Paramax 3 - Bioscience SAS

paramax-3
Prueba Rápida para Malaria Pan/ Pv/Pf
Paramax-3 es un inmunoensayo tipo sandwich, para la detección de proteína
rica en histidina II (Pf HRP-2) para P.falciparum, pLDH específica para P. vivax
y pLDH pan malaria específica. Esta prueba puede ser usada para la
detección de P.falciparum y P.vivax, diferenciación de otras especies de
malaria y para seguimiento de la terapia antimalarial.
RESUMEN
Cuatro especies de parásitos Plasmodium son responsables por la infección
de malaria en Humanos P. falciparum, P.vivax, P.ovale y P.malariae. De
estos el P. falciparum y P. vivax son los de mayor prevalencia. La detección
temprana y diferenciación de Malaria es de mayor importancia dado la
incidencia de malaria cerebral y a la resistencia a medicamentos asociada con
Malaria falciparum y dada la morbilidad asociada con las otras forma
malariales. Como el curso del tratamiento es dependiendo de las especies, la
diferenciación entre Pf y Pv es de mayor importancia para un mejor manejo del
paciente y su recuperación rápida.. Paramax-3 esta basada sobre la detección
de proteína rica en histidina 2 (Pf HRP-2) para P falciparum, la cual es una
proteína soluble en agua que es liberada de eritrocitos parasitados de
individuos infectados. El sistema de detección de P.vivax esta basado sobre la
presencia de pLDH específica para P vivax. Además la detección de otras
infecciones malariales tales como P. ovale y P. malarie se están logrando a
través de pan malaria pLDH específico.
Ya que pLDH es un producto de parásitos viables. La banda pan puede
también ser usada para el curso monitoreado
De una terapia antimalarial efectiva. Paramax-3 detecta la presencia de Pf
HRP-2 específica para P falciparum. pLDH específica para P.vivax y pan
específica pLDH en muestras de sangre total. Es una prueba sensible y
específica para la detección de todas las especies
de malaria, la
diferenciación de P falciparum y P vivax y el exitoso monitoreo de la terapia
antimalarial.
PRINCIPIO
Paramax-3 utiliza el principio de inmunocromatografía. A medida que la
muestra fluye a través de la membrana del cassette después de la adición de
la solución buferizada , el conjugado de Acs anti HRP-2 con oro coloidal, el
anti Ac específico pLDH de P.vivax y el Ac anti pan específico pLDH forman un
complejo de (HRP-2) correspondiente a la pLDH en la muestra lisada. Este
complejo se mueve sobre la membrana a la región donde esta es inmobilizada
por el anticuerpo monoclonal anti Pf (HRP2) y/o el anticuerpo monoclonal anti
P.vivax pLDH específico y/o el anticuerpo monoclonal pan específico pLDH
fijado en la membrana permitiendo la formación de una banda coloreada rosapúrpura en las respectivas regiones, las cuales confirman un resultado de
prueba positiva. La ausencia de banda coloreada en las regiones indicadas
sugieren un resultado negativo. El conjugado que no reacciona y el complejo
no ligado se mueve a través de la membrana y es inmovilizado por un Anti
anticuerpo de conejo que recubre la membrana en la región de control
formando una banda coloreada rosa-púrpura. La banda de control se emplea
para validar el procedimiento de la prueba.
REACTIVOS Y MATERIAL SUMINISTRADO
El kit Paramax-3 consta de los siguientes componentes :
A. Bolsas individuales:
1. Cassettte con membrana que contiene conjugado de Acs
monoclonales anti HRP-2 con oro coloidal anti Anticuerpos
monoclonales anti pLDH específico de P.vivax con oro coloidal,
Anticuerpos monoclonales anti pan específico pLDH con oro
coloidal, conjugado globulina de conejo con oro coloidal, anti
monoclonal anti Pf HRP-2 anticuerpo, monoclonal anti P vivax
específico pLDH anticuerpo, monoclonal anti pan especifico
pLDH anticuerpo y anti Ac de conejo en las respectivas
regiones.
2. Agente desecante.
3. Asa para recoleccion de muestra (5µl).
B. Solución Buffer: vial cuentagotas.
C. Instrucciones de procedimiento
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Cada empaque individual no abierto del kit y el buffer pueden almacenarse
entre 4 - 30º C hasta su fecha de caducidad, indicada tanto en las bolsas como
en el vial. Una vez abierto el vial del buffer, este permanece estable hasta su
fecha de caducidad si se mantiene entre 4 - 30º C. No debe congelarse el kit
ni sus componentes.
PRECAUCIONES
Leer cuidadosamente las instrucciones antes de realizar la prueba.
Solo para su uso como diagnóstico IN VITRO. NO PARA USO MEDICINAL.
No utilizar pasada la fecha de caducidad.
No mezclar reactivos de lotes diferentes.
Manejar todas las muestras como potencialmente infecciosas.
Seguir los estándares de bioseguridad para el desecho de materiales y
muestras potencialmente infectadas
RECOGIDA Y PREPARACION DE LA MUESTRA
Sangre fresca tomada por punción del dedo. Sin embargo, sangre total fresca
con anticoagulante (EDTA, Heparina y Oxalato) pueden ser usadas como
muestra. La muestra puede ser colectada en un contenedor plástico o de
vidrio. Si inmediatamente no es posible la realización de la prueba, la muestra
debe ser almacenada entre 2– 8°C por 72 horas. Muestras de sangre
contaminada o coagulada no deben ser utilizadas para la ejecución de la
prueba.
PROCEDIMIENTO
1. Permita que los componentes del Kit Paramax-3 alcancen la temperatura
2.
3.
4.
5.
6.
ambiente antes de la prueba.
En caso de que la prueba se halla almacenado de 2– 8C, permita que la
prueba este al menos 30 minutos a temperatura ambiente para poder ser
realizada. Verifique el color del desecante. Este debe ser azul. Si ha
cambiado de color o es más débil, deseche esta prueba y utilice otro que
si cumpla con esta observación.
Abra la bolsa y saque el cassette- Una vez abierto, el cassette debe ser
usado inmediatamente.
Si va utilizar sangre total con anticoagulante mezcle la muestra, después
tome con el asa la cantidad de sangre necesaria (5 l ) coloque esta
muestra en el pozo marcado como “A” o en caso de utilizar sangre total
tomada directamente del dedo por punción, utilice también el asa para
tomar la cantidad de muestra necesaria(5 l ) y realice el mismo
procedimiento, alternativamente puede colocarse sangre anticoagulada o
sangre de punción dactilar usando una micro pipeta.
NOTA : Asegúrese que la muestra de sangre tomada con el asa sea
completamente colocada en la almohadilla del pozo marcado como “A”
Dispense 4 gotas del buffer dentro del pozo marcado como “B” utilizando
la botella cuentagotas en posición vertical.
Transcurridos 15 minutos, leer los resultados de acuerdo a lo siguiente:
NEGATIVO para malaria : Únicamente una banda coloreada rosa-púrpura
aparece en la ventana control “C” .
C
Pan
Pv
Pf
A
B
POSITIVO para P.falciparum : En adición a la banda control, también aparece
bajo la región marcada como “Pf y Pan” una banda coloreada rosa-púrpura
en las respectivas regiones.
C
Pan
Pv
Pf
A
B
MATERIAL OPCIONAL REQUERIDO
Micropipeta calibrada con capacidad para medir (5µl).
POSITIVO para P.vivax : En adición a la banda control, también aparece bajo
la región marcada como “Pv y Pan” una banda coloreada rosa-púrpura en
las respectivas regiones
C
Pan
Pv
Pf
A
B
Comportamiento del Test
En un estudio In house se estudiaron 251 muestras, que fueron
tempranamente confirmadas con microscopía y luego fueron probadas con
Paramax-3. Los resultados fueron los siguientes:
Core Malaria Pan/ Pv/Pf
OTRAS ESPECIES: En adición a la banda control, también aparece una
banda coloreada rosa-púrpura únicamente en la región marcada como “Pan”.
C
Pan
Pv
Pf
A
B
INFECCION MIXTA: En adición a la banda control, también aparece una
banda coloreada rosa-púrpura “Pf”,”Pv” y “Pan” en las respectivas regiones.
C
Pan
Pv
Pf
A
B
CONTROL DE CALIDAD
La prueba debe considerarse inválida si no aparece la banda de control “C”.
Repetir la prueba con un nuevo cassette y asegurarse de seguir el
procedimiento adecuadamente.
LIMITACIONES DES TEST
1. Como ocurre con toda prueba de diagnóstico, los resultados deben
correlacionarse con las evidencias clínicas.
2. Los resultados de la prueba deben ser interpretados dentro del contexto
terapéutico clínico y epidemiológico Cuando se indique, las técnicas
parasitológicas
de referencia pueden ser consideradas (examinación
microscópica de la gota gruesa).
3. Alguna modificación del procedimiento de arriba y/o el uso de otros
reactivos invalidará el procedimiento de la prueba.
4. Los cassette y los buffer de diferentes lotes no deben ser mezclados.
5. En caso de infección dada por P.vivax o P falciparum, o dada la infección
mixta por otras especies. La banda pan malaria será también positiva. A partir
de aquí la diferenciación de infección dada por P.ovale o P.malariae no puede
ser hecha.
6. Durante la terapia de monitoreo, si la reacción de la prueba se mantiene
positiva con la misma intensidad después de 5-10 días, post tratamiento, le
posibilidad de una cepa resistente de malaria debe ser considerada.
7. Usualmente, las bandas “Pv” y “Pan” se tornan negativas después del éxito
de la terapia anti malarial Sin embargo ya que la duración del tratamiento y
medicación usada afecta la eliminación de parásitos, las pruebas deberían ser
repetidas después de 5-10 días de iniciar el tratamiento.
8. En malaria por P. falciparum, HRP-2 no es secretada en estado
gametogonia. De esta manera en “portadores” la banda HRP-2 puede estar
ausente.
9. Niveles de HRP-2, post tratamiento persisten hasta 15 días, la banda pan
puede ser usada para monitorear el éxito de la terapia, en los casos de
malaria P.falciparum.
10. En algunos casos donde la banda P.falciparum ( HRP-2) es positiva y la
banda pan malaria es negativa, esto puede indicar una causa de malaria post
tratamiento. Sin embargo su origen puede ser en pocos casos de infecciones
no tradadas. El retestear el paciente dos días después puede ser sugerido.
11. La prueba permite detectar hasta 100 parásitos/µl de sangre de P.
falciparum y 200 parásitos/µl de sangre de P. vivax.
Muestra
Total No. de muestras
Probadas
Sensibilidad
Especificida
d
Positivas
Negativas
P. Falciparum
+Ve
P. Vivax +Ve
16
16
25
25
0
100%
-
0
100%
-
Malaria -Ve
210
210
-
100%
BIBLIOGRAFIA
1. Howard, R.J., et al, 1986: Secretion of a Malarial Histidine-rich
Protein (Pf. HRP II) from Plasmodium falciparum-infected
Erythrocytes.J. Cell Biol., 103, 1269-1277.
2. Rock, E.P., et al, 1987: Comparative Analysis of the Plasmodium
falciparum Histidine-Rich Proteins HRP-I, HRP-II, and HRP-III in
Malaria Parasities of Diverse Origin. Parasitol., 95, 209-227.
3. Parra, M.E., et al, 1991: Identification of Plasmodium falciparum
Histidine-Rich Protein 2 in the Plasma of Humans with Malaria.J.
Clin. Microbiol., 29, 1629-1634.
4.
Rodriguez-Del Valle, M., et al, 1991: Detection of Antigens and
Antibodies in the Urine of Humans with Plasmodium falciparum
Malaria. J. Clin. Microbiol., 29, 1236-1242.
5. Makler, M. T., et. al.(1993) Parasite lactate assay as an assay for
Plasmodium falciparum drug sensitivity. Am. J. Trop. Med. Hyg.
48(6), 739-741.
6. Piper, R. C., et. al., (1999) Immuno-capture diagnostic assays for
malaria utilizing Plasmodium Lactate Dehydrogenase (pLDH) Am. J.
Trop. Med.Hyg. 60(1) 109-118.
7. Srinivasan. S., et. al.,( 2000) Comparison
of blood – film
microscopy, The OptiMAL dipstick, Rhodamine- 123 fluorescence
staining and PCR for monitoring antimalarial treatment. Annals of
Tropical Medicine and Parasitology, 94(3) 227-232.
8. Hunte-Cooke A., et. al., (1999) Comparison of a Parasite Lactate
Dehydrogenase-based Immunochromatographic Antigen Detection
assay (OptiMAL®) with Microscopy for the Detection of Malaria
Parasites in Human Blood Samples. Am J.Trop Med 60(2). 173-176.
9. John, S. M., et. al.,(1998) Evaluation of OptiMAL,a dipstick test for
the diagnosis of malaria. Ann. Trop. Med. Parasitol., 92, 621-622.
10. Quintana M., et. al.,( 1998) Malaria diagnosis by dipstick assay in a
Honduran Population with coendemic Plasmodium falciparum and
Plasmodium vivax. Am. J. Trop. Med. Hyg. 59(6) 868-871.
11. Palmer, C. J.,( (1998) Evaluation of OptiMal test for rapid diagnosis
of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum . J. Clin Microbiol .
36(1) 203-206.
12. Moody A., et. al (2000) Performance of the OptiMAL® malaria
antigen capture dipstick for malaria diagnosis and treatment
monitoring. British Journal of Hematology, 109, 1-5 .
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Zephyr Biomedicals
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Verna Industrial Estate,
Verna Goa – 403 722. India.