doctorado en ciencias mención ingeniería genética vegetal
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UNIVERSIDAD DE TALCA INSTITUTO DE BIOLOGÍA VEGETAL Y BIOTECNOLOGÍA DOCTORADO EN CIENCIAS MENCIÓN INGENIERÍA GENÉTICA VEGETAL GENERACIÓN DE TOLERANCIA A DÉFICIT HÍDRICO MEDIANTE LA REGULACIÓN INDUCIDA DE LA SÍNTESIS DE TOCOFEROLES EN TABACO (Nicotiana tabacum L.) ANALIA ANTONELLA ESPINOZA CONTRERAS PROFESOR GUÍA: JOSÉ ANTONIO CASARETTO VARGAS 2013 Dedicada a Gustavo y Emma Lo mejor de mí. II GENERACIÓN DE TOLERANCIA A DÉFICIT HÍDRICO MEDIANTE LA REGULACIÓN INDUCIDA DE LA SÍNTESIS DE TOCOFEROLES EN TABACO (Nicotiana tabacum L.) GENERATION OF WATER DEFICIT TOLERANCE BY INDUCED REGULATION OF TOCOPHEROL SYNTHESIS IN TOBACCO (Nicotiana tabacum L.) ANALÍA ANTONELLA ESPINOZA CONTRERAS PROFESORES GUÍA: Dr. José Casaretto Vargas. Universidad de Talca, Instituto de Biología Vegetal y Biotecnología. 2 norte 685, casilla 747, Talca. [email protected] AGRADECIMIENTOS Agradezco a la Universidad de Talca y a MECESUP por la oportunidad y financiamiento para realizar el programa de Doctorado en Ciencias mención Ingeniería Genética Vegetal. El desarrollo de este trabajo fue financiado por el proyecto FONDEF D081-1118, beca CONICIT AT24100023, beca de pasantía FEBS gracias a la cual pude realizar una estadía de investigación que aportó importantes resultados y colaboraciones en la Universitat Jaume I, España. En este sentido, agradezco al Dr. Aurelio Gómez- Cadenas por permitirme acceder a su laboratorio y desarrollar mi pasantía doctoral. A la Dra. María López Climent por su grandiosa hospitalidad y disponibilidad profesional durante esta pasantía. A Victoria Ruz por su apoyo administrativo. A Mónica Yáñez por su colaboración técnica. A Alexis San Martin por su buena disposición y colaboración. A mis compañeros y colegas del laboratorio por sus aportes y consejos en distintas etapas de mi trabajo de tesis. De manera muy especial, agradezco también, a mi director de tesis, Dr. José Antonio Casaretto Vargas por su constante apoyo, guía y fortaleza otorgada a mi persona durante estos años. INDICE INDICE .................................................................................................................................................. I LISTA DE TABLAS........................................................................................................................... III LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................................... IV LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................................... VI RESUMEN ....................................................................................................................................... VIII ABSTRACT ........................................................................................................................................ IX 1 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.2.1 1.1.3 1.1.4 1.1.5 1.2 2 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1 Déficit Hídrico ..................................................................................................................................................... 2 Estrés oxidativo ................................................................................................................................................. 2 Mecanismos celulares antioxidantes. ...................................................................................................... 4 Tocoferoles........................................................................................................................................................... 5 Metabolismo de los tocromanoles. ........................................................................................................... 7 Tocoferoles y resistencia a estrés abiótico. .......................................................................................... 8 Estrategias de ingeniería genética y estrés abiótico. ....................................................................... 9 Hipótesis y objetivos .................................................................................................................................... 11 MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................12 2.1 Obtención y análisis de promotores ..................................................................................................... 13 2.1.1 Material vegetal .............................................................................................................................................. 13 2.1.2 Selección de promotores ............................................................................................................................ 13 2.1.3 Análisis in silico de las promotores en los genes seleccionados .............................................. 13 2.1.4 Promotores y construcciones para transformación transitoria .............................................. 14 2.1.5 Transformación transitoria....................................................................................................................... 15 2.1.6 Medición de actividad gusA ....................................................................................................................... 16 2.1.6.1 Tinción histoquímica de gusA .................................................................................................................. 16 2.1.6.2 Medición enzimática de gusA ................................................................................................................... 16 2.1.6.3 Cuantificación de proteínas por el método de Bradford ............................................................. 17 2.2 Obtención de líneas transgénicas que expresen el gen ScVTE2.1 bajo el control del promotor inducible ....................................................................................................................................................... 17 2.2.1 Material Vegetal .............................................................................................................................................. 17 2.2.2 Aislamiento de gen VTE2.1 de S. chilense ........................................................................................... 17 2.2.2.1 Obtención de las construcciones para transformación estable ............................................... 18 2.2.3 Transformación estable de plantas de N. tabacum ........................................................................ 18 2.2.4 Selección de líneas transgénicas de tabaco ....................................................................................... 19 2.2.5 Medición de tocoferoles .............................................................................................................................. 19 2.3 Evaluación del grado de tolerancia al déficit hídrico.................................................................... 20 2.3.1 Material vegetal. ............................................................................................................................................. 20 2.3.2 Tratamientos de déficit hídrico. .............................................................................................................. 20 2.3.3 Variables fisiológicas .................................................................................................................................... 20 2.3.3.1 Contenido relativo de agua........................................................................................................................ 20 2.3.4 Parámetros de daño ...................................................................................................................................... 20 I 2.3.4.1 2.3.4.2 2.3.4.3 2.3.4.4 2.3.4.5 2.3.4.6 2.3.4.7 2.4 3 Intercambio de gases en la hoja .............................................................................................................. 20 Rendimiento cuántico del PS II................................................................................................................ 21 Determinación de clorofila y carotenoides totales. ....................................................................... 21 Expresión relativa de genes indicadores de estrés........................................................................ 21 Determinación de la lipoperoxidación................................................................................................. 22 Determinación del contenido de prolina. ........................................................................................... 22 Determinación del contenido de ABA .................................................................................................. 23 Análisis estadístico ........................................................................................................................................ 23 RESULTADOS...................................................................................................................25 3.1 Selección de regiones promotoras inducibles por estrés ........................................................... 26 3.1.1 Selección de regiones promotoras P05340, P47770, P80160. ................................................ 26 3.1.2 Activación de los promotores seleccionados por deshidratación in planta ...................... 27 3.2 Generación de plantas transgénicas con el gen ScVTE2.1 .......................................................... 28 3.2.1 Identificación y análisis de secuencia de ScVTE2.1........................................................................ 28 3.2.2 Obtención de plantas de tabaco transgénicas que expresan SCVTE2.1 bajo el control de promotores activados por estrés............................................................................................................................ 32 3.3 Plantas transgénicas bajo condiciones de estrés. ........................................................................... 35 3.3.1 Daño en el sistema fotosintético. ............................................................................................................ 42 3.3.2 Contenido de y malondialdehído en las plantas sometidas a déficit hídrico. ................... 44 4 DISCUSIÓN .......................................................................................................................45 4.1 Las secuencias promotoras aumentan la expresión del gen reportero en condiciones de estrés ........................................................................................................................................................................... 46 4.2 Incremento en la concentración de α-tocoferol en condiciones de estrés. ........................ 48 CONCLUSIONES ................................................................................................................................51 5 LITERATURA CITADA. ...................................................................................................53 II LISTA DE TABLAS Tabla 1. Lista de partidores utilizados .............................................................................. 14 III LISTA DE FIGURAS Figura 1. Ruta Metabólica de vitamina E en plantas. .......................................................... 7 Figura 2. Representación esquemática de los elementos reguladores en los tres promotores inducibles. ...................................................................................................... 26 Figura 3. Inducción de promotores por estrés. ................................................................ 27 Figura 4. Análisis de la inducción de los promotores por deshidratación...................... 28 Figura 5. Relaciones filogenéticas entre las proteínas VTE2.1, VTE2.2 y HGGT ............. 29 Figura 6. Comparación de la secuencia aminoacídica de VTE2.1, VTE2.2 y HGGT de plantas. ............................................................................................................................................. 30 Figura 7. Análisis de topología de ScVTE2.1 ...................................................................... 31 Figura 8. Selección de líneas de tabaco transformadas genéticamente. ......................... 33 Figura 9. Expresión relativa de ScVTE2.1 inducidos por estrés en tabaco transgénico en condiciones de déficit hídrico. ........................................................................................... 34 Figura 10. Concentración de α-tocoferol en plantas de tabaco en condiciones de déficit hídrico. ................................................................................................................................ 34 Figura 11. Concentración de γ-tocoferol en plantas de tabaco en condiciones de déficit hídrico. ................................................................................................................................ 35 Figura 12. Fenotipo de plantas sometidas a déficit hídrico. ............................................ 37 Figura 13. Contenido relativo de agua en plantas de tabaco transgénicas en condiciones de déficit hídrico. ..................................................................................................................... 38 Figura 14. Tasa de asimilación de CO2 en plantas de tabaco en condiciones de déficit hídrico. ................................................................................................................................ 38 Figura 15. Conductancia estomática en plantas de tabaco en condiciones de déficit hídrico. ............................................................................................................................................. 39 Figura 16. Concentración de ácido abscísico en tabaco en condiciones de déficit hídrico. ............................................................................................................................................. 39 Figura 17. Concentración de prolina en plantas de tabaco en condiciones de déficit hídrico. ............................................................................................................................................. 40 Figura 18. Expresión relativa de NtER10 y NtRD29B.1 inducidos por estrés tabaco transgénico en condiciones de déficit hídrico. ................................................................. 41 IV Figura 19. Daño ocasionado por efecto de sequía en plantas tipo silvestre y transgénicas que expresan el gen ScVTE2.1. ........................................................................................... 43 Figura 20. Concentración de malondialdehído en hojas de plantas de tabaco en condiciones de déficit hídrico. ........................................................................................... 44 V LISTA DE ABREVIATURAS ABA AREB/ABF CaMV35S CH3COOH CO2 COR CRA DMPBQ DREB/CRT DXP ERO FSII GGDP GPX gs GusA H2O2 HGGT HPLC HPPD HPP HPT HVA1 LEA MDA MPBQ MS NACs NACR NPTII O2OH PDP PF PH PS QY R-COO RD26 RD29A TBA TBE TCA T-DNA VTE1 Ácido abscísico Elemento de unión y respuesta ABA Virus del mosaico de la coliflor 35S Ácido acético Dióxido de carbono Genes de respuesta a frio Contenido relativo de Agua 2,3-dimetil-6-fitol-1,4-benzoquinol Proteínas de union a DRE- /C-repeat-binding factor 1-deoxi-D-xilulosa- 5-fosfato Especies reactivas de oxigeno Fotosistema II Geranilgeranil difosfato Glutatión peroxidasa Conductancia estomática β-glucoronidasa Peróxido de hidrogeno homegentísico geranil-geranil transferasa Cromatografía líquida de alta resolución p-hidroxifenil-piruvato dioxigenasa p-hidroxifenilpiruvato Homogentísico fitol transferasa Genes regulados en presencia de ácido abscísico Proteínas abundantes en la embriogénesis tardía Malondialdehído 2-metil-6-fitol-1,4-benzoquinol Medio de cultivo Murashige y Skoog proteínas con dominio amonio terminal conservado de NAM, ATAF1, 2, y CUC2 Sitio para unión a NACs Gen de resistencia a kanamicina Singlete de oxigeno Grupo hidroxilo Fitol difosfato Peso fresco Peso hidratado Peso seco Eficiencia cuántica del fotosistema II Lipoperóxidos Proteína NAC Proteína de respuesta a la deshidratación Ácido tiobarbitúrico Tampón compuesto por Tris, borato y EDTA Ácido tricloroacético ADN de transferencia Tocoferol ciclasa VI VTE2.1/HPT1 VTE2.2 WT Homogentisati preniltransferasa Parálogo de VTE2.1 Plantas silvestres, no transformadas VII RESUMEN Los tocoferoles o vitamina E, son compuestos orgánicos esenciales que ayudan a proteger las membranas contra el daño oxidativo provocado por diversas condiciones de estrés ambientales. Diversos estudios han demostrado que las deficiencias de tocoferol pueden causar alteraciones en; la germinación, el transporte de fotoasimilados, un retardo del crecimiento y las respuestas propias frente al estrés abiótico. Con esto se puede inferir que los tocoferoles pueden influir en los procesos fisiológicos de las plantas. En esta tesis se ha utilizado la información genética y metabólica disponible para aumentar la acumulación de α-tocoferol en tabaco bajo condiciones de estrés, utilizando promotores inducidos por estrés y el gen VTE2.1 que codifica para la enzima homogentísico fitol transferasa (HPT) la cual cataliza el paso de prenilación en la síntesis de tocoferol. Plantas de tabaco transgénicas que expresan VTE2.1 de Solanum chilense bajo el control de tres promotores inducibles por estrés, no caracterizados y aislados de Arabidopsis, mostraron mayores niveles de α-tocoferol cuando se exponen a condiciones de sequía en comparación con el tipo silvestre. La mayor acumulación de α-tocoferol se correlaciona con un mejor estado hídrico, rendimiento fotosintético y la disminución de daño por estrés oxidativo evidenciada por menor lipoperoxidación y un retraso de la senescencia foliar. Nuestros resultados sugieren que VTE2.1 puede utilizarse para aumentar el contenido de vitamina E y para disminuir la sensibilidad a las condiciones ambientales estresantes. Los tres promotores inducidos por estrés utilizados en este trabajo han demostrado ser útil para nuevas estrategias biotecnológicas que mejoran la respuesta de las plantas al estrés abiótico. VIII ABSTRACT Tocopherols (vitamin E) are essential organic compounds that help protecting photosynthetic membranes against oxidative damage triggered by most environmental stresses. Tocopherol deficiency has been shown to cause alterations in germination, transport of photoassimilates, retarded growth and to affect normal responses to abiotic stresses, suggesting that tocopherols may influence a number of physiological processes in plants. A metabolic engineering approach was followed to enhance α-tocopherol accumulation under stress conditions in tobacco using stress-inducible promoters and the gene VTE2.1 encoding for the enzyme homogentisate phytyltransferase (HPT) which catalyzes the prenylation step in tocopherol synthesis. Transgenic tobacco plants expressing VTE2.1 from Solanum chilense under the control of three uncharacterized stress-inducible promoters isolated from Arabidopsis showed increased levels of α-tocopherol when exposed to drought conditions compared to the wild type. The accumulation of α-tocopherol correlated with improved water content and photosynthetic performance and decreased oxidative stress damage as evidenced by less lipid peroxidation and delayed leaf senescence. Our results suggest that VTE2.1 can be used to increase vitamin E content and to diminish sensitivity to environmental stresses. The three stress-induced promoters used in this work proved to be useful for new biotechnological approaches to improve plant responses to abiotic stress. IX 1 INTRODUCCIÓN 1 1.1 Déficit Hídrico El déficit hídrico, dependiendo de la especie y la intensidad del estrés, es una de las condiciones ambientales adversas más importantes que afecta directamente el rendimiento de los cultivos. El déficit hídrico ocurre cuando la tasa de transpiración excede a la absorción de agua; esto se puede deber por una disminución del agua en el ambiente, por bajas temperaturas o por suelos salinos. Estas condiciones por si solas o en conjunto, disminuyen el agua disponible en el citoplasma de las células generando estrés osmótico Xiong y col. (1999) Las respuestas de las plantas frente a este déficit hídrico es controlada por procesos fisiológicos que incluyen: el cierre de estomas, para evitar la pérdida de agua, regulado por la hormona ácido abscísico (Flexas y Medrano, 2002; Santabarbara y col., 2002; Neill y col., 2008) y sobre-expresión de las enzimas clave en la biosíntesis de osmolitos como prolina y proteínas involucradas en la tolerancia a la poca disponibilidad de agua (Neumann, 2008). Además ocurren cambios como perdida de turgencia celular por disminución del potencial hídrico el cual afecta directamente el crecimiento de la célula, reduciendo el área foliar e inhibiendo la fotosíntesis (Neill y col., 2008); variación de la respiración causando una disminución de la concentración de CO2 intracelular por el cierre estomático y en consecuencia una reducción de la tasa fotosintética. Esta respuesta multifactorial es parte del complejo mecanismo adaptativo el cual induce a su vez estrés oxidativo. 1.1.1 Estrés oxidativo En plantas, las principales especies reactivas de oxigeno (ERO) son: súper óxido (O 2-), peróxido de hidrógeno (H2O2), radical hidroxilo (OH), y lipoperóxidos (R-COO) descritas como moléculas de ácidos grasos en las que el grupo hidroxilo de la formación carboxilo se halla en un estado de singlete activado, confiriéndole propiedades de radical libre. Un origen importante en la producción de ERO es la cadena transportadora de electrones de los cloroplastos. Durante la fotosíntesis, los transportadores de electrones deben reducir y ceder electrones directamente al oxígeno molecular para producir el O2-. En condiciones ideales de crecimiento la producción es de 240 μM s-1 O2- y en estado estacionario 0,5 μM H2O2 en los cloroplastos (Mittler, 2002). En condiciones óptimas del crecimiento el sistema de defensa antioxidante ofrece una protección 2 adecuada contra el oxígeno activo y los radicales libres. Sin embargo no todo el oxígeno es directamente reducido a agua, ya que en muchas reacciones metabólicas se forman estados transicionales de O2 de alta reactividad química y poder oxidante (radicales libres y especies reactivas de oxigeno). Este desbalance entre la producción de radicales libres y su eliminación generará el estrés oxidativo. En condiciones de estrés, se altera la homeostasis celular y la producción de O2- aumenta de 240 a 720 μ s-1 y el nivel de H2O2 en estado estacionario de los cloroplastos alcanza valores de 5.15 μM (Mittler, 2002). Desde luego, los daños oxidativos derivados de situaciones ambientales adversas no se limitan a cloroplastos. Los efectos negativos sobre mitocondrias son también muy importantes y bajo ciertas condiciones de estrés, incluso mayores que los sufridos por los plastidios (Bartoli y col., 2004). Esto ocurre cuando la generación de especies químicas oxidantes rebasa la capacidad de producción o la actividad de especies antioxidantes, por lo cual es habitual una acumulación en las hojas de ERO que causan la oxidación de muchos componentes importantes celulares. El deterioro se produce a todo nivel y afecta especialmente a moléculas de proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y carbohidratos. Una de las estructuras celulares más afectadas por el estrés oxidativo son las membranas celulares, ya que en ellas se inician un proceso de oxidación de sus ácidos grasos no saturados conocido con el nombre de lipoperoxidación. Este es un deterioro estructural que implica la destrucción de los dobles enlaces del ácido graso, despolimerización de las cadenas hidrocarbonadas y debilitamiento de la resistencia de la membrana, la cual aumenta su permeabilidad y con ello disminuye su selectividad (Blokhina y col., 2003). Las proteínas también pueden ser modificadas por las especies reactivas de oxígeno a través de la interacción química directa o indirecta, donde el resultado final es la oxidación de aminoácidos. En un nivel más básico, los aminoácidos pueden ser modificados, por ejemplo, la cisteína puede ser oxidada a cistina, y el semialdehído glutámico es producido por la oxidación de arginina y prolina. Estas modificaciones pueden afectar a la función de las proteínas. En algunos casos, es posible que ocurra reparación de aminoácidos dañados in situ, cuando esto no es así las proteínas son removidas y degradadas (Dean y col., 1997; Moller y Kristensen, 2004). Con respecto a la degradación de clorofila y otros pigmentos fotosintéticos, los efectos mayores son la destrucción de proteínas del FSII y la formación de radicales orgánicos en los 3 lípidos de membrana, particularmente aquellos que contienen ácidos grasos con enlaces insaturados (Santabarbara y col., 2002). Esto genera la liberación de cadenas autopropagantes de oxidación, extendiendo el daño a otras regiones de la membrana (Baroli y Melis, 1996). La diversidad de los blancos susceptibles al ataque de EROs puede causar la muerte celular. Las plantas estresadas para adaptarse han desarrollado una variada y compleja respuesta de efectos fisiológicos a nivel metabólico, que componen los mecanismos capaces de contrarrestar el efecto nocivo del estrés oxidativo (Triantaphylidès y col., 2008). 1.1.2 Mecanismos celulares antioxidantes. Las células han desarrollado mecanismos de defensa a nivel metabólico para evitar el daño oxidativo que incluyen al menos dos sistemas: una vía enzimática de captura de especies reactivas de oxígeno y un mecanismo antioxidativo no enzimático. Con respecto a las funciones enzimáticas, estas constituyen la primera fase de defensa antioxidante. Esta cataliza la reacción de oxidación de los radicales de superóxido mediante la transformación en peróxido de hidrógeno, el cual puede ser oxidado a su vez por las actividad enzimas de gran eficiencia como lo son la catalasa o la glutatión peroxidasa (GPX), tanto que no puede ser saturada por H2O2 a ninguna concentración, su función es catalizar su conversión en H2O y O2. La GPX comparte su sustrato con la catalasa, sin embargo puede reaccionar de manera efectiva con lípidos y otros hidroperóxidos orgánicos, catalizando la reducción de diferentes hidroperóxidos (ROOH y H2O2) usando glutatión reducido (GSH) que es transformado en glutatión oxidado (GSSG) en el ciclo del glutatión (Palma y col., 2006). Con respecto al mecanismo antioxidativo no enzimáticos, se han descrito diferentes componentes. Dentro de los más importantes podemos mencionar el ácido ascórbico que reacciona rápidamente en la eliminación de superóxido, singletes de oxígenos, ozono y peróxido de hidrógeno. Además, regenera el antioxidante α-tocoferol de la radical-cromanoxil (Smirnoff, 1996; Chen y col., 2003). Los carotenoides, carotenos y xantofilas participan en la protección del aparato fotosintético frente a daño fotoinhibitorio. Los flavonoides e isoflavonoides tienen la capacidad de estabilizar la membrana disminuyendo su fluidez, al eliminar radicales libres y 4 quelar metales de transición, interrumpiendo de esta forma la propagación de ciclos oxidativos entre radicales orgánicos (Allen, 1995; Green y Durnford, 1996; Havaux y col., 2007). Los tocromanoles, compuestos por tocoferoles y tocotrienoles son importantes constituyentes de las membranas de los cloroplastos en las plantas verdes. Los tocotrienoles son productos de menor distribución en la naturaleza; tienen una actividad biológica más baja que los tocoferoles y por tanto, menor importancia nutricional. Los tocoferoles son un componente esencial de la red antioxidante del plastidio, su función es proteger y estabilizar las estructuras que componen las membranas biológicas al reaccionar con los radicales libres. En condiciones de estrés, las plantas pueden incrementar la concentración de cualquiera de estos compuestos mencionados para disminuir el daño oxidativo (Mittler, 2002). 1.1.2.1 Tocoferoles En 1922, Evans y Bishop aislaron, a partir de semillas de trigo, una sustancia capaz de prevenir aborto en ratas alimentadas con grasas con alta descomposición oxidativa. Si bien estos animales concebían normalmente, eran incapaces de mantener el feto vivo. Este nuevo producto fue denominado "tocoferos", derivado del griego tokos (nacimiento) y pheros (fortaleza), aludiendo a la buena salud de las crías de ratas alimentadas con el principio liposoluble. Posteriormente, al ser caracterizado como alcohol, se le llamó "tocoferol". En 1924, Sure denominó a esta sustancia como vitamina E y Mattill reporto su actividad antioxidante (Mattill y col., 1924; Sure, 1924; Evans y col., 1936; Evans y col., 1939). La vitamina E es una mezcla de fenoles liposolubles que poseen una cabeza aromática de cromanol y una cadena lateral de 16 carbonos. Los tocoferoles poseen una cola de hidrocarburo saturada mientras que los tocotrienoles una cola isoprenoide insaturada. El número y posición de los grupos metilo en el anillo de cromanol da lugar a los diferentes α-, β-, γ-, y δ-tocoferol e isómeros del tocotrienol. El carácter liposoluble de los tocoferoles les permite intercalarse en la estructura hidrocarbonada de las membranas, actuando como un antioxidante en el sitio mismo en que se produce el ataque de los radicales libres e impidiendo el inicio de la peroxidación de lípidos. La actividad antioxidante relativa de los isómeros del tocoferol in vivo es la siguiente: α-> β-> γ-> δ-, lo cual está relacionado con la cantidad de grupos metilos unidos al anillo fenólico de 5 la estructura polar de la molécula. El α-tocoferol, con tres grupos metilos, posee la mayor actividad antioxidante entre los tocoferoles (Falk y Munné-Bosch, 2010). Los tocoferoles son sintetizados solamente en organismos fotosintéticos. En plantas están localizados en los cloroplastos. Las membranas de los cloroplastos en las plantas superiores contienen α-tocoferol como el isómero predominante de este grupo, el cual confiere protección frente a daños foto-oxidativos (Fryer, 1992; Fachechi y col., 2007). También existe evidencia de que el compuesto α-tocoferol quinona, localizado exclusivamente en las membranas del cloroplasto, posee propiedades antioxidantes similares al α-tocoferol (Kruk y col., 1993; Kruk y col., 1997). La vitamina E es un compuesto antioxidante capaz de reparar radicales oxidados de forma directa, previniendo la reacción en cadena durante la autooxidación lipídica (Serbinova y Packer, 1994). También reacciona con radicales alcoxilos, el radical lipídico peroxil y con radicales alquilos, derivados de la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados (Buettner, 1993; Kamal-Eldin y Appelqvist, 1996). La reacción entre la vitamina E (derivado del tocoferol) y los radicales lipídicos tiene lugar en la interfase agua-membrana donde la vitamina E dona un ión (hidrógeno) al radical lipídico con la consecuente generación de radical tocoferoxil (Buettner, 1993). El radical tocoferoxil vuelve a tomar su forma reducida por acción de la vitamina C (ascorbato), el glutatión reducido (Fryer, 1992) o la coenzima Q (Kagan y col., 2000). Además, los tocoferoles actúan como eliminadores químicos de radicales del oxígeno; especialmente el singlete de oxígeno por la vía de la oxidación irreversible del tocoferol y, como un desactivador físico del singlete de oxígeno, por un mecanismo de transferencia de carga (Fryer, 1992). El αtocoferol puede modular la fluidez de la membrana de forma similar al colesterol y también la permeabilidad de la membrana a pequeños iones y moléculas (Fryer, 1992). Se ha demostrado que el α-tocoferol puede disminuir la permeabilidad de vesículas de digalactosildiacil glicerol a glucosa y protones (Berglund y col., 1999). Además, existe interacción entre el PSII con el αtocoferol quinona y α-tocotrienol quinona (Kruk y col., 1997; Mène-Saffrané y col., 2010b). Los complejos formados entre el tocoferol y ácidos grasos libres y lisofosfolípidos protegen las estructuras de membranas contra efectos dañinos (Blokhina y col., 2003; Song y col., 2010). Este hecho es de gran relevancia fisiológica debido a que los productos de la hidrólisis de los fosfolípidos son característicos de eventos patológicos tales como la hipoxia, isquemia o daño por 6 otro estrés. Por otro lado, existen otras funciones no antioxidantes del α-tocoferol, como la inhibición de la proteína quinasa C e inhibición de la proliferación celular (Azzi y Stocker, 2000). 1.1.3 Metabolismo de los tocromanoles. Los tocoferoles y tocotrienoles presentan como precursor aromático el ácido homogentísico (HGA), el cual es sintetizado a partir de p-hidroxifenilpiruvato (HPP) por la enzima citosolica p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD). La fuente biosintética de HPP puede ser shikimato por vía prefenato o por transaminación de la tirosina (Rippert y col., 2004; Tzin y Galili, 2010). Los tocotrienoles surgen de la condensación del HGA y el geranil-geranil bifosfato, reacción catalizada por la enzima homegentísico geranil-geranil transferasa (HGGT) dando origen al 2-metil-6-geranil geranilbenzoquinol. Por otra parte, la síntesis de los tocoferoles se basa en la condensación del HGA con el fitol difosfato (PDP), reacción catalizada por la enzima homogentísico fitol transferasa (HPT) dando lugar a la formación del 2-metil-6fitolbenzoquinol (Cahoon y col., 2003). Los benzoquinoles derivados de estas reacciones, sufren reacciones de metilación y ciclación para formar el α-tocotrienol y α-tocoferol respectivamente (Almeida y col., 2011)(Figura 1). Figura 1. Ruta Metabólica de vitamina E en plantas. Las enzimas implicadas en la biosíntesis aparecen en rojo. Abreviaciones: P, Fosfato; DXP, 1deoxi-D-xilulosa- 5-fosfato; GGDP, geranilgeranil difosfato; HGGT, homogentísico geranilgeranil transferasa HPPD, p-hidroxifenil-piruvato dioxigenasa; HPT, homogentísico fitol transferasa; MPBQ, 2-metil-6-fitol-1,4-benzoquinol; DMPBQ, 2,3-dimetil-6-fitol-1,4-benzoquinol. Adaptado de (Chen y col., 2006a). 7 La enzima HPT, codificada por el gen HPT1/VTE2.1, es clave en la biosíntesis de tocoferoles (Figura 1) (Collakova y DellaPenna, 2001; Savidge y col., 2002; Maeda y col., 2006). Se ha demostrado que en espinaca y Arabidopsis, HPT tiene preferencia exclusiva sobre el PDP (Cahoon y col., 2003). Plantas transgénicas de Arabidopsis que presentan silenciado el gen VTE2.1 por antisentido, tienen disminuida la concentración de tocoferoles en un 90%. Junto a esto, la sobre-expresión de este gen provoca un aumento en la concentración de tocoferoles, 4,4 veces en tejido foliar utilizando un promotor constitutivo y entre 1,4 a 1,6 veces en semillas utilizando un promotor tejido-especifico (Savidge y col., 2002; Collakova y DellaPenna, 2003). Mediante el análisis de las secuencias de VTE2 y HGGT, Venkatesh y col. (2006), identificaron un parálogo de VTE2, denominado VTE2.2. En ensayos filogenéticos, secuencias VTE2 de diferentes especies se ubicaron cerca de HGGT mientras que otro grupo divergió, distinguiéndose los parálogos VTE2.1 y VTE2.2. Un análisis de expresión realizado in silico determinó que VTE2.1 se concentra en tejido vegetativo a diferencia de VTE2.2 que se presenta en tejido reproductivo. La sobre-expresión de VTE2.2 en semillas de Arabidopsis aumenta un 75% la concentración de los tocoferoles. Mutantes vte2.1 y vte2.2 carecen de tocoferoles e intermediarios (Venkatesh y col., 2006). 1.1.4 Tocoferoles y resistencia a estrés abiótico. Los niveles de tocoferoles son altamente regulados durante el crecimiento y desarrollo vegetal (Molina-Torres y Martinez, 1991) y responden a estrés por luz, frío, salinidad y sequía (Gossett y col.; Leipner y col., 1999; Havaux y col., 2000; Munné-Bosch y Alegre, 2000; Streb y col., 2003; Georgieva y col., 2010; Harb y col., 2010). Se ha observado que la sobre expresión de 35S::VTE2.1 en plantas de Arabidopsis generaba un aumento de 18 y de 8 veces el contenido total de tocoferoles en hojas, sugiriendo que la actividad de la enzima HPT aumenta junto con la síntesis de tocoferoles totales bajo condiciones de estrés (Collakova y DellaPenna, 2003). Por otro lado, investigaciones en plantas mutantes vte2 de Arabidopsis, sugieren que éstas son ligeramente sensibles al estrés fotooxidativo por problemas en el sistema de protección fotosintético dado por DMPBQ (Havaux y col., 2005). El silenciamiento pos-transcripcional mediante VTE2:RNAi en plantas de tabaco, disminuye a un 2% el contenido de tocoferoles con respecto de un tipo silvestre, aumentando la lipoperoxidación y mayor daño en membranas de plantas no estresadas (Abbasi y col., 2007). En condiciones de estrés salino, estas plantas presentan mayor grado de lipoperoxidación, disminución en el contenido de pigmentos y presentan cambios en el 8 metabolismo del carbono y nitrógeno. En tratamientos con sorbitol, presentan mayor peroxidación de lípidos y cambios menores en el metabolismo del carbono. En ambos casos se incrementa el daño por estrés oxidativo a causa de la salinidad y el sorbitol (Abbasi y col., 2007). En investigaciones recientes con estas mismas plantas VTE2:RNAi, se ha observado que el elevado estrés oxidativo provoca una senescencia foliar prematura, por lo cual los autores presumen que el grado y especificidad de la peroxidacion de lípidos podría desencadenar cambios en la exportación y el metabolismo de carbohidratos (Abbasi y col., 2009) En la especie silvestre de tomate, Solanum chilense, se ha detectado un incremento en la concentración de α-tocoferoles y menor lipoperoxidación en plantas sometidas a déficit hídrico comparado con S. lycopersicum, lo que se correlaciona con la expresión diferencial del gen que codifica a la enzima HPT (Loyola y col., 2012). Esta observación sugiere que los altos niveles de α-tocoferol puede constituir un factor que permite a S. chilense resistir el estrés oxidativo inducido por el déficit hídrico. 1.1.5 Estrategias de ingeniería genética y estrés abiótico. La ingeniería genética ha permitido el estudio de la función y expresión de genes y la generación de plantas con nuevas características. Sin embargo, es posible obtener plantas con características fenotípicas no deseadas, en especial cuando la expresión del transgén es controlada por un promotor de activación constitutiva como el del virus del mosaico de la coliflor 35S (CaMV 35S). Los fenotipos comúnmente incluyen inhibición del crecimiento, clorosis y hasta necrosis (Kumar y col., 1997; Masgrau y col., 1997; Bouchereau y col., 1999; Gilmour y col., 2000; Chen y col., 2006b; Pino y col., 2007; Park y col., 2009). Una alternativa a este problema es la utilización de promotores específicos, que controlen la expresión de un gen en algún período de desarrollo, específicamente en un tejido o, en este caso, en condiciones en las que se requiere una respuesta al estrés. Diversos estudios describen el uso de promotores específicos, los cuales son asociados a órganos o tejidos como polen (Bernd-Souza y col., 2000), semillas (Zakharov y col., 2004), floema (Shi y col., 1994); promotores inducidos por heridas (Köck y col., 2004); asociados a estrés abiótico (Medina y col., 2001; Su y col., 2006), entre otros. Uno de los casos más conocidos es el promotor del gen RD29A de Arabidopsis que es inducido significativamente por frío, desecación, 9 altas concentraciones de sal y ácido abscísico (Santabarbara y col.) (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1993). El promotor RD29A se caracteriza por presentar al menos dos tipos de elementos reguladores. Uno de ellos, denominado DRE, se activa en la respuesta rápida a estrés por bajas temperaturas, deshidratación y sal por medio de vías de señalización independientes a ABA, y otro denominado ABRE (ABA response element), el cual responde a vías dependientes de ABA. Este último se encuentra involucrado en la segunda inducción de RD29A, luego de la acumulación de ABA bajo deshidratación y altas concentraciones de sal (Narusaka y col., 2003). Un ejemplo comparativo, es el de caso de una variedad de papa que fue modificada genéticamente con tres genes CBF de Arabidopsis (AtCBF1-3) bajo el control del promotor CaMV 35S y RD29A. Las plantas CAMV 35S-AtCBF incrementaron su tolerancia al congelamiento en 2 °C, sin embargo presentaron disminución del área foliar, retraso en la floración y menor producción de tubérculos. En cambio las plantas RD29A-AtCBF, presentaron igual tolerancia a bajas temperaturas que las plantas de expresión constitutiva e igual producción de tubérculos que el tipo silvestre (Pino y col., 2007), lo que sugiere que el uso del promotor inducible puede brindar beneficios para la expresión controlada de un gen sin afectar negativamente los rasgos agronómicamente importantes. En el presente trabajo de tesis, la estrategia empleada incluye encontrar y caracterizar funcionalmente nuevos promotores que son inducidos por déficit hídrico para poder ser empleados en la modificación de los niveles de tocoferoles en plantas. A través de la expresión del gen VTE2.1 de S. chilense bajo el control de un promotor inducido por deshidratación, se determinará si un aumento en los niveles de tocoferoles en plantas de tabaco mejora la tolerancia a déficit hídrico. 10 1.2 Hipótesis y objetivos Hipótesis: La expresión del gen ScVTE2.1 bajo el control de un promotor inducido por déficit hídrico en plantas transgénicas de tabaco, aumenta la capacidad de éstas de tolerar dicho estrés. Esta mayor tolerancia a la deshidratación está asociada a una disminución del daño oxidativo producto de la mayor acumulación de tocoferoles. Objetivos: Objetivo general: Evaluar el efecto de los niveles de tocoferoles en plantas de tabaco que sobre-expresan el gen ScVTE2.1 en la tolerancia a condiciones de déficit hídrico. Objetivos específicos: i. Identificar y aislar promotores de alta activación por condiciones de déficit hídrico. ii. Generar plantas transgénicas de N. tabacum que expresen el gen ScVTE2.1 bajo los promotores inducibles por estrés hídrico, seleccionados previamente. iii. Evaluar los niveles de expresión del gen ScVTE2.1 bajo el control del promotor inducible seleccionado con la acumulación de tocoferoles en diferentes líneas de plantas transgénicas de tabaco. iv. Determinar el grado de tolerancia a déficit hídrico en plantas transgénicas para el gen ScVTE2.1 bajo los promotores inducibles por estrés hídrico y determinar parámetros fotosintéticos. 11 2 MATERIALES Y MÉTODOS. 12 2.1 Obtención y análisis de promotores 2.1.1 Material vegetal Semillas de Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum cv. Xanthi fueron germinadas en condiciones de invernadero, con fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad (1000 µmol/m 2.s), 25 °C de temperatura, nutrición con solución de Murashige y Skoog y humedad relativa aproximadamente de un 60 % del aire. 2.1.2 Selección de promotores Para la selección de los promotores, se realizó un análisis bibliográfico de los estudios transcriptómicos publicado (Seki y col., 2001; Kreps y col., 2002). La búsqueda se orientó en ensayos de estrés abiótico, específicamente déficit hídrico. Los genes seleccionados cumplieron las siguientes características; (1) Ser inducido por tratamientos de déficit hídrico en tejido vegetativo; (2) Con respuesta positiva a otros tratamientos de estrés abiótico (osmótico y salinidad); (3) Que sea inducido por ABA en tejido vegetativo y/o que se exprese en tejidos que sufren desecación natural (semillas); (4) Que el gen y/o promotor no haya sido sujeto a estudios en la literatura, tal vez de función desconocida. 2.1.3 Análisis in silico de las promotores en los genes seleccionados Las herramientas utilizadas en la búsqueda de elementos en cis en los promotores de los genes seleccionados fueron base de datos asociadas a programa computacionales entre ellas está la base de datos PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/) (Higo y col., 1999); el programa de la base de datos PlantCare (http://www.bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)(Lescot y col., 2002), el programa AGRIS (http://arabidopsis.med.ohio-state.edu/) (Davuluri y col., 2003), y la base de datos JASPAR (http://jaspar.genereg.net/) (Wasserman y Sandelin, 2004). 13 2.1.4 Promotores y construcciones para transformación transitoria Para la obtención de las regiones promotora de los genes seleccionados, se obtuvieron las secuencias genómicas para cada uno de los locus descritos en la base de datos TAIR (http://www.arabidopsis.org/). Los partidores específicos (Tabla 1), fueron diseñados mediante el programa computacional Primer 3 plus (Untergasser y col., 2007), para poder amplificar mediante PCR la totalidad de la región promotora de cada gen. Tabla 1. Lista de partidores utilizados Gen/promotor Partidor P05340 P05340-f 5’-AAGCTTTTTTGGAGGTAAGATATTAATTGCGC-3’ 58°C P05340-r 5'-TCTAGATTAATGTAAAGAACTTTGATCTACTAAAGGC-3' 55°C P47770-f 5’-AAGCTTCTTGTCTTAGTCGGTGTAGAGCC-3’ 60°C P47770-r 58°C P80160-f 5'-TCTAGAATCGAAGGAACAAGATTACTGAGATTTGAG-3' 5’AATGAGTTATGTTGTAAGCTTCATCTAGCC-3’ P80160-f 5’-TCTAGAGAGACGTACAGAAACAGAACGC-3’ 58°C ScVTE2.1-f 5’-ATGGAATCTTTGCTTATTGGG-3’ 58°C ScVTE2.1-r 5’-CACCTCACGAGCGGTATG-3’ 58°C ScVTE2.1 qScVTE2.1-f 5’- GAGTTTTTGGCTTGGATGGA-’3 60°C (qRT-PCR) qScVTE2.1-r 60°C NtERD10B NtERD10B-f 5’- TATCACCGCTCGTACAGCAA-‘3 5’-TCTAGCTCTTCGGAGGATGATG-3’ (qRT-PCR) NtERD10B-r 5’-CCATGATTCCCTTCTTCTCATG-3’ 61°C NtRD29 NtRD29-f 5’-CAGGCAAGTGTAGGTGATGAAG-3’ 60°C (qRT-PCR) NtRD29-r 5’-TCCTGTTACTCCAGTTGCTGTG-3’ 60°C NtL25* NtL25-f 5’- AGGCTGTCAAGTCAGGATCAAC -3’ 60°C (qRT-PCR) NtL25-r 5’- ATTGCAGACTCTGTGGTGAGG -3’ 60°C P47770 P80160 ScVTE2.1 Secuencia Tm 57°C 60°C *HK; Housekeeping, gen de expresión constitutiva. Luego de obtener ADN genómico de Arabidopsis con el método Doyle y Doyle (1987), los promotores fueron aislados por reacción de PCR donde se empleó 100 ng de ADN, 1,5 mM MgCl2, 1 X PCR Buffer, 250 nM de cada cebador, 200 nM dNTPs y 0,25 U de Taq polimerasa (Invitrogen). Los parámetros de la reacción de PCR utilizada fueron: una desnaturación a 95 °C por 5 min, seguido por 35 ciclos de 95 °C por 30 s, 60 °C por 45 s y 72 °C por 60 s y finalmente una 14 extensión a 72 °C por 7 min. Los productos de PCR obtenidos, fueron separados por medio de una electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TBE 1X. Las bandas obtenidas fueron cortadas y purificadas mediante el sistema E.Z.N.A® Gel extraction kit (Promega, Madison, WI, EE.UU) siguiendo las indicaciones del fabricante. Los fragmentos aislados fueron clonados en el vector pGEM-T Easy System I (Promega) y el plasmidio resultante amplificado en bacterias de E. coli DH5-α. Los plasmidios obtenidos que contenían el fragmento insertado, se enviaron a secuenciar a los servicios de secuenciación de Macrogen Inc. (Chongro-ku, Seúl, Corea). Se secuenciaron mediante amplificación utilizando partidores universales M13, en un equipo ABIPrism 3700 (Applied Biosystems, Seúl, Corea). En general, los fragmentos clonados permitieron lecturas directas de secuencia de unos 800 nucleótidos. 2.1.5 Transformación transitoria Cada promotor amplificado fue clonado en el vector de expresión pBI121 río arriba de la secuencia del gen reportero de la β-glucoronidasa (gusA). Las construcciones fueron confirmadas por mapeo de restricción y secuenciación automática de ADN para verificar la correcta inserción de cada uno de los promotores en el vector de expresión. Las construcciones obtenidas fueron introducidos en Agrobacterium tumefaciens (cepa LBA4404) por electroporación. Las bacterias fueron sembradas en placas petri con medio sólido YM (extracto de levadura 0,04%, manitol 1%, NaCl 1,7mM, MgSO4 x 7H2O 0,8 mM, K2HPO4 2,2 mM, agar 15 gr/l) en presencia de los antibióticos estreptomicina (50 μl/dl), rifampicina (50 μl/dl) y kanamicina (50 μl/dl) y crecidas a 28°C durante 48 horas. Para cada construcción, se seleccionó una colonia aislada de Agrobacterium, la cual fue crecida en cultivos líquidos (3ml) en medio YM con los mismos antibióticos en un agitador (200 rpm) a 28 °C por 24 horas. Cada minicultivo se utilizó para inocular un cultivo de 50 ml de medio LB, y crecido en agitación a 28 °C por 24 horas hasta alcanzar una densidad óptica (O.D.600) 0,6. Posteriormente el caldo de cultivo fue centrifugado a 4.500 g por 10 minutos, para precipitar las células y resuspendidas en un tampón de infiltración (20 mM tampón MES pH 5,5, 0,5% glucosa y 10 mM MgSO4, 0,1 mM acetosiringona 0,02% Silwet L-77) (Orzaez y col., 2006). Plantas de tabaco de 6 semanas de edad fueron seleccionadas para la transformación transitoria. Las terceras y cuartas hojas fueron infiltradas, donde se incorporar manualmente, por la zona abaxial de las hojas, los cultivo resuspendidos en el tampón de infiltración, utilizando 15 una jeringa de 5 ml (sin aguja) sin dañar el tejido foliar. Cada hoja se infiltró completamente y luego fue marcada para su posterior identificación. Para determinar el grado de activación de tres promotores bajo condiciones de déficit hídrico, algunas plantas fueron sometidas a deshidratación severa, sin sustrato en cámaras de cultivo por 24 horas post-infiltración y otras mantenidas con riego como control. 2.1.6 Medición de actividad gusA La expresión transitoria del transgén gusA se evaluó mediante tinción histoquímica (Mohamed y col., 2004) y mediante un ensayo basado en el método fluorométrico (Jefferson y col., 1987). 2.1.6.1 Tinción histoquímica de gusA La tinción histoquímica del tejido infiltrado fue incubada con una solución que contiene X-Gluc (100 mM fosfato de sodio pH 7, 10 mM EDTA pH 8, 0,1% Tritón X-100, 0,5 mM βMercaptoetanol, 1mg/ml ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucorónico ó X-Gluc) durante 48 horas a 37 °C. Luego el tejido infiltrado fue tratado con una solución de fijación (425 ml etanol absoluto, 425 ml agua destilada, 50 ml ácido acético glacial, 100 ml formalina 37%) por 15 minutos y posteriormente la clorofila otros pigmentos fueron extraídos con una solución 3:1 de metanol: acetona, para evitar que estos compuestos puedan impedir la formación del compuesto cromogénico azul producto de la actividad gusA sobre X-Gluc. Esta solución se reemplazó hasta la desaparición completa del color verde en el tejido y los resultados fueron registrados mediante fotografía digital (Mohamed y col., 2004). 2.1.6.2 Medición enzimática de gusA Los discos de las hojas infiltradas fueron utilizados para medir la actividad gusA; estos fueron extraídos a 24, 48 y 72 horas e inmediatamente congelados a -80 °C. Las muestras fueron pulverizadas en presencia de nitrógeno líquido y homogenizadas en buffer de extracción gusA (Na2HPO4/NaH2PO4 50 mM, pH 7.0, B-mercaptoetanol 10mM, PVPP, Na2EDTA 10 mM, sarcosil 0,1% y triton X-100 0,1%), luego centrifugadas por 30 min a 4 °C. El sobrenadante fue 16 transferido en un tubo nuevo y mantenido en hielo. A 40 μl del sobrenadante se agregó 32 μl de tampón de extracción y 8 μl de MUG. Para detener la reacción se llevó a un volumen final de 2 ml con Na2CO3 0,2 M. La medición se realizó en un fluorimetro Victor 3 (Perkin Elmer), en placas de 96 pocillos, las longitudes de onda utilizadas fueron 365 nm de exitacion y 465 nm de emisión. Los resultados fueron registrados y tabulados en Microsoft Excel 2007 para su posterior análisis. La actividad de la enzima en cada extracto se registró como la concentración del producto de la reacción de MUG hidrolizado por mg de proteína total de reacción. 2.1.6.3 Cuantificación de proteínas por el método de Bradford La actividad gusA fue expresada por cantidad de proteína presente en cada muestra. Para esto se midió la concentración de proteínas por el método de Bradford (1976). Para la cuantificación de proteínas, se agregó 20 l de cada muestra problema a 980 l del reactivo de Bradford (0,1 gramos de azul de Coomassie G-250, 50 ml etanol 95% y 100 ml ácido fosfórico 85%) y se incubó a temperatura ambiente por 10 minutos. Se midió la absorbancia en un espectrofotómetro a 595 nm contra un blanco y se calculó la concentración de proteínas después de comparar la absorbancia de las muestras interpolando en la curva de calibración hecha con albúmina fetal de suero bovino (BSA). 2.2 Obtención de líneas transgénicas que expresen el gen ScVTE2.1 bajo el control del promotor inducible 2.2.1 Material Vegetal Plantas de Solanum chilense y Nicotiana tabacum cv. Xanthi fueron crecidas en cámaras de cultivo in vitro, con fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad (1000 µmol/m 2.s), 25 °C de temperatura, en medio semisólidos de Murashige y Skoog (Shulaev y col.) humedad relativa aproximadamente de un 60 % del aire. 2.2.2 Aislamiento de gen VTE2.1 de S. chilense 17 Partidores específicos para el gen homólogo de VTE2.1 fueron diseñados a partir de las secuencias de ESTs que se encuentran para tomate en la base DFCI (TIGR) (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html) (Tabla 1). El ARN de S. chilense se extrajo con el sistema SV total RNA isolation (Promega), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para la síntesis del ADNc a partir del ARN, las muestras fueron primero tratadas con DNAsa (Ambion) para posteriormente sintetizar ADNc utilizando el sistema ThermoScript RT-PCR (Invitrogen) siguiendo las indicaciones del fabricante. Las reacciones de PCR se realizaron con el siguiente formato: 5 minutos a 94 °C, luego 35 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 55 °C por 1 minuto y 72 °C por 1 minuto 30 segundos y finalmente 7 minutos a 72 °C. Los productos de PCR fueron separados por medio de una electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TBE 1X. Las bandas obtenidas fueron purificadas mediante el sistema E.Z.N.A® Gel extraction kit (Promega, Madison, WI, EE.UU) siguiendo las indicaciones del fabricante. Los fragmentos aislados fueron clonados en el vector pGEM-T Easy System I (Promega) y el plasmidio resultante amplificado en bacterias de E. coli DH5-α. Los plasmidios obtenidos, se enviaron a secuenciar a los servicios de secuenciación de Macrogen Inc. (Chongro-ku, Seúl, Corea). 2.2.2.1 Obtención de las construcciones para transformación estable La construcción génica con cada promotor aislado y el ADNc del gen ScVTE2.1 fue realizada usando los vectores basados en pBI121 y descritos en la sección 2.1.5, en los que se reemplazó el gen gusA por el ADNc de ScVTE2.1, quedando éste río abajo de cada promotor. Las construcciones obtenidas fueron confirmadas por secuenciación antes de ser insertadas en la cepa A. tumefaciens (LBA4404) mediante electroporación. 2.2.3 Transformación estable de plantas de N. tabacum La transformación se llevó a cabo mediante infección de discos de hojas con Agrobacterium tumefaciens (cepa LBA4404) utilizando el protocolo descrito por el Horsch y col. (1985). Para ello se mantuvo tabaco propagado in vitro en MS sin hormonas. Al momento de transformar, las hojas fueron cortadas con un sacabocado sin tomar las nervaduras centrales. Los discos fueron infectados con Agrobacterium conteniendo la construcción de interés. Posteriormente fueron traspasados a un medio MS con auxina (2 mg/L BAP) y mantenidos con 18 baja iluminación durante 2 días, luego fueron colocados en un medio selectivo inductor de callos y brote con citocinina (0.075 mg/L AIA), auxina (2 mg/L BAP) y kanamicina (100 mg / L). Finalmente los callos luego de 3 semanas generaron callos y 2 semanas más tarde brotes. Al aparecer los brotes estos se colocaron en un medio selectivo de enraizamiento (con kanamicina y sin hormonas). De cada callo se aisló sólo un brote. 2.2.4 Selección de líneas transgénicas de tabaco Al menos 50 brotes seleccionados fueron propagados para extraer ADN genómico. La presencia de la construcción en el genoma de los brotes seleccionados fue verificada mediante PCR utilizando partidores específicos para amplificar ScVTE2.1 y el terminador en el T-DNA, además de partidores de que amplifican el gen NPTII de resistencia a kanamicina. Se multiplicó aquellas líneas que amplificaron ambas secuencias y se llevaron al invernadero para obtener semillas. 2.2.5 Medición de tocoferoles Para la extracción de tocoferoles se trituró 500 mg de hojas frescas en presencia de nitrógeno líquido, se añadió 50 μl de acetato de tocoferol como estándar interno, además de 0,1 g de ácido ascórbico y ácido cítrico como antioxidantes. El macerado fue resuspendido en metanol y los extractos fueron homogenizados con Ultra Turrax (IKA-Werke, Staufen, Alemania) y centrifugados. El sobrenadante fue recuperado en un nuevo tubo para extraer completamente el solvente al vacío en un rotavapor (Speed-vac, Jouan, Saint Herblain, Francia). Luego las muestras fueron resuspendidas en metanol y tamizadas utilizando un filtro de 5 µm. Para la cuantificación se utilizó un equipo de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) Agilent serie 1100, la separación cromatográfica se llevó a cabo en fase reversa sobre una columna de C18 (Kromasil 100 C18 5 μm 100 × 2.0 mm, Scharlau). Como fase móvil se utilizó una mezcla de metanol: acetonitrilo (80:20 v/v). La detección se obtuvo con exitación de 292 nm y una emisión 330 nm. 20μl de muestra fueron inyectados con tres repeticiones por cada extracto. La cuantificación se realizó utilizando una curva de calibración usando α y γ-tocoferol como estándares. 19 2.3 Evaluación del grado de tolerancia al déficit hídrico 2.3.1 Material vegetal. Semillas de Nicotiana tabacum cv. Xanthi transformadas fueron crecidas en cámaras de cultivo in vitro, con fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad (1000 µmol/m 2.s), 25 °C de temperatura, en medio semisólidos de Murashige y Skoog conteniendo 100mg/l de kamamicina como antibiótico de selección. 2.3.2 Tratamientos de déficit hídrico. Luego de 5 semanas después del trasplante y aclimatación de las líneas transgénicas en macetas, se suspendió el riego. Durante los días 3, 9, 15 y 20 se midieron diferentes variables fisiológicas y parámetros de estrés. Después del periodo de déficit hídrico, las plantas fueron regadas para observar su recuperación 12 y 36 horas después y medir el contenido relativo de agua y tasa fotosintética. 2.3.3 Variables fisiológicas 2.3.3.1 Contenido relativo de agua. Fue determinado según la ecuación: CRA = PF – PS / PH - PS x 100, donde: PF corresponde al peso fresco de la hoja al momento de colectar el tejido; PH, corresponde al peso de la hoja luego de 24 horas de hidratación en agua destilada y PS corresponde al peso seco luego de 24 horas de secado a 60 °C. 2.3.4 Parámetros de daño 2.3.4.1 Intercambio de gases en la hoja Para la determinación de las tasas de intercambio gaseoso se ocupó un analizador de gases LCpro + (ADC, Hoddesdon, UK). Las mediciones se realizaron, cuando la concentración de CO2 en la cámara de hoja se mantuvo a aproximadamente en 200 vpm, a una saturación por luz de 870 μmol m-2 s-1, en una cámara de 6.25cm2. El aire en el IRGA se ajustó para mantener una 20 humedad relativa o menos constante en la cubeta de la hoja y a una temperatura de 25 °C. Las mediciones de la tasa de fotosíntesis neta, la conductancia estomática y la hoja interna de CO2 fue tomada desde las 7:30 a las 9:30 AM realizando tres medidas por hoja en la tercera y cuarta hoja de cada planta. Las mediciones se realizaron durante los días 3, 9, 15 ,20 después del último riego, además se evaluó 12 y 36 horas después de un riego de recuperación. 2.3.4.2 Rendimiento cuántico del PS II La fluorescencia de la clorofila se midió con un fluorómetro portátil Fluorpen (PAM-2000, Walz, Effeltrich,Alemania). Con un pulso de 800 ms de radiación de luz saturante (2000 mol fotones m-2 s-1) generado por una lámpara halógena para medir el nivel máximo de fluorescencia. La eficiencia del rendimiento cuántico del PSII se calculó por UPSII = (Fm 0 - Ft) / Fm 0 (Genty y col., 1989). Se hicieron seis mediciones durante la mañana, en la tercera y cuarta hoja de tres plantas por cada línea transformante de las plantas de tabaco. 2.3.4.3 Determinación de clorofila y carotenoides totales. Los contenidos de clorofilas y carotenoides se obtuvieron a partir de la tercera hoja de acuerdo a la metodología utilizada por Lichtenthaler y Wellburn (1983), con tres repeticiones. Para ello se maceraron en un mortero frío dos discos de hojas de 1 cm de diámetro en 1ml de etanol 80%. Posteriormente las muestras fueron centrifugadas a 1200 rpm. Para obtener el contenido de pigmentos se derivó desde las absorbancias obtenidas en un espectrofotómetro (Genesys 10 UV: Thermo Electron Corporation) a 649, 665 y 470 nm usando las siguientes formulas: Clorofila-a (μg cm2) = 13,96 A665-6,98 A649 Clorofila-b (μg cm2) = 24,96 A649-7,32 A665 Carotenoides (μg cm2) = (1000 A470-2,05 clorofila a -114,8 clorofila b) 245 2.3.4.4 Expresión relativa de genes indicadores de estrés. La expresión de los genes NtRD29B y NtERD10 fue evaluada mediante qRT-PCR. Para ello se extrajo ARN mediante el sistema SV total RNA isolation (Promega, Madison, WI, USA), 21 siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las muestras de ARN fueron tratadas con RNasefree DNase I (Ambion, Austin, TX, USA). La integridad del ARN fue visualizada en un gel de agarosa al 1% y su concentración y pureza fue determinada 260 y 260/280 respectivamente mediante un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). Luego se sintetizó ADNc con el kit AffinityScript QPCR ADNc Synthesis (Stratagene, La Jolla, CA, USA) y finalmente se utilizó como templado 50 ng de ADNc en una reacción de 20 ul con 10 ul de tampón SYBR Green y 0,5 µl de mezcla de nucleótidos 10 mM. Las reacciones de qRT-PCR se realizaron en el equipo ABI Prism 7000 Sequence detection system (Applied Biosystems) en una reacción que cuenta con: 95 °C por 10 min, luego 40 ciclos de 95 °C por 15 s, 60 °C por 15 s y 72 °C por 20 s. 2.3.4.5 Determinación de la lipoperoxidación Los niveles de lipoperoxidación se midieron en forma indirecta por medio de la evolución de la formación de malondihaldehído, según la técnica descrita por Esterbauer y Cheeseman (Esterbauer y Cheeseman, 1990). 200mg de hojas frescas de tabaco fueron macerados en 5 ml de etanol al 80%, las muestras fueron homogenizadas mediante el uso del ultraturra por 1 min y centrifugadas a 4000 RPM 15 min. El sobrenadante se dividió en dos tubos de 15 ml, a uno se le agrego ácido tricloracético 5% w/v (TCA) a 4 °C y al otro un volumen de ácido tiobarbitúrico 0.67 w/v % (TBA). Ambos fueron incubados a 100 °C por 60 minutos e inmediatamente enfriados en hielo por 15 min. Posterior a esto se midió la absorbancia de cada muestra en un espectrofotómetro (Genesys 10 UV: Thermo Electron Corporation) a 532 nm y 600 nm. Se analizaron tres replicas biológicas en cada punto muestreado. 2.3.4.6 Determinación del contenido de prolina. Para la extracción y determinación de L-prolina se utilizó tejido fresco, siguiendo el protocolo descrito por Bates (Bates y col., 1973). 50 mg de tejido fueron homogenizado con 5 ml de ácido sulfosalicílico al 3%. Para obtener el sobrenadante se centrifugó a 4000 rpm durante 45 min a 4 °C. Luego, se recuperó 1 ml del sobrenadante al cual se le agrego 1 ml de reactivo de ninhidrina (6.25 g ninhidrina, 100 ml ácido fosfórico 6 M y 150 ml ácido acético glacial) y 1 ml de ácido acético glacial. Las muestras fueron incubadas a 100ºC durante 1h, posterior a esto las 22 muestras se detuvo la reacción en hielo durante 5 min. Finalmente las muestras fueron centrifugadas a 2000 rpm durante 10 min y se midió la absorbancia 520 nm en cubetas de plástico en el espectofotómetro. Las absorbancias obtenidas se interpolaron en una curva de calibración utilizando concentraciones conocidas de L-prolina. 2.3.4.7 Determinación del contenido de ABA Para determinar la concentración de ABA se utilizó el método descrito por (Durgbanshi y col., 2005), donde a 250 mg de tejido fresco se añadieron 25 μl de estándar interno. Esta mezcla se homogenizo en 5 ml de agua destilada mediante Ultra Turrax (IKA-Werke, Staufen, Alemania). Las muestras fueron centrifugadas a 4000 x g a 4 ºC durante 45 min. Posteriormente se extrajo el sobrenadante en nuevos tubos y se ajustó el pH a 2,9 con una solución de CH 3COOH al 30% (v/v). Sobre el extracto acidificado se extrajo las fitohormonas mediante dos extracciones de éter dietílico, incorporando ambas fases y ayudando a la separación mediante centrifugación a 2000 x g durante 10 min. El sobrenadante fue recuperado y secado mediante un evaporador centrífugo (Speed-vac, Jouan, Saint Herblain, Francia) en ausencia de calor y permitiendo la entrada de aire a pulsos. El precipitado se resuspendió con sonicación en 100 μl de metanol y se disolvió en 400 μl de agua ultrapura. El volumen final se mezcló bien mediante el uso del vórtex y tamizó con filtros de acetato de celulosa de 0,22 μm. Alícuotas de 20 μl de las muestras filtradas se emplearon directamente para el análisis cromatográfico. Las muestras se analizaron en un equipo de HPLC (Waters Alliance 2860, Waters Corp., Milford, USA), con un inyector automático y una bomba capaz de generar un gradiente cuaternario. La separación cromatográfica se llevó a cabo en fase reversa sobre una columna de C18 (Kromasil 100 C18 5 μm 100 × 2.0 mm, Scharlau). La fase móvil se compuso de H 2O:MeOH, H2O con 0.01% CH3COOH, con un flujo de 0,3 ml/min. 2.4 Análisis estadístico El diseño que se utilizó presentó un modelo completamente aleatorio, el ensayo de estrés constó de dos tratamientos, tres repeticiones siendo la unidad experimental la planta de tabaco. Para comparar los parámetros cuantitativos de los tratamientos y determinar si existen 23 diferencias significativas entre las líneas transgénicas y las plantas silvestres se realizó mediante análisis de varianza. En los casos en que se encontró diferencias se realizó la prueba t de Student con el software SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Las diferencias se consideraron significativas a P <0,05. 24 3 RESULTADOS 25 3.1 Selección de regiones promotoras inducibles por estrés 3.1.1 Selección de regiones promotoras P05340, P47770, P80160. De acuerdo con los parámetros mencionados en materiales y métodos, se seleccionaron tres genes a partir de los análisis de transcriptómica publicado de Arabiopsis thaliana (At1g05340, At2g47770, At1g80160) (Seki y col., 2001). Para aislar los promotores se generaron los cebadores en los extremos de las regiones intergénicas, sin marco de lectura abierto e incluyendo el sitio de reconocimiento de ARN polimerasa II, caja TATA (5'-TATAAA-3'). El análisis de la región 5’ rio arriba de cada gen mostró sitios putativos de unión a factor de transcripción ya descritos en la literatura, que responden a estrés abiótico y ABA (Figura 2). El promotor P05340, se compone de 929 pares de base (pb) aisladas desde ADN genómico de Arabidopsis y el análisis in silico detectó tres cajas de respuesta a ABA (ABRE, PyACGTGG/TC), dos CRT/DRE (TACCGACAT) y un NACR (CATGTG). El segundo promotor seleccionado fue P47770, el cual es de 359 pb presenta tres cajas ABRE, y el último promotor seleccionado fue P80160 de 734pb donde análisis bioinformáticos incluyeron cuatro cajas NACR y dos cajas de posible respuesta NACR o ABRE. Figura 2. Representación esquemática de los elementos reguladores en los tres promotores inducibles. En el esquema se muestran la ubicación de los putativos sitios de unión a factores de transcripción en los promotores seleccionados estos fueron hallados mediante un análisis in sílico. Estos elementos han sido descritos por ser responsables de respuestas a estrés abiótico en vegetales y son: en rectángulo negro se indica la ubicación del elemento TATA-box de unión a la ARN polimerasa II; en azul ABRE (para unión a bZIPs); en verde NACR (para unión a NACs); en rojo CRT/DRE (para unión a DREBPs o CBFs) y en azul/verde encontramos elementos que tienen sitios de unión para ABRE o NAC. 26 3.1.2 Activación de los promotores seleccionados por deshidratación in planta Los tres promotores, P05340, P47770 y P80160, fueron amplificados por PCR, clonados en pBI121 como es detallado en materiales y métodos, para generar los vectores pBI121P05340, pBI121P47770, pBI121P80160 guiando la expresión de gusA, a modo de control se utilizó el promotor de CaMV35s guiando a gusA como control positivo y tampón de infiltración sin Agrobacterium como control negativo. Las construcciones fueron introducidas mediante infiltración en plantas de tabaco de reproducción vegetativa de seis semanas de edad. La actividad gusA de los tres promotores fue monitoreada en condiciones ideales donde no hubo inducción, y bajo condiciones de déficit hídrico. Para registrar la inducción se realizó un ensayo histoquímico (Figura 3) y un ensayo enzimático (Figura 4), el promotor que mostró mayor inducción, en ambos ensayos y bajo las condiciones de estrés aplicadas fue P80160, seguido por el promotor P05340, el promotor que presento menor inducción fue P47770. Ambos controles, negativo y positivo dieron resultado satisfactorio. Independiente del grado de inducción, es importante señalar que los promotores descritos sólo activaron la acumulación de gusA en condiciones de estrés, manteniendo una actividad transcripcional basal baja en condiciones control. Con estrés Sin estrés Con estrés Sin estrés Con estrés Sin estrés P80160::gusA P05340::gusA P47770::gusA CAMV35S::gus A Figura 3. Inducción de promotores por estrés. Análisis histoquímico el gen de la β-glucoronidasa guiado por diferentes promotores. De izquierda a derecha: hoja infiltrada con la construcción que contiene el promotor constitutivo CaMV 35S, seguido por hojas infiltradas con los diferentes promotores analizados. Para cada promotor se muestran una hoja proveniente de una planta sometidas a déficit hídrico por 24 horas, seguida de una hoja infiltrada con el mismo promotor de una planta no estresada (regada diariamente), mostrando el efecto inductor del tratamiento de deshidratación y la actividad basal de cada promotor, respectivamente. 27 Figura 4. Análisis de la inducción de los promotores por deshidratación. Actividad específica gusA medida en extractos de proteínas totales de hojas del ensayo mostrado en la Figura 3. Los experimentos fueron repetidos tres veces siendo los resultados comparables en todos los casos. Las barras representan el promedio de tres mediciones ± desviación estándar. 3.2 Generación de plantas transgénicas con el gen ScVTE2.1 3.2.1 Identificación y análisis de secuencia de ScVTE2.1. Una de las enzima limitante en la ruta metabólica de los tocoferoles es homogentísico fitol transferasa (HPT), codificada por el gen VTE2.1. S. chilense, es una especie silvestre de tomate distribuida en el desierto de Atacama, la cual se caracteriza por tolerar condiciones de sequía y salinidad. En ensayos preliminares del laboratorio han demostrado que esta especie tiene mayor expresión de esta enzima que su ortólogo en S. licopersicum por ello se extrajo el gen ScVTE2.1 desde ADNc de plantas en condiciones de déficit hídrico. ScVTE2.1 pertenece a la familia de las preniltranferasas determinado por un dominio UbiA. En el análisis filogenético se puede observar que existe proximidad de ScVTE2.1 con proteínas de otras especies y que aquella codificada por su parálogo VTE2.2 se observa más alejada que homogentísico geranil geranil transferasa (HGGT). Al comparar la secuencia de ScVTE2.1; con S. licopersicum se observa un 99% de identidad, con N. tabacum presenta un 76,9% de identidad, con respecto a otra especie dicotiledónea como es el caso de Arabidopsis thaliana muestra un 64,8% de identidad y con VTE2.1 de Oryza sativa un 59,5%. Finalmente esta 28 enzima presenta un 46,1 % de identidad con respecto a la enzima HGGT, involucrada en la generación de tocotrienoles (Figura 5). Figura 5. Relaciones filogenéticas entre las proteínas VTE2.1, VTE2.2 y HGGT El análisis filogenético fue llevado a cabo usando el programa computacional MEGA 4 (http://www.megasoftware.net/mega.html). Se asume que el largo de las ramas es proporcional a las distancias filogenéticas. La posición de la proteína predicha ScVTE2.1 en el árbol no enraizado es destacada mediante un recuadro gris. Las secuencias proteicas de VTE2.1 Nicotiana tabacum (TC134812), Sesamum indicum (ACB42447.1), Arabidopsis thaliana (AT2G18950.1), Manihot esculenta (ACC77744.1), Glycine max (ABB70126.1), Triticum aestivum (ABB70123.1) Zea mays (NP_001105877.1), Oryza sativa (EEE66159.1); HGGT Daucus carota (ADG26668.1), Triticum aestivum (AAP43912.1), Oryza sativa (AAP43913.1); VTE2.2 Glycine max (ABB70128.1) Arabidopsis thaliana (ABB70127.1) fueron deducidas a partir de las secuencias obtenidas en este estudio o desde las accesiones presentes en las bases de datos NCBI y la base de datos de secuencias de TIGR (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html.) 29 Esta proteína se caracteriza por presentar un péptidos señal detectado por iPSORT Prediction (http://ipsort.hgc.jp/predict.cgi) encontrado en las primeras 30 bases de la secuencia de destinación a cloroplastos (Figura 6). Además es integral de membrana contando con 9 dominios tranmembranales obtenidos mediante el análisis de los perfiles hidrofóbicos con WoLFPSORT (http://wolfpsort.org/results/.html#Sc-Vte2.1) y PolyPhobius prediction (http://wolfpsort.org/results/.html#Sc-Vte2.1) (Figura 7). Figura 6. Comparación de la secuencia aminoacídica de VTE2.1, VTE2.2 y HGGT de plantas. El alineamiento fue realizado con secuencias de homólogos presentes en otras especies vegetales. Los residuos aminoacidicos idénticos se muestran en negro. Los nueve dominios de transmembrana predichos mediante PolyPhobius prediction y WoLFPSORT se muestran subrayados con línea discontinua negra bajo las secuencias. El dominio conservado de la familia UbiA preniltransferasas se muestras destacado con una línea negra continua bajo la secuencia. El recuadro gris sobre el extremo N-terminal de ScVTE2.1 destaca un péptido señal de localización en el cloroplasto predicho mediante el programa iPSORT Prediction (http://ipsort.hgc.jp/predict.cgi). 30 a) b) Figura 7. Análisis de topología de ScVTE2.1 a) Análisis de hidrofobicidad para ScVTE2.1 mediante WoLFPSORT con predicción a cloroplasto (http://wolfpsort.org/results/.html#Sc-Vte2.1). b) Predicción de dominios de transmembrana y topología de ScVTE2.1 mediante PolyPhobius prediction (http://phobius.sbc.su.se/cgibin/predict.pl). Ambos programas predicen nueve dominios de transmembrana para la proteína codificada por el gen ScVTE2.1. 31 3.2.2 Obtención de plantas de tabaco transgénicas que expresan SCVTE2.1 bajo el control de promotores activados por estrés. Con el fin de aumentar el contenido de tocoferoles bajo condiciones de estrés, se transformaron discos de hoja de tabaco mediante transformación con Agrobacterium tumefaciens, para ello se generaron las construcciones quiméricas en el vector binario pBI121; P05340::VTE2.1; P47770::VTE2.1 y P80160::VTE2.1. A partir de esta transformación se generaron plantas transgénicas, las que fueron verificadas mediante PCR mediante la amplificación de ADN mediante el uso de partidores específicos del gen NPTII y para ScVTE2.1 (Figura 8). Las plantas seleccionadas fueron multiplicadas in vitro, aclimatadas y llevadas al invernadero para obtener semillas y plantas de la generación T1. De acuerdo a las reacciones de PCR las plantas obtenidas por cada construcción fueron: 25 líneas transgénicas P05VTE2.1; 6 líneas de P47VTE2.1 y 12 P80VTE2.1. Se seleccionaron las plantas que presentaron igual fenotipo que las plantas silvestres en condiciones no estresantes. Para determinar el efecto de los promotores en la inducción de ScVTE2.1 en las plantas transformadas, se seleccionaron diferentes líneas de cada promotor, en el caso de P05340::VTE2.1 se analizó la expresión de ScVTE2.1 en las líneas denominada P05V23 y P05V42. En el caso de P47770::VTE2.1 se analizaron tres líneas (P47-V9, P47-V10, P47-V17) y de P80160::VTE2.1 otras tres líneas transgénicas (P80-V7, P80-V27, P80-V39). Las plantas seleccionadas fueron sometidas a un ensayo de estrés hídrico para determinar el grado de inducción del gen ScVTE2.1 mediante RT-qPCR, el análisis dio como resultado una mayor expresión relativa del gen en que todas las líneas transgénicas estudiadas en comparación a las plantas silvestres (WT; figura 9). Además se midió el contenido de α-tocoferol, en el primer muestreo no se observaron diferencias en el contenido de α-tocoferol, después de 9 días sin riego el contenido aumentó en todas las plantas, no obstante las líneas transgénicas mostraron una mayor concentración de α-tocoferol aunque las muestras tomadas el día 9 y 15 mostraron diferencias leves con respecto a las plantas silvestres, luego de 20 días todas las líneas transgénicas analizadas presentaron un mayor contenido de α-tocoferoles en comparación a la planta silvestre (Figura 10). Con respecto al contenido de γ-tocoferol, tanto las líneas transgénicas como las plantas silvestres aumentaron su contenido en condiciones de estrés. Dos ejemplares de las líneas transformadas con el promotor P47770 mostraron mayor contenido el día 9 y otros dos de las líneas P80160 presentaron una mayor concentración que las plantas 32 silvestres el día 15. Además, P80-V7, presentó mayor contenido de γ-tocoferol de todas las plantas analizadas a los 20 días de iniciado el tratamiento y la línea P80-V39 no varió su contenido de γ-tocoferol entre los días 15 y 20 (Figura 11). a) P05340::ScVTE21 b) P47770::ScVTE21 c) P80160::ScVTE21 Figura 8. Selección de líneas de tabaco transformadas genéticamente. Los tres promotores fueron utilizados para controlar la transcripción del gen ScVTE21. Las plantas de tabaco transformadas fueron seleccionas mediante PCR usando como templado ADN genómico. En la columna de la izquierda los partidores amplifican un segmento del vector junto al transgén de interés y en la columna derecha la reacción amplifica del gen marcador NPTII que genera resistencia a kanamicina. Las construcciones analizadas son: P05340::ScVTE21 (a), P47770::ScVTE21 y P80160::ScVTE21 (c). 33 Figura 9. Expresión relativa de ScVTE2.1 inducidos por estrés en tabaco transgénico en condiciones de déficit hídrico. Expresión relativa en hojas de Nicotiana tabacum cv. Xanthi (WT) y plantas transformadas genéticamente que expresan el gen ScVTE2.1 modulado por los promotores P05(-V42, -V23), P47(-V9, -V10, -V17), P80(-V7, -V27, -V39) de 8 semanas de desarrollo. El gen NtL25 fue utilizado como gen de expresión constitutiva. Figura 10. Concentración de α-tocoferol en plantas de tabaco en condiciones de déficit hídrico. Se determinó la concentración de α-tocoferol en hojas de Nicotiana tabacum cv. Xanthi (WT) y transformadas P05-V42, 47(V9, V10, V17), P80(V7, V27, V39). Plantas de 8 semanas de desarrollo fueron sometidas a déficit hídrico por 20 días. Para obtener las concentraciones se utilizaron tres plantas de cada línea cada dato es el promedio de tres mediciones ± E.S. Los asteriscos denotan diferencias significativas con plantas silvestres (p<0.05). 34 Figura 11. Concentración de γ-tocoferol en plantas de tabaco en condiciones de déficit hídrico. Concentración de γ-tocoferol en hojas de plantas de tabaco silvestres (WT) y transformadas genéticamente que expresan el gen VTE2.1 modulado por los promotores 47 (V9, V10, V17) y P80 (V7, V27, V39). Las plantas son de 8 semanas de desarrollo fueron sujetas a déficit hídrico por 20 días. Para obtener las concentraciones se utilizaron tres plantas de cada línea cada dato es el promedio de tres mediciones ± E.S. Los asteriscos denotan diferencias significativas con WT (p<0.05). 3.3 Plantas transgénicas bajo condiciones de estrés. Para evaluar las diferencias entre el tabaco transgénicas y el silvestre. Se seleccionaron tres líneas P47770::VTE2.1 (P47-V9, P47-V10, P47-V17) y tres líneas de P80160::VTE2.1 (P80V7, P80-V27, P80-V39). Las plantas seleccionadas fueron sometidas a un ensayo de déficit hídrico para determinar el efecto del aumento del contenido de α-tocoferol en condiciones de estrés. Para ello se midieron diferentes parámetros fisiológicos, uno de ellos consistió en determinar el contenido relativo de agua durante todo el ensayo, además de la disponibilidad de agua para las plantas, el intercambio gaseoso, la tasa de transpiración y la concentración de ABA. Las plantas estudiadas en ausencia de riego no presentaron diferencias en el contenido relativo de agua, todas presentaron un 90% CRA. Durante el transcurso del ensayo todas las plantas analizadas perdieron agua, luego de 7 días los síntomas fueron más notorios en plantas sin transformar, las diferencias de turgencia en las plantas transgénicas se observaron luego de 15 días de estrés, sin embargo a los 20 días todas las plantas mostraron signos de marchitamiento y senescencia en las hojas basales (figura 12). Las tres líneas analizadas de la 35 construcción que lleva como promotor a P47770, presentaron mayor contenido relativo de agua entre 15 y 20 días posterior al último riego realizado. Luego en la recuperación, sólo la línea P47V9 presento un 10% menos del CRA, mientras que P47-V10 presentaron un 3% y 10% más que las plantas no transformadas. Con respecto a las líneas que contienen el promotor P80160 guiando la expresión de ScVTE2.1 se observó que la línea P80-V7 pierde mayor contenido de agua, teniendo un 11% menos que las plantas control 20 días después de ser regadas, presentando además un menor contenido en la rehidratación. Las líneas P80-V27 y P80-V39 presentaron entre un 14 y 19% más de agua que las plantas no transformadas al día 20 después de iniciado el tratamiento (Figura 13). 36 Figura 12. Fenotipo de plantas sometidas a déficit hídrico. Líneas transgénicas y plantas silvestres (WT) de tabaco de 8 semanas utilizadas en el ensayo luego de 0, 7, 15 y 20 días en ausencia de riego. 37 Figura 13. Contenido relativo de agua en plantas de tabaco transgénicas en condiciones de déficit hídrico. Evolución del contenido de agua en diferentes líneas transgénicas y plantas silvestres de tabaco de 8 semanas de desarrollo en déficit hídrico. Las plantas expresan el gen ScVTE2.1 modulado por los promotores inducibles por estrés P05 P47 y P80. La flecha indica el momento de reposición del riego. Los asteriscos denotan diferencias significativas con WT (p<0.05). La tasa de asimilación de CO2 de las líneas transgénicas analizadas mostró un mejor comportamiento que las líneas silvestres, conservando mayor asimilación de CO 2. (Figura 14). La conductancia estomática en todas las plantas disminuyó drásticamente al día 9 después de comenzado el tratamiento de estrés y continuó en estas condiciones durante todo el ensayo, mostrando una leve diferencia entre las plantas transgénicas y los controles (Figura 15). Figura 14. Tasa de asimilación de CO2 en plantas de tabaco en condiciones de déficit hídrico. Las líneas transgénicas presentaron una mayor tasa de asimilación de CO 2 en condiciones de déficit hídrico en comparación a las plantas de tipo silvestre (WT). Las mediciones se realizaron en la tercera y cuarta hoja, tres plantas por cada línea, analizadas en seis tiempos. Cada dato es el promedio ± E.S.; n=18. La flecha indica el momento de reposición del riego. Los asteriscos denotan diferencias significativas con WT (p<0.05). 38 Figura 15. Conductancia estomática en plantas de tabaco en condiciones de déficit hídrico. La conductancia estomática fue medida en hojas de Nicotiana tabacum cv. Xanthi silvestres (WT) y líneas transgénicas (P47-V9, P47-V10, P47-V17, P80-V7, P80-V27 y P80-V39) sometidas a déficit hídrico hasta por 20 días. Se utilizaron tres plantas de cada línea las que fueron analizadas en seis tiempos, cada dato es el promedio ± E.S.; n=18. La flecha indica el momento de reposición del riego. Los asteriscos denotan diferencias significativas con WT (p<0.05). La concentración de ácido abscísico aumentó en todas las plantas durante los 20 días que duró el ensayo, observando la máxima concentración a los 15 días de iniciado el tratamiento y continuó a este nivel al día 20 (Figura 16). Figura 16. Concentración de ácido abscísico en tabaco en condiciones de déficit hídrico. Concentración de ácido abscísico, en hojas de Nicotiana tabacum cv. Xanthi transformadas y de plantas silvestres (WT). Se utilizó tres plantas de cada línea cada dato es el promedio de tres mediciones ± E.S. Los asteriscos denotan diferencias significativas con WT (p<0.05). 39 En todas las plantas analizadas aumentó la concentración de prolina durante el ensayo obteniendo el máximo de concentración en la amplia mayoría de las plantas el día 20. La línea P80-V7 presento contenidos similares a lo observado en las plantas controles. Las líneas obtenidas a partir del promotor P47770 y las líneas P80-V27 y P80-V39 presentaron menor contenido de prolina que las plantas silvestres luego de 15 días sin riego (Figura17). Figura 17. Concentración de prolina en plantas de tabaco en condiciones de déficit hídrico. Contenido de prolina se determinó en hojas de Nicotiana tabacum cv. Xanthi silvestre (WT) y plantas transformadas genéticamente expresan el gen ScVTE2.1 modulado por los promotores inducibles por estrés. Se utilizaron tres plantas de cada línea cada dato es el promedio ± E.S.; n=3. Los asteriscos denotan diferencias significativas con WT (p<0.05). La expresión relativa de los genes ERD10 y RD29B, conocidos por su inducción en condiciones de déficit hídrico, aumentó luego de los 15 días en ausencia de riego, la cual no era observable al inicio del tratamiento, basándose en la expresión constitutiva del gen constitutivo L25 (Figura 18). 40 a) b) Figura 18. Expresión relativa de NtER10 y NtRD29B.1 inducidos por estrés tabaco transgénico en condiciones de déficit hídrico. Expresión relativa de genes inducidos por estrés en hojas de Nicotiana tabacum cv. Xanthi silvestre (WT) y plantas transformadas genéticamente que expresan el gen ScVTE2.1 modulado por los promotores P47(-V9, -V10, -V17) y P80(-V7, -V27, -V39) de 8 semanas de desarrollo. El gen NtL25 fue utilizado como gen de expresión constitutiva. 41 3.3.1 Daño en el sistema fotosintético. El estado del sistema fotosintético fue evaluado mediante la medición del contenido de los pigmentos y funcionalidad del fotosistema II (PSII). Los valores de clorofila observados medidos en la tercera y cuarta hoja mostraron leves diferencias al inicio del ensayo. Luego del ensayo de estrés, la concentración de clorofila disminuyó entre un 25-50% en las plantas de tipo silvestre, sin embargo en las plantas transformadas la perdida fue menor. Las diferencias fueron más evidentes en la cuarta hoja (Figura 19 A, B). En relación a la eficiencia cuántica del fotosistema II (QY) se observaron diferencias significativas entre las líneas transgénicas y las silvestres luego de 15 días iniciado el tratamiento de estrés, disminuyendo de 0,7 a 0,5 en plantas no transformadas, efecto que no se observó en las líneas transgénicas (Figura 19 C, D). Con respeto al contenido de carotenoides totales, las plantas silvestres mostraron un leve incremento a lo largo del ensayo, sin embrago en muchas de las líneas transgénicas analizadas no mostraron diferencias significativas (Figura 19 E). En cambio las relación entre clorofilas y carotenoides a los 20 días de suspendido el riego fue menor en las plantas silvestres (Figura 19 F). 42 Figura 19. Daño ocasionado por efecto de sequía en plantas tipo silvestre y transgénicas que expresan el gen ScVTE2.1. Medición de parámetros fisiológicos en plantas de tabaco de tipo silvestre (WT) y transgenicas sometidas a déficit hidrico. (A B) contenido total de clorofila. (C D) eficiencia cuántica del PSII (QY). (E) Contenido total de carotenoides. (F) relacion clorofilas/carotenoides, en hojas de plantas silvestres y transgénicas que expresan ScVTE2.1 bajo el control de un promotor inducible P47-(V9, V10, V17) P80-(V7, V27, V39). Clorofilas y eficiencia cuantica fueron medidos en la tercera hoja (A,C) y cuarta (B,D) hoja, respectivamente, a los 3, 9, 15 y 20 d después del último riego. Las barras indican los valores promedio ± E.S. (n=6). Los asteriscos denotan diferencias significativas con WT (p<0.05). La leyenda de las figuras se encuentran en figuras previas. 43 3.3.2 Contenido de y malondialdehído en las plantas sometidas a déficit hídrico. Las plantas sometidas a estrés presentaron un aumento de la peroxidación lipídica, el cual mostró diferencias con respecto a las plantas no transformadas hasta el día 20 donde todas las plantas transgénicas mostraron menor concentración de malondialdehído que las plantas no transformadas (Figura 20). Figura 20. Concentración de malondialdehído en hojas de plantas de tabaco en condiciones de déficit hídrico. La acumulación de malondialdehído en hojas de tabaco silvestre (WT) y transformadas con el gen ScVTE2.1, fue cuantificada luego de 20 días de iniciado el estrés por déficit hídrico. Se utilizaron tres plantas de cada línea cada dato es el promedio ± E.S.; n=3. Los asteriscos denotan diferencias significativas con WT (p<0.05). 44 4 DISCUSIÓN 45 4.1 Las secuencias promotoras aumentan la expresión del gen reportero en condiciones de estrés La infiltración de Agrobacterium usada para la transformación transitoria en Arabidopsis thaliana y en algunas otras especies, puede ser una herramienta rápida y eficaz para el análisis de expresión genes foráneos (Kapila y col., 1997), silenciamiento de genes (Baulcombe, 1999), interacción entre genes de resistencia de hospedero y genes de avirulencia de patógenos (Frederick y col., 1998) y análisis in vivo de regiones promotoras o factores de transcripción mediante la inducción de un gen reportero (Yang y col., 2000). Este trabajo utilizó esta técnica para evaluar nuevos promotores inducidos en condiciones de estrés. Con ello se logró ratificar la regulación endógena reportada para esos promotores y sugiere que los elementos en cis de unión a factores de transcripción hallados en el análisis in silico serían claves para la funcionalidad de los promotores en respuesta al estrés (Liu y col., 1998; Kasuga y col., 1999). Las regiones promotoras de los genes seleccionados y obtenidas en esta tesis muestran sitios de unión a factores de transcripción de respuesta a estrés de las vías de señalización dependiente e independiente de ABA. Al igual como ha sido descrito en los genes COR y LEA asociados a tolerancia a sequía, bajas temperaturas, alta salinidad y ácido abscísico (YamaguchiShinozaki y Shinozaki, 2005) estos presentan en su región promotora una caja ABRE de unión a ABA semejante a los encontrados en rab16-A en trigo y arroz (Guiltinan y col., 1990; Mundy y col., 1990). Se ha descrito que en promotor del gen HVA1 de cebada existe una región básica ACGT y un elemento TGCCACCGG necesarios para su inducción por ABA (Shen y Ho, 1995). En ensayos de simple híbrido en levadura se aislaron tres proteínas de unión al gen RD29B, denominadas AREB1, AREB2 y AREB3 (Uno y col., 2000), denominados también ABF (Choi y col., 2000). Estos factores de transcripción regulados por ABA, sequía y salinidad son capaces de reconocer secuencias ABRE en promotores que responden a ABA (Fujita y col., 2005; Hsieh y col., 2010; Orellana y col., 2010). El análisis in silico de los promotores aislados en el presente trabajo mostraron al menos dos cajas ABRE. Muy probablemente es por esto que todas las hojas infiltradas con las construcciones quiméricas analizadas mostraron diferentes grados de acumulación de gusA bajo las condiciones de deshidratación. La importancia de estas cajas ABRE ha sido demostrada mediante la transactivación de estos promotores por el factor AREB1 de tomate (San Martín, 2011). Los diferentes grados de inducción puede deberse al número de cajas presente en la región 5’. El promotor P05340 presenta tres cajas ABRE al igual que la región 5’ 46 P47770, aunque no se observa la misma inducción de gusA. Por otro lado, la construcción guiada por el promotor P80160 el cual contiene dos cajas ABRE, es la que presenta la mayor inducción analizada en el ensayo de estrés. Esto puede deberse a la presencia de otros elementos en los promotores aislados. Análisis de genes inducidos por estrés abiótico han demostrado que existe una ruta de respuesta a esta condición independiente de ABA, como es el caso de los genes COR, que presentan un motivo conservado en su región promotora CCGAC, conocido como CRT/DRE. Esta secuencia es fundamental para la inducción de los genes COR15A y RD29A de Arabidopsis (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994). En Arabidopsis, se han descrito factores que reconocen secuencias CRT/DRE. Estos son CBF (factor de unión a CRT)/DREB1 (proteínas de unión a DRE 1) y DREB2 el cual es un CRT/DRE que pertenece a la familia de proteínas de unión a elementos de respuesta a etileno EREBP/AP2 (APETALA2) (Liu y col., 1998). CBF/DREB1 y DREB2 pueden ser inducidos por sequía y bajas temperaturas. El promotor P05340 presenta una acumulación de gusA diferente a P47770 pese a que ambos presentan las tres cajas ABRE. Esta diferencia puede deberse a que P05340 contiene dos CRT/DRE, por lo tanto es posible que tenga mayor sensibilidad al momento de percibir el estrés aplicado y por lo tanto puede acumular mayor cantidad de gusA. Otro de los sitios de unión a factores de transcripción encontrado a las secuencias promotoras utilizadas son los elementos NACR, de unión a NACs, péptidos específicos de plantas que contienen un dominio amino terminal altamente conservado compuesto por NAC (NAM, ATAF1, 2, y CUC2)(Aida y col., 1997). Los miembros de la familia NACs son expresados en diversas etapas del desarrollo vegetativo y reconocen diversos estímulos medioambientales. En Arabidopsis se han descrito alrededor de 100 genes perteneciente a esta familia (Riechmann y col., 2000). Algunos de los integrantes se han reportado como proteínas involucradas en tolerancia y respuesta al estrés abiótico. RD26 identificado desde ADNc de plantas deshidratadas, fue descrito como un integrante de la familia NAC y también es inducido por ABA (Fujita y col., 2004). El estudio de tres factores NAC que responden a sequía en conjunto con el promotor de un gen de respuesta temprana a la sequía, ERD1, permitió describir el sitio de reconocimiento de CATGTG denominado NACR (Tran y col., 2004). ATAF1, el primer factor NAC reportado, es inducido por ABA y deshidratación. Plantas que presentan esta proteína mutada pueden presentar estomas defectuosos y mayor tolerancia al estrés. Esto se puede deber a que la 47 expresión de varios genes de respuesta frente al estrés como son COR47, ERD10, KIN1, RD29A y RD22 presentan mayor expresión que en las plantas silvestres, por lo tanto este factor de transcripción estaría regulando negativamente la tolerancia al estrés (Lu y col., 2007). Sitios NACR están presentes al menos una vez en el promotor P05340, mientras que el promotor P80160 tiene 4 secuencias de reconocimiento. En este último caso, estas secuencias comparten además secuencias de reconocimiento ABRE. Este análisis puede ayudar a dilucidar respecto a la diferencias en la acumulación de gusA observado en el ensayo. Frente a las condiciones de déficit hídrico aplicado, las hojas que presentaron mayor acumulación gusA fueron aquellas con el promotor P80160 que contiene mayor número de NACRs, seguidas por aquellas con las construcciones con los promotores P05340 y P47770 con niveles de inducción comparables. P05340 que presenta tres ABRE, 1 NACR y 2 CRT/DRE puede estar inducido por rutas dependiente e independiente de ABA en respuesta a sequía. Por otro lado, en el promotor P47770 solamente se identificaron tres cajas ABRE, por lo que se infiere que podría ser sólo inducido por ABA y factores de transcripción asociados a esta vía de respuesta. Los promotores de los genes RD29A y RD29B son inducidos por estrés, sin embargo presentan diferencias de inducción. La región promotora de RD29A presenta dos DRE y un ABRE, en cambio RD29B presenta dos ABRE y es principalmente es inducido por ABA (Uno y col., 2000; Narusaka y col., 2003). 4.2 Incremento en la concentración de α-tocoferol en condiciones de estrés. Los tocoferoles son considerados uno de los más efectivos antioxidantes protectores de membrana lipídicas. El silenciamiento del gen para la enzima VTE2.1 genera una disminución del 98% de los tocoferoles totales generando una un aumento de la sensibilidad de las plantas transgénicas a una condición de estrés en comparación a las plantas tipo silvestres (GarciaBassets y col.). En una cepa mutante deficiente en tocoferol de Synechosystis CPP 6803, se observó crecimiento similar a las cepas silvestres, demostrando que los tocoferoles no son esenciales para el desarrollo, sin embargo se aprecia que la deficiencia juega un papel crítico frente al estrés oxidativo y con ello la tolerancia a las especies reactivas de oxígeno, debido a que mostró un aumento en la sensibilidad específicamente de los ácidos grasos poliinsaturados, en ausencia de tocoferoles los carotenoides no compensan su función (Maeda y col., 2005; MèneSaffrané y col., 2007). Al silenciar VTE1 se produce una reducción de 95% de α-tocoferol el cual 48 es compensado con un aumentando el contenido de γ-tocoferol, estas plantas presentan una menor oxidación de lípidos, menor daño en las membranas celulares y una reducción en la perdida de pigmentos fotosintéticos por la aplicación de sorbitol en el sustrato o por aplicación de metil viologeno, ambos generadores de estrés oxidativo, sin embargo el γ-tocoferol no puede sustituir a α-tocoferol, en condiciones de estrés salino (Abbasi y col., 2007). Plantas de arroz transgénicas donde se han silenciado el gen OsVTE1 presentan una mayor sensibilidad al estrés salino, y aquellas que sobre-expresan OsVTE1 muestran mayor tolerancia al estrés salino y menor acumulación de H2O2 (Ouyang y col., 2011). La sobre-expresión de VTE2.1 incremento 4,4 veces el contenido de tocoferol en las hojas de Arabidopsis (Collakova y DellaPenna, 2003). Las plantas analizadas en este trabajo con las construcciones quiméricas Pro::ScVTE2.1 aumentaron alrededor de cuatro veces su concentración de α-tocoferol a los 20 días de iniciado el tratamiento de estrés en comparación al tabaco silvestre. Este resultado es significativo y comparable con respecto a trabajos previos en los cuales se han empleado promotores constitutivos. La síntesis de tocoferoles localizada en los cloroplastos y la acumulación de estos en respuesta a estrés, sugieren que los tocoferoles juegan un papel clave en los organismos fotosintéticos. Se ha observado que α-tocoferol promueve la reparación de PSII fotodañado mediante la protección de la síntesis de las proteínas que se requieren para la recuperación de la inhibición por oxígeno singlete en Synechocystis sp. PCC 6803 (Inoue y col., 2011). Se ha descrito que al sobre-expresar la segunda transferasa de la ruta metabólica VTE1 en tabaco, las plantas presentaron una mayor acumulación de tocoferol, mayor contenido relativo de agua, mayor contenido de clorofila en condiciones de déficit hídrico y los parámetros que evidencian daño oxidativo como la liberación de electrolitos, peróxido de hidrogeno y malondialdehído disminuyeron en comparación a las plantas de tabaco sin transformar y a las líneas transgénicas con menor acumulación de tocoferoles (Liu y col. (2008). En las líneas transgénicas analizadas, el incremento en el contenido de α-tocoferol redujo las pérdida del contenido relativo de agua, mejoró la funcionalidad del sistema fotosintético, desaceleró la senescencia foliar y retraso el daño debido al estrés oxidativo en comparación con las plantas silvestres. Es probable que la mejor condición fisiológica del cloroplasto en las líneas transgénicas influencien en un mejor estado hídrico (evidenciado por un ligero mayor CRA), aunque las mediciones de ABA, prolina y expresión de genes marcadores de estrés indicaron que todas las plantas percibieron el déficit hídrico por igual. Con respecto al contenido de γ-tocoferol observado, no se observaron 49 diferencias entre las plantas transgénicas y las plantas silvestres, lo cual se puede explicar porque α-tocoferol es el principal producto de esta ruta metabólica (Collakova y DellaPenna, 2003; Abbasi y col., 2007). La prevención de la acumulación de EROS se logra mediante la acumulación de antioxidantes tales como los carotenoides, tococromanoles y a través de la vía de ascorbatoglutatión que se considera un mecanismo importante antioxidante en cloroplastos de plantas (Falk y Munné-Bosch, 2010; Miller y col., 2010). Las líneas transgénicas analizadas mostraron un incremento temprano del contenido de carotenoides y mantenimiento adecuado de la relación de los pigmentos fotosintéticos. La contribución entre α-tocoferol y carotenoides, puede ser muy importante para la protección contra el estrés oxidativo provocado por la reducción del oxígeno singlete debido a la pérdida de actividad del fotosistema II (Krieger-Liszkay, 2005; Falk y MunnéBosch, 2010). Por lo tanto, las diferentes capacidades de eliminación de EROS pueden señalar diferentes respuestas de adaptación de las plantas para resistir condiciones estrés abiótico. El aumento de los niveles de α-tocoferol es una respuesta común en algunas especies resistentes a la sequía. Por ejemplo, el arbusto mediterráneo resistente a la sequía Cistus creticus, acumula moléculas antioxidantes bajo déficit hídrico (Munne-Bosch y col., 2009). La sobre-expresión de VTE2/HPT1 y la acumulación de α-tocoferol observado en S. chilense en comparación con S. lycopersicum bajo estrés hídrico, podría ser responsable de parte de la respuesta adaptativa de esta especie de tomate silvestre (Loyola y col., 2012). En plantas es posible medir esta capacidad antioxidante, evaluando el estrés oxidativo o el daño por radicales libres en las membranas celulares y lipoproteínas en las plantas estresadas. En semillas y plántulas de Arabidopsis mutantes deficientes de tocoferol, se ha observado un aumento de la lipoperoxidación, lo que implica una disminución en la acumulación de α-linoleico y un aumento en derivados tóxicos del malondialdehído, con lo que se reduce la longevidad de las semillas y se desfavorece el desarrollo de plántulas (Sattler y col., 2004; Mène-Saffrané y col., 2007; Mène-Saffrané y col., 2010a). En las plantas sometidas a déficit hídrico en este estudio, tanto transgénicas como silvestres, los productos terminales de la peroxidación lipídica, es decir la concentración de malondialdehído, aumentaron en condiciones de estrés. Sin embargo las concentraciones observadas en las líneas transgénicas fueron menores respecto a lo observado en las líneas silvestres, lo que puede estar evitando mayor daño en las membranas del aparato fotosintético. 50 CONCLUSIONES 51 Los resultados obtenidos en el presente trabajo permiten concluir: 1 Se logró identificar y aislar tres regiones promotoras de genes de Arabidopsis thaliana. Construcciones genéticas con estas secuencias permitieron demostrar que los promotores responden a estrés por deshidratación, probablemente por el número y tipo de los elementos en cis presentes en ellos. 2 Las plantas transgénicas generadas que llevan la construcción quimérica compuesta con los promotores controlando la transcripción del gen ScVTE2.1 tienen niveles basales bajos de su expresión, el cual es inducido cuando las plantas son sometidas a estrés por deshidratación. Los niveles de expresión observados se correlacionan con la acumulación de α-tocoferol medida. 3 Las líneas transgénicas analizadas evidenciaron una mayor acumulación de α-tocoferol bajo condiciones de estrés y mostraron un mejor estado hídrico, menor pérdida de clorofila, retraso en la senescencia foliar y una menor lipoperoxidación de membranas. Estas observaciones sugieren que la mayor acumulación de tocoferoles estaría disminuyendo el daño oxidativo promovido por la sequía. 4 Las estrategias de ingeniería genética utilizadas en este trabajo pueden ser útiles para el mejoramiento de cultivos frente a condiciones ambientales adversas como el déficit hídrico. 52 5 Literatura citada. 53 Abbasi, A.-R., Hajirezaei, M., Hofius, D., Sonnewald, U. y Voll, L. M. 2007. Specific Roles of α- and γTocopherol in Abiotic Stress Responses of Transgenic Tobacco. Plant Physiology 143(4): 17201738. Abbasi, A.-R., Saur, A., Hennig, P., Tschiersch, H., Hajirezaei, M., Hofius, D., Sonnewald, U. W. E. y Voll, L. M. 2009. Tocopherol deficiency in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum L.) plants leads to accelerated senescence. Plant, Cell & Environment 32(2): 144-157. Aida, M., Ishida, T., Fukaki, H., Fujisawa, H. y Tasaka, M. 1997. Genes Involved in Organ Separation in Arabidopsis: An Analysis of the cup-shaped cotyledon Mutant. 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