Tecnología de DNA recombinante I

Tecnología de DNA recombinante I
• Base: capacidad de manipular moléculas de DNA
en un tubo de ensayo
• Enzimas: Purificadas, con actividades conocidas y
controladas
– DNA polimerasas  Síntesis de DNA
– Nucleasas Ruptura de uniones fosfodiester
– Ligasas Síntesis de uniones fosfodiester
– Modificación de extremos  Introducción de cambios en los
extremos del DNA
1
DNA polimerasas
• DNA pol I E.coli
• Holoenzima
• Fragmento Kleenow
• DNA pol T4
• DNA pol T7
 Síntesis de ADN
- Rellenado de extremos
simple cadena
- Sondas radioactivas
- Secuencia
- PCR
 Síntesis de ADNc
• DNA pol termoestables
• Rev. Transcriptasas
2
Nucleasas
• Exonucleasas
• Endonucleasas
– Reconocimiento de secuencias específicas en el DNA. Corte
en sitios específicos y reproducibles
Tipo II: Herramientas claves en técnicas de DNA
recombinante.
•
•
•
•
•
Más de 3500 enzimas distintas
Secuencias de reconocimiento de 4, 5, 6 pb
Palindrómicas
Corte en sitio de unión dejando extremos 5’P y 3’OH
Requieren Mg2+
3
Endonucleasas de Restricción
-Rol en la naturaleza: protección de las bacterias contra la infección de virus
-Usualmente en combinación con 1 o 2 enzimas de modificación (ADN
metiltransferasas): reconocen la misma secuencia en el ADN y metilan una
de las bases en ambas cadenas.
Sistemas Bacterianos de
RestricciónModificación (R-M)
-Proteínas separadas con actividades
independientes
-Actividades en subunidades separadas
-Actividades en dominios separados
4
Enzimas Tipo I
-Complejas, con múltiples subunidades, con actividad de clivaje y modificación en
la misma proteína.
-Cortan el ADN al azar desde su secuencia de reconocimiento (+ de 1000nt)
Enzimas Tipo III
-Complejas, grandes, combinan actividades de restricción y modificación
-Cortan el ADN fuera de la secuencia de reconocimiento y requieren 2
secuencias en direcciones opuestas en el mismo ADN.
5
Enzimas Tipo II
- Cortan el ADN en posiciones definidas cercanas o dentro de la secuencia de
reconocimiento.
- Colección de proteínas no relacionadas, origen evolutivo diferente
-Tienden a ser pequeñas
 Clivaje dentro de la secuencia de reconocimiento
 La mayor parte reconocen secuencias simétricas (unión al ADN como
homodímeros).
 Algunas reconocen secuencias asimétricas (heterodímeros) (CCTCAGC
BbvCI)
 Secuencias continuas (GAATTC EcoRI) o discontinuas (GCCNNNNGGC Bgl I)
Enzimas Tipo IIs
- Cortan el ADN fuera de la secuencia de reconocimiento
- 2 dominios: dominio de unión y de clivaje
-Reconocen secuencias continuas y asimétricas
6
Modificación de extremos
• DNA transferasas
• polimerasas sin templado (polyA, polyT)
• Ligasa (fago T4)
• Polinucleótido Kinasa (fago T4)
• Fosfatasa alcalina (CIP)
7
Purificación de DNA
Ruptura de la célula
Remoción selectiva
del DNA
•Unión del DNA a sílica
en presencia de agentes
desnaturalizantes (alta
sal y pH)
Elución
Degradación y
remoción de todos los
componentes distintos
al DNA
Célula animal: SDS
Cél. Vegetal:
congelamiento + mortero
Bacteria: tratamiento
químico + enzimático
•Extracción con solventes
•Tratamiento con RNasas
Precipitación del DNA
de la fase acuosa con
alcohol y sal
8
Hibridización
Capacidad de 2 cadenas de Ácidos nucleicos de renaturalizar, depende
del apareamiento específico entre las 2 cadenas.
En solución
ADN inmovilizado
De acuerdo a las condiciones de hibridización se pueden aparear
secuencias que no son perfectamente complementarias.
9
Separación de fragmentos de ADN producidos por
digestión del ADN genómico con enzimas de
restricción
Electroforesis
Separación de fragmentos de DNA
por tamaño sobre una matriz sólida
en un campo eléctrico
Velocidad de migración inversamente proporcional al log del PM
10
Identificación de fragmentos del ADN genómico que
contienen una secuencia específica (gen)
Southern Blot
Identificación de
fragmentos de DNA con
una sonda radioactiva
11
Southern Blot
12
Evaluación de la expresión génica
Northern Blot
•Muestras de ARN inmovilizadas en una
membrana.
•Sonda específica para analizar expresión
de 1 gen
Microarreglos
•Matriz con oligonucleótidos o clones de
cDNA específicos para genes conocidos (>
30.000 spots)
•Sonda: ARNm marcado
13
Northern Blot
14
Microarreglos
15
Plásmidos
• Información genética no esencial
• Información beneficiosa para la bacteria en determinadas
circunstancias
– resistencia a agentes antibacterianos (antibióticos, metales pesados, etc)
– Bactericina (colicina)
– Degradación de compuestos de C (tolueno)
– Iniciación de tumor (Agrobacterium)
– Nodulación (Rhizobium)
– Factores de virulencia (toxinas, adhesinas, etc))
16
Características
•
DNAdc circular (super-enrollamiento negativo)
•
Tamaño 1 a 200kb
•
Replicación autónoma
•
Regulación de la replicación
•
Número de copias definido
•
+ de 1 tipo de plásmido / célula (incompatibilidad)
•
Rango de Huésped definido
17
Rango de huésped
Bacterias en las que el plásmido puede replicar
• Definido por el ori
– Rango Estrecho (pUC, pBR, pET)
– Amplio Rango (RK2, RSF1010)
• Capaces de expresar sus genes en distinto tipo de bacterias
• Codifican para todas las proteínas requeridas para la
iniciación de la replicación
18
Número de copias
• Plásmidos relajados
– Alto número de copias
– Inhiben la replicación cuando se alcanza un cierto
número de copias
• Plásmidos no relajados (“stringent”)
– Mecanismo preciso de regulación
Col E1 RNA
Plásmido R RNA + proteína
Plásmido F Iterones
19
Vectores de clonado
• Pequeño  facil aislamiento e introducción en células
• Alto número de copias
• Marcadores de selección selección de células
• Sitios únicos de reconocimiento de endonucleasas
• Sistemas de selección de vectores con y sin inserto
pBR322
20
Vectores de clonado
Copias/célula Tamaño inserto
Basados en plásmidos de E.coli
50-100
Basados en Bacteriófago lambda
Cósmidos
0,1-12 kb
10-20 kb
5-50
Cromosoma artif. de levadura: YAC
35-45 kb
600-1400 kb
Basados en bacteriófago P1
1-2
30-90 kb
BAC
1-2
30-300 kb
PAC
1-2
30-300 kb
Fósmidos
1-2
35-45 kb
21
Bacteriófago lambda
22
Cósmidos
23
Yac
24
Bibliotecas Genómicas
•Una biblioteca genómica es un conjunto de clones, cada uno de los cuales contiene un
fragmento del genoma de un organismo dado
•Representación completa de secuencias genómicas
Construcción de una
Biblioteca Genómica
•Clivado del Genoma en
fragmentos
•Ligado de cada fragmento en un
vector
•Introducción de cada vector
recombinante en una bacteria
25
Tamaños de Bibliotecas genómicas humanas preparadas
en distintos vectores
Número de clones*
Tipo de Vector
Tamaño de inserto (kb)
P = 95%
P = 99%
 replacement
18
532 500
820 000
Cosmid, fosmid
40
240 000
370 000
P1
125
77 000
118 000
BAC, PAC
300
32 000
50 000
YAC
600
16 000
24 500
1400
6850
10 500
Mega-YAC
26
Representatividad de una biblioteca Genómica
El tamaño de una biblioteca, necesario para que una determinada secuencia de
interés esté representada, está determinado por el tamaño de los fragmentos
clonados y el tamaño del genoma
N= ln (1-P) / ln (1-I/G)
N= número de clones que deben ser analizados
P= Probabilidad de que un determinado segmento este representado en la
biblioteca
I= Tamaño promedio de los fragmentos insertos en el vector
G= Tamaño del genoma
En general: para aislar un fragmento de interés con una probabilidad del 99% se
deben analizar un número de clones tal que I x N =4,6 veces el genoma
27
Mapa génico
El mapeo genético está basado en la utilización de técnicas genéticas para construir
mapas que muestran la posición de marcadores genéticos o de marcadores moleculares.
Las técnicas genéticas incluyen experimentos de recombinación y estudio de pedigrees
en humanos.
•Armado del mapa genético de un organismo (localización de genes en el
genoma) por análisis de ligamiento entre distintos caracteres.
•Distancia génica basada en el porcentaje de ligamiento entre genes.
Identifica la distancia entre mutaciones en términos de la frecuencia de
recombinación
•Se asume crossing over al azar en todo el genoma, sin embargo no es asi.
28
Marcadores Génicos
• Alelos diferenciables fenotípicamente
• Visualmente
• Limitado número de fenotipos distinguibles visualmente
• Bioquímicamente
• Ej: grupos sanguíneos ABO, HLA
Marcadores de DNA
•Características que no son genes, con al menos 2 alelos
• Sitios de restricción polimórficos (RFLP)
• Repeticiones de secuencias simples
polimórficas
• Posiciones en el genoma con diferencias en 1
nucleótido (SNP)
29
• RFLP
• Sitios de restricción polimórficos
• Solo 2 alelos posibles
30
RFLP screening
31
• SSLP
• Fragmentos de secuencias repetidas de longitud polimórfica (número
de repeticiones variable)
• Múltiples alelos
• Minisatélites (VNTR)
• Microsatélites (STR)
32
Minisatélites
(VNTR)
33
34
• SNP
– Posiciones en el genoma con diferencias en 1 nucleótido
– Potencialmente 4 alelos posibles Generalmente 2 alelos
• Genoma humano 1,42 x106 SNP (100.000 RFLP)
35
SNP screening
36
Mapa Físico
El mapeo físico utiliza técnicas de Biología Molecular para examinar directamente las
moléculas de ADN para la construcción de mapas que muestran la posición de fragmentos
de ADN (en general de secuencia desconocida) en el genoma.
• Mapa de restricción
• FISH:
Hibridación in situ con sonda fluorescente
• STS:
(sequence tag site) sondas de fragmentos pequeños sobre
Biblioteca de DNA
37
38
39
40
Transferencia horizontal de información
genética en bacterias
41
42
Transferencia del
cromosoma bacteriano
43