Regulación de la Expresión en Procariotas

Regulación de la Expresión en Procariotas
•Regulación a nivel de Transcripción (Iniciación o Terminación)
¾RNA polimerasa (factores V)
¾Proteínas regulatorias
¾Estructura del ARN transcripto.
•Regulación a nivel de Traducción (Accesibilidad o no del RBS)
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Regulación de la Iniciación de la Transcripción
• Control constitutivo
– Depende de la estructura del promotorÆ determina el nivel basal
de transcripción
• Secuencia -35 (unión RNA pol)
• Secuencia -10 (complejo cerradoÆ abierto)
• Iniciaciones abortivas (secuencia transcripto)
• Control regulado
– Depende de proteínas regulatorias
– Cambio de subunidad VV70V32V54Vs)
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RNA polimerasa + Factores V
ƒV70 : Factor general
ƒV32 : Heat shock
ƒVs : estrés
ƒV54 : carencia de N
•Secuencias conservadas en centros -35 y -10
•RNA pol + Vcon igual tamaño y ubicación respecto al sitio de iniciación
•Regulación a nivel de modificaciones o actividad de la Proteína (Ej: V32 normalmente
unida a DnaK (inestabilidad). Heat shock produce liberación de V32 )
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Regulación de la expresión en bacterias
• OPERONES Æ un único promotor regula la expresión de genes relacionados
(codifican proteínas involucradas en una misma vía metabólica o proceso)
mRNA policistrónico
•Regulación Positiva
•Activación de la transcripción por proteína activadora (facilita la
unión de la RNApol)
Regulación Negativa:
Inhibición de la transcripción por unión de proteína Represora (Inhibe
la unión o iniciación de RNApol)
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Regulación negativa
Regulación positiva
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Regulación de la expresión en bacterias
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Operón Lactosa
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•Proteína represora LacI
Lac I : tetrámero
– Monómero
•DBD (HTH) N-terminal
•Reg central unión al inductor
•C-terminal: Oligomerización
– Dímero Æ mayor afinidad por DNA
Sitios de unión al DNA: Operador
•O1 (región promotora)
•O2 (+412)
•O3 (-82)
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Regulación Positiva
CAP-AMPc (CRP)
Dímero (2 subunidades idénticas)
activado por AMPc
Sitio de unión de CRP 22pb (repetición invertida)
En operón lactosa: -61
Sistema de control de la captación de
glucosa (PTS) regula la actividad de la
adenilato ciclasa (IIA Gluc -IIA Gluc-P)
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Operón Arabinosa
AraC : Proteína activadora y
represora
CRP: unión a su sitio específico
requerida para activación del operón
AraC represora
El promotor araBAD es un promotor débil
AraC/arabinosa: Activadora
CTGACG -- 18 -- TACTGT
TTGACA -- 17 -- TATAAT
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Operón Triptofano
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Operón Triptofano
Represión por producto final
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UGG
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Atenuación en trp
•
La [trp] determina la [trp-tRNA].
•
En presencia de trp:
– El ribosoma se mueve hasta el codón de terminación.
– Se forma estructura secundaria en el ARNm que provoca la terminación de
la transcripción (OFF).
•
En ausencia de trp:
– El ribosoma se frena en codones Trp
– Se forma una estructura secundaria alternativa en el RNA.
– Continua la transcripción de los genes estructurales (ON).
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•Regulación por atenuación en Operones de genes involucrados
en biosíntesis de aminoácidos: his, phe, leu,etc
En todos los casos los genes estructurales están precedidos por un RNA lider corto que codifica un
polipéptido corto rico en el aminoácido producto final de la via
Secuencia de aminoácidos de algunos péptidos lider
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OPERON TRIPTOFANO Bacillus subtilis
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Regulación de la
asimilación de nitrógeno
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Regulación a nivel traduccional
Operones de Proteínas ribosomales
Regulación de la traducción del ARNm
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ARN reguladores de la expresión
•Riboswitch: Regulación de la expresión a nivel de transcripción o
traducción del ARN
Ligandos
•Parte de la región 5’ no traducida de un ARNm
que funciona como sensora y regula la
expresión.
(aminoácidos, bases, azúcares, vitaminas, etc)
•Comprende 2 dominios: 1) aptamero: unión a
un ligando y 2) plataforma de expresión: acopla
la unión del ligando a un cambio en la expresión.
• Conformaciones mutuamente excluyentes de
una larga región 5’ no traducida del ARNm
(5’UTR)
•Regulado por señal del entorno en forma de un
metabolito (ligando)
•No hay ninguna proteína involucrada
•Unión del ligando directamente al ARNm
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Tiamina
(Tiamina
(E.coli))
(FMN, SAM,
guanina)
GlcN6P
mRNA glmS
(Enz síntesis de
GlcN6P)
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Riboswitches sintéticos: búsqueda de nuevos aptámeros (ARN) que se unan a
ligandos específicos y regulen la expresión.
SELEX
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ARN regulatorios
Codificado en cis
ARN antisentido
Mecanismos regulatorios: Inhibición
de maduración de primer, inhibición de
la traducción o promoción de
degradación o clivaje del ARN
Codificado en trans
Pequeños ARN regulatorios:
- Apareamiento con sitio de iniciación de la traducción
- Unión a una región del ARN puede cambiar la conformación de otra Æ
expone o oculta región de SD
- apareamiento con blancos ARNm generando ARNdc Æ clivaje por
ARNasa E
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•Regulación por RNA antisentido (sRNA)
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SISTEMAS DE EXPRESIÓN PROCARIOTAS
Vector de expresión procariota : set de elementos genéticos óptimos para
transcripción y traducción
•Promotor regulable
•Terminadores de transcripción
•Iniciación de traducción
•Enhancer de traducción
•Terminación de traducción
•Estabilización de mRNA
ATG
R
Promotor
SD
STOP
Gen de interés
TT
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Promotores E.coli
¾Lac (lacI)
¾tac o trc (lacI)
¾Pho (fosfato)
•Promotores fuertes (10-30% de proteína
total) y regulables
¾Trp (triptofano)
•Inducción rápida
¾araBAD (araC)
•Nivel de expresión basal bajo (promotor
altamente represible)
¾pL (O)
(OcIts)
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SISTEMAS DE EXPRESIÓN PROCARIOTA
PROMOTOR trc o tac
-35 promotor trp
Promotor
-10 promotor lac UV5
- Separación 17pb
lac UV5
TTTACA -- 18 -- TATAAT
lac wild-type TTTACA -- 18 -- TATGTT
TTGACA -- 17 -- TATAAT
Trp
TTGACA -- 17 -- TTAACT
TTGACA -- 17 -- TATAAT
IPTG (isopropil-E-D-tiogalactósido)
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SISTEMA DE EXPRESIÓN BASADO EN EL
BACTERIÓFAGO T7
1- Fago OCE6 defectivo (no lítico) que
expresa T7 RNA polimerasa
2-
T7 polimerasa: transcribe genes
tardíos del fago T7 (lisis)
3- + Plásmido que expresa T7 lisozima
(inhibe T7 polimerasa)
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+1
Promotor T7
TAATACGAACTCACTATAGGGAGA
Terminador T7
RBS
GAAGGAGA
ATG
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