por la acción de una enzima desaturasa sobre el precursor saturado. Así el
ácido oleico (de 18 átomos de carbono con una insaturacion entre los carbonos 9
y 10) procede del ácido esteárico (saturado de 18 átomos de carbono) por
acción de la correspondiente desaturasa. Usando la ingeniería genética, es
decir transformando con el gen que codifica la enzima desaturasa, se han
obtenido plantas transgénicas de colza con un contenido en ácido oleico que
constituye el 80% del total de ácidos grasos de sus semillas. Este valor es muy
superior al del aceite de colza natural, y es comparable al de otros aceites
vegetales de procedencia diferente, como puede ser el aceite de oliva.
En el caso de los ácidos grasos también hay trabajos en los que se ha intentado conseguir un elevado contenido de un ácido graso saturado tal como el
ácido esteárico. La producción de margarinas y de diversos componentes de repostería requiere grasas saturadas que mejoran las propiedades de textura y tacto en la boca. La saturación se hace por hidrogenación de las grasas vegetales,
en un proceso puramente químico. Dicha hidrogenación produce con frecuencia también ácidos grasos insaturados «trans», cuya presencia se ha asociado a
alto riesgo de enfermedades coronarias por su potencial aumento en el
coleste-rol total y las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Los ácidos grasos
insaturados naturales son «cis». Para evitar someter las grasas al proceso de
hidrogenación química se han obtenido plantas transgénicas superproductoras de
grasas ricas en ácido esteárico. Así se han obtenido plantas de otra variedad de
colza transformadas con el gen FatAl de Garcinia mangostata, que codifica la
enzima tioesterasa de acil-ACP, que participa en la síntesis de este ácido. El
procedimiento fue mejorado mediante mutagénesis dirigida del transgén, con
el resultado de un incremento entre el 55 y el 68% de ácido esteárico en las
semillas de las plantas transgénicas.
Otros casos de mejora de valor nutritivo incluyen lo que se denomina el reforzamiento para incrementar algunos componentes esenciales para la dieta tales como las vitaminas y los oligoelementos. En el primer caso se encuentra la
vitamina A, cuya deficiencia se considera hoy una epidemia a escala global (250
millones de niños tienen riesgo de esta epidemia). La mejor fuente de vitamina
A son los carotenos, especialmente el P-caroteno, presente en muchas frutas y
hortalizas. Estos carotenos son convertidos en vitamina A después de ser ingeridos por el ser humano. Sin embargo las frutas y hortalizas con alto caroteno
132
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
no son siempre asequibles para la población que sufre la deficiencia de esta vitamina. La transformación genética de la colza con el gen que codifica la fitoeno sintasa, enzima clave en la síntesis de carotenos, ha producido colza
transgé-nica cuyo aceite contiene hasta 5 veces más carotenos que otra fuente
natural de aceite para estas poblaciones como es el aceite de palma (Tabla 1).
No es la colza la única especie transgénica que sobreproduce p-caroteno,
también se ha producido arroz transgénico, obviamente con un atrayente color
amarillo-dorado. Este arroz transgénico contiene suficiente cantidad de
(3-caroteno para suministrar él solo todo el precursor de la vitamina A que
requiere un ser humano alimentado con una dieta de este cereal.
Otro problema nutritivo importante, que se estima que afecta al 30% de la
población mundial, es la deficiencia de hierro. Aunque algunas plantas que son
importantes para el consumo humano, como son las legumbres, tienen alto contenido en hierro, sin embargo contienen también ácidos como el oxálico que disminuyen la biodisponibilidad de este nutriente. Entre los componentes moleculares que regulan el contenido de hierro está la proteína conocida como
ferritina. Esta proteína, compuesta por 24 unidades polipeptídicas ensambladas
en un complejo de 450 kDa, almacena hasta 4.500 átomos de hierro en su cavidad central. Se ha probado que el tratamiento de ratas anémicas con una dieta
enriquecida en esta proteína es efectivo en corregir la deficiencia. El gen correspondiente ha sido aislado de diversas especies vegetales tales como la soja,
la alfalfa, el guisante y el maíz. Recientemente se han obtenido plantas
trans-génicas de arroz que han sido transformadas con el gen aislado de la soja.
En la transformación se ha utilizado un promotor específico de proteína de
reserva de semilla de arroz, GluB-1 de la glutelina, lo que determina que el
gen se exTABLA1
Composición en carotenoides y tocoferoles del aceite de palma y el de colza transgénica
con fitoeno sintasa
Total carotenoides
— |3-caroteno —
a-caroteno —
Licopeno —
Luteína — Fitoeno
Tocoferoles
Tocóles
Aceite de palma
(ug/g)
Aceite de colza transgénica
480-672
280-392
175-245
7-9
10-15
2.025-2.466
690-920
470-530 8-33
85-196
760-820
90-150
400-500
600-1.000
400-500
Tomado de Kishore y Shewmaker, 1999. PNAS 96: 5968.
("g/g)
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA LA MEJORA DE LA CALIDAD...
133
prese de forma preferente en la semilla. El contenido de hierro en las semillas
del arroz transgénico fue hasta 3 veces superior al del arroz sin transformar. El
secuestro del hierro por parte de la ferritina, puede tener un efecto positivo adicional para el cultivo de la especie transgénica, y es que la producción de especies reactivas de oxígeno, nocivas en muchos casos para los tejidos vegetales, depende de la disponibilidad de hierro libre. Las plantas de tabaco expresando
ectópicamente un gen de ferritina de alfalfa están más protegidas frente al daño oxidativo causado por diferentes tipos de estrés.
3.4.2.
Aumento del dulzor
Un elemento esencial de aceptación de un producto alimentario es su sabor, en el que a su vez se han identificado diferentes componentes. Uno de los
componentes primarios es el dulzor y es el que ha sido objeto de mejora por biotecnología, probablemente porque es el más fácil de abordar desde el punto de
vista técnico. En unos casos se ha intentado aumentar el dulzor, en otros el objetivo es disminuirlo, mientras que en otros se han utilizado las plantas como
biorreactores para producir edulcorantes. Un ejemplo conocido en el primer caso es el incremento del dulzor producido en los frutos de tomate. Con este propósito se ha conseguido expresar en esta especie el gen de una proteína que tiene propiedades edulcorantes. Así se sabía que una proteína, denominada
monelina, de la planta Dioscorephylum cumminsii era aproximadamente unas
100.000 veces más dulce que la sacarosa, en una base molar. La proteína activa
es un dipéptido de las cadenas polipeptídicas A y B, de 45 y 50 aminoácidos respectivamente, unidas por interacciones débiles. Al tratarse de dos polipéptidos
la transformación del tomate había de ser con dos genes. Así fue y en la construcción preparada para tal efecto en el vector binario también se incluyó el promotor del gen E8 de tomate que determina una expresión específica en el fruto
de los transgenes. Se obtuvieron frutos de tomate con altos contenido de monelina y con un dulzor significativamente superior. En general, hay que indicar
que hay una serie de proteínas, conocidas como tipo taumatina, que también presentan propiedades edulcorantes para el ser humano y cuyos genes han sido clonados en diversas especies. Este es sin duda un camino abierto en el que se sigue avanzando.
El objetivo en otros casos ha sido la disminución del dulzor al considerarse éste indeseable en el alimento en cuestión. Tal es el caso de la patata cuando
se almacena en frío durante un periodo prolongado, algo que es muchas veces
inevitable en la producción de este cultivo. Con el frío, el almidón de la patata
se convierte en azúcares solubles, lo que produce un dulzor indeseable en este
alimento que afecta también a su procesamiento. La acumulación de hexosas en
estas circunstancias se debe a un desequilibrio entre la velocidad de degradación del almidón y la velocidad de la glicolisis, lo que produce una acumulación
BIOTECNOLOGIA APLICADA A LA AGRICULTURA
134
de sacarosa, que posteriormente se convierte en glucosa y fructosa por accion
de la invertasa (Fig. 2). Dos estrategias se han utilizado para evitar la acumulacion de hex os as durante el almacenamiento en frio. La primera es la inhibicion
de la degradacion del almidon 0 el aumento de su sfntesis. La segunda consiste
en impedir la hidrolisis de la sacarosa inhibiendo la actividad invertasa en las
plantas transgenicas. La invertasa, enzima que cataliza la hidrolisis de la sacarosa en glucosa y fructosa, presenta varias formas celulares especfficas de los
compartimentos donde se encuentra (Fig. 2) . La inhibicion de la actividad invertasa se ha conseguido, a su vez, de dos formas diferentes: transformando las
plantas de patata con una construccion antisentido del gen que codifica la isoforma vacuolar de la invertasa inducida por el frio y en otro caso transforman-
APOPLASTO
Invertasa
Hexosa - - - - - Sacarosa
CITOSOL
Sacarosa sintasa
\...
VACUOLA
PGMIPGI
L-- Hexosa-6-fosfato ... ~ Glucosa-1-fosfato
/
T
I
~~
~~
GLUCOLISIS ~
"
"
PGMIPGI
HK
Glucosa --I~~ Hexosa-6-fosfato'" ~ Glucosa-1-fosfato
~
+ADPGPPasa
Almid6n ...
ADP-glucosa
AMILOPLASTO
Pasos metab61icos de interconversi6n de almid6n y hexosa s en los diversos compartimentos
de la celul a vegeta l. Las enzimas c1aves estan indicadas como sigue: HK: hexoquinasa. PGM: fosfoglllcomlltasas. PGI: fosfogilicoisomerasa. ADPGPPasa: ADP glucosa pirofosfatasa.
Figura 2.
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA LA MEJORA DE LA CALIDAD...
135
do la patata con el gen Nt-inhh de tabaco que codifica una proteína inhibidora
de la invertasa. La transformación con el antisentido de la invertasa sólo produjo un máximo de un 34% reducción en el contenido de hexosas inducidas por
el frío en el tubérculo, a pesar de que la actividad endógena de la invertasa se
había reducido en un 90%. La explicación es que la actividad invertasa restante
(10%) era suficiente para causar la hidrólisis de la sacarosa. En el segundo
caso, la utilización del gen codificante del inhibidor de la invertasa de tabaco
{Nt-inhh) redujo la cantidad de hexosas hasta un 75%. La reducción del contenido en hexosas que se producen en el tubérculo después de su almacenamiento en frío en las plantas transgénicas tiene una ventaja adicional para la industria de los alimentos procesados. En efecto, las hexosas que se producen en el
tubérculo tras su almacenamiento reaccionan con los aminoácidos libres produciendo aminoazúcares. Al freírse las patatas para la preparación de «chips»
estos compuestos dan un color marrón indeseable a las patatas fritas. Este problema también fue evitado al impedir la acumulación de hexosas por el frío en
las patatas transformadas con el gen codificante del inhibidor de la invertasa.
El tercer caso que se puede referir de mejora de la calidad de un producto
en relación con el dulzor es el anteriormente mencionado de utilizar la planta
como fuente de edulcorante, es decir como biorreactor. El edulcorante más usado en la industria alimentaria sigue siendo la sacarosa. Sin embargo, su alto valor calórico y su asociación al desarrollo de caries dentales han provocado un
cambio en la preferencia de los consumidores hacia otros edulcorantes. Una de
las alternativas elegida en Biotecnología ha sido la producción de fructanos de
bajo peso molecular. Estos fructanos, que son polímeros de fructosa, se asemejan a la sacarosa en sus propiedades organolépticas pero tienen sobre ésta las
ventajas de que no pueden ser usados como fuente de carbono por las bacterias
cariogénicas ni ser degradados por las enzimas digestivas humanas. Los fructanos se producen de forma industrial en biorreactores a partir de la sacarosa, utilizando la enzima fructosil transferasa de Aspergillus niger. Sin embargo, los costes de producción son muy elevados al necesitarse una purificación del producto,
del que ha de separarse la glucosa que se produce en el proceso. La especie vegetal elegida para producir fructanos ha sido la remolacha. La elección de esta
especie se ha hecho en base a sus características agronómicas, puesto que su rendimiento en la producción de carbohidratos está entre los más elevados (7-1 OTm
de sacarosa/hectárea), y además en base a sus características bioquímicas, pues
la sacarosa se almacena en las vacuolas de las células de raíz hasta una concentración de 0,5 M. El gen utilizado para transformar la remolacha procedía de
otra especie, Helianthus tuberosus, y codificaba la enzima l-sacarosa:sacarosa
fructosil tranferasa (1-sst) que convierte la sacarosa en fructanos de bajo peso
molecular. Las plantas transgénicas convierten la sacarosa almacenada en la
raíz en fructanos de bajo peso molecular, sin cambio visible en el fenotipo de las
plantas transgénicas.
136
3.4.3.
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
Obtención de frutos partenocárpicos
Las plantas que pueden desarrollar frutos sin fertilización previa (frutos
partenocárpicos) son atractivas desde el punto de vista de aceptación por el consumidor debido al hecho de que estos frutos no tienen semillas, además que hacen más fácil y menos costoso el manejo en muchas especies hortofrutícolas. La
polinización y la fertilización aumentan el nivel de fitohormonas en el ovario,
estimulan la división celular y permiten el cuajado del fruto y su crecimiento.
Los métodos asequibles para producir frutos partenocárpicos han sido la utilización de fitorreguladores, la disponibilidad de mutantes o la obtención de plantas con un nivel de ploidía alterado. Se sabe que el óvulo en desarrollo es una
fuente de la fitohormona auxina, y que la aplicación exógena de esta hormona
puede reemplazar al óvulo para mantener el crecimiento del fruto. Con el propósito de obtener frutos partenocárpicos la práctica ha consistido en tratar las
yemas florales con fitorreguladores. Esta práctica, además de ser costosa, utiliza
productos sintéticos que son rechazados por el consumidor. Por tanto, un aumento de la síntesis endógena de auxina en el óvulo durante las primeras fases
del desarrollo floral y del crecimiento del fruto puede ser suficiente para mantener el cuajado y crecimiento del fruto sin polinización. La construcción quimérica utilizada en la transformación incluía el gen iaaM de Pseudomonas
sy-ringae pv. savastanoi, y el promotor del gen DefH9 de Antirrihinum majus.
El producto del gen iaaM cataliza la síntesis de indolacetamida, que es un
compuesto precursor de la hormona auxina, y el promotor de DefH9 incluía las
secuencias reguladoras que controlan la expresión del gen en óvulo. La especie
transformada con esta construcción quimérica fue la berenjena. Las plantas
trans-génicas sin polinizar producen frutos partenocárpicos con propiedades y
apariencia normales.
3.4.4.
Extensión de la vida post-cosecha
La apariencia externa es un elemento de calidad esencial para el consumidor al ser uno de los primeros factores que determinan su elección. Sin embargo, todo producto en su recorrido desde el campo hasta el consumidor sigue una
serie de pasos que incluyen la recolección, el transporte, la conservación y la distribución, que pueden dañar de una u otra forma al fruto. Es más, la posibilidad
de almacenar un fruto por periodos prolongados sin deterioro aparente del mismo es una cualidad añadida que busca el consumidor. No en vano éste ha sido
uno de los primeros logros de la biotecnología de plantas en lo que se refiere al
aumento de la calidad de los productos.
El fruto recolectado es un órgano vivo que aún respira y que se encuentra
en un estado de senescencia cuyo destino final es la dispersión de las semillas
que permitirá la propagación y supervivencia de la especie. Este estado de senescencia es continuación del estado anterior de maduración de los frutos y, en
APLICACIONES BIOTECNOL6GICAS PARA LA MEJORA DE LA CALIDAD...
137
cierto modo, esUin regulados de forma conjunta. En much os frutos, los denominados climatericos, hay una hormona vegetal, el etileno, que inicia y contribuye
al desarrollo de los procesos fisiologicos que tienen lugar en este organo durante
su maduracion y senescencia. De esta forma, controlando la produccion endogena de etileno en un truto se podrfa controlar el proceso de maduracion y senescencia, y consecuentemente todos los cambios inherentes a estos procesos.
Este control pOl' etileno ha permitido que frutos tfpicamente climatericos como
el pl<itano se hay an podido recolectar en estadios previos a su maduracion, siendo esta inducida en el fruto almacenado en una atmosfera con etileno 10 que permite su maduracion separado de la planta. La ruta metabolica de produccion de
etileno es relativamente simple pues se inicia en el aminoacido metionina y en
tres pasos metabolicos se produce el etileno (Fig. 3). Los dos ultimos pasos estan catalizadas por las enzimas ACC sintasa y ACC oxidasa. Se han realizado intentos de manipulacion de estas enzimas pOl' ingenierfa genetica, es decir inhibiendo su actividad en plantas transformadas con los genes antisentido. Sin
embargo, al ser esta hormona importante en otra serie de procesos fisiologicos
la supresion completa de su sfntesis endogena no es siempre la mejor solucion.
Mejores resultados se consiguen cuando solo se suprime parcialmente la sfntesis del etileno. Con tal proposito se han utilizado genes que producen enzimas
que degradan intermediarios de la sfntesis del etileno. Entre estos esta el gen
que codifica la actividad ACC desaminasa de la bacteria del suelo Pseudomonas (Fig. 3). La red uccion del etileno en las plantas transgenicas de tomate que
ACCdeaminasa
(Pseudomonas)
Adenosina
I
H
S-adenosilmetionina
.
ACC
,,,
,
CO 2 +NH 3
+HCOOH
Figura 3. Ruta biosintetica del etileno en tejidos vege tales a partir del precursor S-adenosilmetio nin a.
La enzima ACCdeam in asa no es vegetal, sino de Pseudomonas. ACC: acido aminociclopropano carboxflico.
138
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
sobreexpresaban este gen bacteriano no causaron ninguna anormalidad aparente en la planta, pero los frutos maduraron más tarde y permanecieron firmes,
una vez recolectados, al menos 6 semanas más que los frutos no transgénicos.
En otros casos, la mejora en la conservación del fruto recolectado no se ha
realizado modificando genes cuyos productos son importantes en el control del
proceso, tal como los que alteran la síntesis de etileno, sino teniendo como dianas genes cuyos productos participan en los procesos finales de la senescencia
del fruto. La maduración y senescencia de los frutos va acompañado de un reblandecimiento de los mismos, lo que es una de las principales causas de su deterioro en las manipulaciones que sufre durante y tras su recolección. Este reblandecimiento se produce, mayoritariamente, como consecuencia de la
degradación de las paredes celulares del fruto. La degradación de las paredes
es, a su vez, una consecuencia de la acción de enzimas hidrolíticas tales como la
poligalacturonasa, la endoglucanasa, la pectato liasa, la pectin esterasa, la
ga-lactosidasa, que catalizan la degradación de los componentes de la pared
celular. Así pues, la modificación de estas actividades en frutos se ha intentado,
con diferente éxito, como otra alternativa para extender su vida postcosecha.
En tomates, ya hay variedades transgénicas comercializadas desde hace años
donde la actividad poligalacturonasa endógena se ha reducido a menos del 1%
de su valor en frutos normales, utilizando el silenciamiento del gen endógeno.
Esta variedad transgénica produjo frutos de tomate más resistentes al daño
mecánico. Indirectamente también se produjo una mejora en el sabor y la
calidad, concretamente cuando se utilizada para producir pastas de tomate,
pues el contenido de sólidos solubles fue superior al del tomate sin
transformar. En tomate también se han producido plantas transgénicas con
niveles disminuidos de otra de las enzimas hidrolíticas, la pectin esterasa. En
conjunto, los resultados no han sido completamente satisfactorios en lo que se
refiere al control completo del reblandecimiento, sin duda alguna por la
complejidad de la pared celular y la ausencia de un conocimiento exhaustivo
sobre su degradación durante la maduración del fruto. Lo que sí es cierto es
que el proceso de hidrólisis de los componentes de las paredes celulares puede
variar según las especies, pues si la poligalacturonasa es importante en tomate,
parece que no interviene en otro fruto como es la fresa. En este fruto un papel
más relevante lo desempeñan otras enzimas hidrolíticas tales como la pectato
liasa, las endocelulasas y, posiblemente, la expansina, que no es una enzima
hidrolítica.
3.4.5.
Cambios en el tamaño del fruto
Entre los elementos de apariencia externa que determinan la elección por
el consumidor de forma importante está el tamaño del fruto. Esto lo conocen desde hace tiempo tanto los agricultores, en especies tales como las manzanas, las
peras, los cítricos, etc., como los responsables de las cadenas de distribución. De
APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA LA MEJORA DE LA CALIDAD...
139
esta forma, los programas de mejora de estas especies han ido seleccionando variedades de mayor aceptación. En algunos casos se busca aumentar el tamaño, al
ser éste un carácter asociado a la sanidad del producto, y en otros casos lo que se
busca es disminuir el tamaño, al constituir un elemento de calidad. Esto último
puede ser importante en la industria de transformación donde se valora positivamente la presencia de los frutos enteros, o al menos fragmentos identificables
de los mismos, que se utilizaron en la preparación de la pasta o mermelada. Los
principales intentos de manipulación del tamaño se han hecho buscando alterar
en la planta las relaciones fuente-sumidero. En las plantas hay tejidos que son
exportadores netos de carbohidratos (fuente) o importadores netos (sumidero).
La capacidad de un tejido que es sumidero de retirar y metabolizar
fotoasimila-dos, en competición con los otros sumideros de la planta, influencia
de forma importante el tamaño final del sumidero. En la mayoría de las plantas
de interés agrícola el producto final de la fotosíntesis en los órganos/tejidos
fuente es la sacarosa, siendo este compuesto la forma de distribución de
carbohidratos dentro de la planta. La sacarosa que llega al órgano sumidero es
hidrolizada por la acción de la invertasa o por la actividad sacarosa sintasa,
dependiendo de la especie vegetal de que se trate (Fig. 2). Modificando estas
actividades se podría modificar la fuerza como sumidero de un órgano y
consecuentemente su tamaño, como se ha conseguido en patatas que, aunque no
es un fruto, es un sumidero con características comparables a los frutos en
algunos aspectos. En esta especie la actividad de hidrólisis de la sacarosa en el
tubérculo se debe a la sacarosa sintasa. Por este motivo se transformó esta
especie de forma que sobreexpresara una invertasa procedente de otro
organismo como la levadura. La transformación se hizo utilizando un promotor
específico de tubérculo (promotor de la patatina clase I, B33) de manera que la
expresión del transgén solo ocurriera en este órgano. Con este promotor se
utilizaron dos construcciones alternativas de invertasa que determinaban que la
expresión ocurriera en citosol o en el apoplasto. Aunque hay evidencia de que
el suministro de sacarosa desde el floema a las células del parénquima de
almacenamiento de los tubérculos ocurría de forma directa célula a célula a
través de los plasmodésmos (vía simplástica), no se desechaba la posibilidad de
algún suministro de sacarosa por la vía extracelular (vía apo-plástica). El
resultado es que las plantas transgénicas de patata con mayor actividad
invertasa citosólica reducían el tamaño del tubérculo, lo que se compensaba
con un mayor número de tubérculos por planta. Por el contrario, la invertasa
aumentada en el apoplasto tenía como consecuencia un mayor tamaño del tubérculo y un menor número de éstos por planta.
3.4.6.
Mejora en la calidad para el procesado
Aunque ya se han indicado algunos casos donde el uso de la ingeniería genética en plantas ha afectado las propiedades del fruto para su procesamiento
140
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
(pastas de tomate con mayor contenido de sólidos solubles, frutos con menores
tamaños), hay casos donde el objetivo primario la sido la mejora del producto
para su procesamiento. Así, las proteínas del gluten del trigo tienen unas propiedades biomecánicas poco corrientes que le confieren una elasticidad y una
extensibilidad (viscoelasticidad) a la masa preparada a partir de este cereal. Esto
le permite ser un ingrediente importante no sólo en la preparación del pan,
sino en otros muchos productos entre los que se encuentran los bizcochos y diversos tipos de pasta. En cada caso se requiere un balance preciso de elasticidad
y extensibilidad. El gluten es una mezcla compleja de más de 50 proteínas, siendo la mayoría pertenecientes al grupo de las prolaminas. Entre éstas hay un grupo que son especialmente importantes en determinar la elasticidad pues forman
polímeros de alto peso molecular (por encima de 1 x 106 kDa) que están estabilizados por enlaces disulfuros. Se han identificado seis genes correspondientes
a esas prolaminas de alto peso molecular. Cada una de estas proteínas representa el 2% del total de proteínas del grano, por lo que una variación cuantitativa en cualquiera de ellas afecta las propiedades de la masa obtenida a partir
del grano. La transformación del trigo con genes adicionales correspondientes
a estas proteínas del tipo prolaminas de alto peso molecular ha permitido obtener variedades transgénicas con diferentes valores de elasticidad de la masa preparada a partir del grano de cereal transgénico. Este caso es una muestra de mejora de propiedades del cultivo para su procesamiento posterior, al variarse las
propiedades funcionales de la masa obtenida a partir de la harina de un grano
con diferente contenido de prolaminas.
3.4.7.
Plantas ornamentales
Dentro del mundo de la producción agrícola el mercado de plantas con fines puramente ornamentales ocupa un lugar cada vez más importante, sobre todo en las sociedades desarrolladas. En este campo la mejora tradicional ha sido
capaz de desarrollar miles de variedades con una amplia gama de formas, colores y arquitecturas. Sin embargo, el proceso ha sido lento y la Biotecnología ha
irrumpido en algunos de los aspectos de la mejora de estas especies ornamentales. Concretamente dos aspectos han sido mejorados, uno se refiere al color
de las flores y otro a su conservación después de cortada.
Las antocianinas constituyen el pigmento más común de los pétalos y sépalos de las flores, en tonos de colores que varían desde el rojo al azul. El color
está determinado por las cadenas laterales de las estructuras de estas antocianinas, desde los derivados de cianidina que dan color rojo intenso hasta los derivados de delfinidina que dan color azul. Las antocianinas son sintetizadas a
partir del aminoácido fenilalanina en una ruta metabólica bien conocida. El conocimiento de esta vía metabólica en diversas especies permitía la posibilidad
de su manipulación por transgénesis y, consecuentemente, la generación de pro-
APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA LA MEJORA DE LA CALIDAD...
141
duelos finales diferentes. El caso más conocido se ha presentado en petunia. En
esta especie una de las enzimas de la vía metabólica, la dihidroflavonol
reduc-tasa (DFR) produce los derivados de cianidina y delfidina, lo que
determina que en estas especies se produzcan flores rojas y azules. Sin embargo,
se conocía que un gen DFR de maíz favorecía la formación de derivados de
pelargonidina, que dan un color rojo-ladrillo. Al transformar petunia con esta
DFR de maíz se obtuvieron flores de este color rojo-ladrillo, no naturales en la
especie.
El 70% del comercio de flor cortada a escala mundial está ocupado por cuatro especies: rosas, claveles, tulipanes y crisantemos. Un elemento de calidad indiscutible en estas especies es la longevidad de las flores una vez en el mercado.
En términos fisiológicos se trataría de inhibir o retrasar la senescencia de los órganos y tejidos florales, proceso que se acelera cuando la flor se separa de la
planta. Al igual que en frutos, las especies se consideran climatéricas o no climatéricas en función de que la hormona etileno ejerza una función iniciadora y
reguladora del proceso de senescencia de la flor. En este sentido hay que indicar que hay algunas variedades de rosa y, sobre todo, de claveles que son muy
sensibles a pequeñas concentraciones de etileno, endógeno o exógeno. La práctica comercial ha utilizado, y aún utiliza, con éxito el tratamiento con tiosulfato
de plata que es un inhibidor de la acción del etileno, pues llega a prolongar la
vida comercial de los claveles hasta 2-3 veces. Sin embargo, la alta toxicidad de
este compuesto y la preocupación medio-ambiental obligan a buscar alternativas a esta práctica comercial. La aproximación biotecnológica ha sido, como se
ha hecho en frutos, el control de la producción de etileno endógeno en este órgano. Así se han obtenido plantas transgénicas de clavel portadoras del gen antisentido de la ACC-sintasa (Fig. 3). La producción endógena de etileno disminuye significativamente en algunas líneas transgénicas que aumentaron su valor
comercial al prolongar su frescura por periodos superiores al de las variedades
no transformadas.
3.4.8.
Perspectivas
Los párrafos precedentes de este capítulo han ido desgranando diversas
aplicaciones de la Biotecnología de Plantas dirigidas a una mejora de la calidad
del producto. En ellos se ha podido constatar que dichas mejoras han beneficiado a diferentes sectores implicados en la utilización por el ser humano de la
riqueza vegetal de la biosfera. Hay mejoras que han beneficiado al distribuidor
al aumentar la vida postcosecha, otras al que procesa los alimentos como la preparación de pastas de tomate, la obtención de frutos más pequeños o de trigos
mejorados para la preparación de masas, pero la gran mayoría han ido dirigidas
a la mejora del producto para el consumidor. En todos los casos se ha beneficiado el agricultor al disponer de variedades con propiedades mejoradas para
el consumo y, por tanto, más valiosas. Sin embargo, no ha sido la búsqueda de la
142
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
calidad el factor más importante en el desarrollo de la Biotecnología. Esta tendencia parece estar cambiando, debido fundamentalmente a la presión social.
La pauta la marcarán, como ha sido hasta ahora, los movimientos sociales de los
países desarrollados. En este contexto es donde hay que situar las perspectivas
del futuro de esta tecnología aplicada al mundo vegetal. Parece más que probable que el énfasis continúe en el desarrollo de nuevos productos cuyos primeros
beneficiarios sean los consumidores de estas sociedades desarrolladas. Es decir,
el factor calidad será esencial. Hay aspectos de esta calidad como son el de las
propiedades organolépticas de los productos que se exigen de forma inmediata, pero cuya posibilidad técnica está lejos en estos momentos. Pero hay otros
elementos de calidad, como aquellos que sean compatibles con un desarrollo
sostenido y con respeto al medio ambiente, que ya se están abordando. Los que
mueven el motor de la Biotecnología deberán pensar en nuevos productos con
beneficios incuestionables en lo que se refiere a la salud, el medio ambiente y la
conservación de la biodiversidad. El nuevo contrato social entre investigadores
y sociedad, que propugna ésta, marcará de forma importante los nuevos avances de la Biotecnología que, sin duda, veremos aflorar en los próximos años.
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
BROWER, V. 1998. «Nutraceuticals: poised for a healthy slice of the healthcare market?». Nature
Biotech. 16: 728-731.
CONWAY, G., y TOENNIESSEN, G. 1999. «Feeding the world in the twenty-first century». Nature. 402 (Supp):C55-C58.
GLICK, B.R., y PASTERNAK, J.J. 1998. «Genetic engineering in plant: applications. En: Molecular Biotechnology, pp. 445-478. ASM Press.
KISHORE, G.M,. y Shewmaker, C. 1999. «Biotechnology: Enhancing human nutrition in developing and developed countries». Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 96: 5968-5972.
3.5.
3.5.1.
LAS PLANTAS COMO BIOFACTORIAS*
Introducción
Las plantas han sido desde siempre, y especialmente desde el desarrollo de
la agricultura, fuente de alimentos, combustible y fibras para los seres humanos.
Los recientes avances en la manipulación in vitro del ADN y en la transformación
y regeneración de diferentes especies vegetales han permitido la creación de plantas transgénicas con modificaciones en su genoma que incrementan su utilidad.
La mayor parte de los esfuerzos iniciales han ido encaminados al desarrollo de
plantas con características agronómicas mejoradas: plantas tolerantes a herbicidas, y resistentes a insectos y virus, fundamentalmente. Sin embargo, ha habido
también abundantes abordajes, alguno llevado con éxito hasta la etapa de comercialización, encaminados a mejorar de alguna forma el producto extraído de
la planta (tomates de maduración retrasada, lípidos con contenidos en ácidos grasos modificados, patatas más ricas en almidón, etc.). Yendo aún más lejos, dadas
las claras ventajas de las plantas sobre otros sistemas en cuanto a economía de
costes de producción y a reducidos riesgos de toxicidad, es posible pensar en las
plantas como factorías en las que producir diferentes compuestos de interés, parcialmente o totalmente ajenos a ellas. En este sentido, existen ya evidencias sólidamente documentadas sobre la posibilidad de producir en plantas enzimas industriales, plásticos fácilmente biodegradables, antígenos para vacunas, anticuerpos
para inmunoterapia pasiva, otros péptidos de uso farmacéutico, etc
Los primeros compuestos que se están produciendo en plantas son enzimas
de aplicación industrial. Muchos procesos industriales que pretenden explotar
productos específicos de plantas se enfrentan a la necesidad de degradar grandes polímeros para incrementar la accesibilidad de los compuestos deseados y
para facilitar la eliminación de los residuos celulares. Por esta razón, muchos
abordajes para producir proteínas de uso industrial en plantas se están centrando
en enzimas que degradan paredes celulares, almidón o fitato. Así, hay numerosos proyectos encaminados a la producción de amilasas, glucanasas, quitinasas,
xilanasas o fitasas. Además, éstas son proteínas que no precisan para su uso de
* Juan Antonio García Álvarez. Centro Nacional de Biotecnología (CSIC). Campus
de la Universidad Autónoma de Madrid. 28049 Madrid.
144
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
un alto grado de pureza, por lo que se aprovecha ampliamente la ventaja del bajo coste de producción en plantas, que se perdería en caso de ser necesarios costosos procesos de purificación de las sustancias deseadas. Hay otras proteínas
de aplicación industrial que se están empezando a producir en plantas transgénicas. Así, dos proteínas producidas en maíz que se espera sean comercializadas
próximamente son la avidina de pollo y la (3-glucuronidasa de Escherichia coli.
La otra gran ventaja de las sustancias producidas en plantas es la seguridad
sanitaria derivada de la ausencia de agentes infecciosos u oncogénicos que pueden contaminar cultivos animales o bacterianos. Es por ello que hay un creciente interés en la producción en plantas de polipéptidos de aplicación farmacéutica tales como factor de crecimiento epidérmico, eritropoyetina, interferón,
proteína C humana, glucocerebrosidasa humana etc. Se está dedicando una atención especial a la producción en plantas de antígenos y anticuerpos para inmunización activa y pasiva, respectivamente. Por motivos de claridad y ahorro de
espacio, este artículo se centrará en la revisión de los esfuerzos que se están realizando en este último campo, aunque mucho de lo que se discuta aquí podría
ser aplicable a la producción en sistemas vegetales de otras sustancias de interés.
3.5.2.
Sistemas de expresión en plantas
Existen dos estrategias generales para obtener en plantas productos de interés (Fig. 1). Una es la ya mencionada transformación genética del genoma de
las plantas, mediante el uso del plásmido Ti de la bacteria Agrobacterium
tume-faciens o por otros métodos, que da lugar a plantas transgénicas que
producen el compuesto extraño en el contexto general de la expresión génica
de la planta. La segunda consiste en la expresión transitoria del gen heterólogo
mediante el uso de vectores extracromosómicos; para este objetivo se están
empleando actualmente vectores virales, pero resultados recientes sugieren que
A. tumefa-ciens puede ser también útil para este tipo de abordaje. Las
principales ventajas de las plantas transgénicas son la posibilidad de transmitir,
por propagación vegetativa o sexual, el carácter adquirido a sucesivas
generaciones después de seleccionar líneas con altos niveles de expresión, y la
capacidad de producir más de una proteína foránea mediante cruces genéticos
de diferentes plantas transgénicas. Por otra parte, no parece haber límites a la
capacidad codificante del gen transferido. Como contrapartida, la generación de
plantas transgénicas transformadas de manera estable requiere una
considerable inversión en tiempo y esfuerzo, sobre todo teniendo en cuenta el
elevado número de líneas transgénicas que hay que analizar a causa en la
extrema variabilidad de fenotipos que resultan de cada ensayo de
transformación. Además, la capacidad de transformación y regeneración varía
mucho no sólo entre diferentes especies, sino incluso entre variedades de una
misma especie, de forma que desarrollar un procedimiento eficiente de
transformación para una determinada planta puede resultar muy complicado,
cuando no imposible.
LAS PLANTAS COMO BIOFACTORfAS
145
Las principales ventajas de replicones basados en virus respecto a las plantas
transgenicas son,junto con la mayor sencillez y rapidez experimental, la expectativa de mayores niveles de produccion de la protefna heterologa, por ser muy alto el numero de copias genomicas que la codifican, y la posibilidad de inducir su
expresion en una fase precisa del desarrollo de la planta, eligiendo el momenta
de inoculacion del vector viral que se considere oportuno. Esto podrfa permitir la
produccion de compuestos toxicos 0 dafiinos, que impedirfan la germinacion y deB
A
Transformacion
Vectores de expresi6n basados en virus
Agrobacterium tllmefaciells
~
T i
gen herer61ogo expresado
Secuencia hetcr610ga
fusion ada a sccucnClas
virales
como producto
indepcndiente
1
planta infectada
planta transgenica
1
• •
••
•
••••
Proteil1a heter610ga
1
Virion
•
•
• ••
•
Proteina heter610ga
Virion
presentando
secuencias
heter610gus
Figura I. Expresi6n de proteina heter6 logas en plantas. A) Construcci6n de plantas transgenicas par
transformaci6n con Agrobacteriwn tumefaciens (tambien existen metodos para transformaci6n con ADN
desnudo). B) Estrategias para expresi6n mediada por factores virales. Otras estrategias para expresi6n
transitoria en plantas se describen en el texto. Figura tomada de M. Fernandez Fernandez . Tesis doctoral. Universidad Aut6noma de Madrid , 1999.
146
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
sarrollo de las plantas transgénicas que los sintetizaran de manera constitutiva.
Es importante destacar, sin embargo, que el reciente desarrollo de promotores de
planta inducibles, permite actualmente generar plantas transformadas con transgenes que codifican a proteínas tóxicas, que sólo se producen cuando se añade el
inductor apropiado. Otra ventaja de los vectores de expresión virales es el amplio
espectro de huéspedes de muchos virus y la disponibilidad de muchos virus con
diferentes espectros de huéspedes, de manera que casi cualquier planta podría ser
infectada por algún vector viral. Por contra, la capacidad de información genética extraña que pueden incorporar los vectores virales parece ser bastante reducida, y cuando se quiere expresar más de un producto extraño es necesario diseñar
estrategias especiales, cuyas expectativas de éxito disminuyen drásticamente cuando aumenta el número de genes foráneos a expresar.
3.5.3.
Plantas transgénicas
Probablemente la obtención de vacunas destinadas a la prevención de enfermedades animales y humanas constituya el área más competitiva de la producción de proteínas xenogénicas en plantas. Aunque la primera demostración
de que una vacuna producida en plantas podía ser efectiva empleaba un antígeno expresado con un vector viral (se discutirá en el siguiente apartado), la mayor parte de los estudios más avanzados acerca de la producción de antígenos
en plantas para producir vacunas se han hecho en plantas transgénicas (tabla 1).
En los primeros trabajos, los antígenos de interés se produjeron en plantas
de tabaco, debido a su facilidad de transformación y regeneración. Sin embargo, como el objetivo final es la obtención de vacunas comestibles, y las hojas de
tabaco contienen alcaloides tóxicos, se ha pasado a utilizar plantas más apropiadas, también relativamente fáciles de transformar, como la patata. También
se empiezan a describir trabajos que emplean plantas perennes, como la alfalfa,
que permiten una producción estable y continua del antígeno de interés.
Se necesita superar varios listones para crear una vacuna basada en plantas con
valor comercial. En primer lugar, es necesario producir en la planta suficiente cantidad del antígeno elegido. En segundo lugar, este antígeno debe estimular una respuesta adecuada de anticuerpos en el huésped tratado. En tercer lugar, la respuesta de memoria del antígeno debe ser capaz de proteger al huésped frente a la
inoculación del patógeno. Finalmente, es necesario incrementar la escala de producción y procesar de manera adecuada el producto para su comercialización. Se
han descrito bastantes casos de producción en plantas de antígenos capaces de inducir anticuerpos específicos cuando se les administraba por vía parenteral a animales de experimentación. En algunos casos se ha comprobado que estos animales
adquirían niveles de protección, más o menos significativos, frente al patógeno correspondiente. Sin embargo, el objetivo fundamental de expresar antígenos en plantas es producir vacunas activas por vía oral. Los patógenos responsables de la mayoría de las enfermedades infecciosas entran en contacto con su huésped a través
TABLA 1
Vacunas y anticuerpos producidos en plantas transgenicas
Antígeno
Anticuerpo
CP del virus de Norwalk
GlicoproteínaSdeTGEV
Planta huésped
Vía de
administración
Organismo
ensayado*
Tabaco
Patata
Intubación gástrica
Alimentación
Ratón
Efecto
IgGs** en suero e IgAs en mucosas
Maíz
Alimentación
ND
En progreso
Arabidopsis
Parenteral
Ratón
Anticuerpos neutralizantes en suero
(sin especificar clase)
Patata
Alimentación
Ratón
Anticuerpos no neutralizantes en suero
(sin especificar clase)
Arabidopsis
Parenteral
Ratón
ti >
Alfalfa
Alimentación
Anticuerpos en suero (sin especificar clase).
Protección frente a FMDV
ProteínaVP60deRHDV
Patata
Parenteral
Conejo
Anticuerpos en suero (sin especificar clase).
Protección frente a RHDV
O
O
Subunidad B de la toxina
del cólera
Patata
Alimentación
Ratón
Anticuerpos en suero (IgGs, IgAs e IgMs) y en
mucosas (IgGs e IgAs). Protección frente a toxina
del cólera
O
Subunidad B de la
entero-toxina LT de E. coli
Patata
Proteína VP1 de FMDV
Hepatitis B
Alimentación
Ratón
IgGs en suero e IgAs en mucosas. Protección
frente a toxina LT
Humano
ASCs. Anticuerpos neutralizantes en el suero
(IgGs e IgAs) e IgAs en mucosas
IgGs en suero
Callo de altramuz
Alimentación
Ratón
Lechuga
Alimentación
Humano
Patata y tabaco bajo en
alcaloides
Alimentación
Ratón
Atenuación y retraso del desarrollo de
la enfermedad
mAb contra HSV-2
Soja
Tópico
Ratón
Protección
SIgA/G contra
Streptococcus mutans
Tabaco
Tópico
Humano
Protección
MAb contra IgGs
Alfalfa
In vitro
Humano
Herramienta de diagnóstico
Auloantígenos causantes de
diabetes
* El organismo ensayado no es siempre el sujeto real de la enfermedad. ** Igs en este apartado siempre se refiere a Igs específicas del antígeno administrado. ND: no descrito. Mab: anticuerpo monoclonal. Ig: inmunoglobulina. SIg: inmunoglobulina secretable. CP: proteína de la cápsida. ASC:
células intestinales secretoras de anticuerpos. HSV-2: virus herpes simplex 2.TGEV: virus de la gastroenteritis porcina transmisible. FMDV: virus
de la fiebre aftosa. RDHV: virus de la enfermedad hemorrágica de los conejos.
>
2
2o
o
o
2
148
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
de una mucosa, ya sea del tracto respiratorio, gastrointestinal o genital. Por ello, es
especialmente deseable el desarrollo de una respuesta inmune, de fuerza y calidad
suficientes para proteger frente a la enfermedad, en estos sitios de entrada. Dado
que la inmunización parenteral raramente induce respuesta inmune en mucosas,
mientras que la inmunización en mucosas puede inducir tanto respuesta inmune humoral y celular sistémica como respuesta inmune local, el segundo tipo de administración del antígeno es, en general, preferible. Además, la administración oral de
vacunas es más económica y más segura desde el punto de vista sanitario (jeringas
y agujas son caras y, si no se mantiene su esterilidad, pueden ser vehículos de entrada de graves enfermedades). Sin embargo, los antígenos no vivos administrados
por vía oral son normalmente poco inmunogénicos. De hecho, la respuesta por defecto del sistema inmune intestinal a los antígenos de la comida es la tolerancia. Esta
tolerancia oral evita el desarrollo de respuestas inmunes indeseadas frente a los
alimentos que ingerimos. Sin embargo, la respuesta inmune a las vacunas clásicas
que se administran por vía oral y a ciertas toxinas bacterianas demuestra que no todos los antígenos ingeridos se perciben por el sistema inmune como comida. Las
su-bunidades B de la toxina del cólera (CT-B) y de la enterotoxina lábil al calor de
E. coli (LT-B) continúan siendo inmunogénicas, aunque carecen de toxicidad. La
administración a ratones por vía oral de patatas transgénicas que producen estas
proteínas inducía el desarrollo de anticuerpos tanto en el suero como en la mucosa
del intestino. Se comprobó, además, que los animales inmunizados mostraban
cierta protección frente a las toxinas activas. En el primer estudio en humanos de
una vacuna hecha en plantas, voluntarios adultos ingirieron patatas transgénicas que
contenían proteína LT-B. Se observó, en el intestino de los individuos tratados, la
aparición de células secretoras de anticuerpos (ASC), típicas de la activación del
sistema inmune en mucosas, específicas del antígeno administrado. Los sueros de la
mayoría de los individuos inmunizados contenían IgGs e IgAs específicas y
mostraban capacidad neutralizante. Además, se pudo detectar la presencia de
IgAs en las heces del 50% de los voluntarios que ingirieron las patatas
transgénicas.
En principio se pensó que los positivos resultados de las inmunizaciones con
LT-B y CT-B podían deberse a su especial capacidad para inducir respuesta inmune en el aparato digestivo. Sin embargo, se ha comprobado que otras proteínas son
también capaces de inducir una respuesta inmunológica local y sistémica cuando
se administran por vía oral como parte de una planta transgénica. Este es el caso
de proteínas estructurales de otros agentes infecciosos que causan diarreas, como
el virus de Norwalk y el virus de la gastroenteritis porcina transmisible (TGEV),
pero también el de proteínas de virus cuya actividad infecciosa no se centra en el
aparato digestivo, como el virus de la fiebre aftosa (FMDV) y el de la hepatitis B.
Como he mencionado más arriba, un antígeno administrado oralmente puede, en lugar de estimular una respuesta inmunológica en su contra, generar tolerancia. Se ha demostrado que, explotando esta propiedad, es posible usar plantas transgénicas en la terapia de enfermedades autoinmunes. La ingestión
LAS PLANTAS COMO BIOFACTORÍAS
149
continuada de tabaco o patatas transgénicas que expresan descarboxilasa del
ácido glutámico (un autoantígeno relacionado con diabetes) a ratones NOD
(diabéticos no obesos) impedía, en la mayoría de los casos, la aparición de la enfermedad. Un estudio semejante mostraba una reducción sustancial de la inflamación de los islotes del páncreas y un retraso de la progresión de la diabetes
clínica en ratones NOD que habían sido alimentados con patatas que expresaban una proteína de fusión de la insulina y la proteína CT-B.
Otra aplicación de las plantas transgénicas, cuya utilidad aparece cada vez
más clara, es la producción de anticuerpos para ser usados en inmunoterapia pasiva o en diagnóstico. Son muchos los casos descritos de producción en plantas
transgénicas de minianticuerpos que constan de una única molécula formada
por la fusión, mediante un péptido flexible, de los dominios variables de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo (scFv). Estos scFvs pueden tener interés
por su actividad dentro de la planta que los produce, aumentando su resistencia
a patógenos o modificando sus propiedades fisiológicas, o por aplicaciones en
otros sistemas de su capacidad de reaccionar con su molécula diana.
En general, sin embargo, es preferible la expresión de anticuerpos completos,
debido a la presencia de dos dominios de unión, sobre todo si se requiere una inactivación muy eficiente de la proteína diana. La necesidad de introducir dos genes,
los que codifican a las cadenas ligera y pesada, dificulta la obtención de plantas
transgénicas que expresen anticuerpos completos. Sin embargo, se ha comprobado que transformando de manera independiente con los dos genes y cruzando
se-xualmente las plantas resultantes es posible obtener plantas que produzcan
abundantemente el anticuerpo funcional procesado y plegado correctamente.
La glicosilación del anticuerpo producido en plantas difiere algo de la de la
molécula producida en células de mamífero, sin embargo ésto no parece afectar a
la actividad del anticuerpo ni conferirle propiedades alergénicas preocupantes.
Por otra parte, la forma de anticuerpo más abundante en las secreciones de las
mucosas, la principal barrera defensiva contra la entrada de patógenos al organismo, es la conocida como inmunoglobulina A secretable (SIgA). Las SIgAs son complejos proteicos constituidos por dos moléculas de IgA (cada una formada por una
cadena ligera y una pesada) unidas por el péptido J que hace de cadena entre ambas, y un cuarto polipéptido, el componente secretor (SC). La síntesis de estas moléculas en el aparato digestivo es complicada, ya que necesita células plasmáticas
que secretan la forma dimérica de IgAs, y células epiteliales que expresan un receptor de Igs y llevan a cabo un elaborado proceso que comienza con la
endocito-sis de los dímeros de IgA y acaba con la liberación del complejo SIgA. Se
ha comprobado que es posible ensamblar en plantas transgénicas complejos
SIgA funcionales, en concreto una SIgA/G (la Ig es híbrida entre A y G) que
reconoce a la proteína de adhesión de la superficie celular de Streptococcus mutans
(Fig. 2). Para ello, se generaron cuatro plantas transgénicas de Ñicotiana tabacum
que expresaban una cadena ligera kappa y una cadena pesada híbrida yl-a de un
anticuerpo
150
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
monoclonal de ratón, un péptido J también de ratón y una proteína SC de conejo.
Por medio de cruces sexuales sucesivos fue posible obtener una planta transgénica
que expresaba los cuatro polipéptidos y era capaz de ensamblarlos en complejos
funcionales. Los primeros ensayos en voluntarios humanos han demostrado la capacidad de estos anticuerpos producidos en planta de impedir la colonización de
dientes y encías por S. mutans, el mayor agente causante de caries dental.
Otro trabajo publicado describe la producción en soja transgénica de un anticuerpo monoclonal humanizado contra el virus del herpes simplex 2 (HSV-2).
Los anticuerpos purificados de las plantas eran similares a los procedentes de
cultivos celulares humanos en cuanto a capacidad de neutralización del virus,
estabilidad en semen o mucus cervical humanos, y eficacia para prevenir infecciones vaginales por HSV-2 en ratón.
La inmunoterapia con anticuerpos producidos en plantas no tiene que reducirse al control de enfermedades infecciosas. Por ejemplo, existe un proyecto
en marcha para la producción en maíz de anticuerpos contra el semen, con posible utilidad como anticonceptivos.
Los anticuerpos producidos en plantas pueden tener aplicaciones distintas
a la inmunoterapia. Así, se ha descrito la producción en alfalfa de un anticuerpo monoclonal anti IgGs humanas. Este tipo de anticuerpos es de uso habitual
en los bancos de sangre para la detección de anticuerpos no aglutinantes. Los
autores del trabajo estiman que el precio del anticuerpo producido en plantas
puede descender a 500 euros por gramo, frente a los 5.000 Euros por gramo del
anticuerpo producido con el sistema actual de hibridomas.
3.5.4.
Vectores de expresión transitoria
El uso de virus de plantas como vectores de expresión ha suscitado desde
hace tiempo un considerable interés tanto científico como comercial. La tabla 2
resume algunos casos de expresión de antígenos y anticuerpos en plantas usando vectores virales.
La posibilidad de utilizar técnicas de ingeniería genética directamente sobre ADN convirtió a los virus con este tipo de genomas en los primeros candidatos para ser usados como vectores de expresión. Sin embargo, el escaso número de virus de plantas con genomas ADN y sus restringidos espectros de
huéspedes, junto con sus estrictos requerimientos en tamaño y expresión
genó-micos, han limitado considerablemente la utilidad de estos virus para
producir en plantas productos foráneos.
Más del 80% de los virus de plantas tienen como genoma ARN de banda sencilla con polaridad de mensajero. Debido a la imposibilidad de usar técnicas de ingeniería genética directamente sobre el genoma de estos virus, no se creyó
inicial-mente que pudieran ser buenos vectores de expresión. Posteriormente se
comprobó que era posible clonar copias ADN de estos genomas ARN,
manipularlas adecúa-
LAS PLANTAS COMO BIOFACTORIAS
15 1
damente in vitro, y convertirlas de nuevo en ARN infeccioso por transcripci6n in
vitro, usando promotores de bacteri6fagos, 0 in vivo, usando promotores reconocidos por una ARN polimerasa de la planta. Esto ha permitido el desarrollo de vectores de expresi6n basados en un amplio numero de virus con genom a ARN.
Hay tres estrategias generales para la inserci6n de genes extranos en genomas virales: i) reemplazamiento genico, don de genes virales no esenciales son re -
(
/
ligera
pesada
IgA completa
cadena J.
IgA dlmerica
componente
secretor
IgA secretable
Figura 2. Cruces sexuales entre plantas transformadas con los genes de las cadenas ligera y pesada, cadena J y componente secretor para construir una planta que expresa IgA secretable completa. Figura
adaptada de Wh itelam y Cockburn, 1996. Trends in Plant Science 1: 268-272.
TABLA 2 Vacunas y anticuerpos producidos
en plantas con vectores de expresión transitoria
Antígeno
Anticuerpo
Vector
Planta huésped
Vía de
administración
Organismo
ensayado*
Proteína VP1 de FMDV
TMV
Nkotkna benthamkim
Parenteral
Ratón
Anticuerpos en suero (sin especificar dase). Protección
frente a FMDV
Péptido de la proteína VP2
deMEV
CPMV
Chícharo
Parenteral
Visón
Anticuerpos en suero (sin especificar clase). Protección
frente a MEV
Péptido de la proteína F de
Pseuioinonas «eruginosa
CPMV
Chícharo
Parenteral
Ratón
IgGs** en suero, atenuación de la enfermedad pulmonar
causada por P. aemgiimsa
Péptido de la proteína FnBP
de Staphilococcm auras
CPMV
Chícharo
Intranasal
Ratón
Suero con IgGs que inhibe la unión de fibronectina
humana a FnBP de 5. airas. IgGs e IgAs en mucosas
Péptido de la glicoproteína del
virus de la rabia
A1MV en
TMV
JV. bentkmkna
Parenteral
Ratón
Anticuerpos neutralizantes en suero (IgGs).
Protección frente a dosis letal del virus de la rabia
Intubación gástrica
Ratón
IgGs e IgAs en suero e IgAs en mucosas. Atenuación de
síntomas causados por virus de la rabia poco virulento
Ratón y conejo
Anticuerpos neutralizantes en suero (sin especificar clase)
Espinacas
Alimentación
JV. deveknáii
Parenteral
Efecto
Péptido de la proteína VP2
deCPV
PPV
Péptido de glicoproteína
gpl20 de HIV
TBSV
JV. bmthamkna
Parenteral
Ratón
Anticuerpos en suero (sin especificar clase)
Péptidos de la proteína CS de
Pksmoiium vivía ■jP.yoéi
TMV
Tabaco
Parenteral
Ratón
Anticuerpos en suero (sin especificar clase)
Péptido de la proteína ZP3 de
la zona pelúcida murina
TMV
Tabaco
Parenteral
Ratón
Autoanticuerpos detectados in vivo en la zona pelúcida de
animales inmunizados
ScFv derivado de un
linfoma de ratón
TMV
JV. bentkmknii
Parenteral
Ratón
IgGs en suero. Protección frente a una dosis letal de
células tumorales
O
w
o
o
o
o
>
r
ñ
>
>
>
o
2
o
¡
TABLA 2 (continuación) Vacunas y anticuerpos
producidos en plantas con vectores de expresión transitoria
Anlígeno
Anticuerpo
Vector
Planta huésped
Vía de
administración
ScFv contra herbicida
diuron
PVX
(«overcoat»)
¡V. demlanáü
In vitro
Mab contra un
antígeno de un
cáncer de colon
TMV
N. bmthamkiui
NE
ScFv contra un
antígeno
carcinoembriónico
humano
Agróbacie-rá
ffli
(agroinfil-tra
ción)
Tabaco
NE
Organismo
ensayado*
NE
NE
Efecto
>
Diagnóstico
>
NE
NE
* El organismo ensayado no es siempre el sujeto real de la enfermedad. ** Igs en este apartado siempre se refiere a Igs específicas del antígeno administrado. NE: no ensayado. Mab: anticuerpo monoclonal. Ig: inmunoglobulina. ScFc: minianticuerpo con las dos regiones variables en una sola
cadena. A1MV: virus del mosaico de la alfalfa. CPMV: virus del mosaico del chícharo. CPV: parvovirus canino. FMDV: virus de la fiebre aftosa. HIV:
virus de la inmunodeficiencia adquirida humana. PPV: virus de la sharka. TBSV: virus del achaparrado peludo del tomate. TMV: virus del mosaico
del tabaco.
O
O
o
S
2
n
o
5
154
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
emplazados por el gen de interés; ii) inserción génica, donde el gen extraño se expresa bajo el control de un promotor subgenómico adicional, o como parte de
una poliproteína de la que se libera por procesamiento proteolítico; y iii) fusión
génica, donde la secuencia proteica extraña se produce como un producto de fusión con una proteína viral. Son pocos los genes dispensables en virus con genoma ARN de plantas. En principio, es posible emplear abordajes de sustitución génica reemplazando genes indispensables, si su producto proteico se suministra en
trans en una planta transgénica. Aunque hay publicaciones que demuestran que
esta estrategia es factible, no se ha seguido en demasiados casos. Así, la inserción
génica es la estrategia que ha dado lugar a resultados más satisfactorios cuando
se pretendía expresar secuencias codificantes grandes. Las fusiones génicas se
han usado principalmente para incluir secuencias extrañas en la proteína de la
cápsida (CP) y han dado muy buenos resultados para la presentación de pequeños péptidos antigénicos en la superficie de las partículas virales.
Son abundantes los casos que, usando genes delatores, han demostrado la
capacidad de diferentes virus con genoma ARN de producir proteínas extrañas
en plantas. Además, se han empleado con éxito en diferentes tipos de experimentos científicos algunos virus recombinantes, sobre todo derivados del virus
del mosaico del tabaco (TMV) y del virus X de la patata (PVX), con secuencias
extrañas insertadas en su genoma. La primera sustancia farmacéutica con posible valor comercial que se produjo con un vector basado en un virus de plantas
con genoma ARN fue una proteína inactivadora de los ribosomas eucarióticos,
la a-trichosantina, que procede de las raíces de una planta medicinal china llamada Trichosanthes kirilowii. La secuencia que codifica a esta proteína se clonó
en TMV bajo el control de un promotor subgenómico adicional (procedente de
un tobamovirus distinto, para evitar recombinación homologa entre secuencias
repetidas). La a-trichosantina se acumulaba en hojas de Nicotiana benthamiana
infectadas sistémicamente hasta representar más del 2% de la proteína soluble
de la planta, estaba correctamente procesada y era biológicamente activa.
Este mismo tipo de vector se ha utilizado para la producción de un
minian-ticuerpo tipo scFv derivado de la inmunoglobulina producida por un
linfoma de células B. La vacunación de ratones con la scFv producida en
plantas protegía frente a la inoculación con células tumorales, demostrando que
este tipo de abordaje puede ser de gran utilidad para la producción rápida de
vacunas para el tratamiento de tumores malignos. Vectores basados en TMV
pueden usarse también para producir en cantidades elevadas proteínas
antigénicas susceptibles de ser usadas en la elaboración de vacunas contra el
patógeno correspondiente. Así, se ha conseguido proteger a ratones contra el
virus de la fiebre aftosa (FMDV) por inmunización con extractos foliares de
plantas infectadas con un virus recombi-nante derivado de TMV que expresaba
la proteína estructural de FMDV VP1.
El sistema de expresión basado en TMV no sólo es capaz de producir cadenas polipeptídicas sencillas. Se ha comprobado que también sirve para pro-
LAS PLANTAS COMO BIOFACTORÍAS
155
ducir complejos multiproteicos. Así, formas completas de un anticuerpo monoclonal dirigido a un antígeno de cáncer de colón se ensamblaban correctamente
cuando sus cadenas ligeras y pesadas se expresaban en la misma planta a partir
de dos vectores independientes.
Un sistema de expresión de secuencias extrañas clonadas en virus de plantas que puede considerarse intermedio entre la inserción y la fusión génicas es
el denominado «overcoat» que se ha desarrollado para PVX. En este caso la secuencia del gen que se desea expresar se fusiona a la de la CP del virus, intercalando entre ellas la secuencia que codifica a los 16 aminoácidos del péptido 2A
de FMDV. Esta secuencia induce el procesamiento proteolítico en su extremo
carboxilo, en un cierto porcentaje de las proteínas de fusión. De esta forma, se
produce un número de moléculas de CP libre suficiente para el ensamblaje de
partículas virales infecciosas. Estas partículas incluyen también moléculas del
producto de fusión no procesado, presentando, por tanto, en su superficie la secuencia proteica extraña. Usando este sistema, ha sido posible producir en hojas de N. benthamiana un anticuerpo scFv funcional (que reconoce al herbicida
diuron) expuesto en la superficie de las cápsidas de PVX.
Como he mencionado más arriba son numerosos los casos en que las cápsidas
virales se han usado como presentadores antigénicos de pequeños epítopos extraños insertados en la CP viral. Entre los virus que se han empleado con esta finalidad se pueden destacar TMV, virus del mosaico del chícharo (CPMV), virus del
mosaico amarillo del nabo (TYMV), virus de la sharka (PPV), virus del mosaico
de la alfalfa (A1MV) y virus del achaparrado peludo del tomate (TBSV). En la mayor parte de los casos el objeto de las partículas quiméricas era inducir una respuesta inmune defensiva frente al patógeno del que deriva el epítopo expresado.
Entre los antígenos que se han estudiado se encuentran péptidos de virus humanos y animales como los de la inmunodeficiencia humana (HIV), rinovirus, FMDV,
rabia, diferentes parvovirus etc., de bacterias como Pseudomonas aeruginosa y
Stap-hilococcus aureus, o de protozoos como diferentes especies de Plasmodium.
Hay que destacar que también se han preparado partículas virales quiméricas,
derivadas de TMV, que expresan un epítopo murino de una proteína de la zona
pelúcida del oocito; aunque la inmunización parenteral de ratones con estas
partículas inducía una respuesta específica de autoanticuerpos que se detectaban
in vivo en la zona pelúcida de las ratones hembras, en contra de lo esperado, no
se apreció en este estudio un impacto significativo sobre la fertilidad de los
animales tratados.
Los avances más significativos hacia el desarrollo de vacunas basadas en
partículas virales quiméricas producidas en plantas se han llevado a cabo con
vectores de expresión derivados de CPMV. Se han purificado en gran cantidad,
a partir de plantas infectadas de Vigna unguiculata, viriones de CPMV que exponen en su superficie un epítopo lineal de la proteína VP2 del virus de la enteritis del visón (MEV). Una sola inyección subcutánea de estas partículas protegía a los visones frente a la infección por MEV con una eficiencia sólo
156
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
ligeramente inferior a la de una vacuna convencional. Como el epítopo introducido estaba conservado en tres parvovirus diferentes (MEV, parvovirus canino y panleucopenia felina) la misma vacuna podría ser usada en tres huéspedes
económicamente importantes (visones, perros y gatos).
Más recientemente se ha logrado conferir a ratones cierto nivel de protección frente a la infección pulmonar por P. aeruginosa, mediante la administración parenteral de cápsidas de CPMV que presentan en su superficie un epítopo de la proteína F de la membrana externa de esta bacteria.
Las partículas quiméricas derivadas de CPMV son también capaces de inducir una respuesta inmune eficiente en mucosas. La inmunización por vía
in-tranasal con cápsidas de CPMV formadas por moléculas de CP que tenían
insertado un péptido de la proteína FnBP de S. aureus, no sólo primaba células
T específicas de CPMV y generaba altos títulos de IgGs específicas de CPMV
y FnBP en suero, sino que, además, inducía la secreción de IgAs e IgGs
específicas de CPMV y FnBP en los fluidos bronquiales, intestinales y vaginales.
El suero inhibía por completo la unión de fibronectina humana a la proteína
FnBP de S. aureus (aunque los títulos de bloqueo eran menores que los logrados
con IgGs de ratones inmunizados subcutáneamente). La inmunización oral con
las partículas quiméricas daba lugar a títulos de anticuerpo en el suero menores
y más variables que los generados por la ruta intranasal, y no parecía inducir
niveles de secreción apreciables de IgAs específicas de FnBP en el intestino.
Otro estudio que ha comparado la eficiencia de inmunización de partículas
virales quiméricas por vía oral o parenteral ha empleado cápsidas formadas por
una CP híbrida de A1MV que incluía dos epítopos del virus de la rabia, expresada en N. benthamiana y espinacas con un vector basado en TMV Después de tres
dosis de cápsidas purificadas administradas intraperitonealmente, un 40% de los
ratones inmunizados quedaban protegidos frente a una dosis letal de virus virulento. La respuesta parecía menos eficiente cuando se administraban partículas
purificadas por intubación gástrica, o se añadían al alimento hojas de espinacas
infectadas. Aún así, se apreciaba en los animales sometidos a estos tratamientos
la aparición de IgGs e IgAs específicas en el suero (más en los animales inmunizados por intubación gástrica) y la secreción de IgAs en la mucosa intestinal (más
en los animales alimentados con espinacas infectadas). En ambos casos de inmunización oral se apreciaba una cierta atenuación de los síntomas clínicos causados por una infección intranasal con una raza poco virulenta del virus de la rabia.
Aunque la mayoría de los ensayos de producción de compuestos foráneos
en plantas por medio de expresión transitoria han empleado vectores basados en
virus, se han desarrollado también otros sistemas. La transferencia de ADN desnudo a plantas por bombardeo de partículas es útil para un test rápido de la síntesis de la proteína deseada previo a la transformación estable, pero no es adecuado para la producción de grandes cantidades de proteína. Un sistema que, por
el contrario, parece ofrecer mejores perspectivas para producir en plantas en un
158
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
tos de la proteína extraña. Una causa importante de este problema es que ni siquiera mecanismos de expresión muy eficientes serían capaces de compensar
tanto una deficiente compatibilidad del gen extraño con la maquinaria
biosin-tética de la planta en la que está clonado como la falta de estabilidad de
la proteína transgénica en la célula vegetal. Es por esta razón por la que existe
una tendencia a editar los genes que se pretende expresar en la planta,
adaptando el uso de codones al preferido por la planta, eliminando señales de
procesamiento o inestabilidad del ARN, o añadiendo marcas a la proteína que
la dirigen a compartimentos subcelulares donde puede ser más estable. Es de
prever que cuando se conozca más acerca de los factores que influyen en la
estabilidad de las proteínas en las células vegetales, se pueda modificar las
proteínas que se pretenda producir en plantas para limitar su degradación sin
alterar el resto de sus propiedades. Por otra parte, se ha demostrado
recientemente que en muchos casos, tanto los transgenes como genes
endógenos homólogos de ellos resultan silenciados transcripcionalmente o
post-transcripcionalmente. Parece que altos niveles de transcripción, junto con
otros factores de estructura del locus de inserción del transgén, facilitan el
silenciamiento post-transcripcional. También los virus inducen una respuesta
defensiva de la planta que está estrechamente relacionada con el
silenciamiento post-transcripcional, pero han desarrollado diferentes
estrategias para suprimirla o escapar de ella. Los futuros progresos en el
conocimiento de los mecanismos del silenciamiento y de su supresión serán
fundamentales para poder desarrollar fitofactorías de alto rendimiento.
La mayor parte de los primeros ensayos para producir en plantas compuestos
foráneos han empleado plantas fácilmente transformables y susceptibles a muchos virus, como varias especies del genero Nicotiana. Como he mencionado más
arriba, ya en estos momentos está habiendo un movimiento hacia especies más
adecuadas para los objetivos deseados. Producción en plantas que sean directamente comestibles puede ser de gran utilidad para vacunas o para aditivos alimentarios. Otro aspecto a considerar es que la acumulación del producto en material vegetal almacenable por tiempos prolongados, como semillas y tubérculos,
añade valor comercial al sistema. Patata, algunas leguminosas y maíz se encuentran entre las especies más prometedoras. Por otra parte, especies perennes podrían, idealmente, convertirse en fuentes estables eternas de moléculas
recombinantes. Es por esto por lo que la alfalfa, que puede cosecharse durante
varios años consecutivos, se ha convertido también en un sistema atractivo. Es
previsible que los progresos, tanto científicos como técnicos, que se realicen en
los próximos años permitirán el incremento del número de especies y variedades susceptibles a transformación y regeneración, lo que hará más fácil encontrar plantas con las características fisiológicas y agronómicas adecuadas para la
producción de cada compuesto. Futuros desarrollos de promotores específicos
de tejido y de promotores inducibles por tratamientos exógenos permitirán un
diseño más racional de los sistemas de expresión.
LAS PLANTAS COMO BIOFACTORÍAS
159
Otra posibilidad para incrementar el nivel de expresión de plantas
trans-génicas que está siendo explorada es la transformación de los genomas
plastí-dicos en lugar del nuclear. Como cada célula de mesófilo puede tener
más de cien cloroplastos, cada uno con aproximadamente cien copias del
genoma plas-tídico, la producción de líneas de plantas homotransplastómicas
(en las que todos los genomas plastídicos han sido transformados) ofrece un
enorme potencial de sobreexpresión.
Hasta ahora la mayor parte de los intentos de producir sustancias extrañas
en células vegetales han empleado plantas completas. No obstante, hay ya trabajos que parecen indicar que el empleo de cultivos celulares en suspensión puede resultar una alternativa satisfactoria. Explotar estos cultivos celulares es claramente más costoso que cultivar plantas, pero los cultivos de células vegetales
son mucho más económicos que los de células animales y siguen careciendo de
los peligros de contaminación con agentes patógenos de estos últimos. Sin embargo, para que se extienda el uso de suspensiones de células de planta en la producción de sustancias recombinantes de interés comercial será necesario un mayor desarrollo de las técnicas de cultivo a gran escala y de los métodos de
procesamiento posterior del material vegetal. Otra nueva tecnología que podría
emplearse para la producción de proteínas de alto valor, es la rizosecreción. En
esta tecnología, la proteína de interés es secretada al medio de cultivo por las
raíces de plantas cultivadas hidropónicamente. El sistema permite producir la
proteína de interés de manera continua, sin necesidad de destruir la planta, obteniéndose así un rendimiento global mayor. Por otra parte, resulta mucho más
sencillo purificar la proteína de interés a partir de un simple medio
hidropóni-co que de complejos extractos de plantas.
Las diferencias que existen en los patrones de glicosilación de mamíferos y
plantas podría representar una importante limitación para el uso en terapia in vivo
de glicoproteínas recombinantes de mamífero, como las inmunoglobulinas, producidas en plantas. Como ya he mencionado en otro apartado, los experimentos efectuados hasta la fecha parecen indicar que estas diferencias no afectan ni a la actividad de la molécula ni a su inmunogenicidad. Sin embargo, no es descartable que en
algunos casos, algunas estructuras de oligosacáridos específicas de plantas, como las
que contienen residuos de (3(1,2)-xilosa y a(l, 3)-fucosa, pudieran resultar altamente
inmunogénicas en mamíferos. Por esta razón, se hace necesario desarrollar plantas
con modificaciones en sus rutas de glicosilación que permitan obtener glicoproteínas con carbohidratos más similares a los de las células de mamífero.
Finalmente, es importante no perder de vista que para que se extienda el
uso de proteínas recombinantes producidas en plantas es preciso que tengan
aceptación social. La aceptación por el público de este tipo de productos no será
automática. Para conseguirlo, será necesario que pasen controles rigurosos
que demuestren su inocuidad, y que haya una información clara y detallada acerca de estos controles, así como sobre las ventajas de los nuevos productos.
160
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA
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