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Investiga la vacuna
de la malaria
Taller de experimentación
PROTOCOLO
Introducción
La malaria es considerada la enfermedad más
importante del mundo debida a un parásito y es
responsable de la muerte de aproximadamente 800.000 personas cada año, especialmente
niños menores de cinco años y mujeres embarazadas. Según la Organización Mundial de la
Salud (OMS), unos 3.000 millones de personas
corren el riesgo de contraer la infección, y en el
año 2010 se produjeron 225 millones de casos
de malaria en el mundo, de los cuales un 90%
tuvieron lugar en África.
Actualmente, la malaria es endémica en más de
100 países localizados en el África Subsahariana
y regiones del sur de Asia, de Latinoamérica y de
Oceanía. Los últimos informes indican que la mitad de la población mundial vive en áreas donde
existe riesgo de contraer la enfermedad y donde,
además de las consecuencias sobre la salud de
la población, la malaria contribuye a debilitar
aún más la situación económica de la zona.
Para erradicar la enfermedad, en las zonas con
alto riesgo de transmisión se están llevando a
cabo varias intervenciones que suponen una
Países o zonas donde se produce la transmisión de malaria
combinación de diferentes medidas que incluyen la utilización de mosquiteras impregnadas
de insecticida, de aerosoles insecticidas, de
tratamientos de prevención, la implantación de
programas educativos e intervenciones ambientales, entre otras cosas.
La comunidad científica está trabajando intensamente para desarrollar una vacuna que
se cree que, en combinación con las medidas
actuales, podría contribuir significativamente a
un mejor control de la malaria. Actualmente ya
existe una vacuna que se encuentra en fase de
estudio clínico y que será efectiva en un 50% de
los casos.
En este taller investigarás con
diferentes candidatos a vacuna para decidir
cuál es el más eficaz.
Países o zonas con riesgo limitado de transmisión de malaria
Fuente: Organización Mundial de la Salud (OMS). Datos de 2009
2
¿Cómo se transmite la malaria?
La malaria es una enfermedad infecciosa que
se contagia mediante la picadura de un mosquito del género Anopheles que transmite parásitos del género Plasmodium y que por lo tanto
actúa como vector. Dentro del organismo humano, los parásitos se multiplican en el hígado y a
continuación infectan los glóbulos rojos. Entre
los síntomas de la malaria destaca la fiebre,
el dolor de cabeza y los vómitos, que aparecen
entre 10 y 15 días después de la picadura del
mosquito.
¿Cómo se está interviniendo para
controlar la malaria?
Las intervenciones fundamentales para controlar la malaria se dividen en varios grupos:
1
2
¿Por qué es necesaria una vacuna
contra la malaria?
Históricamente las vacunas han constituido
uno de los medios más eficaces para prevenir
enfermedades y salvar vidas, especialmente
en el caso de las enfermedades infecciosas. La
obtención de una vacuna parcialmente eficaz
podría significar la posibilidad de salvar a cientos de miles de vidas.
La obtención de una vacuna supondrá un gran
paso adelante y se podrá añadir al arsenal actual de medidas utilizadas para la prevención de
la malaria, como las mosquiteras impregnadas
con insecticida y el tratamiento oportuno y adecuado de los casos diagnosticados de malaria.
Como su eficacia a corto plazo será parcial, no
sustituirá estas medidas, sino que las complementará y, conjuntamente, constituirán una
respuesta integral para la prevención de la
malaria.
Estrategias contra el
mosquito o vector, como la
fumigación de los espacios
cerrados con insecticidas.
Estrategias para evitar
el contacto vectorhuésped, como el uso de
mosquiteras impregnadas
con insecticida.
3
Estrategias contra el
parásito. Dentro de este
grupo de estrategias,
encontramos el tratamiento
con combinaciones de
fármacos basados en
una molécula llamada artemisinina, que es
rápido y eficaz. Una vacuna también sería una
estrategia de control contra el parásito que,
en combinación con otras estrategias, podría
contribuir significativamente a la erradicación
de la malaria.
3
¿Qué hacemos en ISGLOBAL, el Instituto de Salud Global de Barcelona?
El Instituto de Salud Global de Barcelona
(ISGlobal) es una organización sin ánimo de
lucro, cuyo objetivo es mejorar la salud y el
desarrollo de las poblaciones más vulnerables
mediante la generación, la gestión, la transmisión y la aplicación de conocimientos. Su visión
es un mundo donde todos podamos gozar de
una buena salud y, entre otras instituciones,
cuenta con el apoyo de la Obra Social "la Caixa".
Uno de los pilares esenciales de ISGlobal es la
investigación centrada en problemas de salud
que afectan a las poblaciones más vulnerables
y se desarrolla desde el Centro de Investigación
en Salud Internacional de Barcelona (CRESIB).
La investigación sobre la malaria que se lleva a
cabo desde el CRESIB se centra en:
1. Estudio de las bases moleculares de la
enfermedad, así como de las diferentes
respuestas inmunitarias.
2. Desarrollo de nuevos fármacos y evaluación
de su seguridad, eficacia y efectividad.
3. Evaluación de las características epidemiológicas de la malaria en diferentes entornos y
de los aspectos socioculturales que la rodean.
4. Análisis de la efectividad de diferentes herramientas de prevención, así como de la relación coste-efectividad de las intervenciones.
Dentro del ámbito (4), el CRESIB lleva a cabo
estudios clínicos de seguridad, de eficacia y de
efectividad de vacunas. Actualmente participa
en el desarrollo de la vacuna RTS,S contra la
malaria, que está resultando efectiva en más
del 50% de los niños infectados. En paralelo, los
investigadores del CRESIB están investigando
para identificar nuevos candidatos a vacuna.
4
Objetivos del taller
1
En este taller te invitamos a analizar diferentes candidatos a vacuna contra la malaria con
los que el CRESIB está investigando, para que
identifiques cuál es el mejor candidato. Los
candidatos a vacuna del CRESIB han sido obtenidos de proteínas del parásito que previamente
se han purificado.
Para analizarlos dispondrás de varias muestras
de sangre de personas residentes en zonas
afectadas por malaria que ya han sufrido la
enfermedad en varias ocasiones y que ya están
inmunizadas.
Para confirmar que nuestros candidatos a vacuna son efectivos, tenemos que comprobar que
las personas inmunizadas han desarrollado una
respuesta contra esos candidatos. Si en las personas se observa una activación de la respuesta
inmunitaria contra las proteínas candidatas,
significará que podrían ser buenos candidatos a
vacuna porque también podrían desencadenar
la respuesta necesaria para protegerse contra
futuras infecciones.
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3
5
El objetivo de este taller es que te familiarices
con una de las técnicas más utilizadas en los
laboratorios de biomedicina, la técnica ELISA
(“Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”).
Se trata de un análisis para detectar si en
las muestras de sangre hay anticuerpos. La
presencia de anticuerpos específicos contra los
candidatos indicará que ha sido capaz de activar una buena respuesta inmunitaria y que, por
lo tanto, se podría tratar de un buen candidato.
Gracias a esta técnica descubriremos concretamente cuál de los antígenos de los que disponemos en el laboratorio es un buen candidato a
vacuna contra la malaria.
Principios básicos de la técnica ELISA
El principio básico de esta técnica se basa en la
interacción del candidato a vacuna, o antígeno
(1), con el anticuerpo (2). Un anticuerpo específico se unirá a un antígeno específico para dar
un complejo antígeno-anticuerpo exclusivo.
Para llevar a cabo la identificación, se utilizan
unos anticuerpos que tienen asociada una molécula llamada enzima (3), que tiene la capacidad
de reaccionar con una sustancia llamada sustrato (4) que le añadiremos, y producir un color.
La técnica ELISA nos permite identificar si
había anticuerpos, y por lo tanto, si se han
formado los complejos antígeno-anticuerpo al
poner en contacto las muestras de sangre con
los candidatos a vacuna.
Así pues, si la muestra tenía el anticuerpo que
queríamos detectar, éste se unirá al que añadiremos unido a una enzima, que a la vez hará
que el sustrato cambie de color y de este modo
nos indicará el resultado positivo.
Sustrato
Anticuerpo
Enzima
Antígeno
1. Antígeno: cualquier material extraño que se une de forma específica a los anticuerpos o linfocitos específicos para activar
una respuesta inmunitaria. En general, los antígenos tienen un peso molecular elevado y normalmente son proteínas o
polisacáridos.
2. Anticuerpo: proteínas (inmunoglobulinas o Ig) del suero que se forman como respuesta a la invasión de moléculas
extrañas en el organismo, bien por exposición natural a un antígeno o por inmunización mediante vacunas. Tienen
forma de Y y están formados por cuatro cadenas polipeptídicas que se mantienen unidas mediante enlaces disulfuro
intercatenarios. Los anticuerpos tienen una región constante y una región variable.
3. Enzima: proteína que facilita reacciones específicas del metabolismo.
4. Sustrato: solución que contiene un compuesto sobre el cual actuará una enzima.
6
Organización del taller
Para analizar qué candidato a vacuna o antígeno
es el más efectivo, analizaremos si las muestras
de sangre de personas inmunizadas contra ma-
laria tienen anticuerpos contra los mismos.
Para ello dividiremos el experimento en 3 etapas principales.
1. UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS CANDIDATAS (O ANTÍGENOS) A LA SUPERFICIE DE LOS POCILLOS
El primer paso será fijar las proteínas candidatas objeto de estudio a un soporte sólido
2. FORMACIÓN DE COMPLEJOS ANTÍGENO-ANTICUERPO
Después añadiremos las muestras de sangre, concretamente el suero (que corresponde a las
muestras de sangre una vez extraídas las células y los factores de coagulación), y un anticuerpo
marcado con una enzima que denominaremos anticuerpo secundario. En las muestras de sangre
donde esté presente el anticuerpo de estudio se formarán complejos antígeno-anticuerpo, que a su
vez se unirán al anticuerpo marcado con la enzima.
Anticuerpo
secundario
marcado con
enzima
Suero
de los pacientes
3. LECTURA DE LA REACCIÓN
Por último, añadiremos el sustrato de la enzima, que cambiará de color en caso de que hubiera
complejos antígeno-anticuerpo. De este modo podremos saber si las muestras de sangre tenían el
anticuerpo de estudio y en qué cantidad.
Sustrato
de la enzima
Resultados y conclusiones
Con los resultados obtenidos podremos decidir
qué candidato a vacuna activa una respuesta
inmunitaria más intensa y por lo tanto puede
ser el mejor candidato.
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Equipamiento y material
necesario
Instrumentos y utensilios de laboratorio
Agitador magnético (1)
(para preparar PBS-Tween)
Cronómetro
Núcleo magnético y
"pesca-núcleos"
Probeta
de 100 ml
Micropipeta
de 20 a 200 µl (2)
Botella de cristal
de 250 ml
Embudo
Material fungible
Tiras de 12 pocillos
de ELISA y soportes
Pipetas Pasteur
de plástico graduadas
Puntas para micropipeta
Papel absorbente
Rotulador permanente
Guantes, gafas y bata
1. En caso de que no tengas agitadores magnéticos, puedes comprar el PBS líquido
2. En caso de que no tengas micropipetas, puedes utilizar pipetas Pasteur de poco volumen
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Reactivos y muestras
A
B
Sustrato
Candidatos a vacuna
(antígenos)
Sustrato o solución de
revelado
Detergente Tween-20 (4)
C+
C-
Controles positivos
y negativos (5)
1
Agua destilada
Anticuerpo 2ario
Solución tampón PBS (3)
Anticuerpo secundario
con enzima
(peroxidasa)
2
3
4
Muestras de suero de 4 personas residentes en zonas
endémicas de la malaria que son inmunes a la enfermedad
3. Ayuda a mantener el pH de la solución gracias a fosfatos de sodio y de potasio.
4. Ayuda a prevenir uniones de anticuerpos inespecíficas
5. C+: contiene una mezcla de sueros de personas residentes en zonas endémicas de malaria
y que son inmunes a la enfermedad. C-: mezcla de sueros de personas que nunca han estado
expuestas a la malaria
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Procedimientos
Para determinar la presencia o la ausencia de
anticuerpos específicos contra los 2 antígenos
candidatos a vacuna que tenemos en el laboratorio, confrontaremos la sangre (concretamente
1
el suero) de diferentes pacientes que residen en
zonas endémicas de malaria con estos antígenos,
para ver si en estos sueros encontramos anticuerpos específicos contra nuestros antígenos.
Unión de los antígenos a la superficie de los pocillos
Las tiras de micropocillos se recubren con los
candidatos a vacuna (antígenos) que queremos
probar para ver si serían buenos candidatos a
una vacuna contra la malaria.
La unión de estos antígenos a la superficie de
los pocillos se produce con facilidad por estar
hechos con un plástico tratado que tiene una
gran afinidad para unir proteínas.
PROTOCOLO PARA LA UNIÓN DE LOS ANTÍGENOS A LA SUPERFICIE DE LOS POCILLOS
1
2
A continuación anota qué pondrás en cada pocillo (controles, muestras de sangre
y nombre de los antígenos que analizarás).
Rotula los pocillos marcando
donde pondrás cada muestra.
10
3
Prepara una solución de lavado (PBS-Tween 0,05%).
A
Mide 200 ml de agua destilada utilizando la
probeta y enrasando con la pipeta Pasteur.
Añade los 200 ml de agua destilada a la
botella utilizando el embudo.
C
Cuando la píldora se haya disuelto, extrae el
núcleo magnético y añade 100 µl de Tween-20
con una pipeta Pasteur de plástico.
B
Deposita el núcleo magnético dentro de
la botella y diluye con el agua 1 pastilla
de PBS utilizando el agitador magnético.
D
Remuévelo bien invirtiendo la botella
varias veces.
Nota: La solución de lavado contiene PBS (phosphate buffer saline), que permite que los anticuerpos se mantengan en un
ambiente estable que ayuda a conservar su estructura. El Tween-20 es un detergente que ayudará a eliminar las proteínas
que se hayan podido unir de forma no específica y se une a las partes del pocillo que no están cubiertas por antígeno.
De este modo se reduce el ruido de fondo.
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4
5
Añade los dos
antígenos problema
a los pocillos
correspondientes
utilizando la
micropipeta
(50 µl por pocillo).
Es importante que
uses una punta
limpia para dispensar
los antígenos,
así se evitarán
contaminaciones.
Deja incubar durante 5 minutos a
temperatura ambiente.
6
7
Lávalo para eliminar el exceso de antígeno
no unido a la tira. Para ello, llena los
pocillos con la solución de lavado mediante
una pipeta Pasteur de plástico.
Elimina los restos de antígeno mediante
inversión de la tira sobre un papel absorbente.
8
Descarta la solución de lavado mediante
inversión de la tira sobre un papel absorbente.
9
Repite los pasos 7 y 8 una vez más.
12
2
Formación de complejos antígeno-anticuerpo
En este paso, primero acondicionaremos el
suero de los pacientes para analizar si contienen anticuerpos contra el candidato a vacuna.
A estos anticuerpos que queremos analizar los
llamaremos anticuerpos primarios. Después
añadiremos un anticuerpo secundario marcado
con una enzima llamada peroxidasa. Como a
cada anticuerpo primario se le puede unir más
de un anticuerpo secundario, la cantidad de
color que se obtendrá en el paso tres será amplificada. De este modo la técnica tendrá más
sensibilidad.
Anticuerpo
secundario
marcado con
enzima
Suero de los
pacientes
PROTOCOLO DE FORMACIÓN DE COMPLEJOS ANTÍGENO-ANTICUERPO
1
2
Añade los controles positivos y negativos
a los pocillos correspondientes utilizando
la micropipeta (50 µl por pocillo).
El control positivo (C+) contiene una
mezcla de sueros de personas residentes
en zonas endémicas de malaria y que
son inmunes a la enfermedad. El control
negativo (C-) contiene una mezcla de
sueros de personas que nunca han
estado expuestas a la malaria.
Añade las distintas muestras de
sueros de 4 residentes en zonas
endémicas de malaria a los pocillos
correspondientes utilizando la
micropipeta (50 µl por pocillo).
13
3
4
Déjalo incubar durante 5 minutos a
temperatura ambiente.
5
Elimina el exceso de muestra mediante
inversión de la tira sobre un papel absorbente.
6
Lava todos los pocillos para eliminar
los anticuerpos que no han reaccionado
con los antígenos y que por lo tanto no
son específicos. Llena los pocillos con la
solución de lavado mediante una pipeta
Pasteur de plástico.
7
Descarta la solución de lavado mediante
inversión de la tira sobre un papel absorbente.
8
Repite los pasos 5 y 6 dos veces más.
Con la micropipeta, añade el anticuerpo
secundario que está unido a una enzima
a todos los pocillos (50 µl por pocillo).
14
9
10
Elimina el exceso de anticuerpo
secundario mediante inversión de la tira
sobre un papel absorbente.
Deja incubar durante 5 minutos a
temperatura ambiente.
11
12
Lava los pocillos llenándolos con la
solución de lavado mediante una pipeta
Pasteur de plástico.
Descarta la solución de lavado mediante
inversión de la tira sobre un papel absorbente.
13
Repite los dos pasos anteriores 3 veces más.
15
3
Lectura de la reacción
Después de lavarlo para eliminar todas las
moléculas marcadas no fijadas en forma de
complejos antígeno-anticuerpo, se añade el
sustrato enzimático en solución, que facilitará
el cambio de color.
Sustrato
de la enzima
PROTOCOLO DE LA LECTURA DE LA REACCIÓN
1
2
Añade el sustrato de la enzima a todos
los pocillos con la micropipeta
(50 µl por pocillo).
Déjalo incubar durante 5 minutos.
Durante este tiempo el sustrato se unirá
a la enzima e irá apareciendo el color a
temperatura ambiente.
16
3
Recoge los resultados en forma de gráfico de barras.
ANTÍGENO 1
Intensidad
máximo
mínimo
Muestras
C+
C-
M1
M2
M3
M4
ANTÍGENO 2
Intensidad
máximo
mínimo
Muestras
C+
C-
M1
M2
M3
M4
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Resultados y conclusiones
Interpreta y apunta los resultados
1. ¿Qué antígeno de los que has probado crees que es el mejor candidato a vacuna?
¿Crees que los antígenos que has probado son un buen candidato a vacuna? ¿Por qué?
2. ¿Cuándo una reacción es positiva y cuándo es negativa? ¿Por qué?
3. ¿Por qué crees que se utilizan los controles?
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4. ¿Qué parte del anticuerpo primario es reconocida por el anticuerpo secundario: la región
constante o la variable? Razona la respuesta.
5. ¿Qué pasaría si no hiciéramos los lavados antes de poner el sustrato de revelado?
6. ¿Podríamos utilizar sangre de compañeros de tu clase para determinar si nuestros antígenos
de laboratorio son buenos candidatos para una vacuna contra la malaria? Razona la respuesta.
7. ¿Crees que con este experimento ha quedado demostrado que el candidato seleccionado
estimula la respuesta inmunitaria? ¿Tendría que hacerse algún otro tipo de experimento para
evaluar si también es capaz de activar algún otro tipo de respuesta?
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Anexo I
Precauciones de seguridad
INFÓRMATE
Localiza los elementos de seguridad del laboratorio o el espacio habilitado para experimentar
(extintores, duchas o baño, salidas, etc.). Lee
atentamente las instrucciones antes de hacer
un experimento. No olvides leer las etiquetas
de seguridad de reactivos y aparatos.
UTILIZA VESTIMENTA ADECUADA
Guantes, bata y gafas de protección.
NORMAS GENERALES
Está prohibido fumar, comer o beber en el laboratorio o en el espacio habilitado para experimentar.
Lávate las manos antes de salir del laboratorio. Trabaja ordenadamente, pulcramente y sin
prisas. Si se te cae algún producto, recógelo inmediatamente. Deja siempre el material limpio
y ordenado. No uses nunca un equipo o aparato
sin conocer perfectamente su funcionamiento.
MANIPULACIÓN DE CRISTAL
Protégete las manos cuando manipules material de cristal. No uses cristal agrietado.
PRODUCTOS QUÍMICOS
No uses ningún frasco de reactivos sin etiqueta.
No huelas, inhales, pruebes o toques los productos químicos. No pipetees nunca con la boca.
Ponte guantes y lávate las manos a menudo si
usas productos tóxicos o corrosivos. No acerques
USO OBLIGATORIO
DE GAFAS
USO OBLIGATORIO
DE BATA
USO OBLIGATORIO
DE GUANTES
envases de reactivos a una llama. No calientes
líquidos inflamables. Transporta las botellas
sujetándolas por la base, nunca por la boca.
ELIMINACIÓN DE RESIDUOS
Deposita en contenedores especiales y debidamente señalizados el cristal roto, los reactivos
tóxicos, nocivos o perjudiciales para el medio
ambiente y los residuos biológicos. No tires
nunca residuos sólidos por el fregadero.
En caso de accidente, avisa inmediatamente
al educador. Recuerda: Ante cualquier duda,
consulta al educador.
PRECAUCIONES ESPECÍFICAS
PARA ESTE TALLER
En esta práctica deberás seguir las precauciones generales para la manipulación de productos químicos. A continuación se enumeran sólo
los que presentan los grados de peligrosidad
siguientes:
• PBS:
tóxico por ingestión, inhalación y contacto con
la piel.
• Tween 20:
tóxico por ingestión, inhalación y contacto con
la piel. Irritante.
Anexo II
Referencias de los reactivos
NOMBRE
PBS
Tween-20
CHK IGY, bagged (= ANTÍGENO)
RB ANTI-CHK, bagged (= PLASMA)
GAR-HRP, bagged (= ANTICUERPO SECUNDARIO)
SUSTRATO REVELADO
REFERENCIA
P4417-50TAB
P1379-100ML
1662406EDU
1662407EDU
1662408EDU
1662402EDU
CASA COMERCIAL
Sigma
Sigma
BioRad
BioRad
BioRad
BioRad
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Sigue investigando en Xplore Health!
Investigadores que han contribuido con contenidos: Laura Puyol, investigadora del CRESIB, ISGlobal.
DESARROLLADO POR
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licencia, visita http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/