columna

Cromatografía de alta presión: esquema
Registrador
Bomba
Inyector
Reservorio
de
Medidor de solventes
presión
Sistema de datos
o integrador
Columna
Detector
Desecho
HPLC 2 10/96
1
PROPIEDADES DE LA FASE MÓVIL
• Disuelve la
muestra
• k' de 2-10
• Alta pureza
• Costo, viscosidad,
toxicidad, punto
de ebullición
HPLC 2 10/96
2
SISTEMAS DE SOLVENTES TÍPICOS
•FASE NORMAL – hexano, cloruro de
metileno, cloroformo, metanol, acetonitrilo
•FASE REVERSA - metanol/agua,
acetonitrilo/agua
•INTERCAMBIO IÓNICO - buffer acuoso
•PERMEACIÓN EN GEL - tetrahidrofurano,
tolueno, cloroformo
HPLC 2 10/96
3
FILTRACIÓN DE LA FASE MÓVIL
A VACÍO
DISOLVENTE
FILTRO DE 2m
HPLC 2 10/96
4
RAZONES PARA FILTRAR
PARTÍCULA
FUGA
PARTÍCULA
PISTÓN
ARAÑAZOS
VÁLVULA CHECK
BOMBA
• Filtrar el disolvente es esencial en HPLC!
HPLC 2 10/96
5
FILTRACIÓN DE LA MUESTRA
Émbolo
10ml jeringa
0.5 m Filtro
Malla de
soporte
Filtro
HPLC 2 10/96
6
REQUISITOS DE LAS BOMBAS
1. Químicamente inerte
2. Alta presión (5,000 PSI)
3. Flujos (0.5 - 10 ml/min)
4. Libre de pulsos o amortiguada
5. Reproducibilidad de flujo <1.0%
6. Gradiente, cambio rápido de
disolvente
HPLC 2 10/96
7
Materiales de construcción
/compatibilidad con disolventes
• Completamente resistentes:
Teflón, Rubí, Zafiro, Cerámica, Tefzel, Kalrez,
Fluoraz
• Resistencia limitada:
Acero Inox. 316 – Cloruros acuosos ácidos
PEEK – Ácidos nítrico o sulfúrico conc.
Kel-F – disoluciones de THF, hidrocarburos
halogenados
Acetal – Ácidos o bases fuertes
HPLC 2 10/96
8
TIPOS DE BOMBAS
• Pistón reciprocante (las más
comunes)
• Pistón reciprocante de doble
cabeza
• Bombas de jeringa (más
empleadas en SFC y micro HPLC)
HPLC 2 10/96
9
Bombas de pistón reciprocante
Reservorio
externo
Motor
Cam
Cámara
hidráulica
Pistón
Valvulas
Check
HPLC 2 10/96
10
Bombas de pistón reciprocante de
doble cabeza
• Mejor estabilidad de
flujo que las de una
cabeza...
• ...produce una línea
base más estable
HPLC 2 10/96
11
VALVULAS CHECK DE HPLC
A la columna
Válvula de bola
de salida
Pistón
Válvula de bola
de entrada
Del reservorio
HPLC 2 10/96
12
BOMBAS DE PISTÓN
RECIPROCANTE
VENTAJAS
LIMITACIONES
• Baratas
• Ruído de pulso
• 6000 psi
• Mantenimiento, sello
de las válvulas
• Reservorio externo
• Diseño mecánico simple
HPLC 2 10/96
13
BOMBAS DE JERINGA
PISTÓN
MOTOR
DISOLVENTE
SELLOS
GUÍA Y
ENGRANE
HPLC 2 10/96
14
20
20
16
16
% Solvente B
% Solvente B
ELUCIÓN ISOCRÁTICA vs. GRADIENTE
12
8
4
0
12
8
4
0
0
1 2
3 4 5 6
TIEMPO
• En HPLC Isocrático, la
composición de la fase
móvil permanece igual
durante el análisis
7
0
1 2
3 4 5 6
TIEMPO
7
• En HPLC Gradiente, la
fuerza de la fase móvil se
incrementa con el tiempo
de análisis.
HPLC 2 10/96
15
COMPARACIÓN DE ELUCIÓN ISOCRÁTICA
Y GRADIENTE
BIFENILOS CLORADOS
4
5
20% MeOH / 80% H2O
a
75% MeOH / 25% H2O
50% Metanol
50% Agua
7
3
6
4
5
3
2
7
2
6
1
1
0
20
40
60
80
ELUCIÓN ISOCRÁTICA
min
0
20
40
60
80
min
ELUCIÓN GRADIENTE
HPLC 2 10/96
16
FORMACIÓN DE GRADIENTES A ALTA
PRESIÓN
0.4 ml/min
0.9 ml/min
40:60
Bomba
Bomba
90:10
A
Programador
B
Bomba
Programador
Cámara
Mezclado
Bomba
0.6 ml/min
0.1 ml/min
De 40%A - 60%B a 90%A - 10%B
HPLC 2 10/96
17
FORMACIÓN DE GRADIENTES A BAJA
PRESIÓN
Reservorios de disolventes
A
Programador
B
Válvula
Multipuertos
C
Cámara de
Mezclado
A LA BOMBA DE HPLC
HPLC 2 10/96
18
OPERACIÓN VÁLVULA DE INYECCIÓN
DE LA BOMBA
A LA COLUMNA
RIZO DE
MUESTRA
JERINGA
CARGA
INYECCIÓN
HPLC 2 10/96
19
ARREGLO DE PRE-COLUMNA Y
GUARDA-COLUMNA
GUARDACOLUMNA
PRECOLUMNA
BOMBA
VÁLVULA
DE
MUESTREO
COLUMNA
ANALÍTICA
DETECTOR
HPLC 2 10/96
20
CONEXIONES PARA HPLC
"X"
1.
Distan ce " X" is cr itical i n o b tainin g
a lo w-volu m e, leak-fr ee seal...
2.
1. "X" is too long: leaks inevitable
2. "X" is too short: adds to extracolumn volume
.090
.130
.090
WATERS
.090
SWAGELOK
.080
.170
UPCHURCH
VALCO
WATERS
SWAGELOK
.320
PARKER
...and varies greatly from one
manufacturer to another.
UPCHURCH
VALCO
.250
PARKER
RHEODYNE
.210
RHEODYNE
WATERS
UPCHURCH
PARKER
HPLC 2 10/96
21
CONSTRUCCIÓN DE COLUMNAS
DEL
INYECTOR
2 m FRITADO
POROSO
AL DETECTOR
• LARGO: 3, 5, 10, 15, 25, cm
• I.D.: 4 or 4.6 mm
• ACERO INOXIDABLE
• partículas 3, 5, 10 m
HPLC 2 10/96
22
COLUMNAS CARTUCHO
CARTUCHO
HPLC 2 10/96
23
LC ANALÍTICA vs. LC SEMI-PREP
SEMI-PREPARATIVA
ANALÍTICA
MUESTRA :
0.1 mg in 10 µl
50 mg in 2 ml
COLUMNA :
4.6 x 150 mm
10 x 250 mm
FLUJO :
1 ml/min
10 ml/min
DETECTOR :
Alta sensibilidad, PDA
Baja sensibilidad, RI
HPLC 2 10/96
24
CONTROL DE TEMPERATURA EN HPLC
• TERMOSTATADO DE COLUMNA – Áreas de
pico y tiempos de retención más reproducibles.
• CALENTAMIENTO DE COLUMNA :
1. Menor viscosidad, menos presión.
2. Menor coleo de pico, desorción más rápida.
3. Usualmente menor selectividad.
HPLC 2 10/96
25
EFECTO DEL CONTROL DE
TEMPERATURA EN LA SEPARACIÓN
4 0°C
6 5°C
0
5
10
min
HPLC 2 10/96
26
DETECTORES DE HPLC
DETECCIÓN ULTRAVIOLETA (UV)
• Longitud de onda fija
• Longitud de onda variable
• Arreglo de diodos
INDICE DE REFRACCIÓN
FLUORESCENCIA
ELECTROQUÍMICA
MS / FTIR / Conductividad/MS
HPLC 2 10/96
27
SISTEMAS DE DATOS
1.235
1.235
1.235
1.235
1.235
INTEGRADORES
. Fácil de usar
. Precio moderado
COMPUTADORA
. Flexible, poderosa
. Cara
HPLC 2 10/96
28
CROMATOGRAMA DE INTEGRADOR
* RUN#
523
FEB 16, 1994
02:44:11
START
1.679
1.235
3.197
3.289
4.315
5.540
6.235
11.075
STOP
RUN#
523
FEB 16, 1994
02:44:11
SAMPLE#
2
AREA%
RT
1.235
1.679
3.197
3.289
4.315
5.540
6.235
11.075
AREA
22353
10700
1761694
821053
690054
639889
31558
9545536
TYPE
VB
BB
PV
VB
BB
BB
BB
BB
WIDTH
.060
.105
.095
.077
.120
.157
.196
.338
AREA%
.16530
.07913
13.02755
6.07160
5.10288
4.73191
.23337
70.58825
TOTAL AREA=1.3523E+07
MUL FACTOR=1.0000E+00
HPLC 2 10/96
29
VALORES TÍPICOS PARA HPLC
COMPONENTE
VALOR TÍPICO
INTERVALO
EMPAQUE
Tamaño partícula
Tamaño de poro
10 y 5 m
80 y 100 Å
3 - 10 m
60-120 Å, hasta 4,000 Å
COLUMNA
Diámetro Int.
Largo
4.6 mm
15 y 25 cm
2 - 5 mm
3 - 30 cm
BOMBA
Presión
Flujo Volumétrico
Flujo lineal
1500 psi
1 ml/min
0.1 cm/sec
800 - 5000 psi
0.5 - 2 ml/min
0.05 - 0.2 cm/sec
MUESTRA
Volumen
Concentración
20 l
0.1 %
2 - 100 l
1 ppm - 1 %
DETECTOR
Volumen de celda
Constante de tiempo
5 l
50 msec
2-15 l to 200 l
25 msec - 1 sec
HPLC 2 10/96
30