NOTA: Usar para todas las soluciones agua desionizada

WB, Nov 2010 SOLUCIONES WESTERN BLOT NOTA: Usar para todas las soluciones agua desionizada Poliacrilamida al 30% ml
25 50
100
150
200 250
Acrilamida (g) 7.3 14.6
29.2
43.8
58.4 73
Bisacrilamida (g) 0.2 0.4
0.8
1.2
1.6 2
Nota: Usar guantes y cubrebocas al pesar. Disolver en la mitad del volumen final. Aforar. Filtrar y guardar en frasco ambar a 4°C Tris 1.5 M pH 8.8 (gel separador) mL
50 100
150
200 250
Tris base (g) 9.075 18.15
27.23
36.3 45.4
Nota: Disolver en la mitad del volumen final, agregar agua hasta un 90% aprox del volumen final, ajustar el pH y aforar. Guardar a 4°C Tris 0.5 M pH 6.8 (gel concentrador) Tris HCl (g) Nota: mL
50 100
150
200 250
3 6
9
12 15
Disolver en la mitad del volumen final, agregar agua hasta un 90% aprox del volumen final, ajustar el pH y aforar. Guardar a 4°C SDS 10% SDS (g) Nota: mL
50 100
150
200 5 10
15
20 Usar cubrebocas grueso. Disolver en la mitad del volumen final. Aforar. Guardar a TA 1 WB, Nov 2010 Persulfato de amonio 10% (APS) mL 1 2.5 5 10 20
APS (g) 0.1 0.25 0.5 1 2
Nota: Alicuotar. Guardar a ‐20°C
Buffer de Corrida 10X Litros
0.5 1 1.5
2
4 Tris base (g) 15 30 45
60
120 Glicina (g) 72.4 144.8 217.2
289.6
579.2 SDS (g) 5 10 15
20
40 Nota: Aforar. Ajustar el pH a 8.3 si es necesario. Guardar a 4°C • Buffer de transferencia 5X Schafer‐Nielsen (Final: 48 mM tris base, 39 mM glicina, 0.00375 % SDS, 20% metanol, pH 9.2 (sin ajustar; si el pH no da, NO ajustarlo) Tris base (g) MW 121.12 Glicina (g) MW 75.07 SDS (g) Nota: Litros
0.5
1
18.1875
36.375
9.1562
18.3125
0.1171
0.2343
Aforar. Guardar a 4°C. 1.5 54.5625 27.4687 0.3514 2
72.75
36.625
0.4686
NOTA: como al buffer ya diluido (1X) se le agrega el 20% de metanol, los solutos se preparan un poco más concentrados (Tris 60 mM, glicina 40 mM y el SDS 0.04%) TBS 10X Litros
0.5 1 1.5
2
5
Tris base (g) 12.1 24.2 36.3
48.4
121
NaCl (g) 40 80 120
160
400
Nota: Ajustar pH a 7.6 y después aforar. Guardar a 4°C
2 WB, Nov 2010 Ponceau S Ponceau S (g) Ácido Acético (ml) Nota: % ml
Final 50
100 150 200
1000 0.2 % 0.1
0.2 0.3 0.4
2
0.5 % 0.25
0.5 0.75
1
5
Aforar. Guardar a TA protegido de la luz. Desecharlo en el frasco. No reusar NaOH 0.1 M NaOH (g) Nota: ml
50 100
0.2 0.4
Guardar a TA.
150
0.6
200 0.8 Solución de teñido Azul de Coomassie para GELES Metanol (ml) Ácido acético (ml) Azul de coomassie (g) Nota: % Final 45 % 10 %
0.25 %
mL 100
150
200 250
45
67.5
90 112.5
10
15
20 25
0.25
0.375
0.5 0.625
Aforar. Guardar a TA protegido de la luz.
Solución de teñido Azul de Coomassie para MEMBRANAS (TINCIÓN IRREVERSIBLE) Metanol (ml) Ácido acético (ml) Azul de coomassie (g) Nota: % Final 4O % 1%
0.1 %
mL 100
150
200 250
40
60
80 100
1
1.5
2 2.5
0.1
0.15
0.2 0.25
Aforar. Guardar a TA protegido de la luz.
Solución de desteñido para MEMBRANAS teñidas con Azul de Coomassie Metanol (ml) Nota: % Final 50 % mL
100
150
200 50
75
100 Aforar. Guardar a TA.
3 250
125
WB, Nov 2010 Stripping buffer Tris base (g) 60 mM β‐Mercaptoetanol (ml) SDS (g) 2% Nota: Litros
0.5 1
1.5
2 3.76 7.52
11.28
15.04
3.9 7.8
11.7
15.6
10 20
30
40
Aforar. Ajustar pH a 6.7. Guardar a temperatura ambiente, cubierto con aluminio y en un lugar obscuro. Solución Reveladora y Fijadora Kodak 1:5 ml 250
500
750 1,000
Solución Reveladora ó Fijadora Kodak Stock (ml)
50
100
150 200
Agua (ml) 200
400
600 800
Nota: Cambiar cuando ya esté muy sucio y/o tarde mucho en revelar; Cuando esté muy amarillo y/o tarde mucho en fijar. Guardar a TA en el cuarto de revelado. 4 WB, Nov 2010 SOLUCIONES DE TRABAJO (preparar sólo lo necesario) Buffer de Transferencia 1X‐ con metanol al 20% 125 (1) ml (# de membranas) 375 (3) 500 (4) 625 (5)
250 (2)
750 (6)
Metanol 25 50
75
100 125
150
TBS 1X 100 200
300
400 500
600
(hacer la dilución previa 1:5 del 5X) AFORAR con agua desionizada al volumen deseado según el número de membranas que se van a transferir. OJO: como el metanol es miscible, hay que aforar ya que si no el volumen final es incorrecto. Nota: Prepararlo el día que se va a utilizar. En lo que se utiliza mantenerlo a ‐20°C. Solución de lavado: TBS 1X – tween 0.1% Por cada litro de TBS 1X agregar 1 ml de tween (mantenerla a TA mientras se usa) Solución Blotto: TBS 1X ‐ tween 0.1% con leche 5% TBS 1X –tween0.1% Leche 5% (g) mL 25 50 75 100 125 150 175 200
250 1.25 2.5 3.75 5 6.25 7.5 8.75 10 12.5 Solución Blotto: TBS 1X ‐ tween 0.1% con albúmina 0.1% (ó leche) TBS 1X –tween0.1% Albúmina (ó leche) 0.1% (g) mL 25 50 75 100
125 150 175 200
250 0.025 0.05 0.075 0.1 0.125 0.150 0.175 0.2 0.25 5