GU ÍA T IN C IO NES

G u í a : T in c io n e s
E S C U E LA D E S A LU D
G U ÍA
T IN C IO N E S
D IR IG I D O A :
A lu m n o s d e la c a r r e r a T é c n ic o d e L a b o r a t o r io C lí n ic o y B a n c o d e s a n g r e
P R E - R E Q U IS IT O :
B M S 1100,
T a lle r o b s e r v a c ió n
d e m ic r o o r g a n is m o s
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
G u í a : T in c io n e s
IN T R O D U C C IÓ N
E l t a m a ñ o d e la m a y o r í a d e la s c é lu la s b a c t e r ia n a s e s t a l q u e r e s u lt a n d if í c ile s
d e v e r c o n e l m ic r o s c o p io ó p t ic o . L a p r in c ip a l d if ic u lt a d e s la f a lt a
d e c o n tra s te
e n t r e la c é lu la y e l m e d io q u e la r o d e a , y e l m e d io m á s s im p le d e
a u m e n ta r e l
c o n tra s te
d is t in g u ir
es
la
u t iliz a c ió n
e n tre
t ip o s
de
d if e r e n t e s
c o lo r a n t e s .
de
c é lu la s
E s to s
o
pueden
p a ra
r e v e la r
e m p le a r s e
la
p a ra
p r e s e n c ia
d e
d e t e r m in a d o s c o n s t it u y e n t e s c e lu la r e s , t a le s c o m o f la g e lo s , e s p o r a s , c á p s u la s ,
p a r e d e s c e lu la r e s , c e n t r o s d e a c t iv id a d r e s p ir a t o r ia , e t c .
O B J E T IV O S
A l f in a liz a r e l t a lle r e l a lu m n o : s e r á c a p a z d e
.
R e a l iz a r
y
d e s c r ib ir
c o m p r e n d ie n d o
lo s
d if e r e n t e s
e l fu n d a m e n to
t ip o s
q u í m ic o
de
de
t in c io n e s
é s ta s .
que
e x is t e n
( e s p e c if ic a r : g r a m
y
Z N .)
C a li b r a r a d e c u a d a m e n t e e l m ic r o s c o p io y d e t e r m in a r la s d im e n s io n e s d e
d if e r e n t e s m ic r o o r g a n is m o s y / o e s t r u c t u r a s c e lu la r e s
T r a b a ja r
c o rre c ta m e n te
con
lo s
m a t e r ia le s
y
p ro d u c to s
q u í m ic o s
r e q u e r id o s e n la s t in c io n e s
C u m p lir
n o rm a s
de
c a lid a d
en
lo s
p ro c e s o s
de
t in c io n e s
R E A L IZ A D O P O R :
T e c n ó lo g o M é d ic o , M e d ic o M ic r o b ió l o g o
D U R A C IO N :
9 0 m in u t o s
N U M E R O D E A LU M N O S P O R
D O C E N TE
M a x im o 1 0 a lu m n o s
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
p r e p a r a c ió n
de
la s
G u í a : T in c io n e s
M A R C O T E Ó R IC O
L a s c é lu la s g e n e r a lm e n t e s o n t r a t a d a s p a r a c o a g u la r e l p r o t o p la s m a a n t e s d e
t e ñ ir la s , p r o c e s o lla m a d o f i j a c i ó n .
P a r a b a c t e r ia s , la f ija c ió n p o r e l c a lo r e s lo m á s c o r r ie n t e , a u n q u e t a m b ié n
p u e d e f ija r s e c o n s u s t a n c ia s q u í m ic a s c o m o f o r m a ld e h í d o , á c id o s y a l c o h o le s .
D e s p u é s d e la f ija c ió n , s i s e a ñ a d e e l c o lo r a n t e , n o s e p r o d u c e n u lt e r io r e s
c a m b io s e s t r u c t u r a le s e n e l p r o t o p la s m a . L a f ija c ió n s e r e a liz a h a b it u a lm e n t e
e n c é lu la s q u e h a n s id o f ija d a s s o b r e u n p o r t a o b je t o s , t r a t a n d o d e s p u é s é s t e
c o n e l a g e n t e f ija d o r , y s ig u ie n d o in m e d ia t a m e n t e e l p r o c e s o d e t in c ió n . L a
f ija c ió n p r o d u c e h a b it u a lm e n t e e l e n c o g im ie n t o d e la s c é lu la s ; la t in c ió n , p o r e l
c o n t r a r io , h a c e q u e la s c é lu la s a p a r e z c a n m a y o r e s d e lo q u e s o n r e a lm e n t e , d e
m a n e r a q u e la s m e d id a s d e la s c é lu la s q u e h a n s id o f ija d a s o t e ñ id a s n o
p u e d e n r e a liz a r s e c o n m u c h a p r e c is ió n .
La
m a y o ría
a f in id a d
con
de
lo s
e s p e c í f ic a
f r e c u e n c ia
c o m b in a n
c o lo ra n te s
p o r lo s
son
con
m o lé c u la s
in t e n s id a d
n e g a t iv a m e n t e ,
son
t a le s
c o m p u e s t o s o r g á n ic o s q u e
m a t e r ia le s
c a rg a d a s
con
com o
lo s
c e lu la r e s . M u c h o s
lo s
p o s it iv a m e n t e
c o n s t it u y e n t e s
á c id o s
n u c l e ic o s
y
t ie n e n
c o lo r a n t e s
( c a tio n e s )
c e lu la r e s
lo s
a lg u n a
u t iliz a d o s
y
s e
c a rg a d o s
p o l is a c á r id o s
á c id o s .
E je m p lo s d e c o lo r a n t e s c a t ió n ic o s s o n e l a z u l d e m e t i l e n o , e l c r i s t a l v i o l e t a y
la s a fra n in a .
O tro s
c o lo r a n t e s
son
m o lé c u la s
c a rg a d a s
n e g a t iv a m e n t e
( a n io n e s )
y
se
c o m b in a n c o n lo s c o n s t it u y e n t e s c e lu la r e s c a r g a d o s p o s it iv a m e n t e , t a le s c o m o
m u c h a s p r o t e í n a s . E s o s c o lo r a n t e s in c lu y e n
la
e o s in a , la
fu c s in a
á c id a
y
el
ro jo C o n g o .
O tro
gru p o
g ru p o
se
de
c o lo r a n t e s s o n
c o m b in a n
c on
m e n u d o p a r a r e v e la r la
lo s
s u s t a n c ia s
l i p o s o l u b l e s ; lo s c o lo r a n t e s d e
m a t e r ia le s
l ip í d ic o s
lo c a l iz a c i ó n d e
d e
la
la s g o t í c u la s o
c é lu la ,
e s te
usándose
a
d e p ó s it o s d e g r a s a . U n
e je m p lo d e c o lo r a n t e lip o s o lu b l e e s e l n e g r o S u d á n .
A lg u n o s
c o lo ra n te s
t e ñ ir á n
m e jo r
s ó lo
después
de
que
la
c é lu la
haya
s id o
t r a t a d a c o n o t r a s u s t a n c ia q u í m ic a , q u e n o e s u n c o lo r a n t e p o r s í m is m o . E s t a
s u s t a n c ia s e d e n o m in a m o r d i e n t e ; u n m o r d ie n t e h a b it u a l e s e l á c id o t á n ì c o . E l
m o r d ie n t e s e c o m b in a c o n u n c o n s t it u y e n t e c e lu la r y lo a lt e r a d e t a l m o d o q u e
a h o r a s í p o d r á a t a c a r e l c o lo r a n t e .
S i
se
desea
s im p le m e n t e
m ic r o s c o p í a , s o n
m e t ile n o
es
un
in c re m e n ta r
el
c o n tra s te
de
la s
s u f ic ie n t e s lo s p r o c e d im ie n t o s s im p le s d e
buen
c o lo ra n te
s im p le
que
a c tú a
s o b re
c é lu la s
p a ra
la
t in c ió n . E l a z u l d e
to d a s
la s
c é lu la s
b a c t e r ia n a s r á p id a m e n t e y q u e n o p r o d u c e u n c o lo r t a n in t e n s o q u e o s c u r e z c a
lo s
d e t a l le s
b a c t e r ia s
en
c e lu la r e s .
m u e s tra s
E s
e s p e c ia lm e n t e
n a t u r a le s ,
p u e sto
ú til
que
p a ra
la
d e te c ta r
m a y o r p a rte
c e lu la r n o s e t iñ e
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
la
p r e s e n c ia
d e
d e l m a t e r ia l n o
G u í a : T in c io n e s
.L a
tin c ió n
n e g a tiv a
es
el
re v e rs o
del
p r o c e d im ie n t o
de
t in c ió n
u s u a l:
la s
c é lu la s s e d e ja n s in t e ñ ir , p e r o s e c o lo r e a e n c a m b io e l m e d io q u e la s r o d e a . L o
que
se
v e , p o r t a n t o , e s e l p e r f il d e
t in c ió n
n e g a t iv a
es
un
la s c é lu la s . L a
m a t e r ia l
opaco
que
s u s t a n c ia
no
t ie n e
u t il iz a d a
a f in id a d
p a ra
por
la
lo s
c o n s t it u y e n t e s c e lu la r e s y q u e s im p le m e n t e r o d e a la s c é lu la s , t a l c o m o la
ti n t a
c h in a
o
la
es
u n
(q u e
n ig ro s in a
m odo
es
(u n
una
c o lo r a n t e
s a t is f a c t o r io
ó p t ic a ,
p e ro
s u s p e n s ió n
su
de
n e g ro
de
p a r t í c u la s
in s o l u b le
e n
u t ilid a d
e s tá
en
c a rb o n o
a g u a ). L a
a u m e n ta r e l c o n tra s te
m á x im a
de
de
t in c ió n
c o l o id a l)
n e g a t iv a
la s c é lu la s e n
r e v e la r
la
la
m ic r o s c o p i a
p re s e n c ia
de
c á p s u la s
a lr e d e d o r d e la s c é lu la s b a c t e r ia n a s .
L o s m é t o d o s d e t i n c ió n s o n d e g r a n u t i l i d a d , p e r o d e b e n u s a r s e s i e m p r e c o n
p re c a u c ió n , y a
fo rm a n
en
c e lu la r e s
que
pueden
o c a s io n e s
a u t é n t ic a s ,
c o n d u c ir a
p r e c ip it a d o s
p e ro
que
o
s on
e rro re s . L a s
a g re g a d o s
f o r m a c io n e s
m o lé c u la s
que
de
p a re c e n
c o lo r a n t e
e s tru ctu ra s
c o m p le t a m e n t e
a r t if ic ia le s
in d u c id a s p o r e l m is m o c o lo r a n t e . T a le s e s t r u c t u r a s s e d e n o m in a n a r t e f a c t o s , y
deben
to m a rs e
e s ta m o s
m u c h a s p r e c a u c io n e s
e q u iv o c a n d o
a l c re e r q u e
un
p a ra
t e n e r la
a rte fa c to
s e g u r id a d
es
una
de
que
e s tru c tu ra
no
no s
r e a lm e n t e
e x is t e n t e .
D e b a jo
de
la s
m u c ila g in o s a s ,
s u s ta n c ia s
y
en
la
e x t r a c e lu la r e s ,
p e r if e r ia
de
com o
u na
son
d e lic a d a
la s
c á p s u la s
m e m b ra n a
y
que
c u b ie r t a s
e s tá
e n
in m e d ia t o c o n t a c t o c o n e l c it o p la s m a , s e e n c u e n t r a la p a r e d c e lu la r , q u e e s u n a
e s tru c tu ra
r í g id a
que
da
fo rm a
a
la
c é lu la .
Las
p a re d e s
c e lu la r e s
pueden
d e s t r u ir s e o r o m p e r s e e n c o n d ic io n e s e s p e c ia le s .
R E C O R D E M O S :
C o n s t it u y e n t e s
im p o r t a n t e s
de
la
p a re d
c e lu la r
son
lo s
a m in o á c id o s ,
a m in o
a z ú c a r e s , a z ú c a r e s y g r a s a s . E s t a s s u s t a n c ia s ( p r o t e í n a s , H id r a t o s d e c a r b o n o ,
g ra s a s ) e s tá n
e n la z a d a s
fo rm a n d o
e l p o lí m e r o
c o m p le jo
c e lu la r .
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
que
fo rm a
la
p a re d
G u í a : T in c io n e s
E n t r e lo s c o n s t it u y e n t e s d e la p a r e d c e lu la r d e la s b a c t e r ia s
G ra m -n e g a tiv a s
la s
b a c t e r ia s
e x is t e n
G ra m -p o s itiv a s y
im p o r t a n t e s d if e r e n c ia s . P o r e je m p lo , la s p a r e d e s d e
g r a m - p o s it iv a s
c o n t ie n e n
m enos
a m in o á c id o s
que
la s
g ra m -
n e g a t iv a ; e l c o n t e n id o g r a s o e s m u c h o m á s e le v a d o e n la s g r a m - n e g a t iv a s q u e
en
la s
g r a m - p o s it iv a s .
E s te
hecho
m e c a n is m o d e la r e a c c ió n a l g r a m
B a c te ria G ra m
se
ha
p ro p u e s to
com o
e x p l ic a c ió n
de l
(v e r la s d o s im á g e n e s ju n ta s ).
P o s itiv a
B a c te ria G ra m
un a
N e g a tiv a
T ie n e u n a c a p a g r u e s a d e p e p t id o g lic a n o
T ie n e
capa
d e lg a d a
( m u r e in a )
p e p t id o g l ic a n o ( m u r e in a )
de
T in c io n e s s im p le s
E s ta s
t in c io n e s
se
basa n
en
la
a c c ió n
d e
un
s o lo
c o lo r a n t e
s o b re
c é lu la b a c t e r ia n a , e n t a l f o r m a q u e t o d a s e lla s p r e s e n t a r á n e l m is m o c o lo r .
e s te
m o t iv o ,
se
e m p le a n
f u n d a m e n t a lm e n t e
p a ra
o b s e rv a r
la
fo rm a
la
P or
y
la
b a c t e r ia s
de
a g r u p a c ió n d e la s b a c t e r ia s .
T in c io n e s d ife re n c ia le s
E s ta s
t in c io n e s
p e r m it e n
e fe c tu a r
un a
a g r u p a c ió n
de
la s
a c u e r d o a s u d if e r e n t e a f in i d a d p o r lo s c o lo r a n t e s q u e s e u t i liz a n e n e l la s .
b a c t e r ia s q u e
d if e r e n t e s .
que
e x is t e
La
quedan
t e ñ id a s d e
im p o r t a n c ia
c ie r t a
de
c o r r e la c ió n
d if e r e n t e
c o lo r p e r t e n e c e n
a
e s t a s t in c io n e s , e s p e c ia lm e n t e
e n tre
la
a f in id a d
t in t o r ia l d e
la
A s í,
g r u p o s t a m b ié n
la
de
G ram , es
b a c t e r ia
y
o tra s
p r o p ie d a d e s , c o m o p o r e je m p lo la s u s c e p t ib il id a d o r e s is t e n c ia a d e t e r m in a d o s
a g e n t e s a n t im ic r o b ia n o s , b a s a d a
e n d if e r e n c ia s e s t r u c t u r a le s p r in c ip a lm e n t e
n iv e l d e la p a r e d b a c t e r ia n a .
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
a
G u í a : T in c io n e s
a )T in c ió n d e G ra m
(M o d i f i c a c i ó n d e H u c k e r )
E m p le a d o s c o lo r a n t e s , e l v io le t a d e g e n c ia n a y la s a f r a n in a , c o n u n a e t a p a d e
d e c o lo r a c ió n
in t e r m e d ia .
E n
e s ta
fo rm a
la s
b a c t e r ia s
s e
c la s if ic a n
en
G ra m
p o s it iv a s s i r e t ie n e n e l p r im e r c o l o r a n t e y p o r lo t a n t o a p a r e c e n t e ñ id a s d e
v io le t a ,
o
en
G ra m
n e g a t iv a s
s i p ie r d e n
e l p r im e r c o lo r a n t e
e n
la
azu l
e ta p a
d e
d e c o lo r a c ió n y s e t iñ e n c o n e l s e g u n d o c o l o r a n t e , a p a r e c ie n d o a la o b s e r v a c ió n
m ic r o s c ó p ic a d e c o lo r r o s a d o o r o jo .
b a c t e r ia s q u e
jó v e n e s ,
s e
p e ro
n e g a t iv o s .
d e n o m in a n
a
m e d id a
G ra m
que
T a m b ié n s e r e c o n o c e u n t e r c e r g r u p o d e
v a r ia b le s
" e n v e je c e n "
que
so n
G ra m
g r a d u a lm e n t e
p o s it iv o s
se
cuand o
v u e lv e n
L o s b a c ilo s e s p o r u la d o s s o n u n e je m p l o d e e s t e g r u p o
G ra m
o : la t in c ió n
G R A M
L a tin c ió n d e
G ram
es uno
la b o r a t o r io b a c t e r io ló g ic o
de
lo s m é t o d o s d e
y co n e l que
t in c ió n
m á s im p o r t a n t e s e n e l
e l e s t u d ia n t e d e b e
e s ta r p e rfe c ta m e n te
f a m ilia r iz a d o . S u u t i lid a d p r á c t ic a e s in d is c u t i b le y e n e l t r a b a jo m ic r o s c ó p ic o d e
r u t in a
d e l L a b o r a t o r io
b a c t e r ia n a
d e
M ic r o b i o lo g í a
la s r e f e r e n c ia s
a
la
m o r f o lo g í a
(c o c o s , b a c ilo s , p o s itiv o s , n e g a tiv o s , etc ) s e
basan
c e lu la r
ju s t a m e n t e
e n la t in c ió n d e G R A M
.
E s t a t in c ió n s e d e n o m in a d a a s í p o r e l b a c t e r ió l o g o
danés
C h r is t ia n
G ra m ,
q u ie n
la
d e s a r r o lló
en
1 8 4 4 . S o b r e la b a s e d e s u r e a c c ió n a la t in c ió n d e
G ra m ,
la s
g ru p o s ,
caso,
g r a m p o s it iv a s
lo s
nada
b a c t e r ia s
que
t é r m in o s
ver
pueden
y
d iv id ir s e
en
g r a m n e g a t iv a s
(e n
e s te
no
t ie n e
p o s it iv o
con
y
n e g a t iv o
c a rg a
e l é c t r ic o ,
dos
s in o
s im p le m e n t e d e s ig n a n d o s g r u p o s m o r f o ló g ic o s
d is t in t o s d e b a c t e r ia s ) .
L a s b a c t e r ia s g r a m - p o s it iv a s y g r a m - n e g a t iv a s t iñ e n d e f o r m a d is t in t a d e b id o a
la s d i f e r e n c i a s c o n s t i t u t i v a s e n l a e s t r u c t u r a d e s u s p a r e d e s c e l u l a r e s . L a
p a r e d d e la c é lu la b a c t e r ia n a s ir v e p a r a d a r s u t a m a ñ o y f o r m a a l o r g a n is m o a s í
c o m o p a r a p r e v e n ir la lis is o s m ó t ic a . E l m a t e r ia l d e la p a r e d c e lu la r b a c t e r ia n a
q u e c o n f ie r e r ig id e z e s e l p e p t id o g l ic a n o . L a p a r e d d e la c é lu la g r a m - p o s it iv a e s
g r u e s a y c o n s is t e e n v a r ia s c a p a s in t e r c o n e c t a d a s d e p e p t id o g lic a n o a s í c o m o
a lg o d e á c i d o t e ic o ic o . G e n e r a lm e n t e , 8 0 % - 9 0 %
p o s it iv a e s p e p t id o g lic a n o . L a p a r e d d e
c o n t ie n e
una
ro d e a d a
capa
por
lip o p o lis a c á r id o s ,
m ucho
una
y
d e la p a r e d d e la c é lu la g r a m -
la c é lu la g r a m - n e g a t iv a , p o r o t r o l a d o ,
m á s d e l g a d a , ú n ic a m e n t e
m e m b ra n a
lip o p r o t e í n a s .
e x t e r io r
S ó lo
10%
de
p e p t id o g lic a n o
c o m p u e s ta
-
20%
de
la
de
p a re d
y e s tá
f o s f o lí p id o s ,
de
la
c é lu l a
g r a m - n e g a t iv a e s p e p t id o g lic a n o .
D e b id o
a
su
im p o r t a n c ia
en
ta x o n o m ía
b a c t e r ia n a
y
a
que
in d ic a
d if e r e n c ia s
f u n d a m e n t a le s d e la p a r e d c e lu la r d e la s d is t in t a s b a c t e r ia s , d e s c r ib ir e m o s a q u í
c o n a lg ú n d e t a l le la t in c ió n d e G r a m
y la s in t e r p r e t a c io n e s q u e a c t u a lm e n t e s e
h a c e n s o b r e e l p o r q u é d e s u f u n c io n a m ie n t o .
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
G u í a : T in c io n e s
Las
c é lu la s
f ij a d a s
a l c a lo r s o b r e
un
p o r t a o b je t o s
se
t iñ e n , p r im e r o
s o lu c ió n d e c r is t a l v io le t a ( o t r o s c o lo r a n t e s b á s ic o s n o s o n
con
un a
t a n e f e c t iv o s ) y s o n
la v a d a s d e s p u é s p a r a q u it a r e l e x c e s o d e c o l o r a n t e . E n e s t e e s t a d o , t o d a s la s
c é lu la s , t a n t o la s g r a m p o s it iv a s c o m o la s g r a m n e g a t iv a s , e s t á n t e ñ id a s d e a z u l.
E l p o r t a o b je t o s s e
c u b re
e n to n c e s c o n
una
s o lu c ió n
de
y o d o -y o d u ro
p o t á s ic o .
E l in g r e d ie n t e a c t iv o e s a q u í e l I 2 ; e l K I s im p le m e n t e h a c e s o lu b l e e l I 2 e n a g u a .
E l I2 e n tra
en
v io le t a . D e
la s c é lu la s y f o r m a
nuevo
ta n to
la s
un
c o m p le jo
in s o lu b le
en
c é lu la s g r a m p o s it iv a s c o m o
agua
con
e l c r is t a l
l a s g r a m n e g a t iv a s s e
e n c u e n t r a n e n la m is m a s it u a c ió n .
S e
lle v a
a
cabo
d e s p u é s la
d e c o lo r a c ió n , u s a n d o
u n a m e z c la d e a lc o h o l - a c e t o n a , s u s t a n c ia s e n
que
es
s o lu b l e
A lg u n o s
el
c o m p le jo
o r g a n is m o s
I 2 - c r is t a l
v io l e t a .
( g r a m p o s it iv o s )
d e c o lo r a n , m ie n t r a s q u e
la s
no
se
o t r o s ( g r a m n e g a t iv o s ) lo
h a c e n . L a d if e r e n c ia e s e n c ia l e n t r e e s o s d o s t ip o s
de
c é lu la s
e s tá
por
d e c o lo r a c ió n ;
ta n to
e s ta
p r o b a b le m e n t e
al
en
su
r e s is t e n c ia
r e s is t e n c ia
hech o
de
que
a
se
e n
el
la
d ebe
caso
de
b a c t e r ia s g r a m - n e g a t iv a s , la m e z c la d e a lc o h o l/ a c e t o n a e s u n s o lv e n t e lip í d ic o
y
d is u e lv e
la
m e m b ra n a
d a ñ a r la
m e m b ra n a
capa
p e p t id o g lic a n o
de
e x t e r io r
c it o p lá s m ic a
es
de
a
la
la
in c a p a z
p a re d
que
de
se
de
une
la
c é lu la
(y
t a m b ié n
p e p t id o g l ic a n o ) . L a
re te n e r e l d e
c o m p le jo
puede
d e lg a d a
c r is t a l v io le t a -
y o d o y la c é lu la s e d e c o lo r a . la s c é lu la s g r a m p o s it iv a s , a c a u s a d e s u s p a r e d e s
c e lu la r e s
m ás
espesas
( t ie n e n
p e r m e a b le s a l d is o lv e n t e
y a
m ás
que
p e p t i d o g l ic a n o
é s te
d e s h id r a t a
y
la
m enos
p a re d
lí p id o ) ,
no
so n
c e lu la r y c ie r r a
lo s
p o r o s , d is m in u y e n d o a s í e l e s p a c io e n t r e la s m o lé c u l a s y p r o v o c a n d o q u e e l d e
c o m p le jo
c r is t a l
v io le t a - y o d o
quede
a tra p a d o
d e n tro
de
la
p a re d
c e lu la r .
D e s p u é s d e la d e c o lo r a c ió n la s c é lu la s g r a m p o s it iv a s s o n t o d a v í a a z u le s , p e r o
la s g r a m n e g a t iv a s s o n in c o lo r a s .
P a r a p o n e r d e m a n if ie s t o la s c é lu l a s g r a m n e g a t iv a s s e u t iliz a u n a c o lo r a c ió n d e
c o n t r a s t e . H a b it u a lm e n t e e s u n c o lo r a n t e d e
f u c s in a
b á s ic a .
D espués
de
la
c o lo r r o jo , c o m o la
c o lo r a c ió n
de
c o n tra s te
s a f r a n in a o
la s
la
c é lu la s
g r a m n e g a t iv a s s o n r o ja s , m ie n tr a s q u e la s g r a m p o s it iv a s p e r m a n e c e n a z u le s .
D e b e n d e s ta c a rs e a lg u n o s a s p e c to s c ru c ia le s d e la tin c ió n d e G ra m :
1 ) E l t r a t a m ie n t o
con
c r is t a l v io le t a
debe
p r e c e d e r a l t r a t a m ie n t o
con
yodo. E l
y o d o p o r s í s o lo t ie n e p o c a a f in id a d c o n la s c é lu la s .
2) La
t in c ió n
d e c o lo r a c ió n
de be
r e a l iz a r s e
con
poca
agu a
la s c é lu la s g r a m p o s it iv a s . E I p r o c e s o d e
p a ra
e v it a r q u e
d e c o l o r a c ió n
p ie rd a n
la
d e b e s e r c o rto y
e s e s e n c ia l u n c á lc u l o p r e c is o d e l t ie m p o p a r a o b t e n e r r e s u lt a d o s s a t is f a c t o r io s .
3 ) C u lt iv o s
m ás
v ie j o s
de
2 4
h o ra s
pue de
p e rd e r s u
h a b i lid a d
c o m p le jo c r is t a l v io le t a - y o d o .
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
de
re te n e r e l
G u í a : T in c io n e s
E l
c a rá c te r
A lg u n o s
de
g r a m p o s it iv o
o r g a n is m o s
son
no
m ás
es
s ie m p r e
g r a m p o s it iv o s
un
fe n ó m e n o
que
o tro s
y
del
to d o
a lg u n o s
o
nada.
son
g ra m -
v a r ia b le s , e s d e c ir , u n a s v e c e s g r a m p o s it iv o s y o t r a s g r a m n e g a t iv o s
b ) T i n c i ó n d e Z i e h l - N e e l s e n ( M o d if i c a c i ó n d e K i n y o u )
E s t a t in c ió n , a l ig u a l q u e la d e G r a m , e m p le a d o s c o lo r a n t e s : L a f u c s in a y e l
a z u l d e m e t ile n o ( o a m a r illo v ic t o r ia ) , c o n u n a d e c o lo r a c ió n in t e r m e d ia b a s a d o
e n e l u s o d e u n d e c o lo r a n t e e n é r g ic o ( a lc o h o l á c id o ) .
L a s b a c t e r ia s c a p a c e s d e
r e s is t ir e s t a d e c o lo r a c ió n y q u e , p o r lo t a n t o , s e o b s e r v a n d e c o lo r r o jo in t e n s o
s e d e n o m in a n a l c o h o l á c i d o r e s i s t e n t e ( A A R ) .
L a im p o r t a n c ia d e e s t a t in c ió n r a d ic a e n q u e a lg u n a s b a c t e r ia s a lc o h o l á c id o
r e s is t e n t e s s o n e l a g e n t e c a u s a l d e im p o r t a n t e s e n f e r m e d a d e s ( t u b e r c u lo s is ,
le p r a ) .
T in c io n e s e s p e c ia le s
E s ta s
t in c io n e s , c u y a s
s im p le s , t ie n e n
c é lu la
p o r o b je to
b a c t e r ia n a .
f la g e lo s ,
t é c n ic a s
C om o
c á p s u la s ,
s on
m ás
c o m p l e ja s
d e s t a c a r a lg u n a s
e je m p lo s
e s p o ra s ,
e tc .
se
N o
de
pue den
son,
la s
c it a r
en
que
la s
p a rte s
la s
g e n e r a l,
de
la s
t i n c io n e s
c o n s t it u t iv a s
t in c io n e s
de
uso
de
de
la
n ú c le o ,
r u t in a r io
e n c u e n t r a n s u a p lic a c ió n e n t r a b a jo s d e in v e s t ig a c ió n b a c t e r io ló g ic a .
IN S U M O S Y E Q U IP O S N E C E S A R IO S P A R A E L T A L L E R

L a b o r a t o r io d e c ie n c ia s b á s ic a s

M ic r o s c o p io s ó p t ic o s ( u n o p o r a lu m n o )

X ilo l

A c e it e d e in m e r s ió n

P a p e l f i lt r o

P a p e l tis ú e s

P o r ta o b je to s (3

C u b r e O b je to s (2

A sa s d e p u n ta (1 0

P ip e t a s p a s t e u r e s t é r ile s y t a p o n a d a s

P in z a s m e t á li c a s ( u n a p o r a lu m n o )

C u lt iv o s d e

S e t d e t in c ió n

M u e s t r a s F ij a d a s c o n

G u a n te s (u n

A z u l d e m e t ile n o s e t d e t in c io n d e z ie h l - n e e ls e n

b a q u e t a s d e v id r io

a lg o d ó n

ahcoho

s u s t a n c ia s im u la d o r a d e d e s g a r r o
p o r a lu m n o )
p o r a lu m n o )
u n id a d e s )
m i c r o o r g a n is m o s
(3
p o r a lu m n o )
( C o c a c e a s , b a c i lo s e t c )
de G ram .
B A A R . P o s it iv o s . ( s o lo
p a r a d e m o s t r a c ió n )
p a r p o r a lu m n o )
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
y
G u í a : T in c io n e s
D E S C R IP C IO N D E L P R O C E D IM IE N T O
P R E P A R A C IÓ N D E L F R O T IS
A )
P re p a re
un
F R O T IS ,
que
c o n s is t e
en
una
d e lg a d a
capa
de
b a c t e r ia s
d is t r ib u id a s e n la s u p e r f ic ie d e u n p o r t a o b je t o s y f ija d o a é l p a r a q u e r e s is t a la s
d if e r e n t e s
e ta p a s
de
la
t in c ió n
( a d ic ió n
de
c o lo r a n t e s ,
la v a d o s ,
e tc .).
La
p r e p a r a c ió n d e l f r o t is c o n s is t e e n :
1 . - C o lo c a r u n a g o t a d e c u lt iv o lí q u id o e n u n p o r t a o b je t o s lim p io o u n a g o t a d e
e m u ls ió n s i s e t ie n e u n c u lt iv o e n m e d io s ó lid o
2 . - E x t e n d e r e s t e m a t e r ia l c u id a d o s a m e n t e e n u n a c a p a d e lg a d a .
3 . - D e ja r s e c a r a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e o c a le n t a n d o s u a v e m e n t e a la lla m a d e l
m e c h e ro .
E v it e s o b r e c a le n t a m ie n t o .
4 . - F ija r l a p r e p a r a c ió n p a s a n d o r á p i d a m e n t e la
c a r a d e l p o r t a o b je t o
que
lle v a
la s b a c t e r ia s d o s o t r e s v e c e s p o r la l la m a d e l m e c h e r o , e v it a n d o c a r b o n iz a r la s
p o r s o b r e c a le n t a m ie n t o .
E l f r o t is q u e d a
e n t o n c e s l is t o
p a ra
c o lo r a c ió n d e s e a d a .
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
s e r t e ñ id o
con
la
G u í a : T in c io n e s
T in c ió n s im p le
a ) C u b r a e l f r o t is c o n e l c o lo r a n t e q u e d e s e a y p o r e l t ie m p o c o r r e s p o n d ie n t e .
E je m p lo :
V io le t a d e g e n c ia n a
- - - -- - -- - -- - -- - -- - 1 5 s e g .
S a f r a n in a
- - - -- - -- - -- - -- - -- - 2 0 s e g .
A z u l d e m e t ile n o
- - - -- - -- - -- - -- - -- - 3 0 s e g .
b ) L a v e c o n a g u a d e la lla v e b a jo u n c h o r r o f in o y s u a v e p a r a e lim in a r e l e x c e s o
d e c o lo r a n t e .
c)
S eque
la
a b s o rb e n te
p r e p a r a c ió n
( p a p e l f ilt r o
c o lo c a n d o
o
t o a lla
e l p o r t a o b je t o
N o v a ) s in
e n tre
f r o t a r lo , o
d e je
dos
capas
de
pape l
s e c a r a te m p e ratu ra
a m b ie n t e .
d ) O b s e r v e la p r e p a r a c i ó n u s a n d o e l o b je t iv o
de
in m e r s ió n ( 1 0 0 x ) ,
c o lo c a n d o
p r e v ia m e n t e s o b r e la p r e p a r a c ió n u n a g o t a d e a c e it e d e c e d r o ( in m e r s ió n ) .
T IN C IÓ N D E G R A M
a . - P r e p a r e u n f r o t is d e c a d a u n a d e la s c o lo n ia s d if e r e n t e s .
b . - S o m e t a t o d o s lo s f r o t is a la t in c ió n d e G r a m , c u y a s e c u e n c ia e s la s ig u ie n t e :
C o lo r e a r
con
v io le t a
de
g e n c ia n a ,
o
c r is t a l v i o le t a ,
al 1%
d u ra n te
6 0
s e g u n d o s , c u id a n d o q u e e l c o lo r a n t e c u b r a t o d a la p r e p a r a c ió n .
E lim in a r
el
exceso
de
c o lo ra n te s
y
la v a r
r á p id a m e n t e
con
a gua,
m a n t e n ie n d o e l p o r t a o b je t o s e n p o s ic ió n in c lin a d a .
C u b r ir la p r e p a r a c ió n c o n la s o lu c ió n d e G r a m
d u ra n te 6 0 s e g u n d o s .
D e c o lo r a r c o n
a lc o h o l a c e t o n a
( e t a p a d if e r e n c ia l) .
o L u g o l, d e já n d o la a c t u a r
L a v a r n u e v a m e n te c o n a g u a .
d u ra n te
30
segundos
y
la v a r c o n
agu a
I m p o r t a n t e r e s p e t a r e l t ie m p o .
C o lo r a c ió n d e f o n d o o d e c o n tr a s t e c o n s a f r a n in a d u r a n t e 2 0 s e g u n d o s .
L a v a r c o n a g u a , s e c a r y o b s e r v a r p o r in m e r s ió n .
L a f a s e d e d e c o lo r a c ió n c o n a lc o h o l c o n s t it u y e la e t a p a m á s im p o r t a n t e d e la
t in c ió n d e G r a m
y e n e lla r e s id e s u c a r á c t e r d if e r e n c ia l.
O b s e r v e p o r in m e r s ió n la m o r f o lo g í a , a g r u p a c ió n y a f in id a d t in t o r ia l d e la s
b a c t e r ia s q u e U d .
s e le c c io n ó .
T IN C IÓ N D E Z IE L -N E E L S E N
L a s t in c io n e s u t i liz a d a s e n e l e x a m e n m ic r o s c ó p ic o d e M y c o b a c t e r ia s s o n la d e
Z ie h l- N e e ls e n y l a t in c ió n f lu o r o c r ó m ic a c o n a u r a m in a a m b a s s e b a s a n e n u n a
p r o p ie d a d
p e c u l ia r d e
la s
M y c o b a c t e r ia s
ya
que
r e s is t e n
a lc o h o l c lo r h í d r ic o .
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
la
d e c o lo r a c ió n
co n
G u í a : T in c io n e s
T E C N IC A
U na
vez
r e a liz a d o
e l f r o t is
con
la
m u e s tra
o
b a te ría
se
p ro c e d e
de
la
s ig u ie n t e m a n e r a .
C u b r ir la p r e p a r a c ió n c o n f u c c in a f e n ic a d a
E n s e g u id a
de
c a le n t a r , p a s a n d o
q u e m a r y e n c e n d id a
una
t ó r u la
p o r d e b a jo
im p r e g n a d a
d e l p o r t a o b je t o
con
a lc o h o l
h a s ta
que
se
p r o d u z c a e m is ió n d e v a p o r e s ( s in q u e h ie r v a la f u c c in a )
D e ja r
e n f r ia r
y
r e p e t ir
e l c a l e n t a m ie n t o
3
0
3
veces
d u ra n te
5
m in u t o s .
Lavar con agua
d e la lla v e o p iz e t a
D e c o lo r a r a
a lc o h o l c lo r h í d r ic o , l a v a r y
con
v o lv e r a
r e p e t ir e s t e
p r o c e s o h a s t a q u e n o e s c u r r a m á s c o lo r a n t e .
C u b r ir la
p r e p a r a c ió n
con
v e rd e
de
m a la q u it a
o
azul de
m e t ile n o
por unos 30 segundos
L a v a r y s e c a r la p r e p a r a c ió n .
In te rp re ta c ió n
L a s b a c t e r ia s a lc o h o l á c id o r e s is t e n t e s - a l r e t e n e r la f u c c in a - s e
o b s e r v a r á n c o lo r r o s a d o f u e r t e , lo s r e s t a n t e s e le m e n t o s o
m ic r o o r g a n is m o s q u e n o r e s is t e n la d e c o lo r a c ió n s e o b s e r v a r á n v e r d e s o
a z u le s , s e g ú n s e a e l c o lo r a n t e d e c o n t r a s t e u s a d o
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
G u í a : T in c io n e s
M E T O D O L O G ÍA
D E E V A L U A C IÓ N :
E l t a lle r s e e v a lú a a t r a v é s d e u n a p a u t a d e c o m p e t e n c ia s lo g r a d a s d e a c u e r d o
a lo s o b je t iv o s p la n t e a d o s y s o lic it a n d o a l a lu m n o e n t r e g a r u n in f o r m e :
B IB L IO G R A F Í A
P r o c e d im ie n t o s
y
t é c n ic a s
de
la b o r a t o r io
. v o lu m e n
I.
M ic r o b io lo g í a
e s p e c ia l. I S P
M a n u a l d e la b o r a t o r io d e m ic r o b io lo g í a . U . d e c h ile . S e d e L a s e r e n a
..
N o m b r e d e l a lu m n o : … . . .. .. .. . .. .. .. .. . .. .. .. .. . .. .. .. .. . .. .. .. ..
F e c h a : … . . .. .. . .. .. .. .. . .. .. .. .. . .. .. .. .. . .. .. .. . N o t a … .. .. .. . .. .. .. .. .. . ..
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
G u í a : T in c io n e s
T IN C IO N E S
C
IN F O R M E D E R E S U L T A D O S :
T i n c i ó n s i m p l e .C o lo r a n t e . D ib u je u n
c a m p o r e p r e s e n t a t iv o d e la m u e s tr a
D ib u je la m o r f o lo g í a o b s e r v a d a
T ip o d e a g r u p a c ió n
C o lo r d e la s c é lu la
2 . T in c ió n d e g ra m
D e s c r ip c ió n d e l p r o c e d im ie n t o p a s o a p a s o
D ib u je u n c a m p o r e p r e s e n t a t iv o d e la m u e s t r a
D ib u je y d e s c r ib a la m o r f o lo g í a o b s e r v a d a
C o lo r d e la s c é lu la s
G ra m
3.
a n á lis is d e lo s r e s u lt a d o s y
c o n c lu s io n e s
4 . R e a liz a lo s p a s o s o r d e n a d o s e n la p r e p a r a c ió n d e
t in c io n e s
5 . T r a b a ja c o n s e g u r id a d y lim p ie z a
6.
7 . D e ja s u u n id a d o r d e n a d a y lim p ia
a l f in a l iz a r e l t a lle r
C : c o m p e te n te
M C : m e d ia n a m e n t e c o m p e t e n t e
N C : n o c o m p e te n te
A u to re s : T M
S o le d a d C a im a n q u e . . G .
E U E l ia n a E s c u d e r o
D uocU C
M C
N C