plantas resistentes a los virus que tiene un arn inverso.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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ES 2 076 143
kInt. Cl. : C12N 15/00
11 N.◦ de publicación:
6
51
ESPAÑA
A01H 1/00
C12N 5/00
C12N 15/11
C12N 15/82
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 87302827.8
kFecha de presentación : 01.04.87
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 240 332
kFecha de publicación de la solicitud: 07.10.87
T3
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54 Tı́tulo: Plantas resistentes a virus que tienen ARN antisentido.
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73 Titular/es: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
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72 Inventor/es: Loesch-Fries, Sue L.;
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74 Agente: Carpintero López, Francisco
30 Prioridad: 02.04.86 US 847425
700 Capital Square
400 Locust Street
Des Moines
Iowa 50309, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.11.95
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
01.11.95
Aviso:
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Merlo, Donald J. y
Jarvis, Nancy P.
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
1
ES 2 076 143 T3
DESCRIPCION
Campo
La presente invención pertenece al campo de
la ingenierı́a genética y la agricultura, y proporciona especialmente unos medios para producir una planta resistente a virus por transformación de una planta para contener un gen extraño expresable en plantas que dirige la sı́ntesis
de ARN complementariamente a un ARNm viral.
También se proporcionan unos vectores plásmidos
procarióticos que transforman plantas que llevan
tal ARN expresable en plantas y las células de
planta transformadas por tal vector.
Antecedentes
Visión de conjunto de la Agrobacterium
Las cepas virulentas del género gram-negativo
de Agrobacterium hospedan grandes plásmidos
conocidos como plásmidos Ti (inductores de tumor o transformación) (pTi) en A. tumefaciens y
plásmidos Ri (inductores de raı́z) (pRi) en A. rhizogenes, clasificados frecuentemente por la opina
que catabolizan o cuya sı́ntesis causan. Tanto el
plásmido Ti y como el Ri contienen secuencias
ADN conocidas como ADN-T (ADN-transferido),
las cuales, en tumores se encuentran integradas en
el genoma de la planta huésped. Varios genes de
ADN-T están bajo el control de promotores ADNT que se asemejan en estructura a promotores
eucarióticos canónicos. Estos plásmidos también
llevan genes fuera de la región de ADN-T. Los
plásmidos Ti y Ri son funcionalmente equivalentes para muchos propósitos.
Análisis de enfermedades causadas por Agrobacterium, transformación de plantas, ingenierı́a
genética, y expresión de gen, incluyen aquellos
producidos por, o encontrados en, Merlo DJ
(1982) Avd. Plant Pathol. 1:139-178; Ream LW
y Gordon MP (1982) Science 218:854-859; Bevan
MW y Chilton M-D (1982) Ann. Rev. Genet.
16:357-384; Kahl G y Schell J (1982) Molecular
Biology of Plant Tumors; Barton KA y Chilton
M-D (1983) Meth. Enzymol. 101:527-539; Depicker A y col. (1983) en Genetic Engineering of
Plants: an Agricultural Perspective, eds.: Kosuge
T y col., pp. 143-176; Caplan A y col. (1983)
Science 222:815-821; Hall TC y col., solicitud
de Patente Europea 126.546; Binns AN (1984)
Oxford Surveys Plant Mol. Cell Biol. 1:130160; Hall TC (1985) Oxford Surveys Plant Mol.
Biol. 2:329-338; Hooykaas PJJ y Schilperoort RA
(1985) Trends Biochem. Sci. 10:307-309; Thomas
TL y Hall TC (1985) Bioassays 3:149-153; Weissbach A y Weissbach H, eds. (1986) Meth. Enzymol. 118 (ver especialmente Rogers SG y col.,
pp. 627-640); Pühler A, ed. (1983) Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction; y Schilperoort RA (1984) en Efficiency in Plant Breeding (Proc. 10th Congr. Eur. Assoc. Res. Plant
Breeding), eds.: Lange W y col., pp. 251-285.
Transformación de Plantas por Agrobacterium
Las células de Plantas pueden ser transformadas por Agrobacterium por varios procedimientos
conocidos en la técnica. Para un análisis del trabajo reciente, véase Syono K (1984) Oxford Surveys Plant Mol. Cell Biol. 1:217-219.
La infección de tejido de planta por Agrobac2
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terium es una técnica simple bien conocida por
aquellos expertos en la técnica. Tı́picamente,
después de hacerle una herida, una planta se inocula con una suspensión de la bacteria. Alternativamente, se inoculan trozos de tejido, por
ejemplo discos de hoja (Horsch RB y col. (1985)
Science 227:1229-1231). Después de la inducción
con Agrobacterium de tipo salvaje, los tumores
son capaces de crecimiento independiente de fitohormonas. La inoculación tradicional y las
técnicas de cultivo, pueden ser modificadas para
utilizar vectores ADN-T desactivados incapaces
de crecimiento independiente de hormonas. (por
ej. véase Zambyski P y col.(1984) en Genetic Engineering, Principles, and Methods, 6, eds.: Hollaender A y Setlow J, pp. 253-278).
La Agrobacterium es además capaz de infectar células aisladas, células cultivadas en cultivos, células de tejido leñoso cicatrizal, y protoplastos aislados (por ej. Fraley RT y col. (1984)
Plant Mol. Biol. 3:371-378: Fraley RT y Horsch
RB (1983) en Genetic Engineering of Plants: an
Agricultural Perspective, eds.: Kosuge T y col.,
pp. 177-194; Muller A y col. (1983) Biochem.
Biophys. Res. Comm. 123:458-462). La frecuencia de transformación de trozos de tejido leñoso
inoculados puede incrementarse por la adición de
una opina o de precursores de opina (Cello LM y
Olsen WL, Patente U.S. 4.459.355).
El intervalo de huésped de patogenesis de
agalla de copa puede ser influido por funciones
codificadas ADN-T tales como genes onc (Hoekema A y col. (1984) J. Bacteriol. 158:383385: Hoekema A y col. (1984) EMBO J. 3:30433047: Buchholz WC y Thomasshow MF (1984)
160:327-332; Yanofsky M (1985) Mol. Gen. Genet. 201:237-246). Los genes vir también afectan
el intervalo huésped (Yanofsky, véase más arriba).
Ausich RL, Solicitud de Patente Europea 108.580,
informa la transferencia de ADN-T a partir de
A. tumefaciens a células de algal verde, y la expresión en ellas de genes de resistencia a la kanamicina Tn5 y ocs. Hooykaas-van Slogteren GMS
y col. (1984) Nature 311:763-764, y Hernalsteens J-P y col. (1984) EMBO J. 3:3039-3041, han
demostrado la transformación de células monocotiledóneas por Agrobacterium sin la tumorigenesis
acostumbrada.
El ADN-T, el ADN-T desactivado, y los genes extraños funcionales de plantas transformadas, son normalmente transmitidos a la progenie a través de meiosis aparentemente inalterados de forma Mendeliana dominante, unidos
próximamente, (por ej. véanse Horsh RB y col.
(1984) Science 223:496-498; Tepfer D (1984) Cell
37:959-967; DeBlock M y col. (1984) EMBO J.
3:1681-1689; Wöstemeyer A y col. (1984) Mol.
Gen. Genet. 194:500-507; Wallroth M y col.
(1986) Mol. Gen. Genet. 202:6-15). Dos ADN-T
no unidos pueden transformar una célula simple
y, después de la regeneración de la planta, segregar en la generación F1 (de Framond AJ y col.
(1986) Mol. Gen. Genet. 202:125-131)
ADN plásmido Ti
El ADN-T está integrado frecuentemente (es
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decir insertado) en el ADN huésped en múltiples
posiciones en el núcleo. El ADN de planta lindante puede o bien estar repetido o en bajo
número de secuencia de copias. El ADN-T integrado puede encontrarse en disposiciones tándem
directas o invertidas, y puede separarse por espaciadores. El ADN-T puede transformar también
cloroplastos (De Block M y col. (1985) EMBO J.
4:1367-1372; véase análisis por Flavell RB (1985)
Bioessays 3:177-178).
Ha sido descrita la secuencia completa del
ADN-T de un plásmido tipo octopina encontrado
en ATCC 15955, pTi15955, (Barker RF y col.
(1983) Plant Mol. Biol. 2:335-350) como que
tiene la región TL de pTiAch5 (Gielen J y col.
(1984) EMBO J. 3:835-846). Los genes de ADN-T
publicados, no contienen intrones. Pueden reconocerse secuencias que parecen elementos promotores eucarióticos canónicos y posiciones de poliadenilación.
Los plásmidos Ti octopina llevan un gen ocs
que codifica la octopina sintasa (lisopina deshidrogenasa). Koncz C y col. (1983) EMBO J.
2:1597-1603 proporciona un análisis funcional de
ocs. Dhaese P y col. (1983) EMBO J. 2:419-426,
informa de la utilización de varias posiciones de
poliadenilación por “transcrito 7” (ORF3 Barker
R y col., véase más arriba) y ocs. La presencia
de la enzima octopina sintasa dentro de un tejido puede proteger ese tejido del efecto tóxico de
varios análogos de aminoácido, por ej. aminoetil
cisteı́na (Dahl GA y Tempe J (1983) Theor. Appl.
Genet. 66:233-239; Koziel MG y col. (1984) J.
Mol. Appl. Genet. 2:549-562).
Los plásmidos Ti nopalina codifican el gen de
la nopalina sintasa (nos) (secuenciado por Depicker A y col. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561573). Shaw CH y col. (1984) Nucl. Acids Res.
12:7831-7846, proporciona un análisis funcional
de nos. Se han identificado genes equivalentes a
tms y tmr sobre un plásmido tipo nopalina (Willmitzer L y col. (1983) Cell 32:1045-1056).
Los genes de plásmido Ri y Ti fuera de la
región ADN-T incluyen los genes vir, los cuales
cuando mutan dan como resultado un plásmido
Ti avirulento. Los genes vir funcionan en trans,
siendo capaces de causar la transformación de
células de planta con ADN-T de un tipo de
plásmido diferente y localizado fı́sicamente en
otro plásmido. Tales disposiciones se conocen
como sistemas binarios y los plásmidos que soportan ADN-T se conocen generalmente como
plásmidos micro-Ti. Descripciones de sistemas
binarios y de plásmidos micro-Ti incluyen las siguientes: Hoekema A y col. (1985) Plant Mol.
Biol. 5:85-89; Deblaere R y col. (1985) Nucl.
Acids Res. 13:4777-4788; van den Elzen P y col.
(1985) Plant Mol. Biol. 5:149-154; Anderson
DM, Patente U.S. 4.536.475; de Framond AJ
y col. (1983) Biotechnol. 1:262-269; Hoekema A
y col. (1983) Nature 303:179-180; Hille J y col.
(1984) J. Bacteriol. 158:754-756; Hoekema A
y col. (1984) J. Bacteriol. 158:383-385; An G
y col. (1985) EMBO J. 4:277-284; Anderson DM,
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Patente U.S. 4.536.475; Klee HJ y col. (1985)
Biotechnol. 3:637-642); de Framond AJ y col.
(1986) Mol. Gen. Genet. 202:125-131; Dahl GA
y col., solicitud de Patente Europea 140.556; y
Bevan M (1984) Nucl. Acids Res. 12:8711-8721.
El ADN-T no necesita estar sobre un plásmido
para transformar una célula de planta; el ADN-T
localizado cromosómicamente es funcional (Hoekema A y col. (1984) EMBO J. 3:2485-2490). El
ADN-T tiene repeticiones directas de alrededor
de 25 pares de bases asociados con los bordes izquierdo y derecho, es decir con las uniones ANDT/ADN de planta, las cuales pueden estar involucradas o bien en la transferencia a partir de Agrobacterium o bien en la integración en el genoma
del huésped. Las caracterı́sticas determinadas de
plásmido Ti han sido analizadas por Merlo, véase
más arriba (véase especialmente la Tabla II), y
por Ream y Gordon, véase más arriba.
Expresión de Gen Externo
Un gen que codifica la faseolina de alubia se
ha transferido y se ha expresado en tumores de
girasol (Murai N y col. (1983) Science 222:476482). El gen de faseolina se expresó a un alto nivel en semillas de tabaco en desarrollo (SenguptaGopalan C y col. (1985) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82:3320-3324). Se han observado resultados similares con un gen homólogo, betaconglicinina de haba de soja (Beachy RN y col.
(1985) EMBO J. 4:3047-3053). Se ha transcrito
en tejido leñoso de girasol un gen para zeı́na de
proteı́na de endosperma, a partir de la monocotiledónea Zea mays (Matzke MA y col. (1984)
EMBO J. 3:1525-1531). La expresión de un gen
de subunidad pequeña RuBP-Case de guisante
se regula por la luz en células de petunia transformadas; la proteı́na de subunidad pequeña de
guisante producida es procesada correctamente y
aislada dentro de cloroplastos (Broglie R y col.
(1984) Science 224:838-843). Se han identificado las secuencias involucradas en esta inducibilidad por la luz y las necesarias para expresión
máxima, (Morelli G y col. (1985) Nature 315:200204; Nagy F y col. (1985) EMBO J. 4:3063-3068;
Timko MP y col. (1985) Nature 318:579-582).
La expresión de un gen de proteı́na de unión
a/b de clorofila de trigo es regulada por luz y
organo-especı́fica en plantas de tabaco transformadas (Lamppa G y col. (1985) Nature 316:750752). Un gen de choque por calor de haba de soja
es termoinducible en tejido de girasol (Schöffl F y
Baumann G (1985) EMBO J. 4:1119-1124). (Un
promotor de choque por calor de Drosophila melanogaster es funcional de manera similar en tejido de tabaco (Spena A y col. (1985) EMBO J.
4:2739-2743).)
Genes Quiméricos que tienen Promotores ADN-T
El promotor nos puede conducir la expresión
de genes estructurales de resistencia a drogas
útiles para la selección de células de plantas transformadas. Se han creado genes de resistencia para
kanamicina (Bevan MW y col. (1983) Nature
304:184-187; Fraley RT y col. (1983) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80:4803-4807; Herrera-Estrella L
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y col. (1983) EMBO J. 2:987-995), metotrexato
(Herrera-Estrella y col., véase más arriba), cloramfenicol (Herrera-Estrella L y col. (1983) Nature 303:209-213), higromicina B (van den Elzen
PJM y col. (1985) Plant Mol. Biol. 5:299-302).
Helmer G y col. (1984) Biotechnol. 2:520-527,
han creado un gen de fusión que tiene el promotor y el extremo 5’ del gen estructural de nos fusionado a secuencias beta-galactosidasa (lacZ) de
E. coli. Los tejidos de plantas transformados con
este marcador seleccionable, pueden reconocerse
por un color caracterı́stico cuando crecen en el
sustrato cromogénico apropiado.
Se han creado y son funcionales los genes de
proteı́na de fusión entre el gen estructural ocs,
que también proporciona promotores, y los genes
estructurales para faseolina y resistencia a B higromicina (Waldron C y col. (1985) Plant. Mol.
Biol. 5:103-108; Murai N y col. (1983) Science
222:476-482). Se ha construido un gen ocs glifosato conducido (Comai L y col. (1985) Nature
317:741-744).
Los promotores para genes de octopina TL
ORF24 y ORF25 podı́an también conducir expresión de gen estructural (Velten J y col. (1984)
EMBO J. 3:2723-2730; Velten J y Schell J (1985)
Nucl. Acids Res. 13:6981-6998; Gelvin SB y col.
(1985) Mol. Gen. Genet. 199:240-248; Comai L
y col. (1985) Nature 317:741-744).
Genes Quiméricos que tienen Promotores de
Planta
Una proteı́na quimérica de subunidad pequeña RuBP-Case/ de resistencia a kanamicina,
se traslocó en el cloroplasto (Van den Broeck G
y col. (1985) Nature 313:358-363). Ese promotor
de gen confiere expresión fotoinducible en tejido
leñoso a genes de resistencia a kanamicina y cloramfenicol (Herrera-Estrella L y col. (1984) Nature 310:115-120; Facciotti D y al (1985) Biotechnol. 3:241-246). Un promotor de sintasa chalcona también condujo expresión fotoinducible de
un gen de resistencia a kanamicina (Kaulen H
y col. (1986) EMBO J. 5:1-8). Se han utilizado
promotores de proteı́na de unión a/b de clorofila
para dirigir la expresión del gen ocs y del gen
estructural de resistencia a la kanamicina (Jones
JDG y col. (1985) EMBO J. 4:2411-2418; Simpson J y col. (1985) EMBO J. 4:2723-2729).
Genes Quiméricos que tienen Promotores Virales
Se expresó un gen de resistencia a la kanamicina bajo el control de un promotor de virus de
mosaico de coliflor (CaMV) en células de plantas transformadas por ADN-T (Koziel MG y col.
(1984) J. Mol. Appl. Genet. 2:549-562). Un gen
de resistencia a metotrexato detrás del promotor 35S CaMV confirió resistencia a metotrexato
(Brisson N y col. (1984) Nature 310:511-514). Se
ha expresado la proteı́na de la cubierta del virus
del mosaico del tabaco en tejido de tabaco transformado bajo el control de un promotor CaMV
(Bevan MW y col. (1985) EMBO J. 4:1921-1926).
Odell JT y col. (1985) Nature 313:810-812, han
mapeado secuencias del promotor CaMV 35S ne4
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Transformación de Plantas sin Agrobacterium
Se ha analizado recientemente la transferencia directa de ADN en células de planta (Jones MGK (1985) Nature 317:579-580; Potrykus
I y col. (1985) Plant. Mol. Biol. Reptr. 3:117128; Howe C (1985) Trends Genet. 1:38-39; Paszkowski J y Saul MW (1986) Meth. Enzymol.
118:659-668; Power JB y col. (1986) Meth. Enzymol. 118:578-594). Ambas células, las monocotiledóneas y las dicotiledóneas, pueden ser
transformadas directamente por marcadores seleccionables por kanamicina bajo el control de
un promotor nos o CaMV (Paszkowski J y col.
(1984) EMBO J. 3:2717-2722; Gardner RC y col.
(1984) Plant. Mol. Biol. Reporter 2:3-8; Hain
R y col. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:161168; Potrykus I y col. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-188; Lörz H y col. (1985) Mol. Gen.
Genet. 199:178-182; Shillito RD y col. (1985)
Biotechnol. 3:1099-1103; Meyer P. y col. (1985)
Mol. Gen. genet. 201:513-518). Se pueden cotransformar moléculas de ADN distintas en una
célula de planta; es ventajoso que un ADN en
la mezcla lleve un marcador seleccionable (Peerbolte R y col. (1985) Plant. Mol. Biol. 5:235246). Los descendientes de plantas regeneradas
a partir de dichas células transformadas heredan
el gen hı́brido transformado como un rasgo Mendeliano, dominante único (Potrykus y col., Mol.
Gen. Genet., véase más arriba).
El CaMV ha probado ser útil como un vector de transformación de planta (Brisson N y col.
(1984) Nature 310:511-514; Brisson N y Hohn T
(1986) Meth. Enzymol. 118:659-668). El virus de
mosaico de grama (BMV), un virus ARN, puede
utilizarse también en plantas para expresar genes
estructurales extraños (French R y col. (1986)
Science 231:1294-1297).
Se ha probado que la electroforación es útil
para la introducción de genes quiméricos dentro
de células de plantas en un sistema de expresión
transitorio (Fromm M y col. (1985) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82:5824-5828) y para la transformación estable de células de maı́z (Fromm ME
y col. (1986) Nature 319:791-793).
Las células pueden absorber ADN rodeado por
membranas. El ADN, incluyendo el ADN pTi,
puede introducirse a través de liposomas (por
ej. Deshayes A y col. (1985) EMBO J. 4:27312737) o por fusión de células de planta y bacteria
después de eliminar sus paredes celulares respectivas (por ej. Hain R y col. (1984) Plant Cell Rept.
3:60-64). Los protoplastos de planta pueden absorber células Agrobacterium delimitadas por paredes celulares. El ADN-T puede ser transmitido
a tejido regenerado a partir de protoplastos fusionados.
El ADN puede estar integrado de forma estable en un genoma de planta después de microinyección (Crossway A y col. (1986) Mol.
Gen. Genet. 202:179-185).
Ohta Y (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:715-719, y Zhou G-Y y col. (1983) Meth. En-
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zymol. 101:433-418, han informado respectivamente de la introducción de ADN durante la fertilización o polinización en células de plantas de
maı́z y algodón.
Visión de conjunto del AMV
El virus de mosaico de la alfalfa (AMV), pertenece a una clase de virus de planta que tiene
un genoma ARN multi cadena, de cadena simple,
tripartito. El genoma (excluyendo las moléculas
de ARN subgenómicas) está segmentado en tres
moléculas de ARN. Esta clase incluye: el grupo de
virus del mosaico de la alfalfa (AMV), los ilarvirus, los bromovirus, los cucumovirus y los hordeivirus (van Vloten-Doting L y col. (1981) Intervirol. 15:198-203; Matthews REF (1982) Classification and Nomenclature of Viruses). Los segmentos de genoma se encapsulan separadamente en
partı́culas baciliformes de diferentes longitudes.
Al lado de los tres componentes ARN genómicos
(ARN1, ARN2 y ARN3), se encuentra un cuarto
ARN subgenómico (ARN4) en las preparaciones
de virus. Para iniciar la infección, se requiere una
mezcla de los tres ARN de genoma junto con una
pequeña cantidad de proteı́na de la cubierta o su
mensajero, ARN4 (Bol JF y col. (1971) Virol.
46:73-85).
Se ha descrito la secuencia completa de ARN4
de AMV (Brederode FT y col. (1980) Nucl.
Acids Res. 8:2213-2223). El ARN4 tiene 881 nucleótidos de longitud. La región codificante tiene
660 nucleótidos (sin incluir el codón de iniciación
y terminación) flanqueado por una región 5’ no
traducida de 39 nucleótidos y una región 3’ no
traducida de 182 nucleótidos. La secuencia de
ARN4 está presente y localizada en el extremo 3’
de ARN3 (Gould AR Symons RH (1978) Eur. J.
Biochem. 91:269-278).
Se ha descrito la secuencia nucleótida completa de ARN3 de AMV (Barker RF y col. (1983)
Nucl. Acids Res. 11:2881-2891). Una región 5’ no
codificante de 240 bases precede a una secuencia
de lectura abierta (ORF) de 903 nucleótidos.
Esta ORF está seguida por una región intercistrónica de 49 bases y una ORF de 666 nucleótidos, esta última ORF codifica la proteı́na
de la cubierta de AMV. El gen de la proteı́na de
la cubierta está seguido por una secuencia 3’ no
traducida de 179 bases. El ARN4 de AMV es
idéntico y está determinado por el extremo 3’ de
ARN3, que tiene 36 nucleótidos de la región intercistrónica, el gen estructural de proteı́na de la
cubierta, y la secuencia 3’ no traducida.
Se ha obtenido la secuencia nucleótida completa de un ARN1 de AMV (Cornelissen BJC
y col. (1983) Nucl. Acids Res. 11:1253-1265).
El ARN1 tiene 3645 nucleótidos de longitud y
contienen una ORF larga para una proteı́na de
Mr 125.684 flanqueada por una secuencia 5’ no
traducida de 99 nucleótidos y una región 3’ no
traducida de 163 nucleótidos.
La comparación de las secuencias 3’ terminales de los cuatro ARNs del AMV revela una extensa homologı́a entre los 140 a 150 nucleótidos
terminales de 3’ (Houwing CJ y Jaspars EMJ
(19878) Biochem. 17:2927-2933). Hay alrededor
de 20 sustituciones de base en los 145 nucleótidos
del extremo 3’ de los ARN del AMV; estos están o
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bien localizados en los bucles de las estructuras de
bases apareadas o convierten pares de bases A-U
a pares de bases G-C en los troncos de las horquillas de la estructura secundaria (Koper-Zwarthoff
EC y col. (1979) Nucl. Acids Res. 7:1887-1900).
ARN antisentido
Sequeira L (1984) Trends Biotechnol. 2:2529, analiza la protección cruzada y la resistencia inducida. Stebbing N (1979) Pharmac. Ther.
6:291-332 analiza el diseño de agentes antivirales basados en las secuencias de ARN viral y el
efecto antiviral de los ácidos nucleicos de cadena
simple. Weintraub H y col. (1985) Trends Genet.
1:22-25, analiza resultados publicados y no publicados utilizando ARN antisentido para análisis
genético. Travers A (1984) Nature 311:410, y Laporte DC (1984) Trends Biochem. Sci. 9:463,
analizan papeles reguladores de ARN antisentido
(ARNa).
En la naturaleza, el ARN complementario o
antisentido, puede funcionar de una forma reguladora. En E. coli, un ARN ompC de 174 b regula la expresión ompF. En ARN antisentido,
que probablemente se unirá antes a regiones de
ARNm antes de ponerse en contacto con ribosomas, pareció mas eficaz descendiendo la expresión
de gen (Mizun T y col. (1984) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81:1966-1970; Coleman J y col. (1984)
Cell 37:429-436). El ARN complementario puede
inhibir la replicación de ADN (Tomizawa J y col.
(1981) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78:1421-1425;
Tomizawa J y Iton T (1982) Cell 31:575-583.
In vitro, un oligonucleótido complementario a
tan poco como cinco nucleótidos de la región terminal 3’ de ARN ribosomal 16S de E. coli puede
inhibir la iniciación de traducción de los ARNm
de virus bacterianos (Eckhardt H y Luhrmann R
(1979) J. Biol. Chem. 254:11185-11188; Jayaraman K y col. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:1537-1541; Taniguchi T y Weissmann C (1978)
Nature 275:770-772).
La traducción in vitro de ARNm puede inhibirse si el ARNm está mezclado con un ADN
complementario (ADNc) y se somete a condiciones de reconocimiento de ácido nucleico; se puede
traducir una mezcla no reconocida de ARNm y
ADNc (Paterson BM y col. (1977) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74:4370-4374). La replicación
in vitro de fragmentos de ARN viral de planta
puede inhibirse si los fragmentos de ARN se mezclan con un ADNc y se someten a condiciones de
reconocimiento; se puede replicar una mezcla no
reconocida de los fragmentos de ARN y de ADNc
(Ahlquist P y col. (1984) Plant Mol. Biol. 3:3744).
Se inhibe la replicación del virus de sarcoma
de Rous y la transformación de la célula por la
adición de un oligonucleótido complementario a
13 nucleótidos de una repetición 5’ y 3’ terminal (Zamecnik PC y Stephenson ML (1978) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 75:280-284).
El ARNa de globina inhibió la traducción de
ARNm de globina cuando ambos se inyectaron
en el citoplasma de oocitos de rana. El ARNa
inhibió la traducción cuando se inyectaba con o
antes que el ARNm. Los hı́bridos ARNa:ARNm
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parecı́an formarse dentro de los oocitos, aunque
los hı́bridos eran mucho mas cortos que los esperados para duplex de longitud completa (Melton
DA (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:144148. Los resultados sugieren que la estructura
secundaria podı́a limitar las regiones de ácidos
nucleicos que formaban hı́bridos.
Se ha mostrado que la producción de secuencias de ARN viral antisentido, protege parcialmente las células de E. coli contra la infección
por el bacteriófago correspondiente. Los sitios de
unión de secuencia complementaria al ribosoma,
fueron inhibidores mas eficaces que una secuencia
complementaria al extremo 3’ de un gen estructural y la región 3’ no traducida (Coleman J y col.
(1985) Nature 315:601-603).
El ARN antisentido puede reducir la expresión
de gen en sistema de expresión transitorio en
células de ratón. Cuando un gen de timidina kinasa (TK) de un virus de herpes simple (HSV)
y un exceso de 100 veces de una modificación
de ese gen, que tiene la secuencia codificante de
proteı́na basculada de tal forma que se codificó
una ARNa de TK, se coinyectaron en células
TK− , se observó que la actividad TK disminuı́a
4 veces (Izant JG y Weintraub H (1984) Cell
36:1007-1015).
Se observó que la expresión del gen Lac en
células de ratón se reducı́a diez veces cuando se
cotransformaba con un gen ARNa a una proporción de 1:1 o mayor de gen:gen ARNa (Rubenstein JLR y col. (1984) C. R. Acad. Sci.,
Parı́s 299:271-274).
Resumen de la invención
Esta invención se refiere a la ocurrencia de
infecciones virales en plantas y a los esfuerzos de
horticultores y agrónomos para combatir estas infecciones en especies de plantas económicamente
significativas. Las infecciones de virus ocurren en
todas las especies de plantas conocidas y provocan reducciones significantivas en el rendimiento
y calidad de todas las especies de plantas agrı́colas
y hortı́colas. Ninguna industria de plantas en
ningún paı́s del mundo está exenta de tales daños
causados por virus y no se conoce un tratamiento
consistente para tratar o prevenir tales infecciones virales. Por ejemplo, el 90% de las plantas
de tapioca en Kenya están infectadas por el virus del mosaico de la tapioca, dando como resultado una reducción del rendimiento estimada en
el 75%. Como otro ejemplo, en una reciente epidemia viral en Ghana, se perdieron más de cien
mil árboles de cacao por infección con virus de
inchazón de brotes. Se podrı́an dar muchos otros
ejemplos que hacen evidente que las epidemias
e infecciones de virus tienen un gran significado
económico. La reducción en el rendimiento de las
cosechas de alimentos es también relevante con el
continuo crecimiento de la población humana y
con la malnutrición crónica que ya existe. Por lo
tanto, está claro que tanto los medios para producir genotipos de plantas resistentes a virus como
las propias plantas resultantes serı́an muy útiles
para incrementar la capacidad del mundo para
auto alimentarse.
En particular, el virus del mosaico de la alfalfa ha demostrado causar serias disminuciones
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en el rendimiento de las cosechas. El AMV infecta la alfalfa y otros cultivos anuales de legumbres. Esto es importante económicamente;
sólo en los Estados Unidos se plantan aproximadamente 30 millones de acres de alfalfa. El
virus del mosaico de la alfalfa también provoca
daños económicamente importantes en cultivos
tales como pimientos, patatas, apios, guisantes y
habas. La alfalfa puede ser un huésped venteado
a partir del cual los áfidos transportan el virus.
La enfermedad también se difunde a partir de la
alfalfa a otras especies de cultivos siguiendo un
crecimiento de infección de áfidos. En muchos casos, las plantas infectadas por AMV no muestran
sı́ntomas, haciendo difı́cil detectar la ocurrencia
y difusión de la enfermedad. En otros casos, la
enfermedad del mosaico es evidente pero en ese
momento seguramente el virus que se ha difundido a través de una gran superficie de plantas de
un campo.
Aparte de retirar las plantas infectadas y de la
utilización de insecticidas para eliminar los áfidos
que transmiten el virus, no hay desarrollados procedimientos prácticos para prevenir la difusión del
AMV. Por esta razón, está claro que tanto los
medios para la creación de genotipos resistentes
a AMV como las plantas resultantes, serı́an muy
útiles para incrementar la productividad agrı́cola
de un número de cultivos.
Por lo tanto, es un objeto de la presente
invención proporcionar plantas que tienen unos
nuevos genes de resistencia a virus y, en particular, proporcionar plantas que resisten la infección por AMV. Encaminados hacia este objetivo, se proporcionan procedimientos para crear
genes de resistencia viral, en particular, genes de
ARN antisentido inhibidores de la replicación viral. También se proporcionan plantas, células de
plantas, tejidos de plantas y semillas de plantas
que contienen genes ARNa que son responsables
de que esos materiales de planta tengan un fenotipo de resistencia viral. Adicionalmente, se
describen también moléculas de ADN útiles para
la creación de tales plantas resistentes a virus. Se
dan ejemplos de la presente invención poniendo
en tabaco un gen ARNa complementario al ARN
mensajero de la proteı́na de la cubierta del virus
del mosaico de la alfalfa.
El ARN antisentido no ha mostrado nunca
afectar a la expresión de gen en plantas, aunque
se ha mostrado que lo hace en sistemas no vegetales. Existen razones por las que la presencia de
un ARNa viral puede no proteger a una planta de
una infección viral. El ARNa viral es un ARN que
no se encuentra de forma natural en el núcleo; el
ARNa viral puede no ser estable en ese entorno.
El nivel de acumulación de ARNa puede ser demasiado bajo para inhibir la infección. El ARNa
puede no acumularse en una parte de una célula
donde se inician o se mantienen las infecciones
virales. Aunque el ARNa viral puede ser estable
en citoplasma de planta, el ARNa viral puede no
ser estable en un citoplasma de planta en la ausencia de una infección viral. Una infección viral
puede establecerse mas rápidamente que el ARNa
pueda reconocer a un ARN viral. La acumulación
de moléculas ARNa viral a niveles suficientes para
interferir con un ciclo de vida de virus puede ser
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tóxica para las células de la planta. En efecto
la presencia de un gen ARNa puede ser negativo
para las plantas.
Descripción detallada de la invención
Se proporcionan las siguientes definiciones
para eliminar ambigüedades en la intención o el
alcance de su utilización en la especificación y reivindicaciones.
Promotor: Se refiere a secuencias en el extremo 5’ de un gen estructural involucradas en
la iniciación de la transcripción. Un promotor
expresable en plantas es cualquier promotor capaz de dirigir la transcripción en al menos untipo de células de plantas en al menos una etapa
de desarrollo. Las secuencias de promotor eucariótico se conocen comúnmente por la presencia
de homólogos de secuencias de ADN a la forma
canónica 5’...TATAA...3’ alrededor de 10-30 pares de bases (pb) 5’-a la posición del extremo 5’
del ARNm (posición de caperuza). Alrededor de
30 pb 5’- al TATAA, se encuentra a menudo otra
secuencia de promotor que reconoce por la presencia de homólogos de secuencias DNA a la forma
canónica 5’...CCAAT...3’.
Terminador de Transcripción: Se refiere en
este documento a cualquier secuencia de ácido nucleico capaz de determinar la posición del extremo
3’ de un transcrito. El segmento de ADN terminador del transcrito puede ser él mismo un material
compuesto por segmentos derivados de una pluralidad de fuentes, de ocurrencia natural o sintética,
procariótica o eucariótica, y puede estar formado
a partir de un ADN genómico o un ADNc derivado de ARNm (ARNm: ARN mensajero). Los
sitios de terminación de transcrito, incluyen los
sitios de poliadenilación y los sitios que determinan el extremo 3’ de ARN ribosómicos (ARNr),
ARN de transferencia (ARNt), y ARNm no poliadenilados, por ej. ARNm de histona: Krieg PA
y Melton DA (1984) Nature 308:203-206).
Un sitio de poliadenilación es una secuencia
de ácidos nucleicos correlaccionada con poliadenilación de ARNm en eucariotas, es decir después
de la terminación transcripcional, se añaden “colas” de ácido poliadenı́lico al extremo 3’ de los
precursores de ARNm. Los sitios de poliadenilación se reconocen comúnmente por la presencia de homologı́a a la forma canónica 5’...AATAAA...3’, aunque no son extrañas variaciones de
distancia 5’ al extremo 3’ del transcrito, “lectura”
parcial, y secuencias canónicas tándem múltiple.
Parecen ser necesarias las secuencias de ADN entre 20 y 35 pb corriente abajo a partir del extremo
3’ del transcrito (McDevitt MA y col. (1984) Cell
37:993-999). Se deberı́a reconocer que un “sitio
de poliadenilación” canónico puede realmente determinar la posición del extremo 3’ del ARNm y
no la poliadenilación per se (Proudfoot N (1984)
Nature 307:412-413; Birnstiel ML y col. (1985)
Cell 41:349-359).
Secuencias de control de la Transcripción: Se
refiere a una combinación de un promotor/sitio de
terminador de transcripción que flanquea un gen
estructural. Las secuencias de ADN del promotor y terminador que flanquean un gen estructural extraño particular no necesitan derivarse de la
misma fuente de genes (por ej. emparejando dos
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transcritos de ADN-T diferentes) o de la misma
fuente taxonómica (por ej. emparejando secuencias procedentes de ADN-T con secuencias procedentes de fuentes no ADN-T tales como secuencias de plantas, animales, hongos, levaduras, virus
eucarióticos, bacterias y secuencias sintéticas).
ARN antisentido (ARNa): se refiere en este
documento a un ARN que es complementario
completamente o en parte a al menos una secuencia de ARNm viral diana (de sentido). Un virus
diana es un virus contra el que se desea lograr una
resistencia. La secuencia viral diana comprendida
en el complemento por el ARNa puede consistir
en un ARNm viral diana de longitud completa o
en una parte del mismo, siendo dicha parte una
región codificante, una posición de iniciación de
traducción y/o una región 5’, 3’ o una región no
traducida interna. Un ARNa puede incluir secuencias complementarias a una pluralidad de virus distintos, confiriendo de ese modo resistencia
a cada uno de la pluralidad de virus. El ARNa por
si mismo puede funcionar o no como un ARNm.
Gen ARN antisentido (gen ARNa): Se refiere
en este documento a un promotor, una secuencia
que determina un ARNa (ADNc viral), y un terminador de transcrito, el promotor, el ADNc viral, y el terminador, teniendo tal posición y orientación unos respecto a otros que, cuando están
en la célula de la planta, se puede transcribir un
ARNa bajo el control del promotor. En otras palabras, un gen ARNa expresa un ARN que comprende un ARN complementario a un ARNm viral. Un gen ARNa puede ser un material compuesto de segmentos derivados de una pluralidad de fuentes, de ocurrencia natural o sintética.
Un transcrito de gen ARNa puede incluir secuencias derivadas totalmente o en parte a aprtir de ADN procariótico, ADN eucariótico, ADN
episomial, ADN de plásmido, ADN de plástido,
ADN genómico, ADNc, ADN viral, ADNc viral,
ADN sintetizado quı́micamente, o los similares.
Se contempla adicionalmente que un gen ARNa
puede contener una o mas modificaciones en cualquiera de las secuencias de control de transcripción, las secuencias transcritas, o ADNc viral,
que podrı́an afectar la actividad biológica o la estructura quı́mica del ARNa, la proporción de expresión o la forma de control de expresión. Tales
modificaciones incluyen, pero no están limitadas
a, mutaciones, inserciones, eliminaciones, y sustituciones de uno o mas nucleótidos, y modificaciones que no alteran la función ARNa pero que
afectan la localización intercelular, el transporte,
o la estabilidad del ARNa. El ADN que codifica
un ARNa puede determinar una secuencia ARNa
ininterrumpida o puede incluir uno o mas intrones, unidos por las uniones funcionales apropiadas
de plantas, que pueden obtenerse a partir de una
fuente de ocurrencia sintética o natural.
ADNc (ADN complementario): Aunque este
término es bien entendido en la técnica, tiene dos
significados. (1) Un ADNc puede ser un ADN
de cadena simple complementario a un ARN (por
ej. un ARNm viral). (2) Un ADNc puede ser
también un segmento de ADN de doble cadena,
una cadena de las cuales es complementaria a un
ARN, la otra cadena tiene una secuencia equivalente a ese ARN (sustituyendo T por U). Gene7
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ralmente, un ADNc de doble cadena se deriva de
un ADNc de cadena simple. Sin embargo, según
se define en este documento, un ADN de doble
cadena que codifica secuencias de ARNm, por ej.
el ADN de un gen estructural, está incluido dentro del término ADNc. En las reivindicaciones,
el ADNc se refiere siempre a la forma de doble
cadena (significado (2)). En otra parte en esta especificación, el significado de ADNc se define por
el contexto y se entenderá bien por los técnicos
en la materia.
Multi-cadena: se refiere a virus que tienen
genomas que tienen secuencias equivalentes a
aquellas de los ARNm de los virus; es decir, el
ARN encontrado en partı́culas de virus no es complementario al ARNm viral. Frecuentemente el
ARN viral de virus multi cadena puede utilizarse
como un ARNm. El AMV es un ejemplo de un
virus milti cadena; cada uno de los cuatro ARNs
encontrados en los viriones de AMV es capaz de
proporcionar un ARNm.
Genoma de ARN Tripartito: Se refiere a la organización de un material genético de virus. “Genoma” se refiere al material genético total de los
virus. “Genoma ARN” indica que como se presenta en viriones (partı́culas de virus), el genoma
está en forma ARN. “Tripartito” indica que el genoma está dividido entre tres moléculas de ARN
separadas. Un ejemplo de un virus con un genoma de ARN tripartito es el AMV. El genoma de
AMV es portado por los ARN 1, 2, y 3 de AMV.
La secuencia de ARN4 está contenida completamente por el ARN3 y el ARN4 no se replica; por
esta razón, el ARN4 se refiere como un ARN subgenómico y no se cuenta como uno de los ARN
genómico.
Posición de Iniciación de Traducción: Se refiere en este documento al codón de comienzo de
traducción 5’AUG3’ en el extremo 5’ de un gen
estructural, el nucleótido siguiente al AUG, y los
3 nucleótidos qee preceden al AUG (véase Kozak
M (1983) Mocrobiol. Rev. 47:1-45, y Kozak M
(1984) Nucl. Acids Res. 12:857-872).
Secuencia no traducida 5’: Se refiere en este
documento a la parte de un ARNm entre su extremo 5’ o posición caperuza, y el codón de inicio
de traducción.
Secuencia conservada 3’: Se refiere en este documento a una secuencia en el extremo 3’ de un
genoma ARN multipartito no poliadenilado que
es la misma para todos los componentes del genoma. La secuencia conservada 3’ del AMV comprende alrededor de 145 nucleótidos a partir del
extremo 3’ de todos los 4 ARN del AMV.
ADNc de longitud esencialmente completa: Se
refiere en este documento a un ADNc que es
complementario a un ARNm completo, posiblemente exceptuando unos pocos (por ej. cinco)
nucleótidos en cada extremo de esa secuencia de
ARNm.
Marcador seleccionable o identificable expresable en plantas: Se refiere en este documento
a un marcador genético funcional en una célula
de planta. Un marcador seleccionable (por ej.
un gen de resistencia a la kanamicina) permite
a células que contienen y expresan ese marcador crecer bajo condiciones desfavorables al crecimiento de células que no expresan ese marcador.
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Un marcador identificable (por ej. un gen betagalactosidasa) facilita la identificación de células
que expresan ese marcador.
Transformación: Se refiere al acto de provocar que una célula contenga una molécula o una
secuencia nucleica que no es parte original de esa
célula.
Tejido de planta: Incluye tejidos de planta diferenciados y no diferenciados que incluyen pero
no se limitan a raı́ces, brotes, polen, semillas, tejido tumoral, tales como agallas de copa, y varias
formas de agregaciones de células de plantas en
cultivo, tales como embriones y tejidos leñosos.
El tejido de planta puede estar in planta, o en un
órgano, tejido o en cultivo celular.
Célula de planta: Según se utiliza en este
documento incluye células de planta in planta y
células de planta y protoplastos en cultivo.
Los siguientes términos son bien conocidos en
la técnica y no van a ser especificados o especialmente definidos en este documento: de cadena simple, genoma, grupo de virus del mosaico de la alfalfa (véase Mattheus REF (1982)
Classification and Nomenclature of Viruses, p.
177), Tobamovirus (véase Mattheus, véase más
arriba, pp. 158-159), promotor de CaMV 19S
(véase Hohn T y col. (1982) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 96:193-236), ADN-T tipo octopina (posiciones, orientaciones, y secuencias de
lectura abierta (ORFs) se definen como se designan en Barker RF y col. (1983) Plant Mol. Biol.
2:335-350), repetición de borde ADN-T, transcripción bajo el control de un gen promotor, ligando,
descendido y estructural.
La producción de una célula modificada
genéticamente que expresa un gen ARNa combina las enseñanzas especı́ficas de la presente descripción con una variedad de técnicas y expedientes conocidos en la técnica. En la mayorı́a de los
casos, existen expedientes alternativos para cada
etapa del proceso total. La elección de expedientes depende de variables tales como la elección
del virus particular contra el que se quiere obtener una resistencia, el sistema de vector básico
para la introducción y mantenimiento estable de
un gen ARNa, las especies de plantas que se van
a modificar, y la estrategia de regeneración deseada, las secuencias de control de transcripción
utilizadas, las secuencias virales particulares comprendidas por el transcrito del gen de ARNa, y
las similares, todas las cuales presentan etapas de
procedimiento alternativas que aquellos expertos
en la técnica son capaces de seleccionar y utilizar para conseguir un resultado deseado. Como
se han desarrollado nuevos procedimientos para
la inserción estable y la transcripción de ADN
extraño en células de plantas, aquellos de conocimiento ordinario en la técnica, serán capaces
de seleccionar entre aquellas etapas alternativas
del proceso para conseguir el resultado deseado.
Los aspectos fundamentales de la invención son
la naturaleza del gen de ARNa y su utilización
para conferir resistencia a las infecciones virales
de plantas transformadas con él. Otros aspectos incluyen la naturaleza y estructura de la secuencia del ARNa y sus medios de inserción y
expresión en un genoma de planta. Las etapas
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restantes de la realización preferida para obtener
una planta modificada genéticamente incluyen la
inserción del gen ARNa en ADN-T, la transferencia del ADN-T modificado a una célula de planta
en donde el ADN-T modificado llega a estar integrado de forma estable como parte del genoma de
la célula de planta, técnicas para cultivo in vitro y
regeneración eventual en plantas completas, que
puede incluir etapas para selección y detección
de células de plantas transformadas y etapas de
transferencia del gen ARNa introducido a partir
de la cepa transformada original a cultivos comercialmente aceptables, y observación de la expresión en plantas transformadas.
Un punto de comienzo para la construcción de
un gen ARNa es la obtención de clones ADN de
secuencias virales. Si el virus es un virus ADN,
los clones ADN son obtenibles utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica de ADN
recombinante. Si el virus es un virus ARN, puede
obtenerse un clon ADNc a partir de la secuencia
viral deseada. Se conocen en la técnica del ADN
recombinante varios procedimientos para realizar
clones ADNc; la elección de procedimientos dependerá de variables tales como poliadenilación,
longitud de ARN, conocimiento anterior de la secuencia de ARN, preparaciones anteriores en el
laboratorio particular para otros experimentos de
clonado ADNc, y factores similares. Las secuencias virales clonadas son un componente necesario
de un gen ARNa.
Una caracterı́stica principal de la presente invención en su realización preferida es la construcción de un derivado de ADN-T que tiene un
gen insertado bajo el control de secuencias que
controlan la transcripción expresables en planta,
es decir, entre un promotor y un terminador
de transcripción, según se han definido estos
términos, véase más arriba. El ARNa que codifica
ADN debe insertarse en la posición y orientación
correcta con respecto al promotor. La posición se
refiere a qué lado del promotor del ARNa que codifica ADN está insertado. Se sabe que la mayorı́a
de los promotores controlan la iniciación de la
transcripción y traducción solo en una dirección a
lo largo del ADN. La región de ADN que cae bajo
el control del promotor se dice que cae “corriente
abajo” o alternativamente “debajo” o “3’ a” el
promotor. Por lo tanto, para ser controlado por
el promotor, la posición correcta de una inserción
de ARNa que codifica ADN debe ser “corriente
abajo” a partir del promotor. La orientación se
refiere a la direccionalidad del gen estructural.
Esa parte de un ARNa que codifica ADN que
es complementaria al ARNm viral que codifica
el término amino de una proteı́na viral se denomina el extremo 3’ del ADN que codifica ARNa,
mientras que el extremo que es complementario al
ARNm viral que codifica aminoácidos próximos al
extremo carboxilo de la proteı́na se denomina el
extremo 5’ del ADN que codifica ARNa. En otras
palabras, el extremo 5’ y el extremo 3’ de un ADN
que codifica ARNa, codifican respectivamente el
extremo 3’ y el extremo 5’ de ARNm viral. La
orientación correcta del ADN que codifica ARNa
es con el extremo 5’ del mismo próximo al promotor. De forma similar a la región del promotor,
el terminador de transcrito debe estar localizado
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en la posición y orientación correcta relativa al
ARNa, estando próximo al extremo 3’ del ARNa.
Se pueden observar diferencias en proporciones
de expresión de gen ARNa o de control de evolución dependiendo de las particulares componentes ARNa, promotores, terminadores de transcripción, secuencias de ADN flanqueantes, o posiciones de inserción en los genomas de las plantas
transformadas. La acumulación de ARNa puede
estar también fuertemente influida por los detalles
de la estructura secundaria de ARNa, especialmente las estructuras de bucle de tronco. Cuando
los componentes de gen ARNa se varı́an, se pueden observar diferentes propiedades, incluyendo,
pero no limitándose a, tales propiedades como la
estabilidad, la localización intracelular, el procesamiento posttranscripcional y otras propiedades
funcionales del propio ARNa expresado. Todas
estas variaciones presentan numerosas oportunidades para manipular y controlar las propiedades
funcionales del fenotipo de resistencia viral, dependiendo de las propiedades fisiológicas deseadas dentro de la célula de la planta, el tejido de
la planta y la planta completa.
El principio fundamental de la presente invención es que la presencia de secuencia ARN
antisentido en una célula de planta es capaz de
conferir a esa célula al menos algún nivel de resistencia viral. Los requisitos por los que segmentos de secuencia viral son incluidos en un ARNa
son mejor expresados en términos funcionales. La
presencia de ARNa en una célula confiere resistencia viral por interferencia con una o mas funciones virales. Tales funciones pueden incluir traducción de proteı́nas virales, replicación de ARN
virales, encapsulación de ácido nucleico viral, etc.
El ARNa interfiere presumiblemente por reconocimiento de un segmento multi cadena del virus o
por unión con al menos una proteı́na involucrada
en el ciclo de vida viral. La presente invención no
está limitada por el modo o mecanismo de interferencia. El ARNa no necesita incluir una secuencia
viral de longitud completa; basta con cualquier
segmento de secuencia complementaria a un segmento multi cadena capaz de interferir con una
función viral. En otras palabras, se requiere en
un ARNa la presencia de al menos una secuencia viral capaz de interferir con funciones virales, y puede ser preparado con cualquier segmento
de secuencia viral incapaz de tal interferencia, en
base a consideraciones de estabilidad de ARN, localización celular, y las similares. Pueden combinarse secuencias virales de algunos virus distintos,
siendo cada secuencia capaz de funcionar como un
ARNa, para formar un ARNa que tiene actividad
antiviral contra cada uno de los distintos virus.
Según se ha definido, un ARNa puede incluir
secuencias no virales. Incluso en casos en los que
se incluye una secuencia viral de longitud completa, un ARNa puede incluir secuencias no virales. Usualmente, estas secuencias no virales estarán en los extremos 5’ y 3’ del ARNa. Frecuentemente estos componentes no virales derivarán de segmentos de ADN del terminador del
transcrito o del promotor. La inclusión de varias
secuencias no virales puede afectar a la estabilidad del ARN, a la localización celular del ARNa,
al procesamiento posttranscripcional y a los si9
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milares. Se sabe en la técnica que la estabilidad
del ARN está afectada por estructuras terminales tales como la caperuza 5’ y la poliadenilación
3’ y por el alargamiento de la estructura interna,
es decir, emparejamiento intramolecular de bases.
Un ARNa puede estar localizado dentro de una
célula, por ej. un ARNa que tiene una secuencia
traducible que codifica una señal polipéptido que
contiene péptido tenderá a estar unido a retı́culo
endoplasmático rugoso. Un intrón puede estar incluido en un ARNa, siempre que, si las posiciones
de unión se derivan de dos genes diferentes, las
posiciones de unión de intrón sean compatibles.
Un ARNa debe designarse teniendo en cuenta
algunos factores biológicos. La estructura secundaria de ARN puede afectar a la actividad antiviral, ası́ como a la estabilidad y procesamiento.
En particular, el emparejamiento intramolecular
de bases que comprende secuencias que interfieren
con funciones virales no debe ser tan fuerte que
impida el reconocimiento del ARNm viral. Un
transcrito ARNa deberı́a se incapaz de ser convertido por el mecanismo de replicación viral en
un componente viral en sentido funcional capaz
de incrementar la severidad de la enfermedad viral. La producción de cadenas de sentido puede
bloquearse por inclusión de secuencias no virales
en el ARNa, las cuales interfieren con la función
de replicado, especialmente en uno o ambos extremos de ARNa. Si la producción multi cadena
no estuviera bloqueada, se pueden realizar otras
etapas. La eliminación de un segmento de secuencia que codifica proteı́na o la introducción de una
mutación alternancia de cadena posicionada apropiadamente puede provocar que la proteı́na viral
copiada por la cadena de sentido, no sea funcional. Las mutaciones de alternancia de cadena se
introducen convenientemente abriendo un ADNc
viral que transporta un plásmido en un único, extremo adhesivo que genera posición de restricción,
quitando los extremos adhesivos y volviendo a ligarlo. Dependiendo de la enzima y los procedimientos utilizados, esto eliminará o insertará dos
o cuatro pares de bases, generando por ello una
alternancia de cadena (y también eliminando esa
posición de restricción).
Una realización importante de la presente invención es la inhibición de la propagación viral
provocada por la unión a un ARNm viral de una
longitud esencialmente completa de ADNc (por
ej. a uno de los cinco nucleótidos de cada extremo de la secuencia ARNm). Un ADNc de longitud completa tiene cuatro regiones importantes:
una secuencia 5’ no traducida, una posición de comienzo de traducción, un gen estructural y una
secuencia 3’ conservada. La unión de un ARNa a
una secuencia 5’ no traducida puede interferir con
la iniciación de la traducción por interferencia con
la exploración de preiniciación del ARNm para
posiciones de iniciación de la traducción por subunidades ribosomales 40S (véase Kozak M (1983)
Mocrobiol. Rev. 47:1-45). La unión a una posición de iniciación de la traducción puede interferir con la iniciación de la traducción. La unión
a la secuencia del gen estructural, es decir a la secuencia que codifica la proteı́na, puede disminuir
la eficacia de la traducción. La unión a la secuencia 3’ conservada puede interferir con el comienzo
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de la replicación.
La combinación de segmentos de ADN, incluyendo secuencias virales, no virales, promotoras
y terminadoras de transcripción, para formar un
gen ARNa se consigue por medios conocidos por
aquellos de conocimiento normal en la materia de
tecnologı́a de ADN recombinante. La elección del
promotor depende de la regulación de desarrollo
deseada. La utilización de promotores regulados
en desarrollo para la expresión de gen en plantas está descrita en los antecedentes. Los promotores de ADN-T o CaMV son ventajosos por ser
constitutivos. El promotor de subunidad pequeña
RuBP-Case puede ser útil para la expresión en los
tejidos verdes de una planta de ARNa transformada genéticamente. En las realizaciones preferidas el terminador de transcripción es un sitio de
poliadenilación. La fuente de genes de planta del
sitio de poliadenilación no es crucial siempre que
el sitio de poliadenilación, el promotor y el ARNa
sean compatibles para el proceso de transcripción
y posttranscripcional.
Como será aparente para aquellos de conocimiento normal en la técnica, la combinación
del gen ARNa puede estar colocada entre cualesquiera sitios de restricción convenientes para
que se pueda extraer la combinación del plásmido
y convenientes para la inserción en el vector de
transformación de la planta elegida. Por ejemplo,
la localización de la posición de inserción de gen
ARNa dnetro del ADN-T no es crı́tica, puesto
que la función de transferencia de secuencias que
rodean inmediatamente a los bordes del ADNT no está interrumpida, ya que en estudios de
la técnica anterior estas regiones aparecen como
esenciales para la inserción del ADN-T modificado en el genoma de la planta. La combinación
se inserta en el vector de transformación de la
planta por técnicas estándar bien conocidas por
aquellos expertos en la técnica. La orientación
del gen de ARNa ensamblado, con respecto a la
dirección de la transcripción y la traducción de
los genes de vector endógenos no es normalmente
crı́tica; generalmente, son funcionales cualquiera
de las dos posibles orientaciones.
Como se analizó en los Antecedentes (ADN
plásmido Ti), el ADN-T de los plásmidos microTi puede transferirse desde una cepa de Agrobacterium a una célula de planta siempre que
la cepa de Agrobacterium contenga ciertos genes
que actúan en trans cuya función es promover la
transferencia de ADN-T a una célula de planta.
Los plásmidos micro-Ti son ventajosos puesto que
son pequeños y relativamente fáciles de manipular
directamente eliminando la necesidad de transferir el gen a ADN-T a partir de un vector lanzadera
por recombinación homóloga. Después de que el
ARNa deseado se ha insertado, ellos pueden introducirse fácilmente directamente en una célula
de Agrobacterium que contiene los genes vir que
actúan en trans, estando usualmente los genes vir
sobre un “plásmido auxiliar”, que promueve la
transferencia de ADN-T. La introducción en una
cepa de Agrobacterium se produce convenientemente o bien por transformación de la cepa de
Agrobacterium o por transferencia conjugada a
partir de una célula bacteriana donante, cuyas
técnicas son bien conocidas por los de conoci-
19
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miento normal en la materia. Para propósitos de
introducción de secuencias de ADN nuevas en un
genoma de planta, deberı́an considerarse funcionalmente equivalentes, plásmidos Ti, plásmidos
Ri, plásmidos micro-Ti, y ADN-T integrado en
cromosomas.
El ADN-T que tiene un gen ARNa puede transferirse a células de planta por cualquier técnica
conocida en la materia. Por ejemplo, esta transferencia es conseguida de la manera más conveniente por cocultivo de la cepa de Agrobacterium
con células de planta o con tejidos de planta. Utilizando estos procedimientos, se transforma una
cierta proporción de las células de planta, lo que
quiere decir tener dentro un ADN-T transferido e
insertado en el genoma de la célula de la planta.
En cualquier caso, las células transformadas deben ser seleccionadas o identificadas para distinguirlas de las células no transformadas. La selección se lleva a cabo de la manera más fácil proporcionando un marcador seleccionable incorporado en el ADN-T en adición al gen ARNa. Ejemplos de marcadores artificiales incluyen aquellos
analizados en los Antecedentes (véase las secciones acerca de Genes Quiméricos). Además, el
ADN-T proporciona marcadores endógenos tales
como gen(es) que controla(n) la morfologı́a anormal de las raı́ces de tumor inducido por Ri y
gen(es) que controla(n) la resistencia a compuestos tóxicos tales como análogos de aminoácidos,
estando proporcionada tal resistencia por una enzima que sintetiza la opina (por ej. ocs). Procedimientos de identificación bien conocidos por
aquellos expertos en la técnica incluyen, pero no
se limitan a, ensayos para la producción de opina,
hibridación especı́fica a secuencias caracterı́sticas
de ácido nucleico (por ej. ARNa o ADN-T) o
ensayos inmunológicos para proteı́nas especı́ficas.
Adicionalmente, un fenotipo de un gen ARNa
expresado (por ejemplo resistencia a un virus
huésped) puede ser utilizado para identificar tejido transformado. El ensayo de resistencia viral
puede realizarse por uno de los varios procedimientos bien conocidos en la técnica de virologı́a
de plantas, incluyendo la detección de la disminución de la producción de un componente de un
virus (por ej. ARN viral o una proteı́na viral),
disminución de la capacidad de infección según se
prueba por ensayos de infección de protoplasto
o lesión local, disminución de producción del
número de virus y los similares. Aunque las realizaciones preferidas comprenden la utilización de
plásmidos micro-Ti, pueden ser fácilmente sustituidos otros sistemas de vector basados en ADNT conocidos en la técnica. Adicionalmente, aunque la realización preferida de esta invención incorpora un sistema mediado por Agrobacterium
basado en ADN-T para la incorporación del gen
ARNa en el genoma de la planta que se va a transformar, se incluyen también en el alcance de esta
invención otros medios para transferir e incorporar el gen ARNa. Otros medios para la incorporación estable del gen ARNa en un genoma de
planta incluyen adicionalmente, pero no están limitados a, la utilización de vectores basados en
genomas virales, minicromosomas, transposones,
y recombinación homóloga o no homóloga en cromosomas de planta. Formas alternativas de su-
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ministro de estos vectores a una célula de planta,
incluyen pero no se limitadan a, fusión con liposomas que contienen vector o esferoplastos bacterianos, microinyección, encapsulación en proteı́na
de cubierta viral seguido por un procedimiento
tipo infección, y admisión directa de ADN, posiblemente después de inducción de permeabilidad a plasmalema por un pulso eléctrico, un láser
o un agente quı́mico. También se incluyen dentro del alcance de esta invención los medios para
la incorporación transitoria y/o expresión. Los
sistemas basados en células de Agrobacterium y
ADN-T pueden utilizarse para transformar angiospermas, incluyendo dicotiledóneas y monocotiledóneas, por transferencia de ADN a partir de
una bacteria a una célula de planta; pueden utilizarse sistemas basados en vectores alternos o medios para el transporte del vector para transformar gimnospermas y angiospermas.
La regeneración de células y tejidos transformados se consigue recurriendo a técnicas conocidas. Un objeto de la etapa de regeneración es
obtener una planta completa que crece y se reproduce normalmente pero que retiene el ADN-T
integrado. Las técnicas de regeneración varı́an
algo de acuerdo con los principios conocidos en la
técnica y puede depender del vector de transformación de la planta y de las especies de planta
transformada. Es bien conocida en la técnica la
regeneración de plantas de tabaco transformadas,
de plantas de petunia, y de plantas de especies relacionadas. Según se vayan descubriendo medios
para la regeneración de otras especies de plantas,
la técnica entenderá, sin experimentación indebida, como adaptar estos medios de nuevo descubrimiento a la regeneración de plantas a partir de
células de plantas transformadas y de tejidos de
plantas transformadas.
El genotipo del tejido de planta transformado
se elige frecuentemente por su facilidad para que
sus células puedan crecer y regenerarse en cultivo in vitro y por su susceptibilidad al agente
selectivo que se va a utilizar. Cuanto mas inadecuado para estas manipulaciones es un cultivo
de interés agrario, antes se transforma una variedad tratable. Después de la regeneración, el gen
ARNa introducido nuevamente puede ser transferido fácilmente al cultivo agrario deseado por
técnicas bien conocidas por aquellos expertos en
la materia de cultivo de plantas y genética de
plantas. Los cruces sexuales de plantas transformadas con los cultivos agronómicos de plantas producen hı́bridos iniciales. Estos hı́bridos
pueden después retrocruzarse con plantas de los
antecedentes genéticos deseados. La progenie se
identifica o selecciona continuamente para la presencia continua de ADN de gen ARNa integrado,
ADN-T, o para un nuevo fenotipo que resulta de
la expresión del gen ARNa u otros genes portados
por el ADN insertado. De esta manera, después
de un número de vueltas de retrocruzamiento y
selección, pueden producirse plantas que tienen
un genotipo idéntico a los progenitores deseados
agronómicamente con la adición de secuencias insertadas de ADN.
Una alternativa para la incorporación de un
gen ARNa en un genoma de planta para producir
una célula de planta que contiene ARNa es infec11
21
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tar una planta con un ARN viral devector capaz
de ser mantenido en la planta, el ARN viral que
tiene secuencias de ARNa para un virus diana
distinto (es decir un virus contra el que se desea
protección). Tı́picamente, secuencias de ADNc de
doble cadena del virus vector y del virus diana se
manipulan utilizando tecnologı́a de ADN recombinante. Después del ensamblado de una secuencia de ADN correspondiente a la combinación deseada de vector ARN/ARNa de diana, la combinación ADNc de vector viral de planta/ADNc de
ARNa puede situarse detrás de un promotor que
puede conducir la transcripción in vitro. Descripciones de tales vectores y condiciones para su utilización incluyen Melton DA y col. (1984) Nucl.
Acids Res. 12:7035-7056, Krieg PA y Melton DA
(1984) Nucl. Acids Res. 12:7057-7070, Ahlquist
P y Janda M (1984) Mol. Cell. Biol. 4:28762882, y French R y col. (1986) Science 231:12941297. Después que se ha ensamblado tal combinación de vector viral/ARNa/vector de transcripción in vitro, se puede producir una combinación ARN de vector viral/ARNa diana por
transcripción in vitro y mezcla con cualquier otro
componente ARN viral necesario para el mantenimiento del vector viral en una célula de planta. La
infección por una combinación de vector/ARNa
de una célula de planta puede efectuarse entonces por procedimientos conocidos y, después de
la inoculación con el virus diana o con el ARN
de virus diana, se puede probar la inhibición a la
infección o la producción de un componente viral
por procedimientos bien conocidos en la técnica.
De manera similar, los vectores de ADN virales de planta, pueden utilizarse para introducir un
gen ARNa en una célula de planta. La utilidad
de tales vectores ha sido demostrada por Brisson
N y col. (1984) Nature 310:511-514. Los medios
para la creación de genes funcionales ARNa según
se muestra en la presente invención combinarse
por aquellos de conocimiento común en la materia
con la utilización de vectores basados en virus de
ADN de plantas. Después de la infección de una
célula huésped de planta apropiada, la inhibición
de la infección del virus diana puede ensayarse
según se ha descrito anteriormente.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan con el
propósito de ilustrar realizaciones especı́ficas dentro del alcance de la presente invención sin limitar el alcance, estando dicho alcance definido
por las Reivindicaciones. Aparecerán inmediatamente numerosas variaciones para aquellos de
conocimiento común en la materia.
Los Ejemplos utilizan muchas técnicas bien
conocidas y accesibles por aquellos expertos en
la materia de biologı́a molecular y manipulación
de ADN-T y Agrobacterium; tales procedimientos están completamente descritos en una o mas
de las referencias citadas si no se describen en
detalle en este documento. Todas las referencias
citadas en esta Especificación se incorporan aquı́
por referencia. Las enzimas se han obtenido a
partir de fuentes comerciales y se han utilizado
de acuerdo con las recomendaciones de los vendedores y otras variaciones conocidas en la técnica.
Los reactivos, los tampones, y las condiciones de
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cultivo son también conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los trabajos de referencia que
contienen tales técnicas estándar incluyen los siguientes: Wu R, ed. (1979) Meth. Enzymol. 68;
Wu R y col., eds. (1983) Meth. Enzymol. 100
y 101; Grossman L y Moldaveeee K, eds. (1980)
Meth. Enzymol. 65; Weissbach A y Weissbach H,
eds. (1986) Meth. Enzymol. 118 (véase especialmente Rogers SG y col., pp. 627-640); Miller JH
(1972) Experiments in Molecular Genetics; Davis R y col. (1980) Advanced Bacterial Genetics;
Schleif RF y Wensink PC (1982) Practical Methods in Molecular Biology; Walker JM y Gaastra
W, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology;
y Maniatis T y col. (1982) Molecular Cloning.
Adicionalmente, Lathe RF y col. (1983) Genet.
Engin. 4:1-53, hacen comentarios útiles sobre manipulación de ADN.
La utilización textual del nombre de una endonucleasa de restricción aisladamente, por ej.
“BclI”, se refiere a la utilización de esa enzima
en una digestión enzimática, excepto en un diagrama en donde puede referirse a la posición de
una secuencia susceptible a la acción de tal enzima, por ej. una posición de restricción. En
el texto, las posiciones de restricción se indican
por la utilización adicional de la “posición” de
trabajo, por ej. “posición BclI”. La utilización
adicional del “fragmento” de trabajo, por ej. el
“fragmento BclI”, indica una molécula de ADN de
doble cadena lineal que tiene los extremos generados por la acción de la citada enzima (por ej. un
fragmento de restricción). Una frase tal como un
“fragmento BclI/SmaI” indica que el fragmento
de restricción fue generado por la acción de dos
enzimas diferentes, en este caso BclI y SmaI, resultando los dos extremos de la acción de dos enzimas diferentes.
Los plásmidos, y sólo los plásmidos, se preceden con una “p”, por ej., pTi15955 o pH400,
y unas designaciones de cepa entre paréntesis incidan un plásmido albergado dentro, por ej. A.
tumefaciens (pTi15955) o E. coli H802 (pH400).
Las siguientes cepas están en depósitado y se ponen a disposición de la técnica en base a las denominaciones patentes:
E. coli MC1061 (pH400A4I) NRRL B-18062
NRRL B-18009
E. coli K802 (pH4-1)
A. tumefaciens (pTi15955) ATCC 15955
E. coli CSH52 (pSUP106) NRRL B-15486
NRRL B-15481
E. coli SM10
NRRL B-15483
E. coli S17-1
(ATCC: American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852 USA;
NRRL: ARS Patent Collection, Northern Regional Research Center, 1815 N. University St., Peoria, IL 61614 USA.) Otros plásmidos y cepas están
ampliamante disponibles y son accesibles por los
técnicos en la materia.
Ejemplo 1
Preparación de ADNc de ARN4 de AMV
El pSP65A4 (Loesch-Fries LS y col. (1985)
Virol. 146:177-187) transporta una copia de
ADNc de longitud completa de ARN4 de AMV.
El ADN de pSP65A4 digerido con EcoRI y SmaI
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se sometió a la electroforesis en gel de agarosa
y se diluyó del gel un fragmento de 0,89 kpb.
Este fragmento se mezcló y se ligó con el ADN
de pSP64 linealizado y se transformó en MC1061.
Los transformantes resistentes a la ampicilina se
identificaron por hibridación con una sonda de
ARN4 de AMV. Se identificó una colonia que
hospedaba un plásmido, llamado pSP64A4I, que
portaba un ADNc de ARN4 de AMV de longitud
completa.
Los pSP64 y pSP65 son designados para la
transcripción in vitro bajo el control de un promotor SP6 de un bacteriófago (Melton DA y col.
(1984) Nucl. Acids Res. 12:7035-7056; Krieg PA
y Melton DA (1984) Nucl. Acids Res. 12:70577070;. El pSP65A4 y el pSP64A4I dirigen respectivamente la sı́ntesis de secuencias multi-cadena
de ARN4 de AMV y secuencias de ARNa de
ARN4 de AMV. Cuando los dos plásmidos se cortan respectivamente por SmaI y EcoRI in vitro
los transcritos resultantes son esencialmente secuencias de ARNm de proteı́na de la cubierta de
longitud completa y el complemento a las mismas. Los fragmentos EcoRI/SmaI de ADNc de
AMV de pSP65A4 y pSP64A4I son idénticos.
Ejemplo 2
Pruebas in vitro de inhibición ARNa de la infección por AMV
Se infectaron in vitro protoplastos de tabaco
y alfalfa con ARN esencialmente según se describe por Samac DA y col. (1983) Virol. 131:455462; siendo la mayor modificación que el ARN se
añadió en un pequeño volumen (por ej. 10 µl)
al sedimento de protoplasto, que fue resuspendida después en sobrenadante residual antes de
la adición de polientilengliol (PEG). Esta modificación al procedimiento de Samac y col. consistente en añadir ARN al PEG antes de la combinación con los protoplastos llevó a una reducción
de aproximadamente cincuenta veces en la cantidad de ARN necesario para una infección. Se cree
que las condiciones de inoculación son desfavorables para la formación de duplex cadena de sentido:cadena de sentido inverso fuera de una célula.
Los ARN sintéticos fueron realizados esencialmente según se describe por Melton y col., véase
más arriba y por protocolo del vendedor de la SP6
polimerasa. Se sintetizaron los ARN con caperuza fueron sintetizados por inclusión de 0,5 mM
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mG5 ppp5 G y reducción de la concentración de
GTP a partir de 0,5 mM a 0,025 mM. el ARN4
de AMV sintético se templó por pSP65A4 linelizado con SmaI y el ARNa de ARN4 de AMV se
templó por pSP64A4I linealizado con EcoRI.
En un experimento tı́pico utilizando o protopolastos de alfalfa o de tabaco, ARN1, ARN2 y
ARN3 de AMV naturales mezclados con ARN4
con caperuza sintético, dieron como resultado infecciones de alrededor de dos tercios de los protoplastos inoculados. La inclusión de una cantidad
equivalente, relativa al ARN4 sintético de ARNa
de ARN4 con caperuza llevó a al menos una reducción de uno a cien en los niveles de infección,
y frecuentemente a una infección no detectable.
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Ejemplo 3
Preparación de secuencias de control de transcripción de CaMV
El pDOB512, que lleva secuencias de control
de transcripción del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (obtenido de Dr. Ken Richards,
Centre National de la Recherche Scientifique, Institute de Biologie Moleculaire y Cellulaire, 15, rue
Descartes, F-67084 Strasbourg, France) se construyó como sigue: (Para un análisis de CaMV,
véase Hohn T y col. (1982) Curr. Top. Microbiol. Inmunol. 96:193-236.) Un fragmento de
HindIII que lleva la región promotora de ARN 19S
de CaMV (nucleótidos 5376-5851 de CaMV) se insertó en pBR322 y se recortó dentro de un par de
bases de la posición de caperuza del transcrito de
19S. Un fragmento de HincII que porta el terminador de transcripción de CaMv 19S (nucleótidos
7018-7794 de CaMV) al que han sido añadidos
los ligandos BamHI, se insertó después detrás del
promotor 19S; el plásmido resultante se designó
como pDOB412. El ADN de pDOB412 se digirió
con Bg1II y Sa1I, se rellenó con el fragmento de
Klenow del ADN polimerasa I de E. coli, y se religó, eliminando por ello el ADN, el cual incluye
posiciones BamHI y HindIII, entre el sitio Bg1II
en la posición 7644 y el sitio Sa1I en la posición
650 y regenerando un sitio Bg1II. El plásmido resultante se designó como pDOB512.
Los extremos pegajosos del ADN de pDOB512
linealizado con HindIII se rellenaron con el fragmento de Klenow (o alternativamente por la
ADN polimerasa T4). El ADN de pDOB512 de
extremos romos se mezcló y ligó con ligandos
Bg1II disponibles comercialmente que se recortaron después por digestión con Bg1II y se religaron. La mezcla de ligado se transformó en
E. coli K802 y se aisló un transformante resistente
a ampicilina que albergaba un plásmido, designado pDOB513, el pDOB513 tiene secuencias de
control de transcripción 19S de CaMV en un fragmento Bg1II. Las posiciones SmaI y BamHI se
encuentran entre los segmentos de ADN que tienen el promotor y la posición de poliadenilación
en pDOB412, pDOB512 y pDOB513, proporcionando por ello una localización conveniente para
la inserción de ADN extraño que va a ser un templado para un transcrito.
Ejemplo 4
Colocación de ADNc de AMV detrás del promotor de CaMV
Se digirió el ADN de pSP65A4 con EcoRI y
SmaI y el ADNc de AMV de 0,89 kb se purificó
por dilución a partir de gel de agarosa después de
separación por electroforesis. El extremo adhesivo de EcoRI se convirtió en un extremo romo
por incubación con el fragmento de Klenow de la
ADN polimerasa I de E. coli. Después el ADN
de pDOB513 linelizado con SmaI se mezcló y
ligó con ADNc de extremo romo, y los productos de ligado se transformaron en MC1061. Los
ADNs de plásmidos aislados a partir de tansformantes resistentes a la ampicilina, se identificaron por hibridación con colonias de tinción a
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una sonda de ARN4 de AMV. Se identificó una
colonia que albergaba un plásmido, denominado
pDOBA4I, que tiene ADNc de AMV insertado entre las secuencias controladoras de transcripción
19S de CaMV orientadas de tal forma que al transcribirse, se sintetizarı́a un ARNa; es decir de
tal forma que el extremo EcoRI y una posición
terminal de BamHI interno están distantes del
promotor y próximos al terminador de transcripción. Una combinación de secuencias de control de transcripción de CaMV/ARNa de AMV
podrı́a extraerse a partir de pDOBA4I sobre un
fragmento Bg1II de 1,92 kpb.
Ejemplo 5
Construcción de pH400, un plásmido micro-Ti
El pH4-1 es un plásmido micro-Ti albergado
por E. coli K802 (pH4-1), que está depositado
como NRRL B-18009. El pH4-1 ha sido descrito por Sutton DW y col., solicitud de Patente
U.S. no. de serie 778.384∗, la cual se incorpora
aquı́ por referencia, y por Merlo D y col. (1985)
Abstracts, 1st Int. Cong. Plant Mol. Biol.,
ed.: Galau GA. El pH4-1 contiene dos fragmentos de ADN-T, un fragmento HindIII que se extiende entre las posiciones 602 y 2.290 (según
ha sido definido por Barker RF y col. (1983)
Plant Mol. Biol. 2:335-350) que lleva el borde
izquierdo de TL y secuencias de promotor asociadas con ORF1, y un fragmento SmaI/BclI que se
extiende entre las posiciones 11.207 y 14.711, teniendo un tml 3’ suprimido, un ocs intacto y el
borde derecho de TL . Entre la posición del sitio
HindIII 3.390 y la posición del sitio SmaI 11.207
(habiéndose convertido el sitio SmaI a un sitio
BglII de inserción de ligandos de BglII) de estos
∗
Véase también Gray, L.E. Plant Science (1986)
47:45-55. dos fragmentos hay un marcador seleccionable expresable en plantas. Este marcador
tiene un promotor de CaMV 19S, un gen estructural de resistencia a la kanamicina Tn5 que codifica neomicina fosfotransferasa II, y dos sitios de
poliadenilación, uno a partir de CaMV y otro a
partir de ORF26 de ADN-T, donado por un fragmento de ADN-T que se extiende en sitios HincII
en las posiciones 21.727 y 22.440. El gen de resistencia a la kanamicina se orienta paralelo a ocs y
tml y antiparalelo al promotor ORF1. La combinación ADN-T/marcador seleccionable se inserta
en la posición HindIII de pSUP106, un plásmido
de amplia gama de huéspedes de 11 kpb capaz
de mantenerse tanto en E. coli como en Agrobacterium (Priefer UB y col. (1985) J. Bacteriol.
163:324-330; E. coli CSH52 (pSUP106) está depositado como NRRL B-15486). El ADN-T está
orientado dentro del pSUP106 de tal forma que el
borde derecho de TL está próximo al sitio EcoRI
pSUP106, que está presente dentro del gen de resistencia al cloramfenicol de pSUP106.
El pH4-1 tiene dos sitios BglII, flanqueando
ambos el marcador seleccionable kan. Uno de los
sitios BglII se extrajo como sigue, dejando por ello
un único sitio BglII útil para la inserción de ADN
codificante extraño. Se linealizó el ADN de pH41 por digestión parcial con BglII y se aisló ADN
lineal de longitud completa por electroforesis. Se
eliminaron entonces los extremos pegajosos del
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BglII por incubación con el fragmento de Klenow
de la ADN polimerasa I de E. coli. El ADN resultante de extremos romos se religó a si mismo
y se transformó en E. coli. Los ADN de plásmido
aislados a partir de transformantes resistentes a
cloramfenicol se identificaron por análisis de restricción y se identificó una colonia que albergaba
un plásmido denominado pH400. El pH400 era
idéntico al pH4-1 excepto en la ausencia del sitio BglII entre el gen kan y el promotor ORF1,
el único sitio BglII del pH400 estaba localizado
entre el gen kan y el gen ocs.
Ejemplo 6
Inserción de un gen ARNa de AMV4 en pH400
El ADN de pDOBA4I se digirió con BglII y
después se mezcló y ligó con ADN de pH400 linealizado con BglII. Después de la transformación en
MC1061 y de la selección para resistencia al cloramfenicol, las colonias se tintaron e hibridaron
con una sonda de ARN4 de AMV. Se identificó
una colonia que albergaba un plásmido, que se
denominó pH400A4I, que tenı́a un gen ARNa insertado en el sitio BglII de pH400. El pH400A4I
tiene un gen ARNa que tiene secuencias de ARN4
de AMV de longitud completa, estando orientado
el gen paralelamente al gen tml de 3’ eliminado,
ocs, y el marcador seleccionable para kanamicina.
Ejemplo 7
Transformación de la planta
Se transfirió por la técnica de emparejamiento
triparental pH400A4I a A. tumefaciens LBA4404
(Ooms G y col. (1981) Gene 14:33-50), una cepa
movilizante de micro-Ti, que alberga el gen vir
(Ruvkun GB y Ausbel FM (1981) Nature 289:8588), que es bien conocida en la técnica, o por
emparejamiento a partir de una cepa de movilización de E. coli, por ej. SM10 (NRRL B15481) o S17-1 (NRRL B-15483) (Simon R y col.
(1982) Biotechnol. 1:784-791 se obtuvo tejido
de hojas de tabaco de plantas Xanthimc de 4
o 5 semanas cultivadas axenicamente en cajas
Magenta. La inoculación se realizó mediante
una modificación del procedimiento Horsch RB
y col. (1985) Science 227:1229-1231. Los inóculos
se prepararon colocando dos espirales de agrobacteria en 10 ml de caldo-L. Después de suspensión por pipeteo enérgico con una pipeta Pasteur, los inóculos se podı́an utilizar inmediatamente. Las hojas se escindieron y se extrajeron las partes intercostales, las superficies cortadas se humedecieron con caldo-L para ayudar a
mantener las hojas húmedas. Los trozos de hoja
eran de alrededor de 2-4 mm de ancho y de alrededor de 7-10 mm de longitud. Los trozos de
hoja se sumergieron en el inóculo durante 5-10
min, aunque, en algunos experimentos, los trozos de hoja fueron solamente sumergidos en el
inóculo o se infiltraron con el inóculo en un matraz de vacı́o. Los trozos fueron secados sobre
papel de filtro estéril y se colocaron con el anverso hacia abajo sobre placas de alimentación
preparadas a partir de un cultivo de suspensión
Xanthi. Las placas de alimentación tenı́an un
medio SMPi (SMPi: MX− suplementado con
0,1 mg/l de ácido p-clorofenoxiacético (pCPA) y
7,5 mg/l de 6-(8,8-dimetilalilamino)purina (2iP);
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MX− : 1,65 g/l NH4 NO3 , 1,9 g/l KNO3 , 440 mg/l
CaCl2·H2 O, 370 mg/l MgSO4 ·7H2 O, 170 mg/l
KH2 PO4 , 0,83 mg/l KI, 6,2 mg/l H3 BO3 , 22,3
mg/l MnSO4 ·4H2 O, 8,6 mg/l ZnSO4 ·7H2 O, 0,25
mg/l Na2 MoO4 ·2H2 O, 0,025 mg/l CuSO4 ·5H2 O,
0,025 mg/l CoCl2 ·6H2 O, 1 g/l inositol, 50 mg/l
ácido nicotı́nico, 50 mg/l piroxidina·HCl, 50 mg/l
tiamina·HCl, 30 g/l sacarosa, pH 5,8, solidificada
con 8 g/l de agar). Los trozos de hoja se retiraron
de las placas de alimentación después de 4-6 dı́as
y se colocaron en medio SMPi suplementado con
500 mg/l de carbenicilina, 50 mg/l de cloxacilina,
y 100-300 mg/l de kanamicina (siendo óptimo 200
mg/l). Los brotes resultantes se escindieron y
se colocaron en medio MX− suplementado con
100-300 mg/l de kanamicina (siendo óptimo 200
mg/l).
Ejemplo 8
Expresión en plantas
Se autofertilizaron plantas de tabaco regeneradas descendientes de células transformadas por
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A. tumefaciens LBA4404 (pH400A4I). Las semillas resultantes se germinaron en MX− suplementado con 100-300 mg/l de kanamicina (siendo
óptimo 200 mg/l) para seleccionar las plantas que
contenı́an el ADN-T de comportamiento de gen
ARNa. La presencia de ARNa se confirmó por
análisis de tinción Northern. Las plantas de tabaco no transformadas de control y las plantas
que contienen gen ARNa se probaron siendo inoculadas con los cuatro ARN de AMV después de
abrasión de las hojas con carborundo, un procedimiento bien conocido en la técnica. Bajo
estas condiciones, es necesaria la traducción de
moléculas ARN4 de AMV presentes en el inóculo
para el establecimiento de una infección de AMV.
Cuando se comparan con las plantas de control, se
observa que las plantas que tienen un gen ARNa
son resistentes a la infección por AMV o que tienen sı́ntomas retrasados o reducidos, dependiendo
del grado de expresión de ARNa en tejidos de una
planta particular.
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REIVINDICACIONES
1. Una célula de planta, tejido de planta, semilla de planta o planta resistente a virus que
no es infectada por un virus y que comprende
una molécula de ADN integrada de forma estable
que comprende un promotor, un ADNc que codifica ARN antisentido a al menos una parte de
un genoma ARN de un virus de planta que tiene
un genoma ARN tripartito de cadena simple, de
cadena múltiple, y un terminador de transcrito,
en donde dicho ADNc codifica ARN antisentido
capaz de conferir resistencia viral a una planta,
en donde el promotor, el ADNc, y el terminador de transcrito tienen tal posición y orientación
unos con respecto a otros que el ARN antisentido
puede transcribirse en una célula de planta bajo
control del promotor y del terminador.
2. Una célula de planta, tejido de planta, semilla de planta o planta resistente a virus que no
es infectada por un virus y que comprende una
molécula de ADN integrada de forma estable que
comprende un promotor, un ADNc que codifica
ARN antisentido a ARN4 de un virus de planta
que tiene un genoma ARN tripartito de cadena
simple, de cadena múltiple, y un terminador de
transcrito, en donde dicho ADNc codifica ARN
antisentido capaz de conferir resistencia viral a
una planta, en donde el promotor, el ADNc, y
el terminador de transcrito tienen tal posición y
orientación unos con respecto a otros que el ARN
antisentido puede transcribirse en una célula de
planta bajo control del promotor y del terminador.
3. Una célula de planta, tejido de planta, semilla de planta o planta resistente a virus que no
es infectada por un virus y que comprende una
molécula de ADN integrada de forma estable que
comprende un promotor, un ADNc que codifica
ARN antisentido a ARN1, ARN2 o ARN3 de un
virus de planta que tiene un genoma ARN tripartito de cadena simple, de cadena múltiple, y un
terminador de transcrito, en donde dicho ADNc
codifica ARN antisentido capaz de conferir resistencia viral a una planta, en donde el promotor,
el ADNc, y el terminador de transcrito tienen tal
posición y orientación unos con respecto a otros
que el ARN antisentido puede transcribirse en
una célula de planta bajo control del promotor
y del terminador.
4. La célula de planta, el tejido de planta, la
semilla de planta, o la planta de cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 o 3, en donde el virus es del
grupo de virus del mosaico de la alfalfa.
5. La célula de planta, el tejido de planta, la
semilla de planta, o la planta de la reivindicación
4 en donde el virus de planta es AMV.
6. La célula de planta, el tejido de planta, la
semilla de planta, o la planta de la reivindicación
4 en donde el virus de planta es AMV cepa 425.
7. La célula de planta, el tejido de planta,
la semilla de planta, o la planta de cualquiera de
las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en donde el virus de
planta se selecciona entre el grupo que consta de
un ilarvirus, un bromovirus, un cucumovirus y un
hordeivirus.
8. La célula de planta, el tejido de planta, la
semilla de planta, o la planta según cualquiera de
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las reivindicaciones precedentes, en donde el ARN
antisentido es complementario a una secuencia viral 5’ no traducida.
9. La célula de planta, el tejido de planta, la
semilla de planta, o la planta según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en donde el ARN
antisentido es complementario a una posición de
iniciación de traducción viral.
10. La célula de planta, el tejido de planta, la
semilla de planta, o la planta según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en donde el ARN
antisentido es complementario a una secuencia viral 3’ conservada.
11. La célula de planta, el tejido de planta, la
semilla de planta, o la planta según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en donde el ADNc es
esencialmente ADNc de longitud completa.
12. La célula de planta, el tejido de planta,
la semilla de planta, o la planta según cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en donde el
terminador del transcrito es una posición de poliadenilación.
13. La célula de planta, el tejido de planta,
la semilla de planta, o la planta según la reivindicación 12, en donde la posición de poliadenilación
es una posición de poliadenilación de CaMV.
14. La célula de planta, el tejido de planta, la
semilla de planta, o la planta según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en donde dicha
molécula de ADN comprende adicionalmente un
marcador seleccionable o identificable en planta.
15. La célula de planta, el tejido de planta,
la semilla de planta, o la planta según la reivindicación 14, en donde el marcador seleccionable
codifica la neomicina fosfotransferasa.
16. La célula de planta, el tejido de planta, la
semilla de planta, o la planta según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en donde dicha
molécula de ADN comprende adicionalmente un
gen ocs.
17. La célula de planta, el tejido de planta,
la semilla de planta, o la planta según cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en donde la
molécula de ADN comprende adicionalmente una
repetición de borde ADN-T.
18. La célula de planta, el tejido de planta,
la semilla de planta, o la planta según la reivindicación 17, en donde el ADN-T es el ADN-T de
pH400, en donde el pH400 puede obtenerse extrayendo la posición BglII entre el gen kan y el
promotor ORF1 por digestión parcial de pH4-1 y
tratamiento de pH4-1 lineal de longitud completa
con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli y subsiguiente religado de los
extremos romos.
19. La célula de planta, el tejido de planta,
la semilla de planta, o la planta según la reivindicación 18, en donde el ADN-T es el ADN-T de
pH400A4I (NRRL B-18062).
20. La utilización de una molécula de ADN
según se cita en cualquiera de las reivindicaciones
1 a 19 para conferir resistencia viral a una célula
de planta, tejido de planta, semilla de planta o
planta.
21. La utilización de una molécula de ADN
según la reivindicación 20 en donde la resistencia
viral es para el virus AMV.
22. La utilización de una molécula de ADN
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según la reivindicación 20 en donde la resistencia
viral es para el virus seleccionado entre el grupo
que consta de un ilarvirus, un bromovirus, un cucumovirus y un hordeivirus.
23. Un procedimiento para producir una
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planta resistente a un virus de planta que comprende transformar una célula de planta con una
molécula de ADN según se ha citado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
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Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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