Resumen Tema 7 protegidoSecuenciacion Peptidica

Secuencia de Aminoácidos en las Proteínas
• Es característica para cada proteína
Tema 7
• Es codificada por una secuencia de
nucleótidos del DNA
SECUENCIACIÓN PEPTÍDICA
• Por lo tanto, es una forma de información
genética
• Se lee desde el amino terminal al carboxilo
terminal
Etapas para el conocimiento de una
secuencia peptídica (I)
Estrategia en 8 pasos:
1.- Aislamiento y purificación de la
proteína
2.- Determinación de la masa molecular
3.- Comprobar si posee más de una
cadena
Etapas para el conocimiento de una
secuencia peptídica (II)
6.- Determinar la composición y la secuencia
de estos péptidos mas pequeños
7.- Solapamiento o superposición de péptidos
4.- Separación de las cadenas
5.- Escisión de las cadenas en péptidos
mas pequeños
8.- Hidrólisis total
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Determinación de la estrategia de secuenciación
Paso 1
Paso 2
2.- Determinación de la masa molecular (Mr)
1.- Aislamiento y purificación de la proteína
Métodos indirectos
• Dialisis
• Filtración a través de geles
• Ultracentrifugación
• Otras técnicas ( según Mr; pI; carga; etc.)
• Ultracentrifugación
• Electroforesis (PAGE-SDS)
Métodos directos
• Espectrometría de masas
Paso 3
3.- Comprobar si posee más de una cadena y
calcular su número
•
Identificación del grupo N-terminal
a) Reactivo de Sanger
b) Cloruro de dansilo
c) Cloruro de dabsilo
d) Reactivo de Edman
Fred Sanger desarrolló métodos de secuenciación
de proteínas, por la secuencia de la insulina (1953)
recibió el Premio Nobel de Química en 1958
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Reactivos para identificar NH2 terminales
2,4-dinitrofluorbenceno
NO2
NO2
F
FDNB
Después de la hidrólisis
Sanger
COOH
NO2
R
Amarillo, se extrae con cloroformo
(los demás productos de hidrólisis
ionizados no se extraen)
NO2
Cloruro de dimetilaminonaftalen-5-sulfonilo
C
H
NH
DNS-Cl
Cloruro de dansilo
Después de la hidrólisis CH3
CH3
CH3
N
O
S Cl
O
CH 3
Análogo a FDNB pero fluorescente
(detecta cantidades mínimas)
COOH
N
O
R
S
NH
C
H
O
Reactivo de Edman
3
Paso 4
ClH 6M
4.- Separación de las cadenas
Sanger
• La interacción entre las subunidades depende
de fuerzas débiles
• La separación se lleva a cabo con:
- pH extremos
Edman
- urea 8 M
- clorhidrato de guanidina 6 M
- alta concentración de sales,
fundamentalmente sulfato amónico
Paso 4
a) Rotura de puentes disulfuro
Residuos de
ác.cisteico
Ác.perfórmico
• Agentes que reducen puentes disulfuro:
- β- mercaptoetanol
- ditiotreitol o ditioeritritol
- para evitar recombinaciones, añadir un
agente alquilante como iodoacetato
β-mercaptoetanol
Ác. yodoacético
• Oxidación con ácido perfórmico
S-carboximetil derivado
3 bromopropilamina
4
Paso 4
Paso 5
b) Rotura de atracciones electrostáticas
5.- Escisión de las cadenas en péptidos
mas pequeños
• Cromatografía de intercambio iónico
A.- Métodos químicos
• Bromuro de cianógeno
• Hidroxilamina. Hidrólisis de .....Asn-Gly......
c) Rotura de interacciones hidrofóbicas
B.- Métodos enzimáticos
• Tripsina
• Agentes desnaturalizantes
• Termolisina
• Quimotripsina
• Clostripaina
• Proteasa del Staphylococcus
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A.- Fragmentación Química
• Bromuro de cianógeno
B.- Fragmentación Enzimática
• Tripsina : ruptura de enlace peptídico por lado carboxilico
de Rn=Lys o Arg. Rn+1≠ Pro
Tripsina
• Termolisina: lado amino de Rn= Val, Leu, Ile,Phe, Trp,
Tyr, Met(Voet). Rn-1≠ Pro
• Quimotripsina: lado carboxílico de Rn= Phe, Trp, Tyr.
Rn+1≠ Pro
• Clostripaina: igual que tripsina, pero ataca más a lado Cde Arg que de Lys
• Proteasa estafilocócica:
- lado C- de Glu y Asp en tampón fosfato
- específico para Glu en tampón acetato ó bicarbonato
6
Paso 6
6.- Determinar la composición y la secuencia
de estos péptidos mas pequeños
a) Identificación de los restos N-terminal
• Determinación de restos N-terminales
Tripsina
Tripsina
Tripsina
- Reactivo de Edman: Fenilisotiocianato
Los derivados tienen una naturaleza de
feniltiohidantoinas (derivados PTH)
b) Identificación de los restos C- terminales
Paso 6
Paso 6
b) Identificación de restos C- terminales
b) Identificación de restos C- terminales
Métodos enzimáticos (carboxipeptidasas)
Métodos químicos
• Carboxipeptidasa A, rompe cualquier residuo
excepto C-terminal de Pro, Lys y Arg
• Hidruro de litio y aluminio: AlH4Li
• Carboxipeptidasa B, solamente actúa sobre Cterminal de Arg y Lys
• Carboxipeptidasa C, si es Pro y cualquier aa
• Carboxipeptidasa Y (levaduras), cualquier aa
• Ninguna actúa si el aa n-1 = Pro
• Hidrazinolisis: H2N-NH2
- Libera el aa C-terminal y el resto de aa
quedan como aminoacil-hidrazidas
- Caso de que ninguna carboxipeptidasa
libere el C-terminal
7
Paso 7
7.- Solapamiento o superposición de péptidos
Reactivos para identificar C terminal
Ordenamiento del péptido original con los datos
suministrados en etapas anteriores
Hidrazinolisis
Ej: Comparación de la ruptura por tripsina y proteasa
NH2-NH2
de staphylococcus sobre un péptido:
Después de la hidrólisis
COOH
NH 2-NH 2
CO NH NH 2
R
NH2
R
C
H
C
NH2
H
El C-terminal queda libre y los demás
Aminoacilhidrazida Rn-1
como hidracidas
Aa libre
• Acción de la Tripsina (lado C-Rn=Lys o Arg.
Rn+1≠ Pro)
A-E-F-S-G-I-T-P-K
L-V-G-K
• Acción de Proteasa del Staphylococcus (lado
C- de Glu y Asp en T.F y Glu en T.A o bicarb.)
F-S-G-I-T-P-K
L-V-G-K-A-E
Paso 7
Ejemplo:
7.- Solapamiento o superposición de péptidos
• El correcto solapamiento de los fragmentos
L-V-G-K
A-E-F-S-G-I-T-P-K
L-V-G-K-A-E
F-S-G-I-T-P-K
• Secuencia Correcta (péptido original):
L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K
Leu-Val-Gly-Lys-Ala-Glu-Phe-Ser-Gly-Ile-Thr-Pro-Lys
8
Paso 8
8.- Hidrólisis total
Determinación de la composición en Aminoácidos
• Hidrólisis total con ClH 6M. 100-110ºC/10-100h
• Hidrólisis con NaOH 2M a 4M.100ºC/4-8h
• Enzimática: mezcla de peptidasas para determinar
Trp, Asn y Gln (destruidos por métodos químicos)
LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS SUMINISTRA
VARIOS TIPOS DE INFORMACIÓN
1.- Se pueden comparar secuencias de proteínas para
confirmar semejanzas significativas
Ej: Hb y Mb ( familia de globinas)
Quimotripsina y Tripsina (serin-proteasas)
2.- Información de las vías evolutivas correspondientes.
Ej: seroalbúmina
3.- Repeticiones internas. Ej: calmodulina
LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS SUMINISTRA
VARIOS TIPOS DE INFORMACIÓN
Evolución molecular de las globinas
β-globina
α-globina
4.- Señales que determinan el destino de la proteína y
controlan su maduración. Ej: proteínas de secreción
5.- Preparación de anticuerpos especificos para una
proteína de interés. Ej: anticuerpos
6.- Preparación de sondas especificas de DNA para los
genes que codifican las proteínas correspondientes
Ej: genética molecular
clonaje de DNA
(Garret & Grisham , 1999)
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Comparación de secuencias de citocromo c
Evolución según la secuencia de los citocromos c
Número de aminoácidos variantes
(Garret & Grisham , 1999)
Procedimientos experimentales para averiguar la
conformación de las proteinas
• Dicroismo circular
• Cristalografía de rayos X
• Espectroscopia de resonancia magnética nuclear
(NMR)
•Dicroismo circular
Proteínas
asimétricas
Ópticamente
activas
Carbono
asimétrico
• La actividad óptica se expresa en bandas de absorción
• Hay coeficientes de absorción de luz polarizada
circularmente a derechas o izquierdas
ESPECTROS DE DICROISMO CIRCULAR
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• Experimento de
cristalografía por rayos X
PROTEINA
CRISTALIZADA
Stryer 6ª Ed.2007
• Base de la espectroscopía de RMN
Proteína en
disolución
La radiación de
microondas puede
hacer pasar estos
núcleos de un estado
energético a otro= RMN
Es un tipo de
espectroscopia
Ciertos núcleos atómicos son
intrínsecamente magnéticos →
campos magnéticos (1H;2H; 13C; 15N)
Stryer 6ª Ed.2007
Isótopos: tienen igual número
atómico (número de protones en el
núcleo), pero diferente número
másico (suma del número de
neutrones y número de protones en
el núcleo). Difieren pues en el
número de neutrones.
Stryer 6ª Ed.2007
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Espectro de RMN unidimensional
Fin de Tema 7
Stryer 6ª Ed.2007
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