Trabajo de investigacion Bioq. Raga Ariel

Evaluación de un medio de cultivo para el
aislamiento de dermatofitos a partir de uñas
Raga Ariel J; Druetta Silvina del V; Fraenza Laura B
Hospital Nacional de Clínicas, Laboratorio Central, Servicio de Micología.
Santa Rosa 1564, Ciudad de Córdoba (C.P.5000).
[email protected]
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RESUMEN
En el Laboratorio de Micología del Hospital Nacional de Clínicas (Ciudad de
Córdoba) se formuló un medio de cultivo específico para el aislamiento de hongos
dermatofitos. Se denominó DTM 50% y surgió a partir de modificaciones del medio
DTM propuesto por Taplin. Se evaluó la probabilidad de aislamiento de dermatofitos a
partir de uñas de pie, efectuando una comparación entre ambos medios.
Concluimos que, el medio de cultivo DTM 50% si bien brinda una mayor
probabilidad de recuperación de hongos dermatofitos a partir de uñas de pie comparable
con DTM, es más permisivo para el desarrollo de hongos no dermatofitos.
Palabras clave: DTM, DTM 50%, onicomicosis, dermatofitos.
INTRODUCCIÓN
Las micosis superficiales son una de las patologías más frecuentes de consulta
dermatológica. La mayoría de estas enfermedades cutáneas son infecciones producidas
por el parasitismo fúngico de los tejidos queratinizados como la piel y sus faneras, tanto
del ser humano como de animales (1). Los principales agentes causales son un grupo
homogéneo de hongos queratinofílicos denominados “dermatofitos”, constituido por
tres géneros: Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton (1). Pueden identificarse
por sus características macro y micro morfológicas estudiadas sobre medios de cultivo
específicos y por el uso de pruebas bioquímicas (1,2,3).
El “Dermatophyte test medium” (DTM) formulado por Taplin en 1969 (4) es el
medio comúnmente empleado para aislamiento e identificación presuntiva de
dermatofitos. Contiene antibióticos para impedir el desarrollo de bacterias y
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cicloheximida, antifúngico que inhibe el crecimiento de la mayoría de hongos miceliales
y levaduras saprófitas que pueden estar presentes en la muestra (1,5,6). Adicionalmente
incluye rojo fenol como indicador de pH, el cual vira de amarillo a rojo en presencia de
hongos dermatofitos, debido a que generan metabolitos alcalinos (6,9). Aunque su costo
es elevado, es útil para primo aislamiento ya que, por sus características, permite un
mayor porcentaje de recuperación de dichos hongos en comparación a lo obtenido con
medios de cultivo convencionales (6).
Se han propuesto algunos medios de cultivo que, en comparación a DTM,
brinden una mayor probabilidad de aislamiento de dermatofitos (9,10,11). La falta de
estudios registrados en los últimos años en la Ciudad de Córdoba motivó a nuestra
investigación.
El objetivo de nuestro trabajo fue formular un medio de cultivo específico para
dermatofitos y evaluar la probabilidad de aislamiento de estos hongos a partir de uñas
de pie, comparándolo con DTM.
MATERIALES Y MÉTODOS
Medios de cultivo
Se preparó DTM según Taplin (4) y el medio de cultivo a ensayar, al que se
denominó DTM 50%. Los componentes de este último fueron los mismos que para
DTM pero se modificaron las concentraciones (Tabla 1).
Ambos medios de cultivo se esterilizaron en autoclave a 120ºC (1 atmósfera de
presión) durante 10 minutos. Luego se dispensaron en placas de Petri descartables de 50
x 12 mm, procurando alcanzar un espesor de capa de agar que oscile alrededor de los
6mm (aproximadamente 6 ml).
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Tabla 1: componentes de DTM y DTM 50%.
DTM
DTM 50%
Peptona de Soja
10g
5g
Cicloheximida
0.5g
0.25g
Glucosa
10g
5g
Sulfato de gentamicina
100ug/ml
50ug/ml
Clortetraciclina
100ug/ml
50ug/ml
Rojo fenol 0.5%
40ml
20ml
Agar/agar
20g
20g
1000ml
1000ml
5,5
5,5
Agua destilada c.s.p.
pH
Para las pruebas bioquímicas que formaron parte de la identificación de los
hongos aislados se utilizó agar papa glucosado (Britania) para estimular la fructificación
y agar urea de Christensen (Britania), con el que se realizó el test de producción de
ureasa.
Preparación y toma de muestras
En el Servicio de Micología perteneciente al Laboratorio Central del Hospital
Nacional de Clínicas durante el periodo Octubre 2010- Mayo 2011, se recolectaron 108
muestras de uñas de pie provenientes de pacientes de entre 15 a 65 años de edad. Se
instruyó a los pacientes para evitar la contaminación de las mismas: se les indicó
suspender la medicación antifúngica durante un lapso no inferior a siete días, suspender
uso de pomadas, talcos, tinturas y lacas, y por último, lavar la/las uñas afectadas con
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jabón blanco no perfumado tres veces por día durante tres días previos a la toma de
muestra.
Previa desinfección con alcohol 70% de la zona afectada, se efectuaron los
raspados con hoja de bisturí número 22, recolectando en portaobjeto o cápsula de Petri
estériles.
Procesamiento de las muestras
Para el examen microscópico directo (EMD) se tomó una fracción de escamas
que fueron tratadas con hidróxido de potasio al 40% y calor, para facilitar la
visualización del hongo.
La totalidad de las muestras fueron sembradas en DTM y DTM 50%, se
incubaron a 28°C durante 20 días. Los cultivos fueron revisados diariamente durante
dicho período.
La identificación de género y especie fue realizada por observación de
características macro y micro morfológicas, y aplicación del test de ureasa para
diferenciar las colonias de Trichophyton mentagrophytes de las colonias de
Trichophyton rubrum, siendo el test positivo sólo para el primero.
Las colonias que no fructificaron en DTM y DTM 50% se repicaron en agar
papa glucosado.
Interpretación de resultados
Tanto en DTM como en DTM 50%, se consideraron cultivos positivos para
dermatofitos a las placas que presentaron desarrollo de colonias de hongos filamentosos
hialinos con viraje del indicador del color amarillo al rojo y EMD previo positivo, con
presencia de hifas hialinas tabicadas o artrosporadas, compatibles con dermatofitos. Se
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reportaron como negativas las placas que no presentaron desarrollo de dichas colonias
trascurrido el tiempo de incubación, previa correlación con lo observado en el EMD.
Análisis estadístico
Se utilizó el programa SPSS versión 15.0 para el análisis estadístico de los datos.
Se aplicó la prueba Chi-cuadrado (χ²) de Pearson, trabajando con niveles de confianza
entre el 95% y 99%, siendo el valor de Chi crítico para 1 grado de libertad
respectivamente χ²=3.84 y χ²=6.64.
RESULTADOS
De las 108 muestras recolectadas sólo en 65 (60.2%) se observó presencia de
hifas hialinas tabicadas o artrosporadas, compatibles con dermatofitos (Fig.1). A partir
de estas 65 muestras con EMD positivo se obtuvo desarrollo de hongos dermatofitos en
el 61,5% de las sembradas en DTM 50% y el 46,2% en DTM. Los aislamientos de
hongos dermatofitos en ambos medios de cultivo correspondieron a: Trichophyton
rubrum 60.0%, Trichophyton mentagrophytes 30.0% y Trichophyton spp. 10.0%.
Se repicaron en agar papa glucosado 15 colonias que desarrollaron sin
fructificación en DTM ni DTM 50%, asimismo 7 de las mismas no fructificaron y se
clasificaron como Trichophyton spp.
Fig.1. EMD de material extraído
de uña de pie. Se observan hifas
artrosporadas compatibles con
dermatofitosis.
6
En todas las muestras con EMD negativo no hubo desarrollo de hongos
dermatofitos tanto en DTM como en DTM 50%, pero en algunos casos sí hubo
desarrollo de hongos no dermatofitos.
Del total de las 108 muestras sembradas en DTM y DTM 50%, 21 (19.4%) y 39
(36.1%) respectivamente, desarrollaron hongos no dermatofitos de los géneros
Candida, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Acremonium y hongos dematiáceos, cuya
identificación escapaba a los objetivos de este trabajo. Además, se observó viraje del
indicador en 6 casos de los desarrollados en DTM y en 15 de los desarrollados en DTM
50%.
No se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa en cuanto a la
posibilidad de que DTM 50% brindara una mayor probabilidad de aislamiento de
dermatofitos que DTM (χ²experimental=3,09). Si hubo una diferencia estadísticamente
significativa (χ²experimental=7.48) en cuanto al desarrollo de hongos no dermatofitos
en DTM 50% versus DTM.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Las onicomicosis son consideradas como las micosis superficiales más difíciles
de diagnosticar (5,12,13), ya que están sujetas a diferentes variantes, que van desde las
condiciones higiénicas y medidas adoptadas por el paciente antes de la toma de muestra,
hasta las dificultades que se presentan en el laboratorio, como la obtención de una
muestra óptima que permita identificar las hifas en el EMD, la calidad de la muestra que
permita el desarrollo de colonias puras del agente causal y la utilización de medios
selectivos para el aislamiento de patógenos específicos como los dermatofitos. Cabe
mencionar que dichos medios de cultivo presentan un elevado costo comercial, por eso
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es que DTM 50% fue formulado con menores concentraciones de los componentes
propuestos por Taplin (4), con el propósito de reducir el costo de su preparación.
La visualización de estructuras compatibles con dermatofitos en el EMD arroja
un diagnóstico presuntivo debido a su carácter de patógeno primario en onicomicosis
(1,3,14). Según algunas publicaciones, sólo resultan positivos los cultivos en el 50-70%
de los EMD positivos ungueales (3,14,15,16), sin embargo, Singh y cols informaron
haber alcanzado porcentajes superiores al 85% (17). En nuestro estudio el porcentaje
obtenido a partir de DTM 50% no es superior a lo informado por Singh (17), pero se
ubica dentro del 50-70% reportado por otros (3,14,15,16) y además fue superior a lo
obtenido a partir de DTM.
En la bibliografía se reporta a Trichophyton rubrum y Trichophyton
mentagrophytes como los hongos aislados con mayor frecuencia a partir de escamas de
uñas de pie (3,6,12,13,15,18,19). En nuestro trabajo se obtuvo una frecuencia similar
tanto a partir de DTM como de DTM 50%, ya que, del 100% de dermatofitos aislados
en uñas de pie, un 60% correspondió a Trichophyton rubrum, lo cual concuerda con el
63% informado por Rich y cols (6). Por otro lado, se aisló Trichophyton
mentagrophytes en un 30%, siendo mayor al 7% informado en el estudio antes
mencionado. La diferencia podría deberse simplemente a variaciones de tipo
epidemiológicas y no relacionadas al medio de cultivo.
Hubo colonias de dermatofitos que desarrollaron sin fructificación en DTM ni
DTM 50%, y a pesar de repicarse en agar papa glucosado no fructificaron, por lo que, al
no observarse las estructuras micro morfológicas características de los hongos y no
disponer de otras vías de identificación en nuestro laboratorio, se clasificaron como
Trichophyton spp. Consideramos que fue producto de las propiedades intrínsecas de los
hongos, ya que las colonias se comportaron de igual manera en ambos medios.
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En ninguna muestra con EMD negativo hubo desarrollo de hongos dermatofitos
tanto en DTM como en DTM 50%. Esto no concuerda con el estudio realizado por
Nazar y cols (19) donde se informa lo contrario. Esta diferencia se debería a una
variable aleatoria difícil de controlar como es la presencia de estructuras fúngicas en la
fracción de escamas utilizadas para el EMD.
En publicaciones referidas a onicomicosis por dermatofitos y por hongos no
dermatofitos, muchos investigadores analizaron la utilidad de DTM y proponen que la
concentración de cicloheximida que compone el medio de cultivo no garantiza la
inhibición del desarrollo de hongos no dermatofitos, ya sean saprófitos o patógenos,
incluso muchos de ellos son capaces de inducir cambios en el color del medio de cultivo
(9,11,12,19,22). En consecuencia, el proceso de recuperación e identificación de
dermatofitos se ve afectado a partir del primo aislamiento en DTM. En nuestro trabajo
fue mayor el porcentaje de desarrollo de hongos no dermatofitos en DTM 50% que en
DTM, muy probablemente debido a la reducción de concentración de cicloheximida que
se usó en DTM 50%. Es de destacar que esto no redundó en un diagnóstico errado, ya
que los hongos dermatofitos poseen características micro y macro morfológicas
diferenciales. A partir de estos hallazgos pueden surgir nuevos estudios comparativos
que evalúen la concentración de cicloheximida en el medio de cultivo.
Concluimos que el medio de cultivo DTM 50% brinda una elevada probabilidad
de recuperación de hongos dermatofitos a partir de uñas, comparable a DTM, siendo útil
en el diagnóstico de dermatofitosis en uñas de pie. Debido a la reducción de
concentración de algunos componentes, resulta más económico que DTM.
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