conclusiones

Estructura y estabilidad de un dominio proteico BRCT.
Mansilla, Alexandra J. I.
Obregón
Derechos reservados conforme a Ley
CONCLUSIONES
De los resultados experimentales, se puede concluir:
1. Que las mutaciones realizadas en la posición 21 del dominio BRCT de la
DNLJ-ligasa de T. Thermophilus no producen ningún efecto en la estructura
de la proteína, manteniéndose el plegamiento compacto y definido de la
proteína nativa en sus mutantes.
2. Que si bien la contribución de la arginina 21 del dominio BRCT de la DNLJligasa de T. Thermophilus es favorable para la estabilidad del dominio, este
residuo no mostró tener una contribución crucial en la estabilidad del mismo.
3. Que la diferencia en estabilidad entre los mutantes R21M y R21A muestra
que mas allá de la relevancia de la carga de la arginina, la hidrofobicidad que
su cadena lateral aporta es también significativa en la estabilidad del dominio,
por tanto, el aporte de la arginina 21 a la estabilidad del dominio estaría dado
por la adición de la contribución favorable de su carga positiva y de la
hidrofobicidad de su cadena radical, que también es favorable para la
estabilidad del dominio.
4. Que la contribución estabilizante de la Arginina 21, al hallarse en la superficie
del dominio, parece tener relevancia más que para el dominio en si, en la
capacidad de interactuar con otros módulos de proteínas o ácidos nucleicos,
que se considera es la función principal del dominio BRCT.
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APÉNDICE 1
Medios de cultivo
(*) Si medio sólido es requerido, se emplea la misma receta agregando 20 gramos
de Bactoagar por litro de medio.
LB (*) (53)
Bactotriptona
10 g
Extracto de levadura
5g
Cloruro de Sodio
10 g
Ajustar a pH 7.5 con Hidróxido de Sodio
Agua destilada en cantidad suficiente para 1 litro
TB (53)
Agua destilada
900 ml
Bactotriptona
12 g
Extracto de levadura
24 g
Glicerol
4 ml
Autoclavar y dejar enfriar hasta 60 C
Agregar 100 ml de buffer fosfato autoclavado
Para un litro de Buffer fosfato: Fosfato de potasio monobásico 23.1 g
Fosfato de potasio dibásico
125.4 g
Autoclavar
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2xYT (*) (53)
Bactotriptona
20 g
Extracto de levadura
10 g
Cloruro de Sodio
10 g
Agua destilada en cantidad suficiente para 1 litro
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APÉNDICE 2
SDS PAGE (33)
•
Buffer para el Ánodo (+): 200 mM Tris pH 8.9 (diluido de una solución 10X
stock)
•
Buffer para el cátodo (-): 100 mM Tris/100 mM Tricina/0.1% SDS (no necesita
ajustar pH, es aproximadamente 8.25, también puede ser diluido de una
solución stock 10X)
•
Gel Buffer: 3.0 M Tris, pH 8.45/0.3% SDS
•
Proporción de Acrilamida/bis en el gel de Apilamiento : 48%
acrilamida/1.5% bis-acrilamida
•
Proporción de Acrilamida/bis en el gel de Separación : 46.5%
acrilamida/1.5% bis-acrilamida
•
Buffer de muestra: Para 20 ml (2X)
5 ml 0.5 M Tris, pH 6.8
4 ml 20% SDS
1 ml 2-mercaptoetanol
4 ml 50% glicerol
0.004 g azul de bromofenol
6 ml agua
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Geles :
•
1. Gel de Separación:
10% gel
1.22 ml acrilamida
2 ml gel buffer
2 ml 50% glicerol
0.78 ml agua
75 ul 10% persulfato de amonio
7.5 ul TEMED
•
2. Gel de apilamiento:
0.25 ml acrilamida
0.75 ml gel buffer
2.0 ml agua
20 ul 10% persulfato de amonio
2 ul TEMED
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