procedimiento para la produccion de toxina difterica.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
C07K 14/34 (2006.01)
C12P 21/02 (2006.01)
C12N 15/31 (2006.01)
A61P 35/00 (2006.01)
C12R 1/16 (2006.01)
ESPAÑA
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11 Número de publicación: 2 267 499
51 Int. Cl.:
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 00906484 .1
86 Fecha de presentación : 25.02.2000
87 Número de publicación de la solicitud: 1157034
87 Fecha de publicación de la solicitud: 28.11.2001
54 Título: Procedimiento para la producción de toxina diftérica.
30 Prioridad: 26.02.1999 GB 9904582
73 Titular/es: GE Healthcare AS.
Nycoveien 1-2
0401 Oslo, NO
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.03.2007
72 Inventor/es: Wolfe, Henry, Raphael;
Merchant, Fahar;
Merchant, Rosamina;
Black, Christopher, D., V.;
Storflor, Harry;
Stokke, Geir, O. y
Hellebust, Halldis
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto
ES 2 267 499 T3
16.03.2007
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la producción de toxina diftérica.
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La presente invención se refiere a un procedimiento para producir formas mutantes de toxina de difteria, y en
particular a un procedimiento para producir una forma mutante no tóxica de toxina de difteria, por ejemplo una
forma mutante conocida como CRM107, y uno de sus conjugados tóxicos, que pueden utilizarse con propósitos
terapéuticos.
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La toxina de difteria es una toxina proteinácea que es sintetizada y secretada por cepas toxigénicas de Corynebacterium diphtheriae, es decir, cepas que son lisógenas para un bacteriofago que porta el gen de la toxina. Se sintetiza
inicialmente como un polipéptido de 535 aminoácidos, que sufre proteolisis para formar la toxina, que está compuesta
de dos subunidades, denominadas A y B, unidas por un puente disulfuro. La subunidad A es el dominio enzimático.
Ella cataliza la ribosilación del ADP del Factor de Elongación 2, inactivando de esta forma el EF-2. El EF-2 es una
enzima esencial implicada en la síntesis de proteínas, y su inactivación da como resultado el cese de la síntesis de
proteínas y la muerte de una célula eucariota “infectada”. La subunidad A es solo activa intracelularmente, pero como
ella sola es incapaz de unirse a, o de cruzar la membrana de la célula, no es tóxica cuando se aplica extracelularmente.
Es la subunidad B la que es responsable de introducir a la subunidad activa A en el interior de las células; esto lo hace
uniéndose a la superficie de las células por medio de un receptor de la superficie celular, y después facilita el paso de
la subunidad A a través de la membrana celular al interior del citoplasma, donde pueden ejercerse los efectos tóxicos
de la subunidad A.
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La toxina de difteria es altamente citotóxica; una única molécula puede ser letal para una “célula infectada”, y una
dosis tan baja como 10 ng/kg puede matar animales y seres humanos. Existe pues un considerable interés en investigar
las estrategias terapéuticas que utilizan la subunidad tóxica A. La toxina natural, aunque es altamente citotóxica es noespecífica, es decir, atacará cualquier célula que tenga un receptor para la subunidad B.
Se han descrito ciertas formas mutantes de la toxina de difteria que son deficientes en la función de unión a la
célula y/o de traslocación. Éstas incluyen moléculas de toxina que tienen una mutación en la subunidad B, que da
como resultado una reducción en la unión a las células, tales como por ejemplo las formas mutantes CRM9, CRM 45,
CRM102, CRM103 y CRM107, como lo describieron Nicholls y Youle en Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel,
Marcel Dekker, Inc, 1992. Las moléculas de toxina resultantes son esencialmente no tóxicas, ya que la subunidad A es
incapaz de alcanzar su lugar de acción. Estas mutaciones pueden tener un efecto dramático. Así, la CRM107 tiene una
sustitución de aminoácido en la posición 525, donde la serina en la toxina natural ha sido reemplazada por fenilalanina,
dando como resultado una reducción de 1000 veces en la propiedad de unión a la célula, con escaso o ningún efecto
sobre las propiedades de traslocación de la subunidad B. La subunidad A en dichas formas mutantes no está afectada,
y, si puede dirigirse al citoplasma, es tan tóxica como la toxina natural.
Cuando se diseñan fármacos citotóxicos, existe un interés en utilizar estas formas mutantes de toxina de difteria,
para hacer diana sobre poblaciones de células específicas, sin afectar a las células normales, modificando la toxina
mutante, uniéndola de alguna forma a un resto que sea específico para ciertas células o tipos celulares, tales como un
anticuerpo para un receptor específico, o un resto tal como una proteína, por ejemplo transferrina, que tiene un socio
de unión, por ejemplo en forma de un receptor que se expresa solo, o al menos predominantemente, sobre la superficie
de las células que deben eliminarse. De esta forma, es posible mantener las propiedades citotóxicas de la subunidad A
de la toxina de difteria, sin afectar, o solo afectando de forma limitada, a las células normales.
Una de las áreas en las que las formas mutantes modificadas de la toxina de difteria, tales como las CRM107
modificadas pueden utilizarse, es en el tratamiento de determinadas enfermedades cancerosas, y en particular en los
gliomas malignos. El glioma maligno es la neoplasia del SNC más frecuente en adultos. No existe actualmente ninguna
terapia disponible para él, y el pronóstico de los pacientes con gliomas de alto grado, astrocitomas anaplásicos y
glioblastomas multiformes es por lo tanto malo, y la muerte ocurre generalmente durante el primer año después del
diagnóstico. La toxina de difteria mutante CRM107, particularmente en forma de un conjugado dirigido, proporciona
una terapia para enfermedades tales como éstas, y en particular, los conjugados de CRM107 con la proteína de unión a
hierro transferrina. Esto es particularmente adecuado para el tratamiento de tumores, incluyendo neoplasias cerebrales,
porque los receptores para la transferrina se expresan en un nivel elevado sobre la superficie de las células que se
están dividiendo rápidamente, tales como las células del glioma, pero están ausentes sobre la superficie de los tejidos
cerebrales normales. Estos conjugados de toxina de difteria mutante-transferrina pueden dirigirse selectivamente a los
tejidos neoplásicos, en los que la toxina se internaliza, y la subunidad A mata a la célula “infectada”.
Para su uso clínico, se necesitan grandes cantidades de toxina de difteria mutante. Existen sin embargo, problemas
para producir la toxina de difteria de cepas de C. diphtheriae productoras de toxina, y además, se han encontrado
dificultades en aumentar las condiciones de fermentación a escala de laboratorio, para producir cantidades suficientes
de toxina, y en particular formas mutantes de toxina de difteria, para uso terapéutico. Así, hay problemas para obtener
toxina en suficiente rendimiento y pureza, por lo que la producción a gran escala tiende a ser ineficiente. Estas dificultades necesitan ser superadas, para ser capaces de explotar la promesa de los llamados fármacos derivados de toxina
mutante dirigidos.
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Es conocido en la técnica que la producción de toxina de difteria es dependiente de las condiciones bajo las que se
cultiva la cepa productora. En particular, se ha observado que tanto el contenido de hierro del medio como la fuente de
carbono, que son esenciales para el crecimiento bacteriano, tienen un efecto sobre la producción de toxina. Así, se sabe
desde hace tiempo que el hierro en grandes concentraciones tiene un efecto inhibidor sobre la producción de toxina,
en otras palabras, que la producción de toxina está regulada negativamente por el hierro. Así, para la preparación de
toxina, se utiliza un medio de cultivo con baja concentración de hierro, con el hierro generalmente en el intervalo de
50-150 µg/l.
Aunque la glucosa se utiliza habitualmente como fuente de carbono para el crecimiento bacteriano, también se
sabe desde hace algún tiempo que la fermentación de la glucosa por el C. diphtheriae puede afectar a la producción
de toxina de difteria. Así, se sabe que la fermentación de la glucosa por el C. diphtheriae puede producir productos
de fermentación ácidos, incluyendo ácido acético, fórmico y láctico, al menos algunos de los cuales se piensa que
son bacterisotáticos, e incluso posiblemente bactericidas para las bacterias. La fermentación de la glucosa puede por
lo tanto afectar la tasa del crecimiento bacteriano, con los correspondientes efectos sobre la producción de toxina.
También se ha propuesto que los productos de fermentación ácidos pueden tener un efecto sobre la estabilidad de
la toxina. Por esta razón, se han utilizado otras fuentes de carbono tales como maltosa y glicerol, utilizadas como
fuente única de carbono, o como al menos un sustituto parcial de la glucosa, en la técnica del cultivo de cepas de
C. diphtheriae productoras de toxina. Ninguna de estas fuentes de carbono es sin embargo una fuente de energía tan
eficaz como la glucosa.
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Hemos desarrollado un nuevo procedimiento de fermentación, que permite que la toxina de difteria sea producida
por el C. diphtheriae con un rendimiento bueno, utilizando glucosa como fuente de carbono.
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Este método para la producción de toxina de difteria en el que un microorganismo capaz de producir toxina de
difteria se fermenta utilizando glucosa como fuente de carbono, comprende añadir glucosa a un cultivo en crecimiento,
de tal forma que la adición de glucosa mantiene un crecimiento de microorganismo efectivo para apoyar la producción
de toxina de difteria.
Como aquí se utiliza, la expresión “toxina de difteria” se utiliza para referirse a la proteína natural, así como a las
formas mutadas, particularmente para propósitos terapéuticos las formas mutadas de la subunidad B, que tienen una
función de unión reducida o que no la tienen, mientras que retienen al menos un grado de la función de traslocación, y
preferiblemente retienen al menos alguna actividad enzimática de la subunidad A, variantes por ejemplo de proteínas
que tienen sustituciones, adiciones o delecciones de aminoácidos, y sus fragmentos, particularmente fragmentos que
retienen la actividad citotóxica de la subunidad A. El método de la invención puede utilizarse para preparar la toxina
de difteria natural, así como las formas mutantes, tales como las formas mutantes no tóxicas arriba mencionadas, tales
como CRM107.
La toxina de difteria natural puede obtenerse de cepas productoras de toxina, disponibles de una variedad de
fuentes disponibles públicamente, incluyendo la American Type Culture Collection. Las CRM107 pueden obtenerse
de la cepa Corynebacterium diphtheriae monolisógena C7 βtox 107 , que puede obtenerse de los National Institutes of
Health, 6011 Executive Boulevard, Rockville MD20852, EE UU (Dr. Richard Youle). Las formas mutantes de la
toxina, tales como las formas mutantes descritas por Laird et al., J. Virology, 19, 220-227, 1976, y por Nicholls y
Youle en Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Marcel Dekker, Inc, 1992, incluyendo las CRM107, pueden
también prepararse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante los métodos descritos en Laird
et al (arriba), o mediante expresión en C. diphtheriae u otros microorganismos, utilizando las técnicas de la tecnología
de DNA recombinante (Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989), y también mediante mutagénesis dirigida a un lugar, basada en la secuencia de nucleótidos conocida
(Greenfield et al., Proc Nat Acad Sci 50, 6953-7, 1993), del gen estructural natural para la toxina de difteria portado
por el corinebacteriófago β.
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En el método, la glucosa se añade según se requiere a un cultivo en crecimiento, preferiblemente a un cultivo
exponencial, más preferiblemente a un cultivo en fase exponencial tardía, y/o puede añadirse según se requiera a un
cultivo en crecimiento en fase estacionaria, preferiblemente a un cultivo de fermentación en lotes.
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Este método contrasta con la fermentación en lotes convencional, en el que el suplemento inicial de nutrientes
no se renueva, y de este modo el cultivo crece exponencialmente durante solo unas pocas generaciones, hasta que un
nutriente esencial se acaba, y con el cultivo continuo convencional, en el que se añade continuamente medio de cultivo
fresco, a una tasa constante, a la vez que el cultivo es simultáneamente removido, lo que da como resultado periodos
de crecimiento exponencial mucho más largos.
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El método de alimentación en lotes ofrece una ventaja sobre los métodos anteriores que utilizan glucosa como
fuente de carbono para el cultivo de C. diphtheriae y la síntesis de toxina. Así, por ejemplo, Fass et al., Appl. Microbiol.
Biotechnol. 43, 83-88 (1995), describen un procedimiento en dos etapas, en el que la glucosa y el hierro se eliminan
simultáneamente al final de la fase de crecimiento exponencial, y la toxina se produce de esta forma solamente cuando
el cultivo entra en la fase estacionaria. En contraste, la adición controlada de glucosa permite que la toxina se produzca
durante la fase exponencial tardía, así como durante la fase estacionaria, prolongando las fases exponencial tardía y
estacionaria temprana, y como resultado permite que la toxina se produzca y se acumule durante un tiempo mayor,
incrementado así la capacidad de producción acumulada de toxina de un cultivo.
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El método puede utilizarse para producir toxina de difteria tanto de su productor natural, C. diphtheriae, y también
de otros hospedantes microbianos, tales como bacterias, por ejemplo E. coli transformadas con genes de toxina o genes
modificados de toxina.
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El método de fermentación de alimentación en lotes es particularmente aplicable para la producción de toxina de
difteria por cepas productoras de toxina de C. diphtheriae, por el efecto inhibidor que pueden tener ciertos nutrientes
o sus metabolitos sobre la producción de toxina, si su concentración no se controla cuidadosamente. El método de
alimentación en lotes de la invención permite así que se mantenga un nivel bajo de glucosa en el medio, mientras
al mismo tiempo se proporciona la necesaria fuente de carbono requerida para el crecimiento. Así, monitorizando
cuidadosamente los niveles de glucosa y/o el pH del cultivo de fermentación, los niveles de glucosa pueden controlarse
para alcanzar un balance entre, por un lado proporcionar una fuente de carbono suficiente y eficiente para apoyar el
crecimiento bacteriano y la producción de toxina, y por otro lado limitar la generación de productos secundarios
inhibidores de la fermentación, que pueden tener un efecto perjudicial sobre la producción de toxina. Mediante la
adición de glucosa al medio de fermentación según se requiera durante la fermentación, el pH puede controlarse
utilizando los ácidos orgánicos producidos a partir del metabolismo de la glucosa, sin la complicación adicional de
añadir ácido inorgánico exógeno, mientras que se permite que se produzca la toxina tanto durante la fase de crecimiento
exponencial como durante la de crecimiento estacionario. De esta forma, la glucosa puede utilizarse tanto como fuente
de ácido como de fuente de carbono para aumentar la densidad celular.
En el método, el crecimiento se inicia en un medio basado en glucosa, que contiene niveles convencionales de
glucosa, por ejemplo en el intervalo de 0,8 a 2,5%, tal como alrededor de 1,5% de glucosa. La mejoría sobre los
métodos anteriores, es que la glucosa se añade al medio de cultivo durante la fermentación, comenzando durante la
fase de crecimiento exponencial, o durante la fase estacionaria, a los tiempos a los que es requerida, para mantener el
pH dentro del intervalo óptimo para el crecimiento de los microorganismos y la producción de toxina, preferiblemente
desde 7,0 hasta 7,5, preferiblemente desde 7,1 hasta 7,3, por ejemplo alrededor de 7,2. Como se ha mencionado antes,
ciertas sustancias ácidas son productos secundarios del metabolismo de la glucosa, y estos ácidos ayudan a controlar
el pH del medio de fermentación.
Si es necesario, el pH puede controlarse adicionalmente mediante la adición de ácido o base, según sea apropiado
para mantener el pH del cultivo a un nivel apropiado para la producción de toxina, por ejemplo alrededor de un pH de
7,2 ± 0,2.
Así, hemos descubierto que controlando la concentración de glucosa dentro del cultivo de fermentación, mediante
la adición periódica para mantener el pH dentro del intervalo mencionado antes, es posible maximizar el crecimiento
celular y la producción de toxina, minimizando la degradación de la toxina debida a las fluctuaciones del pH. Así,
hemos observado que cuando las células C. diphtheriae entran en una fase de crecimiento logarítmico, el pH y la
concentración de glucosa disminuyen. También hemos descubierto que la pureza de la toxina disminuye según disminuye el pH del medio. Sin el deseo de aferrarse a la teoría, se cree que esto podría ser debido a la rotura proteolítica.
También se ha observado que la pureza de la toxina disminuye según progresa la fermentación a un pH por debajo de
alrededor de 7,0, y también a un pH por encima de 8,0. Es por esta razón que los niveles de glucosa (y los niveles de
pH determinados por ellos), deben deseablemente mantenerse dentro de este intervalo.
El progreso de la fermentación puede monitorizarse midiendo diversos parámetros indicativos de crecimiento bacteriano y producción de toxina, bien en muestras recogidas asépticamente de los vasos de cultivo, o mediante la
medición directa en el medio de fermentación. Por ejemplo, el pH puede monitorizarse dentro del medio de fermentación mediante una sonda de pH. La glucosa puede monitorizarse mediante una variedad de métodos conocidos en
la técnica, directa o indirectamente, por ejemplo los métodos descritos en Clinical Diagnosis and Management by
Laboratory Methods, 18 Edn, John Bernard Henry, Editor, WB Saunders Company, Filadelfia, 1991. Ejemplos de mediciones directas incluyen análisis de azúcar, por ejemplo los basados en reacciones químicas tales como por ejemplo
reacciones enzimáticas, por ejemplo reacciones basadas en la utilización de glucosa oxidasa, tal como las reacciones colorimétricas. Los ejemplos incluyen mediciones mediante dipsticks, por ejemplo el Glucose Chemtrip BG de
Boehringer Mannheim, y la utilización de un monitor de glucosa en línea. Como el pH ha demostrado disminuir en
proporción al consumo de glucosa, la glucosa también puede monitorizarse indirectamente, monitorizando el pH del
medio de cultivo. La producción de toxina puede monitorizarse mediante una diversidad de formas conocidas, tales
como, por ejemplo, SDS PAGE (Laemmli, Nature 227, 680-684, 1970), ELISA (Nielsen et al., Journal of Clinical Microbiology, 25, 1280-1284, 1987) o un ensayo de ribosilación de ADP (Blanke et al., Biochemistry 33, 5155 (1994)), o
mediante una combinación de estos métodos. Generalmente, la adición de glucosa comenzará cuando el nivel de glucosa en el medio disminuye hasta niveles tales como éste, pero mediante la adición de glucosa para generar productos
secundarios ácidos, sería necesario añadir ácido para controlar el pH del medio de fermentación. Generalmente, puede
añadirse glucosa adicional cuando el nivel de glucosa en el medio de fermentación disminuye por debajo de alrededor
de 10 g/l, preferiblemente por debajo de 2 g/l, y más particularmente por debajo de alrededor de 1 g/l. A este nivel, la
fase de crecimiento exponencial del cultivo se extiende y el pH del medio disminuye por el aumento del metabolismo
de la glucosa. De esta forma, la alimentación con glucosa puede utilizarse para controlar el pH y estabilizar la toxina,
así como para mantener el crecimiento del cultivo para obtener una densidad celular elevada.
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Hemos encontrado así que con el método de fermentación en lotes con alimentación con glucosa, en un medio de
cultivo que contiene 10-15 g/l de glucosa, la fase exponencial del crecimiento bacteriano comienza generalmente 5
horas después del inicio de la fermentación, y la producción de toxina se inicia aproximadamente antes de 9 horas
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después del inicio de la fermentación. Con la adición periódica de glucosa, que comienza aproximadamente 8 horas
después del inicio de la fermentación, tal como alrededor de 9 horas después, por ejemplo, cuando el cultivo está en
el último 25% de aumento en el valor OD de la curva de crecimiento, hemos sido capaces de conseguir producción de
toxina durante al menos 13,5 horas. En dicho método de alimentación en lotes, puede consumirse glucosa adicional
en el intervalo de 7 g/l a 15 g/l.
Mediante el método de alimentación con glucosa con alimentación en lotes, hemos sido capaces de conseguir una
densidad celular en el intervalo de 45-60 (OD a 590 nm), y una producción de toxina en el intervalo de 145-165 mg/ml
de cultivo.
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Además de una fuente de carbono, hay otros requerimientos nutricionales mínimos para el crecimiento del C.
diphtheriae. Estos incluyen trazas de metales, fosfato y una fuente de nitrógeno. Generalmente los casaminoácidos y
el extracto de levadura se incluyen en el medio de crecimiento bacteriano, para proporcionar una fuente de nitrógeno
y aminoácidos. Un medio de cultivo para C. diphtheriae, tal como el medio CY (Fass et al., Applied Microbiol
Biotechnol 43, 83-88 (1995)), generalmente contiene al menos un 2% de extracto de levadura. Hemos observado,
sin embargo, que aumentando la relación de carbono a nitrógeno, reduciendo la cantidad de extracto de levadura por
debajo de este nivel convencional, hasta entre 0,5-1,5%, tal como entre 0,75% y 1%, por ejemplo alrededor del 1%
de extracto de levadura, mejora el método de fermentación con alimentación en lotes de acuerdo con la invención.
Así, hemos encontrado que reducir la cantidad convencional de extracto de levadura da como resultado un aumento
significativo en el rendimiento de la toxina. También hemos encontrado que puede conseguirse un aumento en el
rendimiento, utilizando cistina en vez de cisteína, que puede utilizarse en el medio de cultivo bacteriano. Así, se ha
observado un aumento de 5 veces en el rendimiento de CRM107, cuando se utiliza extracto de levadura al 1%, y
utilizando un medio que contiene 0,7 g/l de cistina, comparado con extracto de levadura al 2% en un medio que
contiene 0,26 g/l de cisteína, en 10 litros de fermentación, de acuerdo con la invención.
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Según esto, la utilización de un medio de cultivo que no contiene más del 1% de extracto de levadura, es un aspecto
preferido del método.
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Hemos encontrado que la reducción del extracto de levadura en las condiciones de fermentación también tiene
otros beneficios, además de aumentar el rendimiento de la toxina en la producción de toxina de difteria. Así, como
será descrito con más detalle a continuación, la reducción en el contenido de extracto de levadura del medio de cultivo
tiene beneficios adicionales en la purificación de la toxina.
La presente invención también se refiere a un método para purificar la toxina de difteria de un sobrenadante del
cultivo de una cepa bacteriana productora de toxina.
La toxina de difteria se secreta en grandes cantidades de las bacterias que la sintetizan, tales como las corinebacterias; puede alcanzar hasta el 70% de la proteína total en el medio de cultivo. Este nivel es suficientemente alto para
cultivos pequeños, a escala de laboratorio, en el que una precipitación sencilla, por ejemplo utilizando sulfato amónico
de ácido tricloroacético del medio de cultivo puede ser efectiva por si sola para purificar la toxina. Sin embargo, se
encuentran dificultades cuando se utilizan cultivos a gran escala. Las etapas de precipitación consumen mucho tiempo, y debido a las dificultades en el manejo y la diálisis de volúmenes tan grandes de material, hay una pérdida en el
producto de la toxina. Hemos desarrollado un método de purificación que es capaz de manejar grandes volúmenes de
material y que supera estas dificultades.
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Así, visto desde otro aspecto más, la presente invención proporciona un método de purificar la toxina de difteria de
un cultivo de microorganismos productores de toxina, comprendiendo dicho método poner en contacto una preparación
que contiene toxina con una matriz de intercambio iónico, eluír una fracción que contiene la toxina, aplicar el eluído
a una matriz hidrófoba, y eluír una fracción que contiene la toxina.
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El material de inicio para la purificación puede ser, por ejemplo, un sobrenadante que contiene toxina, una fracción
celular que contiene toxina, o una preparación derivada de un sobrenadante de cultivo que contiene toxina, por ejemplo
un sobrenadante concentrado, o un sobrenadante diafiltrado.
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En los métodos de purificación de toxina conocidos en la técnica, la etapa de intercambio iónico se realiza después
de la etapa cromatográfica de interacción hidrófoba, porque la técnica ha enseñado que el sobrenadante de cultivo no
puede aplicarse directamente a una matriz de intercambio iónico, tal como la DEAE celulosa. Dichas matrices son
capaces de unirse a proteínas solo bajo condiciones de baja fuerza iónica, y se ha pensado que la fuerza iónica del
medio de cultivo sería demasiado elevada para conseguir una unión eficiente (Rappuoli et al., J Chromatography, 268,
543-548, 1983).
Nosotros hemos encontrado, sin embargo, que contrariamente a esta percepción de la técnica, es posible aplicar el
sobrenadante del cultivo sobre una matriz de intercambio iónico, tal como la DEAE inmovilizada. Preferiblemente,
porque la toxina se une generalmente a un medio de intercambio iónico a baja fuerza iónica, el sobrenadante del
cultivo se diafiltra antes de aplicarlo a la columna. Esto ha permitido que las dos etapas de separación cromatográfica
se realicen en la secuencia de cromatografía de intercambio iónico (IEC), antes de la cromatografía de interacción
hidrófoba (HIC). Además, la diafiltración puede servir como una etapa de purificación.
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Así, visto desde otro aspecto, la presente invención proporciona un método de purificar la toxina de difteria de un
cultivo de microorganismos productores de toxina, comprendiendo dicho método etapas cromatográficas de cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de interacción hidrófoba, caracterizado porque dicho método comprende
llevar a cabo una cromatografía de intercambio iónico antes que una cromatografía de interacción hidrófoba.
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Hemos encontrado que este método de purificación según la invención, da como resultado un rendimiento de
toxina más elevado, comparado con procedimientos convencionales, sin sacrificio para su pureza (es decir, sin niveles
significativos de proteínas contaminantes). Así, hemos encontrado que llevando a cabo una etapa de IEC antes que la
de HIC, puede conseguirse una pureza de alrededor del 98%:
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Preferiblemente, el material de inicio es un sobrenadante de cultivo, por ejemplo un sobrenadante de cultivo de un
cultivo que se ha fermentado utilizando glucosa como fuente de carbono, de acuerdo con la invención. Como se ha
mencionado previamente, la utilización de cantidades menores de extracto de levadura que las convencionales, al menos en los medios de cultivo con glucosa, por ejemplo alrededor del 1%, tiene ventajas adicionales además de mejorar
el rendimiento. Así, hemos observado que el extracto de levadura contribuye a la pigmentación del medio de cultivo,
contribuyendo a los contaminantes, que pueden hacer el proceso de purificación posterior menos efectivo. Según esto,
la capacidad de reducir los niveles de contaminantes al comienzo, representa una ventaja para la purificación posterior. Los medios de cultivo con menor contenido en extracto de levadura están menos pigmentados, y por lo tanto son
ventajosos.
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Así, visto desde otro aspecto más, la presente invención proporciona un método de purificación de toxina de difteria
que comprende:
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(1) fermentar una cepa de un microorganismo capaz de producir toxina de difteria utilizando glucosa como fuente
de carbono, comprendiendo dicho método añadir glucosa a un cultivo en crecimiento, en la que la adición de glucosa
mantiene el crecimiento del microorganismo efectivo para apoyar la producción de toxina de difteria; y
(2) purificar la toxina de difteria de un cultivo, poniendo en contacto una preparación derivada del mismo que
contiene la toxina, con una matriz de intercambio iónico, eluir una fracción que contiene la toxina, aplicar el eluato a
una matriz hidrófoba, y eluir una fracción que contiene la toxina.
Preferiblemente, el microorganismo es una bacteria, tal como C. diphtheriae. En el caso de la C. diphtheriae, en
la que la toxina es secretada en el sobrenadante del cultivo, el método puede llevarse a cabo directamente sobre el sobrenadante del cultivo, o sobre una preparación derivada del mismo, tal como por ejemplo un sobrenadante de cultivo
diafiltrado. Así, una etapa preliminar puede incluir una clarificación primaria del medio de cultivo, para obtener un sobrenadante de cultivo que contenga toxina. Así, las bacterias pueden separarse del medio de cultivo mediante métodos
conocidos en la técnica, tal como centrifugación o filtración, por ejemplo, ultrafiltración, y el sobrenadante resultante,
diafiltrarse, o aplicarse directamente a la primera matriz, la matriz de intercambio iónico. En el caso de expresión en
otros microorganismos, tales como E. coli modificada genéticamente con toxina, la toxina puede encontrarse intracelularmente, por ejemplo en el periplasma o el citoplasma. En tales casos, las etapas primeras de recuperación pueden
depender de la localización celular. La toxina puede extraerse de las células por métodos conocidos en la técnica, por
ejemplo, como los descritos por Skopes en Protein Purification, Principles and Practice, 3rd ed., Pub: Springer Verlag,
seguido por purificación según el método de la invención.
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La filtración para clarificar el medio de fermentación puede efectuarse por métodos conocidos en la técnica, por
ejemplo, con membranas tales como membranas de fibra hueca o enrolladas en espiral, tales como los filtros de 0,1
ó 0,2 µm, por ejemplo un filtro de fibra hueca, tal como el disponible de A/G Technology, o una membrana de fibra
hueca o enrollada en espiral de 0,4 ó 0,65 µm, o un filtro de 300 K o de 500 K.
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Para la facilidad del manejo, particularmente cuando se trata de volúmenes grandes, tal como podría ser el caso
de purificación a escala “industrial” para propósitos farmacéuticos, puede efectuarse un grado de concentración del
sobrenadante previo a la etapa de intercambio iónico. El sobrenadante del cultivo libre de células puede concentrarse,
generalmente entre 5 y 50 veces, preferiblemente entre 15 y 25 veces, tal como 20 veces, utilizando métodos de
concentración de proteínas conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante ultrafiltración con un material poroso, por
ejemplo en forma de filtros, membranas o fibras huecas. Para la facilidad del manejo, se prefieren los filtros. Para la
ultrafiltración/concentración, se prefieren filtros que tienen un corte de peso molecular más pequeño, preferiblemente
20% más pequeño que la toxina, preferiblemente los filtros de 30 K (es decir, filtros que tienen un corte de 30000 dalton
de peso molecular). Los materiales adecuados para dichos filtros son conocidos en la técnica, e incluyen materiales
poliméricos tales como celulosa mezclada, poliéter-sulfona o PVDF, por ejemplo polisacáridos tales como celulosa, y
polisulfonas. Los materiales preferidos son aquellos que tienen menor capacidad o habilidad para absorber proteína.
Los filtros de celulosa son particularmente preferidos, por ejemplo los filtros hechos de celulosa regenerada, tales
como los filtros basados en “YM”, y otras membranas que tienen poca capacidad de unirse a proteínas, por ejemplo
los bioconcentradores de flujo tangencial de placa plana producidos por Amicon. La utilización de filtros de celulosa
para ultrafiltración, constituyen así un aspecto preferido del método de purificación según la invención.
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La IEC puede llevarse a cabo directamente en el sobrenadante del cultivo, utilizando un volumen de lecho de
tamaño adecuado, lo que puede determinarse por un experto en la técnica. Opcionalmente, el sobrenadante clarificado
concentrado puede tratarse más antes de la purificación cromatográfica, por ejemplo mediante diafiltración. De esta
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forma, la fuerza iónica puede reducirse, mediante la eliminación de sales y otros iones más pequeños que el peso
molecular de corte de la membrana de diafiltración. La reducción en la fuerza iónica tiene beneficios para la realización
de la etapa de intercambio iónico, ya que a una fuerza iónica reducida, se retiene menos toxina en la matriz de
intercambio iónico, y así mejora el rendimiento. Además, se consigue una purificación parcial mediante la membrana
de diafiltración. La diafiltración puede por lo tanto llevarse a cabo contra una solución de tampón de baja fuerza
iónica, por ejemplo Tris, Tricine, MES, Bis-Tris, TES, MOPS y fosfato, en una concentración de desde alrededor de
0,1 mM hasta alrededor de 100 mM, preferiblemente desde alrededor de 10 hasta alrededor de 50 mM, por ejemplo
10 mM, teniendo un pH de desde alrededor de 5 hasta alrededor de 8, preferiblemente de desde alrededor de 6 hasta
alrededor de 8, por ejemplo alrededor de 7,4 hasta 7,6, utilizando por ejemplo una membrana de corte de 30000, lo que
dará como resultado la eliminación de las sales, los componentes del medio de bajo peso molecular, y las proteínas
secretadas con menos de 30000 de peso molecular. Tales componentes pueden por otro lado unirse a la matriz de
intercambio iónico y reducir su capacidad de unirse a la toxina.
La diafiltración puede llevarse a cabo por ejemplo utilizando materiales del tipo de los utilizados para la etapa de
ultrafiltración, contra soluciones de tampón tales como soluciones de tampón de baja fuerza iónica tales como Tris,
Tricine, MES, Bis-Tris, TES, MOPS o fosfato, en una concentración de desde alrededor de 0,1 mM hasta alrededor de
100 mM, preferiblemente desde alrededor de 10 hasta alrededor de 50 mM, por ejemplo 10 mM, teniendo un pH de
desde alrededor de 5 hasta alrededor de 8, preferiblemente desde alrededor de 6 hasta alrededor de 8, por ejemplo desde
alrededor de 7,4 a 7,6, por ejemplo fosfato potásico 10 mM, pH 7,6, para reducir la conductividad del sobrenadante
del cultivo concentrado hasta tan bajo como sea posible, preferiblemente por debajo de 5 mS/cm.
El tratamiento del sobrenadante de cultivo de esta forma antes de la IEC, supera así los problemas del método de
la técnica anterior, que requiere que la HIC tenga que tener lugar antes de la IEC. La combinación de diafiltración y
ultrafiltración no solo reduce la fuerza iónica, sino que sirve como una purificación inicial y permite que el volumen se
reduzca. Esto significa que pueden utilizarse columnas más pequeñas, reduciendo de esta forma el tiempo requerido
para que las etapas de cromatografía se lleven a cabo.
30
Una ventaja más es que la purificación de la toxina según el método de la invención, es más rápido globalmente
que el método convencional, limitando así el tiempo durante el que la toxina se expone a temperatura ambiente, y es
vulnerable a la degradación.
35
Las etapas cromatográficas pueden llevarse a cabo utilizando matrices de intercambio iónico o hidrófobas, según
sean apropiadas, en forma de lote o de columna, siendo preferida la última, tanto por velocidad como por conveniencia.
La matriz puede ser un soporte convencional como los conocidos en la técnica, por ejemplo soportes inertes basados
en celulosa, poliestireno, acrilamida, sílice, fluorocarbonos, dextrano entrecruzado o agarosa entrecruzada.
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Cualquier resina de intercambio iónico convencional puede utilizarse. Ejemplos incluyen Q sefarosa y dietilaminoetilo (DEAE) y resinas de amino cuaternario. El material de intercambio aniónico puede empaquetarse en una
columna, cuyo tamaño dependerá del volumen de sobrenadante de cultivo que va a utilizarse. El tamaño apropiado de
la columna puede determinarse por los expertos en la técnica según la proteína total en el medio concentrado. Generalmente, para cultivos a gran escala, del orden de 40-50 litros, pueden aplicarse 2 litros de sobrenadante concentrado
a columnas de 1,25 l de volumen. La columna puede equilibrarse primero con una solución de tampón, por ejemplo
con una solución de tampón de baja fuerza iónica tal como Tris, Tricine, MES, Bis-Tris, TES, MOPS o fosfato, en una
concentración de desde alrededor de 0,1 mM hasta alrededor de 100 mM, preferiblemente de desde 10 hasta alrededor
de 50 mM, por ejemplo 10 mM, teniendo un pH de desde alrededor de 5 hasta alrededor de 8, preferiblemente desde
alrededor de 6 hasta alrededor de 8, por ejemplo alrededor de 7,4 a 7,6, por ejemplo la solución de tampón utilizada
para diafiltrar el sobrenadante concentrado, tal como fosfato potásico 10 mM, pH 7,6. El sobrenadante de cultivo o
el concentrado pueden entonces cargarse, la columna lavarse con una solución de tampón de baja fuerza iónica y el
mismo pH que el de la solución de tampón de equilibrio, para eliminar cualquier proteína no unida, por ejemplo la
solución de tampón de equilibrio.
La toxina unida puede entonces eluirse de diferentes formas. Estas incluyen alterar el pH o aumentar la fuerza
iónica de la solución de tampón. Así, la toxina puede eluirse mediante un aumento del gradiente de la solución de
tampón con alta fuerza iónica, tal como Tris, Tricine, MES, Bis-Tris, TES, MOPS o fosfato, en una concentración de
desde alrededor de 10 mM hasta alrededor de 1,0 M, preferiblemente desde alrededor de 10 mM hasta alrededor de 500
mM, que contenga sales como NaCl, KCl o sulfato amónico, a una concentración de desde alrededor de 0,1 M hasta
1,0 M. Estas soluciones de tampón pueden tener un pH de desde alrededor de 5 hasta alrededor de 8, preferiblemente
desde alrededor de 6 hasta alrededor de 8, por ejemplo alrededor de 7,0 a 7,6. Un ejemplo de una solución de tampón
preferida es fosfato potásico 10 mM, que contiene KCl 500 mM a pH 7,6. La proteína se eluirá entre 100 y 150 mM
de KCl en la solución de tampón.
El eluato que contiene la toxina puede entonces aplicarse a la matriz hidrófoba. Opcionalmente, pero preferiblemente, la fuerza iónica del eluato puede aumentarse antes de la segunda etapa de interacción hidrófoba, mezclándolo
con una solución de tampón de fuerza iónica apropiada o mediante diafiltración. Esto puede facilitar la unión de la
toxina a la resina hidrófoba. Así el eluato puede mezclarse con una solución de tampón de alta fuerza iónica, por
ejemplo Tris, Tricine, MES, Bis-Tris, TES, MOPS o fosfato, en una concentración de desde alrededor de 10 mM hasta
alrededor de 1,0 M, preferiblemente desde alrededor de 10 mM hasta alrededor de 500 mM, que contiene sales como
NaCl, KCl o sulfato amónico a una concentración de desde alrededor de 0,1 M hasta 1 M. Las soluciones de tampón
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pueden tener un pH de desde alrededor de 5 hasta alrededor de 8, preferiblemente desde alrededor de 6 hasta alrededor
de 8, por ejemplo alrededor de 7,0 a 7,6. Un ejemplo de una solución de tampón es solución de tampón de fosfato
potásico 10 mM que contiene 500 mM de sulfato amónico con un pH de 7,0. La diafiltración puede llevarse a cabo
utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando membranas de ultrafiltración, tales como filtros
de fibra hueca de 30 K o 10 K de punto de corte, disponibles de A/G Technology, o filtros enrollados en espiral de
Amicon, o Ultrasette (Omega) (Pall Filtron), y utilizando soluciones de tampón tales como los Tris, fosfato, acetato o
HEPES mencionados anteriormente.
Las matrices hidrófobas son conocidas en la técnica. Estas incluyen los soportes mencionados previamente que
contienen restos hidrófobos tales como alquilo, por ejemplo grupos butilo, hexilo, octilo, acetilo o fenilo, por ejemplo
alquil-agarosa, tal como decil-agarosa.
El material de la matriz hidrófoba puede empaquetarse en una columna, cuyo tamaño dependerá del volumen del
sobrenadante de cultivo que va a utilizarse. El tamaño de columna apropiado puede determinarse por los expertos en
la técnica. Generalmente, para cultivos a gran escala, del orden de 40-50 litros, el eluato de la etapa de IEC estará
generalmente en un volumen de 1 l a 2 l, y se aplicará a columnas cuyo tamaño se determinará por los expertos en
la técnica, según la cantidad de proteínas, pero podrá estar en el orden de 250 ml para una concentración de proteína
de hasta 100 mg/ml. La columna puede primero equilibrarse con una solución de tampón de alta fuerza iónica, por
ejemplo Tris, Tricine, MES, Bis-Tris, TES, MOPS o fosfato, en una concentración de desde alrededor de 10 mM hasta
alrededor de 1, 0 M, preferiblemente desde alrededor de 10 mM hasta alrededor de 500 mM, que contiene sales como
NaCl, KCl o sulfato amónico a una concentración de alrededor de 0,1 M a 1,0 M, que tiene un pH de desde alrededor
de 5 hasta alrededor de 8, preferiblemente desde alrededor de 6 hasta alrededor de 8, por ejemplo alrededor de 7,6, por
ejemplo la solución de tampón utilizada para diafiltrar el sobrenadante concentrado, o la solución de tampón mezclada
con el eluato, tal como por ejemplo fosfato potásico 50 mM con sulfato amónico 1 M, pH 7,0. El eluato de la IEC,
o el eluato mezclado con la solución de tampón de alta fuerza iónica, por ejemplo Tris, Tricine, MES, Bis-Tris, TES,
MOPS o fosfato, en una concentración de desde alrededor de 10 mM hasta alrededor de 1,0 M, preferiblemente de
desde alrededor de 10 mM hasta alrededor de 500 mM, que contiene sales como NaCl, KCl o sulfato amónico a
una concentración de alrededor de 0,1 M a 1,0 M, que tiene un pH de desde alrededor de 5 hasta alrededor de 8,
preferiblemente desde alrededor de 6 hasta alrededor de 8, por ejemplo alrededor de 7,6, tal como por ejemplo la
solución de tampón de equilibrio de la columna, para eliminar cualquier proteína no unida.
La toxina unida puede entonces eluirse de diferentes formas, por ejemplo mediante un aumento de gradiente de
un solvente polar en la solución de tampón de lavado, o mediante un aumento de gradiente de una solución de tampón de baja fuerza iónica, por ejemplo Tris, Tricine, MES, Bis-Tris, TES, MOPS o fosfato, en una concentración
de desde alrededor de 10 mM hasta alrededor de 1,0 M, preferiblemente de desde alrededor de 10 mM hasta alrededor de 500 mM, que contiene sales como NaCl, KCl o sulfato amónico a una concentración de desde alrededor
de 0,1 M hasta 1,0 M, que tiene un pH de desde alrededor de 5 hasta alrededor de 8, preferiblemente de desde alrededor de 6 hasta alrededor de 8, por ejemplo alrededor de 7,6, por ejemplo solución de tampón de fosfato 50 mM
que contiene sulfato amónico 1 M pH 7,0, a solución de tampón de fosfato 50 mM pH 7,0 sin sulfato amónico. La
toxina puede eluírse en dicho gradiente, cuando la concentración de sulfato amónico se reduce a aproximadamente
700 mM.
Utilizando el método de la invención, hemos sido capaces de purificar la toxina de difteria mutante CRM107, a
partir de grandes volúmenes de sobrenadante de cultivo, del orden de 50 litros, con un rendimiento medio del 32%
del material de inicio, y de una pureza mayor del 98%, medida por HPSEC (cromatografía de exclusión de tamaño de
alta resolución). Esto, por primera vez permite que las propiedades de las formas mutantes de toxina de difteria, tales
como la de unión de la forma mutante CRM107, sean explotadas para preparar productos terapéuticos.
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Cuando la toxina purificada es una toxina mutante, que se va a utilizar para preparar agentes terapéuticos derivados
de la toxina diana, la toxina puede ser eluida convenientemente con una solución de tampón adecuado, para llevar a
cabo la conjugación o la unión de la toxina con una célula específica de unión o con un resto diana, por ejemplo un
resto de reconocimiento celular, tal como un anticuerpo a un resto de superficie celular o uno de sus fragmentos de
unión a antígeno, o una proteína que tiene un socio de unión sobre la superficie de la célula, por ejemplo en forma
de receptor, teniendo dichos receptores algún grado de selectividad, es decir, estando presentes en algunos pero no en
todos los tipos celulares.
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Como aquí se utilizan, “específico de célula” o “selectivo de célula” se refieren a un resto que es diana o tiene una
afinidad de unión por un resto de superficie celular que no está presente en todas las células, y que de esta forma es
selectivo para ciertas células o grupos o tipos de células o receptores específicos. En otras palabras, abarca un resto
que permite a una toxina de difteria o a una toxina mutante, conjugarse con él para que sea una diana selectiva.
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Un proceso para preparar un conjugado de toxina de difteria comprende unir la toxina de difteria producida por el
método de la invención, con un resto de unión diana o de unión específica de célula.
65
Ejemplos de restos específicos de célula incluyen anticuerpos a restos expuestos sobre la superficie de células particulares, y proteínas tales como factores de crecimiento o transferrina, cuyos socios de unión en forma de receptores
se expresan solamente sobre tipos particulares de células, o predominantemente solo sobre tipos de células específicos.
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La conjugación puede efectuarse por métodos conocidos en la técnica, tales como entrecruzamiento químico o
formación de uniones covalentes. Preferiblemente, la conjugación se hace por medio de formación de puentes covalentes, por ejemplo entre grupos maleimido introducidas en un componente del conjugado, y grupos tiol introducidos
en el otro. En dicho método, uno de los dos componentes se modifica mediante la introducción de grupos maleimido
y el otro se modifica mediante la introducción de grupos tiol. Preferiblemente, la toxina de difteria o la forma mutante
se modifican mediante grupos maleimido, y el resto diana específico de célula, mediante grupos tiol. Preferiblemente
para la preparación de agentes anticancerosos tales como los utilizados para el tratamiento de los gliomas malignos, el
resto selectivo de célula es transferrina, ya que los receptores de transferrina se expresan en cantidad en células que se
dividen rápidamente, tales como las células del glioma, pero estén esencialmente ausentes en otras células del CNS.
En dichos conjugados, generalmente el elemento toxina de difteria se modifica con maleimido y el elemento transferrina con grupos tiol. Sin embargo, el elemento toxina de difteria puede modificarse con grupos tiol y el elemento
transferrina con maleimido.
Pueden utilizarse agentes modificadores convencionales conocidos en la técnica. Ejemplos incluyen compuestos
esterificadores, compuestos activadores tiol y agentes modificadores carboxilo, tales como el N-etil-maleimido y el éster de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimidilo (MBS) y el 2-iminotiolano. En una conjugación típica, el MBS puede
añadirse a la toxina de difteria en una razón de desde 1 hasta 100 veces de exceso molar, tal como 2 a 5, preferiblemente
3,5 veces, incubarse a una temperatura entre 2 y 50ºC, por ejemplo entre 15 y 20ºC, tal como a temperatura ambiente,
durante entre 5 minutos y 24 horas, tal como entre 20 y 40 minutos, tal como 30 minutos, seguido de eliminación
del exceso de reactivos, mediante técnicas conocidas en la técnica tales como filtración en gel, por ejemplo utilizando
el desalador Sephadex G-25. El eluato puede enfriarse después, antes de la reacción de conjugación. Los intermedios
crudos pueden eliminarse antes de la conjugación mediante métodos conocidos en la técnica, tales como precipitación,
diálisis, cromatografía, extracción. La transferrina puede ser tiolada mediante incubación con 2-iminotiolano en una
razón de 1 a 100 veces de exceso molar, tal como 5 a 10 veces de exceso molar, preferiblemente 7 a 8 veces, tal como
7,7 veces, a una temperatura de 2 a 50ºC, por ejemplo 35-40ºC, durante entre 5 minutos y 24 horas, tal como entre
20 y 40 minutos, tal como 30 minutos, seguido de eliminación del exceso de reactivo mediante técnicas conocidas en
la técnica tal como filtración en gel. Para la conjugación, los dos reactivos funcionalizados pueden mezclarse en una
razón de 1 a 2, preferiblemente a una temperatura de 2 a 8ºC durante 4 a 24 horas, preferiblemente 12 a 20 horas, por
ejemplo 18 horas.
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Un método para el tratamiento de una neoplasia del CNS comprende administrar a un sujeto un conjugado de
toxina de difteria producido por el método aquí descrito.
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Un conjugado de toxina de difteria producido por el método aquí descrito puede utilizarse en la fabricación de un
medicamento para utilizar en el tratamiento de las neoplasias del CNS.
La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
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Comparación de crecimiento en lotes y de alimentación en lotes
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Este estudio se llevó a cabo en un fermentador de 10 litros. Se investigaron tres fermentaciones en lotes, utilizando
glucosa al 0,8%/maltosa al 2,4% (A), glucosa al 2,4% (B) y glucosa al 1,5%/maltosa al 2,4% (C). Se investigaron tres
procesos de alimentación en lotes, utilizando glucosa al 1,5% como concentración inicial, con una alimentación de
glucosa, en medio que contiene extracto de levadura al 2% y 0,2 g/l de cisteína (D) y extracto de levadura al 1% y 0,7
g/l de cistina (E).
Métodos
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Preparación de los medios
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La composición de los cinco medios analizados se muestra en la Tabla 1, mostrando variaciones en el tipo y
la cantidad de fuente de carbono, la cantidad de extracto de levadura y la sustitución de cisteína por cistina. Los
medios estaban basados en el medio NIH (que contiene 20 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de casaminoácidos, 5
g/l de KH2 PO4 , 15 g/l de glucosa, 0,7 g/l de cistina, 0,1 g/l de triptófano, 1,5 mg/l de beta alanina, 1,5 mg/l de ácido
nicotínico, 0,075 mg/l de ácido pimélico, 0,03 ml de HCl 10 mM, y 10 ml/l de solución de suplementos de metales a
pH 7,4).
Cepas
Todos los ejemplos fueron llevados a cabo utilizando Corynebacterium diphtheriae (β tox’) que produce CRM107
Phe390 Phe525 , como describen Greenfield et al., Science 238, 536-539, 1987.
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Preparación del inóculo
El inóculo para (A) se cultivó en 100 ml de medio LICY (Mueller et al., J Immunol 40, 21-32, 1941) en frascos
de 500 ml, suplementados con glucosa a una concentración de 0,8% (peso/volumen). Los cultivos se incubaron a 34
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± 2ºC, a 300 ± 50 rpm durante 14,5 horas, en cuyo momento la OD590 era 11,5 y el fermentador se inoculó con 1,5%
(volumen/volumen) de inóculo.
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El inóculo para (B) y (C) se preparó como sigue: dos viales que contenían 1,0 ml de un cultivo de Corynebacterium
diphtheriae (β tox+ ) congelado en glicerol, se inocularon en un frasco de 500 ml que contenía 100 ml ± 10 ml de medio
LICY (NM5) estéril, y se incubó a 34 ± 2ºC a 300 ± 50 rpm. Lo anterior fue llevado a cabo en triplicado, que incluía
una reserva del cultivo del inóculo. Después de 15 horas de incubación, se analizó la densidad óptica y se realizó una
tinción de Gram de los contenidos del frasco de agitación. La densidad óptica a 590 nm de los cultivos combinados
era de 3,4 y 3,9. La tinción de Gram mostraba bastones Gram positivos, que tenían mayoritariamente forma de maza,
indicadores de C. Diphtheriae. Los fermentadores se inocularon con un inóculo del 5% (volumen/volumen), con estos
cultivos combinados.
El inóculo para (D) y (E) se preparó como sigue: dos viales que contenían 1,0 ml de un cultivo congelado en
glicerol de Corynebacterium diphtheriae (β tox’), se inocularon en cada frasco de Fernbach de 2,8 l, que contenían
250 ml ± 10,0 ml de medio LICY (NM5) estéril, sin una fuente de carbono, en duplicado, y se incubaron a 34 ± 2ºC
a 300 ± 50 rpm. Uno de los frascos contenía cisteína con extracto de levadura al 2% (para la inoculación de D) y otro
que contenía cistina con extracto de levadura al 1% (para la inoculación de E). Se prepararon inóculos adicionales
para las dos fermentaciones en tres frascos de 500 ml cada uno, para permitir un tamaño de inóculo combinado del
5% (volumen/volumen), en el fermentador de producción. Estos se prepararon a partir de 300 µl de cultivo congelado
en glicerol de Corynebacterium diphtheriae (β tox’), se inocularon en un frasco de 500 ml que contenía 100 ml ± 2
ml de medio estéril, idéntico al medio de fermentación sin la fuente de carbono, y se incubaron a 34 ± 2ºC, a 300
± 50 rpm. Los cultivos de inóculo de reserva se prepararon en triplicado en frascos de 500 ml, como se describió
anteriormente, en medio que contenía glucosa al 1,5%. Después de 15 horas de incubación, se analizó la densidad
óptica y se realizó una tinción de Gram de los contenidos de los frascos de agitación. La densidad óptica a 590 nm de
los cultivos fue de 3,01 y 1,62 para D y E, respectivamente. La tinción de Gram demostró bastones Gram positivos,
que tenían mayoritariamente forma de maza, indicativos de C. Diphtheriae. Los fermentadores se inocularon hasta un
5% de inóculo (volumen/volumen), con ellos.
Monitorización intra-proceso
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Se tomaron muestras con intervalo de una hora. Cada hora se registraron la fecha, el tiempo real, la temperatura, el pH y la agitación. También se determinaron cada hora la concentración de glucosa del medio residual tras la
fermentación y la densidad óptica a 590 nm del medio de fermentación.
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Densidad óptica y concentración residual de glucosa
La densidad óptica se midió utilizando el espectrofotómetro Ultrospec 4000 UV/Visible de Pharmacia, a 590
nm. Se utilizó agua Milli Q para establecer el blanco de referencia, y para diluir el cultivo según se requería. La
concentración residual de glucosa se estimó con un tira para glucosa Chemstrip BG de Boehringer Mannheim.
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Temperatura, pH, RPM y aireación
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La temperatura y el pH se midieron directamente dentro del fermentador, utilizando una sonda de temperatura
PT100 y una sonda de pH Bradley James, respectivamente. Las RPM se midieron directamente del ritmo de agitación
del fermentador. La aireación se midió utilizando un rotámetro.
Recolección del fermentador (Recuperación del sobrenadante)
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Se obtuvieron aproximadamente 2 litros de medio de fermentación clarificado mediante centrifugación. Este método se utilizó debido a la excesiva cantidad de anti-espumante requerido durante la fermentación. Para (B), (C), (D)
y (E), se clarificaron 5 litros de medio de medio de fermentación mediante microfiltración, utilizando el filtro de fibra
hueca de A/G Tecnology de 0,2 micras. Antes de que se iniciara la filtración, el medio se enfrió hasta alrededor de
10ºC. Una vez que el cruce de flujo se estableció, el cierre del filtrado se liberó lentamente para proporcionar un flujo
de filtrado de alrededor de 700 ml/min. El retentado se bombeó de nuevo al interior del fermentador, mientras que los
5 litros de filtrado se recolectaron en botellas estériles, y se guardaron inmediatamente a -70ºC.
Análisis SDS-PAGE, ELISA y de la actividad de ribosilación de ADP
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Las muestras recogidas de la fermentación en los diversos tiempos, se congelaron inmediatamente en partes alícuotas de 2 ml, en viales de crío-conservación a -70ºC, y se analizaron posteriormente mediante SDS-PAGE para
confirmar la presencia de CRM107. Las muestras que mostraban la banda de la proteína CRM107 se escanearon
con un escáner Sharp JX-330, para estimar la concentración de CRM107 en el medio de fermentación. La concentración de CRM107 se analizó también mediante un ensayo ELISA, y se midió la actividad de ribosilación del
ADP.
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Resultados y discusión
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En este grupo de experimentos, se comparan cinco medios de experimentos diferentes, incluyendo el de glucosa al
0,8%/maltosa al 2,5% (A), glucosa al 2,4% (B), glucosa al 1,5%/maltosa al 2,4% (C), glucosa al 1,5% (con cisteína)
(D), glucosa al 1,5% (con extracto de levadura al 1%) (E).
Crecimiento del Corynebacterium diphtheriae
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Como se muestra en la Figura 1a, el C. diphteriae creció hasta una OD290 final de 25 a 28, en 14 horas, en los tres
procesos de fermentación en lotes. El crecimiento fue inicialmente más lento en el medio de glucosa al 2,4%, lo que
podría haberse debido a un “choque de cultivo”, después de la transferencia del inóculo desde un medio sin una fuente
de carbono. El crecimiento del C. diphteriae en los dos procesos de fermentación en alimentación por lotes fue más
rápido en el medio de glucosa-cisteína que en el medio de glucosa-cistina. Sin embargo, la tasa de crecimiento, así
como la OD590 final fueron esencialmente los mismos (Figura 1b).
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Producción de CRM107
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La producción de CRM107 durante el curso de la fermentación se analizó mediante SDS-PAGE, ELISA y ensayo
de ribosilación de ADP. En los tres procesos en lotes, el medio de glucosa al 1,5%/ maltosa al 2,4% produjo un
rendimiento de 55 mg/l (datos de ELISA), después de 12 horas de fermentación (Figura 2), que es la producción
más elevada alcanzada para los procesos en lotes. El medio de glucosa al 2,4% se comportó por detrás tanto en el
crecimiento como en la producción de CRM107, por aproximadamente 4 horas, y consecuentemente la producción se
retrasó. La fase lag larga puede deberse al choque del cultivo debido a la alta concentración de glucosa en el medio,
particularmente cuando el inóculo se ha cultivado en ausencia de una fuente de carbono. A pesar de este retraso, la
producción comenzó a las 12 horas y continuó hasta las 13 horas, y podría quizá haber continuado durante más tiempo.
Esto se hizo evidente por el continuo aumento en la concentración de CRM107, observada en la fracción de 0,2 µm
(véase Tabla 1), que alcanzaba 47 mg/l (datos de ELISA), ya que al fermentador se le permitió permanecer durante
una hora adicional mientras que se recolectaba el otro fermentador. El medio de glucosa al 0,8%/maltosa al 2,4%
produjo muy poca CRM107, a pesar de que el rendimiento celular fue equivalente al obtenido con los otros medios de
fermentación. Esto podría ser debido a la excesiva espuma observada con esta fermentación, que daba como resultado,
no solo un elevado consumo de antiespumante, sino que también forzaba al oxígeno disuelto a disminuir hasta cerca
de 0 durante un periodo de 15 a 20 minutos, cuando la agitación disminuía a menos de 100 rpm, lo que podía haber
jugado un papel en el pobre rendimiento observado.
El rendimiento de CRM107 es significativamente mayor que el obtenido a partir de fermentación de glicerol
(datos no mostrados), con un aumento de aproximadamente 14 veces en la concentración post-fermentación, medida
mediante SDS-PAGE.
En el proceso de alimentación por lotes, el medio de glucosa al 1,5%, con la mitad de la cantidad de extracto
de levadura utilizada en los otros cuatro medios, demostró ser el mejor medio globalmente para la producción de
CRM107. El rendimiento final se acercaba a los 100 mg/l de CRM107 en 12 horas de fermentación (Figura 3). La
adición de glucosa comenzó aproximadamente a las 9,5 horas de fermentación, y continuó durante 3,5 horas. Se
añadieron un total de 125 g de glucosa (121 ml de una solución al 50%) al fermentador, como medio de controlar
el pH, cuando se requería ácido más adelante durante el curso de la fermentación (Tabla 2). La estrategia de añadir
glucosa está basada en el ajuste del pH mediante ácidos orgánicos producidos por el metabolismo de la glucosa, en
lugar de utilizar ácido inorgánico.
También analizamos la concentración de CRM107 mediante el ensayo de ribosilación de ADP. Los resultados se
muestran en la Tabla 3, que compara la concentración de CRM107 determinada mediante ELISA y mediante ensayo
de ribosilación de ADP. El producto obtenido es biológicamente activo, según se muestra en el ensayo de ribosilación
de ADP. La alimentación en lotes con glucosa (glucosa al 1,5%), que contiene extracto de levadura al 1% da como
resultado una producción óptima de toxina.
Escalada
55
Hemos aumentado este proceso, sobre la base de las condiciones óptimas de alimentación con glucosa y extracto de
levadura al 1%, hasta 50 l, y observamos un crecimiento exponencial, como en el cultivo de 10 l, comenzando alrededor
de las 6 horas, y continuando hasta las 13 horas. Después de 14 horas, el C. diphtheriae creció hasta una OD590 de
37,4. La producción de CRM107, analizada mediante SDS PAGE fue de 165,5 mg/l al final de la fermentación.
60
65
11
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TABLA 1
Resumen de los cinco procesos de optimización de la fermentación
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
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12
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TABLA 2
Alimentación con glucosa durante la fermentación de C. diphtheriae en el proceso de alimentación en lotes,
Lotes D y E
5
10
15
20
TABLA 3
25
Actividad de ribosilación de ADP de las CRM107 a lo largo del tiempo en el medio de fermentación en muestras de
los lotes A, B y C
30
35
40
45
Ejemplo 2
50
Recuperación primaria de las CRM107 producidas a partir de una fermentación de corynebacterium diphtheriae (β
Tox + )
55
60
Las CRM107 se recuperaron del medio de fermentación mediante dos etapas. La primera pretendía clarificar el
medio de fermentación, utilizando un filtro de fibra hueca de A/G Technology a 0,1 µm o 0,2 µm. La segunda etapa
consigue una concentración aproximadamente 10 veces mayor del medio de fermentación libre de células, utilizando
una membrana de fibra hueca de 30 K de A/G Technology. Este medio de fermentación clarificado y concentrado se
utiliza después como el material de inicio para la purificación de CRM107 (véase Ejemplo 3).
Este estudio investiga un número de procesos de recuperación utilizando el filtrado de 0,1 µm de una fermentación
de alimentación en lotes de 50 l como material de inicio. El objetivo era desarrollar un proceso que minimizara la
pérdida de producto durante la recuperación primaria.
65
13
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Procedimiento
Materiales
5
Los diversos filtros analizados en este estudio están listados en la Tabla 4. La eficiencia de los filtros se analizó
durante los procesos de ultrafiltración y diafiltración.
TABLA 4
10
15
20
Tipos de filtros analizados en el estudio de optimización de recuperación primaria
Tipos de membranas
Número de catálogo
Características
AMICON MiniPlate-10
AMICON MiniPlate-30
FILTRON 10K Alpha
AIG Technology 1 OK
AIG Technology 30K
FILTRON 10K Omega
series
1571303
1571304
AS010C72
UFP-10-C-6A
UFP-30-C-6A
10.000NMWC placa plana
30.000NMWC placa plana
10.000NMWC placa plana
10.000NMWC fibra hueca
30.000NMWC fibra hueca
0501070
10,000NMWC placa plana
Clarificación del medio de fermentación
25
30
El medio de fermentación utilizado para optimizar la recuperación primaria de CRM107 se obtuvo de una fermentación de C. diphtheriae (β tox+ ), de 50 l, con alimentación en lotes de glucosa como en el Ejemplo 1. Veinte litros del
medio de fermentación se clarificaron utilizando el filtro de fibra hueca de A/G Technology de 0,1 µm.
Esquemas de recuperación primaria
Se evaluaron seis esquemas de recuperación primaria (como se resume en la Tabla 5), utilizando el filtrado de 0,1
µm como material de inicio.
35
TABLA 5
Esquemas de optimización de recuperación primaria de CRM107
40
45
50
55
60
65
14
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Esquemas de recuperación primaria números 1 y 2
5
10
15
En el esquema número 1, 12 l del filtrado de 0,1 µm se concentraron hasta 1,2 l utilizando una fibra hueca A/GT
de 30K. Este retentado se dividió en dos lotes iguales de 550 ml, que tenían una conductividad inicial de 16,8 mS/cm.
En el esquema nº 1, un lote de 550 ml se diafiltró utilizando un filtro de fibra hueca A/GT de 30K, y el volumen se
mantuvo en aproximadamente 500 ml con adición constante de solución de tampón de fosfato 10 mM. La diafiltración
se detuvo cuando la conductividad de la solución era menor de 5 mS/cm (4,34 mS/cm). Se recolectaron un total de
aproximadamente 2 l de permeado.
En el esquema nº 2, el otro lote de 550 ml se diafiltró utilizando un filtro de fibra hueca A/GT de 10K, y el volumen
se mantuvo en aproximadamente 500 ml, con la adición constante de solución de tampón de fosfato 10 mM. La
diafiltración se detuvo cuando la conductividad de la solución era menor de 5 mS/cm (3,97 mS/cm). Se recolectaron
un total de aproximadamente 2 l de permeado. El objetivo del esquema nº 2 era minimizar la pérdida de CRM107
durante la diafiltración. La diafiltración era para reducir la interferencia de la sal durante los estadios posteriores de
purificación (tales como la cromatografía de intercambio iónico).
Esquemas de recuperación primaria números 3, 4, 5 y 6
20
Estos cuatro esquemas estaban basados en la utilización de filtros de flujo tangencial de placas planas Amicon y
Filtron, para las etapas de concentración y diafiltración. Los esquemas 3, 4 y 6 se utilizaron para evaluar las químicas
de las diferentes membranas.
25
En el esquema nº 3, 959 ml de filtrado de 0,1 µm se concentraron hasta aproximadamente 125 ml, utilizando un
filtro de flujo tangencial Amicon de 30K. La conductividad del retentado era 18,6 mS/cm. El retentado se llevó hasta
aproximadamente 200 ml con solución de tampón de fosfato 10 mM, y después se diafiltró utilizando el mismo filtro.
El volumen se mantuvo en aproximadamente 200 ml mediante la adición constante de solución de tampón de fosfato
10 mM. La diafiltración se detuvo cuando la conductividad del retentado se redujo a menos de 5 mS/cm (4,34 mS/cm).
Se recolectaron un total de aproximadamente 600 ml de permeado. El volumen final de retentado era de 75 ml.
30
35
40
45
50
55
En el esquema nº 4, 550 ml de filtrado 0,1 µm se concentraron hasta aproximadamente 100 ml, utilizando un
filtro de flujo tangencial Amicon de 10K. La conductividad del retentado era de 18,5 mS/cm. El retentado se llevó
hasta aproximadamente 200 ml con solución de tampón de fosfato, y después se diafiltró utilizando el mismo filtro.
El volumen se mantuvo en aproximadamente 200 ml mediante la adición constante de solución de tampón de fosfato
10 mM. La diafiltración se detuvo cuando la conductividad del retentado era menor de 5 mS/cm (4,43 mS/cm). Se
recolectaron un total de aproximadamente 500 ml de permeado. El volumen de retentado final era de 83 ml.
En el esquema nº 5, 950 ml de filtrado 0,1 µm se concentraron hasta aproximadamente 150 ml, utilizando un filtro
de flujo tangencial Filtron alpha de 10K. La conductividad del concentrado era de 17,2 mS/cm. El retentado se llevó
hasta aproximadamente 200 ml con solución de tampón de fosfato 10 mM, y después se diafiltró utilizando el mismo
filtro. El volumen se mantuvo en aproximadamente 200 ml mediante la adición constante de solución de tampón de
fosfato 10 mM. La diafiltración se detuvo cuando la conductividad del retentado era menor de 5 mS/cm (3,80 mS/cm).
Se recolectaron un total de alrededor de 800 ml de permeado. El volumen final de retentado era de 72 ml.
En el esquema nº 6, aproximadamente 18 l de filtrado 0,1 µm se concentraron hasta aproximadamente 1,8 l,
utilizando un filtro de fibra hueca de 30K. El retentado se diafiltró utilizando una membrana de flujo tangencial Filtron
omega de 10K. El volumen se mantuvo constante en aproximadamente 400 ml mediante la adición constante de
solución de tampón de fosfato potásico 10 mM. La diafiltración se detuvo cuando la conductividad era menor de 5
mS/cm (4,74 mS/cm).
Análisis de una muestra de la recuperación primaria
La optimización de la recuperación primaria se realizó utilizando muestras de 1,8 ml tomadas al comienzo y al
final del proceso, para el análisis de recuperación de CRM 107 y la eficiencia del proceso. Las muestras se congelaron
inmediatamente en viales criogénicos a -70 ± 5ºC, y se analizaron posteriormente mediante SDS-PAGE, enfoque
isoeléctrico, Western blot, y HP-SEC.
SDS-PAGE y Western blot
60
65
Los análisis SDS-PAGE y Western blot de las muestras se realizaron en un gel de gradiente de poliacrilamida al 415% precargado de Bio-Rad. Las muestras se diluyeron 1-2 veces en solución salina tamponada con fosfato (para las
muestras de permeado y filtrado 0,1 µm), o 20 veces (para el retentado), y después de nuevo dos veces en la solución de
tampón de disolución. Veinte microlitros de la mezcla se cargaron en un gel, y se sometieron a electroforesis a 200 V
durante 50 minutos. Las muestras que mostraban la banda de la proteína de CRM107 en el SDS-PAGE se escanearon
con un escáner Sharp JX-330, para estimar la concentración de CRM107. Para el análisis Western blot, las bandas de
proteínas en el gel de poliacrilamida se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con una sonda
de toxina de difteria de ratón anti-humana, y se detectaron con un conjugado de IgG anti-ratón y fosfatasa alcalina.
15
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Enfoque isoeléctrico (IEF)
5
El análisis IEF de las muestras de retentado se llevó a cabo utilizando la placa Ampholine PAG de Pharmacia (pI
4-6,5), con marcadores de pI en el intervalo de 3,6-6,6. Las muestras se diluyeron apropiadamente entre 1 y 5 veces.
Veinte microlitros de la mezcla se cargaron en un gel, y se sometieron a electroforesis a un voltaje de 2000 V, a 25
mA, durante 2,5 horas.
Cromatografía de exclusión de tamaño de alta resolución (HP-SEC)
10
Las muestras finales del proceso de optimización de la recuperación, obtenidas después de la etapa de diafiltración,
se analizaron mediante HP-SEC, para evaluar el grado de pureza del producto y el impacto del proceso en la eliminación del pigmento. Cien microlitros de las muestras se cargaron sobre una columna, y la cromatografía se monitorizó a
una longitud de onda de 280 nm. El pico de CRM107 se eluyó con un tiempo de retención de alrededor de 9,3 minutos.
El % del área del pico se utilizó para estimar la pureza del producto.
15
Resultados y discusión
20
25
30
Se evaluaron seis esquemas de optimización de recuperación primaria de CRM107, para la recuperación del producto y para la eficiencia del proceso en cuanto a la facilitación de la purificación subsiguiente de CRM107. Los
criterios aplicados para la recuperación primaria fueron: (i) alcanzar una concentración de 5-10 veces más del medio
de fermentación clarificado con 0,1 µm, mediante una etapa de ultrafiltración, y (ii) reducir la conductividad del medio
concentrado hasta por debajo de 5 mS/cm, mediante una etapa de diafiltración.
El estudio de optimización se monitorizó utilizando cuatro análisis diferentes (SDS-PAGE, Western blot, IEF y
HP-SEC). Los datos de Western blot e IEF mostraban la presencia de CRM107 en todas las muestras de retentado.
Similarmente, los datos de SDS-PAGE mostraban CRM107 en las muestras de retentado, así como en la muestra
de filtrado a través de 0,1 µm (Tabla 6). El análisis de las muestras de permeado mediante SDS-PAGE sugiere que
todos los esquemas analizados, excepto los esquemas nº 1 y 5, no ocasionaban ninguna pérdida visible de CRM107
en el permeado. Sobre la base de los datos de SDS-PAGE, IEF y HP-SEC, el esquema nº 3 parece ser el proceso de
recuperación primaria de elección. Los datos de SDS-PAGE no apoyan esta conclusión, ya que la recuperación postdiafiltración es buena en la mayoría de los casos, excepto en el esquema nº 5, en el que es evidente una pérdida visible
de producto. Los datos de IEF muestran más bandas en la muestra procesada con el esquema nº 5, lo que implica que
esta muestra diafiltrada estaba menos limpia. En todas las muestras analizadas mediante IEF, eran visibles tres bandas
prominentes, idénticas a las que estaban presentes en la muestra de referencia estándar, con un pI entre 5,0 y 5,4.
35
La pureza alcanzada con el esquema nº 3 después de esta etapa era del 17,5%, comparada al 9% de pureza de
CRM107 conseguida con el esquema nº 1, Tabla 4. La recuperación de CRM107 es mejor con el esquema nº 3, que
mostraba un área de pico de CRM107 de 161, casi dos veces mayor que la obtenida con el esquema nº 1.
40
(Tabla pasa a página siguiente)
45
50
55
60
65
16
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TABLA 6a
Balance material de los diferentes esquemas de recuperación primaria (datos de SDS-PAGE)
5
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35
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45
50
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60
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TABLA 6b
Balance material de los diferentes esquemas de recuperación primaria (datos de SDS-PAGE)
5
10
15
20
25
30
TABLA 7
Análisis HP-SEC de las muestras de diafiltración de los diferentes esquemas de recuperación primaria
35
40
45
50
Ejemplo 3
Purificación de CRM107 con cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de interacción hidrófoba
Antecedentes
55
60
El protocolo de purificación de CRM107 ha implicado tradicionalmente dos procesos cromatográficos. El primero es HIC, que lleva a la mayor purificación, eliminando la mayoría de los pigmentos en el proceso, pero tiene la
desventaja de que produce la mayor disminución en el rendimiento. A continuación, después de la concentración y
el intercambio en la solución de tampón apropiada a través de la diafiltración, se lleva a cabo una etapa de IEC para
limpiar más el producto; la pérdida en el rendimiento no es tan dramática, pero tampoco lo es el grado de purificación.
65
Este estudio invierte estas dos cromatografías para determinar si se puede obtener una mejoría en el rendimiento o
en la pureza sin efectos adversos, siendo la idea que el procedimiento de IEC no solo podría actuar como una etapa de
raspado inicial previa a llevar a cabo la HIC, sino que también podría ser más adecuado para un volumen de muestra
grande, que puede anticiparse con fermentaciones a gran escala de 50 l.
18
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Materiales y métodos
1. Preparación de las muestras
5
10
15
Una preparación cruda, congelada de CRM107, consiste en 20 l de medio de fermentación libre de células, procedente de 50 l de fermentación, concentrados a través de un filtro de fibra hueca de 30K, para proporcionar 2 l de
retentado. Ésto se diafiltró de nuevo (utilizando un Omega Ultrasette de 10K), para equilibrar el pH y la conductividad
con solución de tampón C (Fosfato de potasio 10 mM, pH 7,6 ± 0,2); los 400 ml resultantes de retentado se distribuyeron en partes alícuotas de 200 ml para conservarlas a -70ºC. Antes de la etapa cromatográfica inicial, cada lote se
calentó hasta aproximadamente 27ºC; de aquí en adelante, los procedimientos difieren. La muestra purificada según
el protocolo tradicional se denomina LOTE 1, mientras que la sometida al procedimiento alternativo se denomina
LOTE B.
(A) Los 200 ml de retentado se acondicionaron para HIC mediante la adición de 30 g de (NH4 )2 SO4 , con agitación.
Este material se pasó después a través de un filtro de 0,22 µ (Media-Kap 25), para eliminar su enturbiamiento antes de
cargarlo en la columna de HIC.
(B) Se añadieron 500 ml de solución de tampón C a los 200 ml de retentado, para ajustar la carga, para que fuera
idéntica a la de la etapa IEC del Lote A (véase Sección 3). No fue necesaria la filtración.
20
2. Primer procedimiento de cromatografía
(A) Cromatografía de interacción hidrófoba utilizando Decil Agarosa 6XL
25
30
Una columna de Decil Agarosa 6XL de volumen de columna {Vc } (∼250 ml) se equilibró con solución de tampón
A (Fosfato Potásico 50 mM, (NH4 )2 SO4 1 M, pH 7,0 ± 0,2), antes de cargar el filtrado obtenido después de la filtración
por 0,22 µm. Después de cargarla, la columna se lavó con cuatro Vc de Solución de Tampón A, seguido secuencialmente por cinco Vc de Solución de Tampón B (Fosfato Potásico 50 mM, pH 7,0 ± 0,2), a cada uno de 30% B, 50% B
y 100% B. Las CRM107 se eluyeron durante la etapa 30% B, y su pureza se midió como 55,1% mediante HP-SEC.
Todos los contenidos se guardaron a 2-8ºC, pendientes de procesamientos posteriores.
(B) Cromatografía de Intercambio Iónico utilizando DEAE de Pharmacia de Flujo Rápido
35
40
Una columna DEAE FF de Pharmacia (Vc ∼220 ml), se equilibró con Solución de Tampón C antes de cargarse
con 700 ml de muestra. Después se lavó con cuatro Vc de solución de tampón C. La CRM107 unida se eluyó con
un gradiente lineal de 0-50% de solución de tampón D (Fosfato Potásico 10 mM, KCl 500 mM, pH 7,6 ± 0,2),
llevado a cabo sobre diez Vc , con recolección concurrente de fracciones de 90 ml. Después se lavó con cinco Vc de
solución D al 100%. Después del análisis HP-SEC, se decidió agrupar las fracciones 12-16; la pureza resultante era
aproximadamente 69,8% (calculada del Área Pico y del Porcentaje de Área de cada fracción). Cada pool/fracción se
recolectó y se guardó a 2-8ºC hasta su procesamiento posterior.
3. Diafiltración y concentración utilizando 10K Omega Ultrasette
45
50
55
(A) El pool de 1300 ml de CRM107 de la etapa HIC (la fracción 30% B), se diafiltró utilizando una membrana
10K Omega Ultrasette. La diafiltración se llevó a cabo utilizando solución de tampón C hasta que la conductividad
de la muestra cayó hasta ≤ 5 mS/cm; se requirieron 3900 ml de solución de tampón de diafiltración para alcanzar una
conductividad de 4,34 mS/cm, y un volumen final de retentado de 700 ml. La pureza de las CRM107 en el retentado
se midió como 79,3% mediante HP-SEC. Los pool se guardaron a 2-8ºC hasta su procesamiento posterior.
(B) El pool de 450 ml de CRM107 de la etapa de DEAE (fracciones 12-16), se diafiltró utilizando una membrana
10K Omega Ultrasette. La diafiltración se llevó a cabo utilizando solución de tampón A hasta que la conductividad
de la muestra agrupada alcanzó 130 ± 20 mS/cm; se requirieron 600 ml de solución de tampón de diafiltración para
alcanzar una conductividad de 116 mS/cm, y un volumen final de 300 ml. La pureza de las<CRM107 en el retentado
se midió como 84,2% mediante HP-SEC. Los pool se guardaron a 2-8ºC hasta su posterior procesamiento. La solución
permaneció clara a lo largo de toda esta etapa.
4. Segundo procedimiento cromatográfico
(A) Cromatografía de Intercambio Iónico utilizando DEAE de Flujo Rápido de Pharmacia
60
65
Una columna DEAE FF de Pharmacia (Vc ∼220 ml), se equilibró con solución de tampón C antes de cargar los
700 ml de muestra. Después se lavó con cuatro Vc de solución de tampón C. Las CRM107 unidas se eluyeron con
un gradiente lineal de 0-50% de solución de tampón D, llevado a cabo sobre diez Vc , con recolección concurrente de
fracciones de 90 ml. Después se lavó con cinco Vc de solución de tampón D al 100%. Después del análisis HP-SEC,
se decidió agrupar las fracciones 15 y 16; la pureza resultante es 94,9% (95,6% si se calcula del Área del Pico y del
Porcentaje del Área de cada fracción, como para la Sección 2, LOTE B). Cada pool/fracción se recolectó y se guardó
a 2-8ºC hasta su procesamiento posterior.
19
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(B) Cromatografía de Interacción Hidrófoba utilizando Decil Agarosa 6XL
5
Una columna de Decil Agarosa 6XL (Vc ∼220 ml) se equilibró con solución de tampón A antes de cargarse con
los 300 ml de muestra. Después de cargarla, la columna se lavó con cuatro Vc de solución de tampón A, seguido
secuencialmente por cinco Vc de solución de tampón B, a 30% B, 50% B, y 100% B. Las CRM107 se eluyeron
durante la etapa de 30% B, y su pureza se midió como 76,6% mediante HP-SEC. Todos los pool se guardaron a 2-8ºC,
pendientes de procesamiento posterior.
5. Segunda diafiltración y concentración utilizando un nivel de corte de 10K
10
15
20
(A) La solución de tampón C se utilizó para equilibrar una unidad de agitación celular Filtron de 150 ml, que
contenía una membrana Omega de 10K, presurizada a 40-45 psi. Ésta se utilizó para diafiltrar el pool de DEAE de 180
ml. Se utilizaron 260 ml de solución de tampón C para proporcionar 31 ml de retentado con una pureza final de 98,0%,
monitorizada mediante HP-SEC. El perfil de HP-SEC no tuvo picos detectables con tiempos de retención entre 10 y
11 minutos.
(B) El pool de 1100 ml de HIC se concentró primero utilizando la membrana Omega Ultrasette de 10K; se utilizaron 670 ml de solución de tampón C para reducir el volumen de retentado hasta 150 ml. Éste se concentró más
después, hasta 34 ml, con la unidad de agitación celular Filtron de 150 ml preparada, que contenía una membrana
Omega de 10K. La pureza final era de 97,4%, monitorizada mediante HP-SEC. El perfil de HP-SEC mostró dos picos
a 10,2 y 10,6 minutos, que comprendían el 1,4% del Porcentaje del Área.
Resultados y discusión
25
30
35
Para determinar la eficiencia de cada etapa, varias muestras intra-proceso se analizaron mediante algunas o todas
las siguientes técnicas: HP-SEC, SDS-PAGE, IEF, absorbancia de la tinción de proteínas (Coomassie), absorbancia
intrínseca a 280 nm y fluorescencia de tinción de DNA. Estos datos se resumen en las Tablas 8 y 9.
Mientras que los procedimientos parecen diferir en sus porcentajes de recuperación globales, esto es parcialmente
un artefacto de la excesiva presión posterior aplicada a la etapa de diafiltración de Ultrasette llevada a cabo sobre el
Lote A. Consecuentemente, alrededor del 60% (160 mg) de la fracción de CRM107 de la etapa de HIC se perdía en el
filtrado, comparado al solo 8% para el Lote B. Siendo iguales todos ellos, cuando esta pérdida se aplica en el Lote A,
debería tener una recuperación global del 27% (160 mg), más a la par con el Lote B. Incluso cuando esto se tiene en
cuenta irregularmente, el rendimiento global para el Lote A es todavía solo el 70% del obtenido con el Lote B.
TABLA 8
Datos de rendimiento, pureza y recuperación para los Lotes A y B
40
45
50
55
60
65
# La Ultrasette se sometió a excesiva presión posterior durante esta etapa, como se evidencia por la cantidad de CRM107
en el filtrado (156 mg, ∼60% del pool de HIC); durante el B, solo 30 mg (8% del pool de DEAE), se perdieron de forma
similar. Tomando esta pérdida en cuenta, la recuperación global para el Lote A es del 27%
* Estos valores se calcularon utilizando rendimientos de células agitadas.
20
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TABLA 9
Resultados de la purificación de CRM107 de los Lotes A y B
5
10
15
20
25
30
35
Nota: El LOD (límite de detección) para el ensayo de DNA es de 5 ng/ml
Esta discrepancia entre las dos recuperaciones globales es indudablemente atribuible directamente a los diferentes
procesos utilizados para preparar las muestras para la primera etapa de cromatografía. En el Lote A, el (NH4 )2 SO4
adicional y las etapas de filtración llevan a una pérdida de 200 mg de las CRM107 presentes en el sobrenadante del
cultivo.
Las CRM107 producidas a partir del Lote B, mediante la realización de IEC antes de la HIC, llevan a un aumento
en la cantidad recuperada del medio de cultivo concentrado
40
Ejemplo 4
Expresión de CRM107 en Escherichia coli
45
50
Esto se hizo para estudiar la expresión de la toxina de difteria mutante CRM107 en un hospedante microbiano
diferente. El DNA se purificó de corinebacteriófago β aislado de cultivos de C. diphtheriae, y un fragmento de 2 kb
que contenía el gen entero que codifica la CRM107, incluyendo el promotor y la secuencia de señal, se insertó en el
lugar de clonación poli-ligador del pUC19, y se amplificó en cepas de E. coli y se acumuló en el periplasma de las
bacterias. El nivel de expresión de fue hasta 45 mg de proteína recombinante por litro de medio.
Materiales y métodos
Cepas y plásmidos: El Corynebacterium diphteriae C7(βtox−107 ) se recibió del Dr. Richard Youle, NIH, y se utilizó
para la producción de CRM107. El C. diphteriae C7(-) (ATCC 27010) se utilizó para amplificación y titulación de βfagos.
55
El plásmido pUC19 (Gibco, Paisley, Reino Unido), se utilizó como vector para clonación del gen de CRM107, y
las E. coli DH5α (Gibco), E. coli HB2151 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), E. coli TG1 (Pharmacia Biotech) y
E. coli RR1∆M15 (ATCC 35102), se utilizaron para la expresión de CRM107.
60
65
Preparación del β-fago: El DNA se preparó como describieron Greenfield, L., Bjorn, M.J., Horn, G. Fong, D., Buck,
G.A., Collier, R.J. y Kaplan D.A. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6853-6857, con modificaciones menores.
Brevemente, los β-fagos se aislaron del medio de C. diphtheriae C7(βtox−107 ), y se amplificaron en C. diphtheriae C7 (-).
Las células se eliminaron mediante centrifugación a 2500 g, y el medio se clarificó más mediante centrifugación a 1500
g. Se añadieron polietilén-glicol 8000 y NaCl a una concentración del 6% y 0,5 M respectivamente, al sobrenadante
que contenía los fagos. Los fagos se precipitaron mediante incubación sobre hielo durante 2 horas, y se recuperaron
mediante centrifugación a 15000 g durante 20 minutos.
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La titulación de los fagos para determinar el número de unidades formadoras de placa (pfu) se llevó a cabo en C.
diphtheriae C7 (-), como describieron Laird, W y Groman, N. (1967), J. Virol. 19, 208-219.
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10
Los fagos (1011 pfu) suspendidos en Tris-HCl pH 7,5 100 mM, NaCl 100 mM, EDTA 25 mM se incubaron con
1 mg/ml de pronasa (Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas a 37ºC, y después se extrajeron con un volumen igual
de fenol:cloroformo:isoamilalcohol (49,5:49,5:1). La fase acuosa se precipitó con etanol frío después de la adición de
acetato sódico a una concentración de 0,3 M. El centrifugado se lavó una vez con etanol al 70% y se disolvió en TrisHCl pH 7,5 10 mM, EDTA 1 mM.
Clonación de CRM107 en pUC19. Se cortó β-DNA purificado con EcoRI y Xba1, y se separó en un gel de agarosa
al 1%. Se escindió una banda de 2 kb de los geles, y se purificó utilizando un QIAEXII Agarose Gel Extraction Kit
(Qiagen GMBH, Hilden, Alemania). El fragmento aislado se ligó en el lugar de clonación poliligador del pUC19.
Las enzimas de restricción (New England Biolabs, Beverly, MA) y la T4 ligasa (Pharmacia Biotech) se utilizaron de
acuerdo a las recomendaciones de los suministradores. El plásmido resultante, pEtox, se amplificó en E. coli TG1.
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Expresión de CRM107 en E. coli: El plásmido pEtox se transformó en diferentes cepas de E. coli mediante electroporación. Las bacterias se cultivaron a 37ºC, de acuerdo con la invención. Las células se recolectaron mediante
centrifugación, y se prepararon extractos de las células completas mediante desintegración de las células en una Prensa Francesa. El fraccionamiento de las células se llevó a cabo primero aislando las proteínas periplasmáticas de células recién cultivadas mediante choque osmótico. Nossal, NG y Heppel, LA (1966) J. Biol. Chem. 241, 3055-3062.
El residuo se desintegró en una Prensa Francesa, y la fracción de la membrana se separó del citoplasma mediante
centrifugación.
Ejemplo 5
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Conjugación de transferrina con CRM107
Las CRM107 se conjugaron con transferrina según métodos publicados, incluyendo el método descrito en el Documento US-5728383.
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Sustitución de CRM107
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Se mezclaron 150 mg de CRM107 (concentración de aproximadamente 10 mg/ml), con 299 µl de solución MBS
(10 mg/ml), y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La cantidad de MBS añadida estaba en un
exceso molar respecto a las CRM107, de 3,5 veces. Después de completarse la incubación, la reacción se detuvo
colocando la mezcla a 5ºC, seguido de desalación sobre una columna Sephadex G25.
Sustitución de transferrina
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Se mezclaron 350 mg de transferrina (concentración de aproximadamente 20 mg/ml) con 840 µl de 2-IT (5 mg/ml),
y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. La cantidad de 2-IT añadida estaba en un exceso molar respecto a la
transferrina de 7,7 veces. Después de completarse la incubación, la reacción se detuvo colocando la mezcla a 5ºC,
seguido de desalación sobre una columna Sephadex G25.
Conjugación de la transferrina y las CRM107 sustituidas
Las CRM107 sustituidas con MBS (141 mg) y la transferrina sustituida con 2-IT (293 mg), en una relación de 1:2
se mezclaron y se incubaron a 5ºC durante 18 horas. Después de completarse la conjugación, el conjugado se purificó
mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando Q Sepharose Fast Flow, seguido por filtración en gel sobre
una columna Sephadex 200.
Cromatografía de intercambio aniónico del conjugado
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60
65
Aproximadamente 440 mg de conjugado se cargaron sobre una columna Q Sepharose Fast Flow de 100 ml, equilibrada con solución de tampón de fosfato sódico (0,05 M) a pH 7,6. El conjugado se eluyó con 300 ml (3 volúmenes
de columna) de solución de tampón de elución, que consistía en 70% de solución de tampón de equilibrio y 30% de
solución de tampón B (fosfato sódico 0,1 M, cloruro sódico 1,5 M, pH 7,4). El pico de conjugado se eluyó entre 60
ml y 150 ml de solución de tampón de elusión.
Concentración del conjugado
Las fracciones de la columna Q Sepharose Fast Flow que contenían el conjugado, se combinaron y se concentraron
hasta una concentración mayor de 10 mg/ml, y se cargaron en una columna Superdex 200 de filtro molecular para
purificarlas más. Las soluciones de tampón de equilibrio y de elución para la Superdex 200 eran fosfato sódico pH 7,4
0,01 M, que contenía cloruro sódico 0,15 M. El conjugado purificado se conservó a -70ºC.
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REIVINDICACIONES
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1. Un método para purificar la toxina de difteria de un cultivo de microorganismos productores de toxina, comprendiendo dicho método poner en contacto una preparación que contiene toxina con una matriz de intercambio iónico,
eluir una fracción que contiene la toxina, aplicar el eluato a una matriz hidrófoba, y eluir la fracción que contiene la
toxina.
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2. Un método de purificar la toxina de difteria de un cultivo de microorganismos productores de toxina, comprendiendo dicho método etapas cromatográficas de cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de interacción
hidrófoba, caracterizado porque dicho método comprende llevar a cabo una cromatografía de intercambio iónico
antes que una cromatografía de interacción hidrófoba.
3. Un método de purificar la toxina de difteria, que comprende
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(1) fermentar una cepa de microorganismos capaz de producir toxina de difteria utilizando glucosa como fuente
de carbono, comprendiendo dicho método añadir glucosa a un cultivo en crecimiento, en el que la adición de glucosa
mantiene el crecimiento del microorganismo efectivo para mantener la producción de toxina de difteria; y
(2) purificar la toxina de difteria del cultivo, poniendo en contacto una preparación que contiene toxina derivada
del mismo con una matriz de intercambio iónico, eluyendo una fracción que contiene la toxina, aplicando el eluato a
una matriz hidrófoba, y eluyendo una fracción que contiene la toxina.
4. Un método como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la preparación que
contiene la toxina es un sobrenadante de cultivo o una de sus fracciones.
5. Un método como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material
que contiene la toxina se concentra antes del intercambio iónico.
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6. Un método como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la fuerza iónica
se reduce antes del intercambio iónico.
7. Un método como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la toxina de
difteria es una forma mutante.
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8. Un método como el reivindicado en la reivindicación 7, en el que la toxina mutante tiene una subunidad citotóxica A.
9. Un método como el reivindicado en la reivindicación 8, en el que la toxina mutante es CRM107.
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10. Un método como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el microorganismo es Corynebacterium diphtheriae.
11. Un método como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el microorganismo
es E. coli.
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