Efecto de la lesión de la sustancia negra pars compacta sobre la

ORIGINAL
Efecto de la lesión de la sustancia negra pars compacta sobre
la liberación de glutamato y GABA en el núcleo pedunculopontino
L. Blanco-Lezcano a, L.L. Rocha-Arrieta e, L. Álvarez-González b, L. Martínez-Martí c,
N. Pavón-Fuentes d, M.E. González-Fraguela d, Y. Bauzá-Calderín d, Y. Coro-Grave de Peralta a
THE EFFECTS OF LESIONS IN THE COMPACT PART OF THE SUBSTANTIA NIGRA
ON GLUTAMATE AND GABA RELEASE IN THE PEDUNCULOPONTINE NUCLEUS
Summary. Introduction. The pedunculopontine nucleus (PPN), co-localized with the mesencephalic locomotor region, has
been proposed as a key structure in the physiopathology of Parkinson’s disease. Objectives. The goal of the present study was
to assess if the aminoacid neurotransmitter release in the PPN is modified by the degeneration of dopaminergic cells, from
substantia nigra pars compacta in 6-hydroxidopamine (6-OHDA)-lesioned rats. In addition, it was studied the aminoacid
neurotransmitter release in the PPN of rats with lesion of the subthalamic nucleus by quinolinic acid (QUIN) (100 nmol)
intracerebral injection. Materials and methods. Rats were assigned to five groups: untreated rats (I) (n = 13), 6-OHDA lesion
(II) (n = 11), 6-OHDA + QUIN lesion (III) (n = 9), sham-operated (IV) (n = 10), QUIN, STN (V) lesioned (n = 9). The
extracellular concentrations of glutamic acid (GLU) and gamma-aminobutyric acid (GABA) were determined by brain
microdialysis and high performance liquid chromatography (HPLC). Results. GLU released in PPN from 6-OHDA lesioned
rats (group II), was significantly increased in comparison with the others groups (F(4, 47) = 18.21, p < 0.001). GABA released
shows significant differences between experimental groups (F(4, 45) = 12.75, p < 0.001). It was detected a higher valour (p <
0.05) in-group II. The groups III and IV exhibited intermeddle valour (p < 0.001) and groups I and IV (p < 0.001) showed the
lower GABA extracellular concentrations. The infusion of artificial cerebrospinal fluid with higher potassium (100 mmol)
induced an increase in the GLU and GABA released in all groups, which confirm the neuronal origin of the extracellular
content. Conclusion. These results are in agreement with the current model of basal ganglia functioning and suggest the role
of STN-PPN projection in the physiopathology of Parkinson’s disease. [REV NEUROL 2005; 40: 23-9]
Key words. Microdialysis technique. Parkinsonism. PPN. STN. 6-OHDA.
INTRODUCCIÓN
La degeneración de las células dopaminérgicas de la sustancia
negra pars compacta (SNc) es el cambio neuropatológico más
prominente que caracteriza a la enfermedad de Parkinson (EP)
[1]. La administración intracerebral de 6-hidroxidopamina (6OHDA) en roedores induce degeneración de las células dopaminérgicas neurales de la SNc [1]. Este modelo se ha aceptado
ampliamente para el estudio de la neurotransmisión dopaminérgica y su papel en los trastornos motores asociados al parkinsonismo [2].
Algunos núcleos de los ganglios basales (GB) –estriado,
SNc y sustancia negra pars reticulata (SNr)– se han explorado
mediante la técnica de microdiálisis cerebral, con el propósito
de obtener datos relevantes sobre la función y regulación de los
sistemas de neurotransmisores dopaminérgico y otros [3-14].
Aceptado: 06.09.04.
a
Departamento de Neurofisiología Experimental. b Clínica de Trastornos del
Movimiento. c Laboratorio de Neuromorfología. d Departamento de Inmunoquímica. Centro Internacional de Restauración Neurológica (CIREN). Ciudad de la Habana, Cuba. e CINVESTAV. Sede sur. México DF, México.
Correspondencia: Lic. Lisette Blanco Lezcano. Departamento de Neurofisiología Experimental. Laboratorio de Biomodelos. Centro Internacional de
Restauración Neurológica (CIREN). Ave. 25, n.º 15805, e/ 158 y 160. Playa.
Ciudad de la Habana, Cuba. Fax: 537 332 420. E-mail: lisette.blanco@
infomed.sld.cu
Agradecimientos. A los colegas del laboratorio de Microdiálisis Cerebral
del Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente, en México DF,
por el entrenamiento en el uso y manejo de la técnica de microdiálisis cerebral. A la Dra. Luisa Rocha, por la donación de materiales para construir
las cánulas de microdiálisis. Igualmente, por la donación de la membrana
de diálisis utilizada en este trabajo.
© 2004, REVISTA DE NEUROLOGÍA
REV NEUROL 2005; 40 (1): 23-29
Sin embargo, otras estructuras fuera de los GB, pero íntimamente relacionadas con los circuitos que conforman los GB, se
han estudiado pobremente.
En este sentido, el núcleo pedunculopontino (NPP) adquiere vital importancia por sus relaciones con los GB y el tronco
cerebral [15,16]. El NPP recibe proyecciones procedentes del
núcleo subtalámico (NST), las estructuras de salida de los GB,
la SNr y el globo pálido interno (Gpi), y la corteza sensorimotora [15,16]. Igualmente, se ha documentado la existencia de una
proyección dopaminérgica procedente de la SNc que inerva el
NPP [17]. En relación con sus eferencias, este núcleo envía proyecciones de regreso al NST, la SNr y el Gpi. Además, envía
una proyección colinérgica hacia la SNc, donde modula la actividad dopaminérgica de sus células [18]. Igualmente, el NPP
envía proyecciones descendentes a diferentes núcleos motores
reticuloespinales, entre los que se cuentan los núcleos reticular
gigantocelular, reticular pontino oral y reticular pontino caudal
[19]. Estos núcleos envían proyecciones reticuloespinales a través del haz ventromedial, las cuales terminan en las redes de
interneuronas de la médula espinal [18,19].
El NPP se colocaliza con la región locomotora mesencefálica, uno de los sitios motores principales del tronco cerebral
[20]. Esta localización hace de este núcleo un blanco privilegiado en el curso de los impulsos motores. En este sentido, se ha
señalado que el NPP procesa información relacionada con la
postura y el movimiento procedente de los centros motores
superiores, que incluyen los GB y la corteza motora [15,16].
Se ha señalado que el NPP desempeña un papel importante
en la fisiopatología de la EP; sin embargo, se desconoce la naturaleza y extensión de la participación del NPP en los mecanismos fisiopatológicos que median los trastornos motores asociados al parkinsonismo [15,16]. Los estudios en animales han su-
23
L. BLANCO-LEZCANO, ET AL
gerido un papel importante del NPP en la iniciación, aceleración, desaceleración y terminación del movimiento [15,21].
Otros estudios han proporcionado evidencias que sugieren una
relación causal entre la muerte de células del NPP, los trastornos del sueño y las reacciones auditivas anormales que se presentan en el parkinsonismo [21].
Por otra parte, se conoce el papel del NST en la fisiopatología
del parkinsonismo [22,23]. La ‘liberación’ de este núcleo es uno
de los cambios más importantes que caracterizan el modelo de
funcionamiento de los GB en el parkinsonismo [22,23].
Sin embargo, se conoce muy poco sobre la síntesis, almacenamiento y liberación de neurotransmisores en el NPP en condiciones normales y en estado parkinsoniano. Muy probablemente, el pequeño tamaño de esta estructura ha sido una de las principales razones que han limitado su abordaje. En este sentido, la
liberación de neurotransmisores en el NPP en modelos experimentales de parkinsonismo puede considerarse desconocida.
Este trabajo tuvo dos objetivos fundamentales: estudiar la
liberación de aminoácidos neurotransmisores –ácido glutámico
(GLU) y ácido γ-aminobutírico (GABA)– en el NPP de ratas
hemiparkinsonianas. Además, se estudió el impacto de la lesión
del NST sobre la liberación de estos neurotransmisores en NPP.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sujetos experimentales
Se utilizaron ratas Wistar machos adultas de 200-250 g de peso, las cuales se
colocaron individualmente en cajas de plástico bajo condiciones de temperatura (22 °C) y humedad (70%) constantes. Durante todo el tiempo que duró
el experimento, los animales tuvieron agua y alimentos ad libitum. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas del Código Práctico
de Normas Éticas para el uso de Animales de Laboratorio (Centro para la
Producción de Animales de Laboratorio, CENPALAB, Cuba).
Materiales
Los siguientes reactivos se obtuvieron a través de Sigma (St Louis, EE. UU.):
o-ftaldialdehído (OPA), 6-OHDA y ácido quinolínico. Las sales y los solventes, de calidad HPLC, se adquirieron a través de Merck (Darmstadt, Alemania). El resto de los reactivos utilizados tuvieron calidad analítica.
El tubo de acero empleado (HTX-24-36; diámetro externo: 0,22 pulgadas; diámetro interno: 0,12 pulgadas) para construir las cánulas de microdiálisis cerebral se obtuvo a través de Small Parts, y la fibra de vidrio
(TSP/075/150) se obtuvo a través de Polymicro Technology.
nolínico en el NST utilizando las siguientes coordenadas estereotácticas
(mm): AP = –3,80, L = 2,4, V = 8,00 [25]. Esta segunda lesión se practicó
un mes después de la inyección de la 6-OHDA.
Un último grupo de animales recibió sólo una inyección intracerebral de
ácido quinolínico en las coordenadas del NST, sin haber recibido previamente la administración de 6-OHDA.
En resumen, se organizaron cinco grupos experimentales: I. animales
sanos (n = 13); II. inyección de 6-OHDA en el SNc (n = 11); III. inyección
de 6-OHDA en la SNc + inyección de ácido quinolínico en el NST (n = 9);
IV. falsa lesión del SNc (n = 10), y V. inyección de ácido quinolínico en el
NST (n = 9).
Cánulas de microdiálisis
Se construyeron cánulas de microdiálisis de tipo concéntrico de acuerdo a
lo descrito [29,30]. Se utilizó un segmento (1 mm) de membrana de diálisis
de poliacrilonitrilo cuyo poro de corte es de 41.000 Da (Hospal Industrie
Meyzie, Francia). Se determinó el recobrado in vitro de las cánulas a temperatura ambiente para una concentración conocida de aminoácidos neurotransmisores, y los resultados fueron: 31,71 ± 6,14% para el GLU, y para el
GABA, 26,42 ± 5,65%.
Microdiálisis in vivo
La cirugía de implante de la cánula guía se realizó un mes después de la
inyección de la 6-OHDA y/o una semana después de la inyección de ácido
quinolínico. Mediante técnicas estereotácticas estándar, se cementó al cráneo
una cánula guía de acero inoxidable en las coordenadas (mm) correspondientes al NPP derecho, ipsilateral a las lesiones de 6-OHDA y ácido quinolínico: AP = –8,00, L = 1,90, DV = 6,82 (esta última, ajustada a la cánula de
microdiálisis cerebral).
A los animales se les permitió recuperarse y, cinco días después del
implante de la cánula guía, se introdujo en ella una cánula de microdiálisis,
después de retirar el estilete que cubre el orificio de la cánula guía. Todos
los experimentos se realizaron con las ratas despiertas.
Las cánulas de microdiálisis se conectaron a un sistema de bomba de
infusión (CMA 100; CMA Microdialysis, Estocolmo, Suecia) y se prefundieron continuamente con una solución de líquido cefalorraquídeo artificial
(LCRa) preparado en el laboratorio (125 mmol de NaCl, 2,5 mmol de KCl,
0,5 mmol de NaH2PO4, 5 mmol de Na2HPO4, 1 mmol de MgCl.6H2O,
1,2 mmol de CaCl2, 1,2 mmol de ácido ascórbico, a pH 7,4-7,6) a una tasa
de 1,8 μL/min. Después de dos horas de estabilización, las muestras se
recogieron manualmente cada 20 minutos.
Con el propósito de probar la participación de la despolarización neuronal en el origen de los neurotransmisores encontrados en el espacio extracelular estudiado, después de tomar seis dializados, se pasó una solución de
LCRa con mayor concentración de potasio (100 mmol de KCl) y menor
contenido de iones Cl– (43,4 mmol de NaCl) [31].
Análisis de los aminoácidos
Lesión con 6-OHDA
La lesión de la SNc derecha se realizó de acuerdo a lo descrito previamente
[24]. Las ratas se anestesiaron con hidrato de cloral (420 mg/kg IP) y se
colocaron en un marco de cirugía estereotáctica para roedores (David Kopf
Instruments, EE. UU.). La solución de 6-OHDA (8 μg de 6-OHDA disueltos en solución salina fisiológica al 0,9% que contenía 0,5 mg/mL de ácido
ascórbico) se inyectó en la SNc utilizando las siguientes coordenadas estereotácticas (mm) [25]: AP = –4,4; L = 1,2; V = 7,8; barra de incisivos: –2,4.
Un mes después de la lesión, se estudió la actividad rotatoria inducida
por d-anfetamina (5 mg/kg IP). La determinación de esta variable se hizo en
un tiempo de 90 min con el empleo de un multicontador LE 3806 acoplado
a sensores LE 902 (PanLAB, Barcelona, España). Sólo los animales que
mostraron como mínimo siete giros por minuto –lo que se corresponde con
una denervación dopaminérgica igual o superior al 97%– [26,27] se incluyeron en el estudio. La administración de solución salina fisiológica al 0,9%
en igual volumen y coordenadas permitió conformar un grupo de ratas con
lesión falsa en la SNc.
Lesión del NST
Seguidamente, se procedió a la lesión del NST según lo comunicado [28].
En un grupo de animales inyectados con 6-OHDA y con criterio de bien
lesionados, se inyectaron 0,8 μL de una solución de 100 nmol de ácido qui-
24
Las concentraciones de aminoácidos en los dializados se determinaron por
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con un detector de fluorescencia y empleando derivación con OPA.
Se mezclaron 10 μL de muestra con 10 μL del agente derivativo (10 mmol
de OPA disueltos en tampón de tetraborato de sodio 0,1 M que contenía 77
mmol de ácido 3-mercaptopropiónico y metanol al 10% a pH 9,3). La mezcla se agitó en un agitador durante 15 s y la reacción se detuvo con ácido
acético al 5% a los 45 s. De esta mezcla se inyectaron 20 µL en el cromatógrafo con una jeringuilla Hamilton. Los aminoácidos derivativos se hicieron
pasar por una columna de fase inversa (HR-80, de 8 cm de longitud y 4,6 mm
de diámetro interno, ESA), con una precolumna de fase estacionaria similar,
mediante una bomba cromatográfica isocrática (Philips PU 4100) y se
detectaron mediante un detector de fluorescencia con 340 nm de λ de excitación y 460 nm de λ de emisión (Philips PU 4027). El registro de los cromatogramas se realizó mediante el programa CHROMATEPC, versión 4.24
(Philips). Para la separación de los aminoácidos se utilizó una fase móvil
compuesta por NaH2PO4 0,1 M y metanol al 20%.
Cada muestra se analizó por duplicado.
Estudio morfológico
Al final del experimento, se les suministró a las ratas una dosis mayor de
hidrato de cloral (IP, 480 mg/kg) y se perfundieron a través de la aorta
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MICRODIÁLISIS CEREBRAL EN NPP
a
Figura 1. Microfotografía (5×) que ilustra la pérdida de células inmunorreactivas a la enzima tirosina hidroxilasa en la SNc derecha. Las flechas señalan la zona de lesión.
b
Figura 2. Microfotografía de secciones coronales del NST teñidas con
violeta de cresilo: a) las flechas señalan la trayectoria de la aguja de inyección (5×); b) microfotografía local (25×) que ilustra el sitio exacto de inyección de la neurotoxina. NST: núcleo subtalámico.
gica nigral, los cortes coronales de la SNc se examinaron con inmunohistoquímica para la enzima tirosina hidroxilasa (TH), de acuerdo a lo descrito
previamente en la literatura [32].
Los animales que presentaron algún sangrado interno alrededor de la
cánula de microdiálisis o mostraron una localización errónea de la cánula,
se eliminaron del estudio.
Análisis de los datos
Figura 3. Microfotografía (5×) que ilustra el sitio exacto donde se ubicó la
cánula de microdiálisis cerebral. NPP: núcleo pedunculopontino; PCS: pedúnculo cerebeloso superior.
Los cerebros se extrajeron y se almacenaron en formalina al 10%
durante 24 h. Seguidamente, se obtuvieron cortes coronales (20 μM) de las
áreas correspondientes a la SNc, el NST y el NPP. Las secciones se montaron en láminas gelatinizadas y se realizó más tarde una tinción de Violeta de
cresilo para comprobar la localización correcta de la cánula de microdiálisis
en el NPP y la inyección de ácido quinolínico en el NST.
Igualmente, para determinar la extensión de la degeneración dopaminér-
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Se comprobó la distribución normal de los datos mediante el test de Kolmogorov-Smirnov. Se compararon las concentraciones de GLU y GABA entre
los cinco grupos experimentales mediante un análisis de varianza de clasificación simple, seguido por una prueba de intervalos múltiples de Duncan
con p < 0,05 como nivel de significación.
La comparación de las concentraciones de GABA y GLU dentro de cada
grupo experimental, antes y después de la infusión de una solución de LCRa
con alta concentración de potasio, se realizó mediante la prueba t de Student.
RESULTADOS
Estudio morfológico
El estudio inmunohistoquímico para la enzima TH reveló una marcada disminución en el número de neuronas teñidas para la enzima en la SNc derecha, donde se inyectó la 6-OHDA. Estos resultados confirman la denervación dopaminérgica estriatal (Fig. 1).
El estudio morfológico en relación con la lesión del ácido quinolínico
mostró una localización correcta de la lesión del NST, así como de las cánulas guía y de microdiálisis cerebral (Figs. 2a, 2b y 3).
25
L. BLANCO-LEZCANO, ET AL
a
b
B
Concentración GABA (μmol)
Concentración GLU (μmol)
B
A
A
A
A
Sanas
6-OHDA
Lesión
doble
Falsa
QUIN. NST
lesión SNc
C
C
A
A
6-OHDA
Sanas
Grupos experimentales
Lesión
doble
Falsa
QUIN. NST
lesión SNc
Grupos experimentales
Figura 4. Liberación de aminoácidos neurotransmisores en el NPP de ratas hemiparkinsonianas. a) Liberación de GLU, comparación entre grupos
experimentales: F(4, 47) = 18,21, p < 0,001. b) Liberación de GABA, comparación entre grupos experimentales: F(4, 45) = 12,75, p < 0,001. Los datos se
expresan como media ± EEM. Las letras en la parte superior de cada gráfico corresponden a las diferencias estadísticas entre grupos experimentales
detectadas en el análisis de intervalos múltiples de Duncan (letras comunes: diferencias no significativas; letras diferentes: diferencias significativas).
Tabla. Liberación de aminoácidos neurotransmisores en el NPP antes y después de la infusión de una solución de LCR artificial con mayor concentración de potasio.
GLU
Grupos
experimentales
Basal
I. Sanas
a
GABA
Tras LCR con mayor
concentración de K+
Estadística
Basal
Tras LCR con mayor
concentración de K+
0,646 ± 0,07
1,263 ± 0,16
T = 5,048 p < 0,01
0,059 ± 0,01
0,155 ± 0,05
T = 2,39 p < 0,05
II. 6-OHDA
2,06 ± 0,20
2,894 ± 0,09
T = 12,61 p < 0,001
0,358 ± 0,03
0,700 ± 0,06
T = 4,66 p < 0,05
III. 6-OHDA + QUIN
0,409± 0,06
0,663 ± 0,10
T = 2,94 p < 0,05
0,242 ± 0,05
0,413 ± 0,07
T = 4,17 p < 0,05
IV. Falsa lesión SNc
0,835 ± 0,11
1,302 ± 0,13
T = 3,17 p < 0,05
0,080 ± 0,02
0,180 ± 0,05
T = 3,21 p < 0,05
V. QUIN NST
0,654 ± 0,5
0,964 ± 0,3
T = 4,20 p < 0,05
0,207 ± 0,04
0,340 ± 0,09
T = 3,80 p < 0,05
a
Estadística
Antes de la infusión de LCR con mayor concentración de potasio. Los datos se presentan como media ± EEM.
Estudio de liberación de neurotransmisores
GLU
En todos los grupos experimentales se pudo determinar la concentración
extracelular de GLU (Fig. 4a). La comparación de esta variable entre grupos
experimentales reveló diferencias significativas entre ellos (F(4, 47) = 18,21;
p < 0,001). Estas diferencias se deben al incremento significativo de la concentración extracelular de GLU (p < 0,001) en el NPP de las ratas del grupo
II (lesión con 6-OHDA). El resto de los grupos experimentales no mostraron diferencias significativas entre ellos.
La infusión de una solución de LCR con mayor concentración de potasio
provocó un incremento significativo en esta variable en todos los grupos en
estudio (Tabla).
GABA
En todos los grupos experimentales se pudo determinar la concentración
extracelular de GABA. La comparación entre grupos experimentales (Fig.
4b) reveló diferencias significativas entres ellos (F(4, 45) = 12,75, p < 0,001).
Según el comportamiento de esta variable, los grupos se segregan con un
aumento significativo (p < 0,05) en el grupo II (lesión de SNc), valores intermedios y significativamente diferentes de los restantes grupos (p < 0,001)
para los grupos con lesión del NST (III y V) y valores menores significativamente (p < 0,001) para los grupos I y IV (sanos y con falsa lesión de la SNc).
La infusión de una solución de LCRa con mayor concentración de potasio provocó un aumento significativo de esta variable en todos los grupos
experimentales (Tabla).
26
DISCUSIÓN
Este estudio aporta evidencias de que en las ratas lesionadas
con 6-OHDA existe un aumento de la liberación de GLU y
GABA en el NPP. Simultáneamente, demuestra el impacto de la
lesión excitotóxica del NST sobre la disminución de la liberación de GLU en el NPP.
Un número creciente de evidencias demuestra la participación del NPP en la fisiopatología del parkinsonismo [21,33,34].
Numerosos trabajos han documentado la localización privilegiada del NPP como parte del área locomotora mesencefálica,
muy relacionada con los GB y la red de interneuronas de la médula espinal [33,35].
Los resultados mostrados en el presente trabajo concuerdan
con lo publicado por otros autores, que conceden un papel
importante al NPP en la fisiopatología de la EP.
El incremento significativo de las concentraciones extracelulares de GLU en el NPP del grupo de ratas lesionadas con 6OHDA (II) puede explicarse por un incremento en la aferencia
glutamatérgica procedente del NST. Se sabe que el NST está
hiperactivo en el parkinsonismo, como resultado de la degeneración de las células de la SNc y la consecuente disminución de la
transmisión dopaminérgica negroestriatal [22,23]. El NPP reci-
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MICRODIÁLISIS CEREBRAL EN NPP
be una proyección glutamatérgica procedente del NST, la cual
se considera también hiperactiva en el parkinsonismo [15,21].
Los resultados obtenidos para la liberación de GLU en el
NPP de los grupos con lesión del NST (III y V), vienen a confirmar el comentario anterior. Estos grupos exhibieron una disminución significativa en la concentración de GLU en el NPP en
comparación con el grupo II y, al mismo tiempo, no mostraron
diferencias significativas con las ratas sanas (I y IV). Estos
resultados apuntan hacia que la lesión del NST tiende a normalizar la liberación de GLU en el NPP y, al mismo tiempo, permiten afirmar que la infusión local realizada en el NPP abarca a
las células pontinas y a las terminales glutamatérgicas que
hacen contacto sináptico con dichas células pontinas.
En relación con el aumento en la liberación de GLU en el NPP
de ratas tratadas con 6-OHDA (grupo II), este hallazgo podría
incluirse dentro de los resultados que apoyan un comportamiento
hiperactivo del NPP en el parkinsonismo, los cuales han sido
muy bien argumentados por otros autores [16,36-38].
Recientemente se ha publicado un aumento en la tasa de
descarga de las células del NPP de ratas hemiparkinsonianas
[37], junto a un patrón muy irregular de actividad eléctrica.
Estos cambios se revirtieron con la lesión excitotóxica del NST.
Estos hallazgos apoyan la participación del NPP en la fisiopatología del parkinsonismo y, al mismo tiempo, sugieren que el
NPP está bajo el control fisiológico del NST [37].
Igualmente, se ha señalado un aumento significativo en el
metabolismo de la glucosa en el NPP ipsilateral a la lesión de la
SNc en ratas hemiparkinsonianas, lo cual apoya la idea de la
hiperactividad del NPP en el parkinsonismo [16].
Por otra parte, la hiperactividad del NPP se ha implicado en
la propia hiperactividad del NST en el parkinsonismo, ya que
ambos núcleos están conectados de forma recíproca [39]. El
NPP recibe una inervación glutamatérgica procedente del NST
y envía hacia éste proyecciones de naturaleza colinérgica y glutamatérgica [39]. El incremento significativo en la expresión del
ARNm que codifica para la subunidad I de la citocromo oxidasa en las neuronas pontinas que proyectan al NST, en el parkinsonismo, distingue la participación del NPP en la hiperactividad
subtalámica [37].
Otros autores han publicado que en ratas parkinsonianas se
produce un incremento significativo de la liberación de GLU en
otras estructuras que, al igual que el NPP, reciben aferencias
glutamatérgicas procedentes del NST; tal es el caso del globo
pálido y la SNr [40].
En resumen, la hiperactividad señalada para el NPP en el
parkinsonismo podría ser fisiológicamente relevante como parte
de un mecanismo compensatorio en el cual interviene la proyección excitatoria pedunculopontina nigral, de naturaleza glutamatérgica y colinérgica. Esta actividad excitatoria, incrementada en
el parkinsonismo, podría mejorar la actividad dopaminérgica y,
en consecuencia, atenuar el desequilibrio inducido por la degeneración de las neuronas de la SNc y la consecuente disminución de la transmisión negroestriatal [41,42].
Por otra parte, se ha señalado que la hiperactividad de la
proyección pedunculopontinonigral podría ser beneficiosa como mecanismo compensatorio en estadios tempranos de la EP;
pero, a largo plazo, esta hiperactividad podría acentuar la degeneración excitotóxica de las células de la SNc [36].
Otros estudios señalan el NPP como pieza clave en la comprensión de la fisiopatología de los trastornos en el funcionamiento de los GB. La lesión unilateral del NPP en los macacos
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induce un síndrome hemiparkinsoniano, que gradualmente mejora y pasa a ser estacionario una o dos semanas después de la
lesión [43]. A la proyección NPP-SNc contralateral se le atribuye un papel compensatorio, ya que se sabe que el NPP envía
fibras a la SNc gipsy y contralateral, aunque esta proyección tiene una predominancia ipsilateral [43].
Por otra parte, se conoce poco sobre el metabolismo extracelular del GLU en el sistema nervioso central [44]. La mayor
parte del GLU liberado de las terminales nerviosas al espacio
extracelular pasa al interior de las células gliales y es convertido
en glutamina. La glutamina regresa a las terminales nerviosas,
donde participa en el reemplazo del GLU y el GABA almacenados en la neurona [44]. En relación con el presente trabajo, el
aumento en la liberación de GLU encontrado después de la
infusión de una solución de LCR con mayor concentración de
potasio permite afirmar que el glutamato detectado es producto
de la despolarización neuronal y constituye un factor de seguridad de la técnica de microdiálisis por sí misma [31].
En lo que respecta a la liberación de GABA encontrada en
este trabajo, resulta muy interesante la separación que se establece entre los grupos experimentales. El grupo de animales
lesionados con 6-OHDA (II) exhibe un incremento significativo
en los valores en esta variable, diferentes de los restantes grupos. A su vez, los grupos con lesión combinada de la SNc y el
NST (III) y de lesión del NST (V) muestran valores intermedios, y los grupos sanos (I y IV) se presentan con los valores
más bajos de GABA extracelular.
El NPP recibe una proyección gabérgica procedente de los
núcleos de salida de los GB [15]. Numerosos trabajos han documentado la hiperactividad de esta proyección en el parkinsonismo [15,45,46], lo que justifica el aumento en la concentración
extracelular de GABA en el NPP encontrado en el grupo II.
La hiperactividad de la vía SNr-NPP en el parkinsonismo
está íntimamente relacionada con la hiperactividad subtalámica,
de acuerdo al ‘modelo’ aceptado en la literatura para explicar el
funcionamiento de los GB [22,23]. Este hecho explica la disminución significativa de las concentraciones de GABA extracelular en el NPP de las ratas con lesión del NST posterior a la
lesión de la SNc (grupo III). En este grupo, el impacto de la
lesión excitotóxica del NST modifica significativamente la actividad gabérgica, aunque ésta no alcanza valores normales, lo
cual explica su comportamiento intermedio.
En relación con el grupo V (lesión sólo del NST), la actividad dopaminérgica, tanto a partir de la liberación dendrítica de
dopamina en la SNr como a través de la interacción con los
receptores D-1 de la vía estriatonigral, se mantiene aparentemente normal [47]. En estas condiciones, es probable que, aunque la lesión del NST atenúe los impulsos glutamatérgicos excitatorios sobre la SNr, la actividad gabérgica en esta estructura
mantenga un intervalo de funcionamiento normal que permita
la liberación del GABA detectado en el NPP en las condiciones
de este estudio.
El NPP consiste en un grupo de neuronas morfológica y
neuroquímicamente muy heterogéneo [15]. Por medio de diferentes métodos, se han descrito células colinérgicas y no colinérgicas (probablemente glutamatérgicas) en el NPP de la rata,
pero no existen comunicados sobre la presencia de células
gabérgicas en esta estructura [48]. Esta evidencia apunta hacia
el origen nigral (procedente de la SNr) del GABA extracelular
encontrado en el NPP, y el aumento significativo en esta variable después de la infusión de una solución de LCRa con alta
27
L. BLANCO-LEZCANO, ET AL
concentración de potasio justifica con más ahínco la participación de la despolarización de las fibras aferentes nigrales que
alcanzan el NPP en el origen del GABA extracelular encontrado
en dializados del NPP.
Aunque no es objetivo de este trabajo estudiar cómo compiten las proyecciones gabérgica y glutamatérgica sobre el NPP,
es muy interesante el hecho de que después de la lesión excitotóxica del NST, tienda a normalizarse la liberación de GLU en
el NPP y la liberación de GABA; aunque disminuye significativamente, no alcanza valores similares a los de los animales
sanos.
Se sabe que el NPP envía fibras colinérgicas a la SNc, y una
proyección de menor cuantía a la SNr (en primates y ratas).
[49]. Es posible que la actividad gabérgica en el NPP forme parte de un lazo SNr-NPP-SNr que podría estar bajo la influencia
de otros sistemas de neurotransmisores, tales como el dopaminérgico, ya que existen evidencias de las interacciones dopamina-GABA de la SNr [50-52]. Estas interacciones se modifican
sensiblemente en el parkinsonismo [50]. No obstante, esta hipótesis necesita ser confirmada por medio de estudios electrofisiológicos, farmacológicos y conductuales.
En conclusión, el aumento en la liberación de GLU y GABA
del NPP de ratas hemiparkinsonianas puede explicarse por la
hiperactividad del NST y la SNr, secundaria a la degeneración
de las células de la SNc. La lesión excitotóxica del NST tiene
un impacto importante sobre la liberación de estos neurotransmisores en el NPP, pues restablece las concentraciones originales de GLU y actúa sobre la disminución de la concentración de
GABA, aunque no es suficiente para retornar estas últimas a sus
valores normales.
El actual ‘modelo de funcionamiento’ de los GB nos acerca al
significado de la variación en las concentraciones de aminoácidos
neurotransmisores en el NPP en el parkinsonismo. La correlación
de estos resultados con los trastornos posturales y de la marcha
asociados al parkinsonismo requerirá futuros estudios.
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EFECTO DE LA LESIÓN DE LA SUSTANCIA NEGRA
PARS COMPACTA SOBRE LA LIBERACIÓN DE GLUTAMATO
Y GABA EN EL NÚCLEO PEDUNCULOPONTINO
Resumen. Introducción. El núcleo pedunculopontino (NPP), colocalizado con el área locomotora mesencefálica, se ha señalado
como una estructura clave en la fisiopatología de la enfermedad de
Parkinson. Objetivos. 1. Estudiar el efecto de la lesión de la sustancia negra pars compacta –por inyección de 6-hidroxidopamina
(6-OHDA)– sobre la liberación de aminoácidos neurotransmisores
en el NPP. 2. Estudiar el efecto de la lesión del núcleo subtalámico
(NST), por inyección intracerebral de 100 nmol de ácido quinolínico
(QUIN), sobre la liberación de aminoácidos neurotransmisores en el
NPP. Materiales y métodos. Se organizaron cinco grupos experimentales: ratas sanas (I; n = 13), lesión con 6-OHDA (II; n = 11),
lesión simultánea de 6-OHDA + QUIN (III; n = 9), falsa lesión de
6-OHDA (IV; n = 10), y lesión del NST con QUIN (V; n = 9). Las
concentraciones extracelulares de ácido glutámico (GLU) y GABA
se determinaron por medio de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección fluorimétrica. Resultados. Se detectaron
diferencias significativas en la liberación de GLU entre todos los
grupos experimentales (F(4, 47) = 18,21, p < 0,001), con un aumento
significativo de esta variable en el grupo II. La liberación de GABA
en el NPP mostró diferencias significativas entre los grupos en estudio (F(4, 45) = 12,75, p < 0,001). Para esta variable se produjo una
separación entre los grupos, con un aumento significativo (p < 0,05)
en el grupo II, valores intermedios y significativamente diferentes
para los grupos III y V (p < 0,001) y valores menores para los grupos I y IV. La infusión de una solución de líquido cefalorraquídeo
artificial con mayor concentración de potasio (100 mmol) produjo
un incremento en la liberación de los aminoácidos neurotransmisores en todos los grupos experimentales, lo cual confirma el origen
neuronal del contenido extracelular estudiado. Conclusiones. Estos
resultados concuerdan con el ‘modelo’ actual de funcionamiento de
los ganglios basales y sugieren un papel importante a la proyección
STN-NPP en la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson. [REV
NEUROL 2005; 40: 23-9]
Palabras clave. Microdiálisis cerebral. Núcleo pedunculopontino.
Núcleo subtalámico. Parkinsonismo. 6-OHDA.
EFEITO DA LESÃO DA SUBSTÂNCIA NIGRA
PARS COMPACTA SOBRE A LIBERTAÇÃO DO GLUTAMATO
E GABA NO NÚCLEO PEDUNCULOPONTINO
Resumo. Introdução. O núcleo pedunculopontino (NPP), co-localizado na área locomotora mesencefálica, foi assinalada como sendo uma estrutura chave na fisiopatologia da doença de Parkinson.
Objectivos. 1. Estudar o efeito da lesão da substância nigra pars
compacta – provocada por injecção de 6-hidroxidopamina, 6ohDA – sobre a libertação de aminoácidos neurotransmissores no
NPP. 2. Estudar o efeito da lesão do núcleo subtalâmico (NST),
provocada por injecção intra-cerebral de 100 nmol de ácido quinolínico (QUIN), sobre a libertação de aminoácidos neurotransmissores no NPP. Materiais e métodos. Organizaram-se cinco grupos
experimentais: ratos sãos (I) (n = 13), lesão com 6-OHDA (II) (n =
11), lesão simultânea de 6-OHDA + QUIN (III) (n = 9), falsa lesão
de 6-OHDA (IV) (n = 10), e lesão de NST QUIN (V) (n = 9). As
concentrações extra-celulares de ácido glutâmico (GLU) e ácido
gama-aminobutírico (GABA) determinaram-se por meio de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) com detecção fluorimétrica. Resultados. Detectaram-se diferenças significativas na libertação de GLU entre todos os grupos experimentais (F(4, 47) = 18,21,
p < 0,001), com um aumento significativo desta variável no grupo
II. A libertação de GABA no NPP mostrou diferenças significativas
entre os grupos em estudo (F(4, 45) = 12,75, p < 0,001). Para esta
variável verificou-se uma separação entre os grupos, com um
aumento significativo (p < 0,05) no grupo II, valores intermédios e
significativamente diferentes para os grupos III e V (p < 0,001) e
valores menores para os grupos I e IV. A perfusão de uma solução
de líquido cefalorraquidiano artificial com maior concentração de
potássio (100 mmol) produziu um incremento na libertação dos
aminoácidos neurotransmissores em todos os grupos experimentais, o que confirma a origem neuronal do conteúdo extra-celular
estudado. Conclusões. Estes resultados concordam com o ‘modelo’
actual de funcionamento dos gânglios da base e sugerem um papel
importante da projecção STN-NPP na fisiopatologia da doença de
Parkinson. [REV NEUROL 2005; 40: 23-9]
Palavras chave. Microdiálise cerebral. Núcleo pedunculopontino.
Núcleo subtalâmico. Parkinsonismo. 6-OHDA.
REV NEUROL 2005; 40 (1): 23-29
29