Eficacia de Duddingtonia flagrans sobre larvas pre

Facultad de Ciencias Veterinarias
- UNCPBA -
Eficacia de Duddingtonia flagrans sobre larvas
pre-parasíticas de rumiantes en verano
Zegbi, Sara; Berisso, Raúl; Saumell, Carlos; Fernández, Silvina
Diciembre, 2015
Tandil
Eficacia de Duddingtonia flagrans sobre larvas pre-parasíticas
de rumiantes en verano
Tesina de la Orientación Sanidad de Grandes Animales, presentada como
parte de los requisitos para optar al grado de Veterinario del estudiante: Zegbi
Sara.
Tutor: Med. Vet., Berisso Raúl
Director: Med. Vet., PhD, Fernández Silvina
Codirector: Med. Vet., PhD, Saumell Carlos
Evaluador:Prof., MSc, Iglesias Lucía
Agradecimientos
Al Área de Farmacología por prestarme los ovinos con los cuales se realizó el
ensayo, y a Santiago Leeson por permitirme usar sus terneros como donantes
de materia fecal.
A Martin Ignacio Bayala, del Instituto de Hidrología de Llanuras por los datos
meteorológicos brindados.
A cada uno de los que integran el Área de Parasitología y Enfermedades
Parasitarias, desde los ayudantes alumnos a los profesores que me ayudaron
en el presente proyecto, especialmente a mis directores Silvina y Carlos, les
agradezco el apoyo, orientación y experiencia adquirida en esta etapa.
A mis familiares y amigos que estuvieron siempre a mi lado acompañándome
durante toda la carrera, en particular a Silvia, mi mamá, por su apoyo
incondicional brindado.
Resumen
El presente trabajo es un ensayo experimental que tuvo como objetivo dilucidar
el comportamiento predador e interacción del hongo Duddingtonia flagrans con
las larvas de nematodos gastrointestinales de rumiantes en el ambiente
durante el verano del 2015 sobre parcelas con pasturas consociadas en el
sudeste de la provincia de Buenos Aires. Previamente se hizo una breve
revisión bibliográfica sobre los nematodos gastrointestinales parásitos que
afectan a los rumiantes, su ciclo y su modo de control actual, haciendo hincapié
en el control biológico como herramienta alternativa de control basada en el
uso de hongos nematófagos, y principalmente en D. flagrans, que fue el agente
en estudio. El ensayo experimental se basó en exponer por 30 días
deposiciones fecales de ovinos y bovinos con y sin el hongo a condiciones
ambientales de verano bajo la sombra y al sol. Durante ese período se
procedió a la recuperación y conteo de las larvas infectantes (L3) del pasto en
los días 16 y 30 y al día 30 también se recuperaron las deposiciones fecales.
Tanto en los grupos tratados como controles se obtuvo un bajo número de L3 y
sin diferencia estadística significativa entre los mismos. A su vez durante el
ensayo los registros de temperatura dentro y fuera de la materia fecal fueron
analizados, atribuyéndoles a las altas temperaturas y desecación el bajo
número de L3.
Palabras clave: Nematodos gastrointestinales, control biológico, Duddingtonia
flagrans, verano.
Índice
Introducción .......................................................................................1
Objetivo ..............................................................................................1
Revisión bibliográfica .......................................................................1
Parasitosis en el ganado: Nematodos tricostrongilídeos ................................ 1
Ciclo biológico................................................................................................ 2
Control actual y sus consecuencias ............................................................... 4
Alternativas de control ................................................................................... 5
Control biológico ............................................................................................ 6
Hongos nematófagos: Duddingtonia flagrans ................................................ 7
Materiales y métodos ......................................................................10
Diseño experimental .................................................................................... 10
Parcela experimental ................................................................................... 12
Donantes de materia fecal ........................................................................... 12
Material fúngico ........................................................................................... 12
Monitoreo de temperatura ............................................................................ 13
Técnicas de laboratorio ................................................................................ 13
Análisis estadísticos..................................................................................... 14
Resultados .......................................................................................14
Coprocultivos ............................................................................................... 14
Larvas en pasto ........................................................................................... 15
Larvas en materia fecal ................................................................................ 16
Temperaturas ambientales y dentro de la materia fecal ............................... 18
Discusión..........................................................................................20
Conclusiones ...................................................................................25
Bibliografía .......................................................................................25
Apéndice ...........................................................................................33
Introducción
La capacidad de los hongos nematófagos de atrapar larvas de nematodos
tricostrongilídeos ha sido demostrada tanto en ensayos in vitro como in vivo. La
aplicación experimental de hongos nematófagos en sistemas pastoriles redujo
significativamente la población de larvas en pasto y las cargas parasitarias en
los animales. Uno de los desafíos aún pendientes es evaluar la aplicación de
los hongos a campo en sistemas reales de producción, donde algunos
aspectos ambientales que podrían influir en el rendimiento de los hongos no
han sido estudiados hasta el momento. Los hongos generalmente tienen como
aliado para su desarrollo la humedad del suelo y como aspectos que influyen
negativamente, la falta de humedad y la acción directa del sol. Ambas
condiciones son comunes de observar en los sistemas de pastoreo continuo,
donde existen potreros con extensas áreas soleadas y con algunas áreas de
sombra para la protección de los animales. Por lo tanto, la aplicación y acción
predadora de los hongos nematófagos debe analizarse bajo las condiciones
naturales para conocer su verdadero alcance a través de las diferentes
condiciones ambientales durante los ciclos productivos, donde la humedad,
intensidad del sol, sombra de los lugares de protección, etc., podrían influir
directamente en la eficacia del hongo para reducir la población larvaria en las
pasturas. Esta tesina apunta a contribuir a ese conocimiento mediante un
estudio bajo condiciones naturales de verano en el centro-sudeste de la Pcia.
de Buenos Aires.
Objetivo
Dilucidar el comportamiento predador e interacción del hongo Duddingtonia
flagrans con las larvas de nematodos gastrointestinales de rumiantes en el
ambiente en verano.
Revisión bibliográfica
Parasitosis en el ganado: Nematodos tricostrongilídeos
Los nematodos gastrointestinales (NGI) de rumiantes son una de las mayores
limitantes de los sistemas productivos pastoriles en nuestro país. Estos
1
parásitos pertenecen al phylum Nemathelminto, clase Nematoda, orden
Strongylida, superfamilia Trichostrongyloidea, familias Trichostrongylidae y
Molineidae,
subfamilias
Haemonchinae,
Ostertagiinae,
Cooperiinae,
Trichostrongylidae y Nematodirinae (Soulsby, 1987). En cuanto a los géneros y
especies, los principales en bovinos son: Haemonchus placei, Ostertagia
ostertagi y Trichostrongylus axei en el abomaso, T. colubriformis, Cooperia
oncophora
y
Nematodirus
helvetianus
en
intestino
delgado
y
Oesophagostomum radiatum en intestino grueso. En los ovinos las principales
especies en el abomaso son H. contortus, Teladorsagia circumcincta y T. axei,
en el intestino delgado Cooperia spp., N. battus, N. filicollis, T. colubriformis, y
T. vitrinus, y en el intestino grueso O. venulosum, Chabertia ovina y Trichuris
ovis (Steffan et al., 2012). En el tubo digestivo tanto de bovinos como ovinos
puede haber 7-8 géneros, sin embargo, los de mayor incidencia y
patogenicidad son solo 2 o 3. De este modo cabe destacar que en la recría de
razas carniceras bovinas en regiones templadas/frías (predominando Aberdeen
angus, Hereford y sus cruzas), Ostertagia es el género de mayor patogenicidad
y junto a Cooperia, de elevada prevalencia, constituyen los principales géneros
que provocan pérdidas productivas, mientras que en sistemas de cría toma
importancia T. axei así como lo hace H. placei en rodeos lecheros. En ovinos
los géneros de mayor importancia son H. contortus, que debido a la anemia
que genera puede producir muertes asintomáticas hacia fines de primavera y
otoño, y T. colubriformis, causante de diarreas a fines de otoño-invierno (Fiel et
al., 2013).
Ciclo biológico
El ciclo de los NGI es de tipo directo y consta de una fase parasitaria y una fase
de vida libre. La fase parasitaria se inicia cuando el tercer estadío larvario (L3)
es ingerido por el animal junto con el pasto. Las L3 pierden su envoltura
externa en rumen o abomaso, dependiendo si se localizarán en abomaso o
intestino, respectivamente; en estos lugares comienza la fase histotropa hasta
su desarrollo preadulto (L5). Luego, en la luz del órgano alcanzan la adultez, se
diferencian en machos y hembras, se produce la cópula y las hembras ponen
huevos que alrededor de las 3 semanas comenzarán a hallarse en la materia
fecal de los animales. En el momento que los huevos caen al suelo con las
2
heces comienza la fase de vida libre, en la cual los huevos evolucionarán
dependiendo de la temperatura, humedad y oxigenación y originarán el primer
estadío larvario (L1) que luego muda a larva 2 (L2). Ambos estadíos se
alimentan y tienen poca motilidad, a diferencia de las L3 infectantes que tienen
gran movilidad y no pueden alimentarse al mantener la cutícula de las L2 más
su envoltura externa. Finalmente las L3, si existe suficiente humedad, son
arrastradas fuera de la materia fecal y en la pastura tienen la capacidad de
migrar activamente de acuerdo a la humedad e intensidad lumínica esperando
ser ingeridas por el hospedador y así reiniciar su ciclo (Giudici et al., 2013;
Soulsby, 1987).
Los efectos de la parasitosis por NGI son consecuencia directa de la acción de
los parásitos, e indirecta por la respuesta del organismo, y varían según la
especie animal, la categoría del rodeo/majada y los géneros parasitarios
actuantes. Es de amplio conocimiento que en bovinos, ya sea una explotación
para producción de carne así como tambera, la categoría de mayor riesgo
parasitario es la recría (desde los 6 a los 20 meses de edad), mientras que los
ovinos son susceptibles a las parasitosis durante toda su vida, presentando
mayor riesgo los corderos, borregos diente de leche y ovejas durante el parto y
lactancia (Fiel et al., 2013; Giudici et al., 2013). En general los NGI producen
pérdida del apetito y por lo tanto reducción de la ingesta de alimentos, pérdidas
de sangre y/o proteínas plasmáticas en el tracto gastrointestinal, alteraciones
en el metabolismo proteico, reducción en los niveles minerales, depresión en la
actividad de algunas enzimas intestinales y diarrea; todo esto contribuye a
afectar la salud productiva de los animales produciendo mermas significativas
en la ganancia de peso durante el crecimiento, disminuyendo la calidad y
rendimiento de la res, así como también falta de desarrollo corporal para el
servicio de vaquillonas y disminución de la producción de leche, mientras que
en ovinos a su vez disminuye el crecimiento y calidad de lana (Steffan et al.,
2012; Soulsby, 1987).
3
Periodo de Prepatencia:
3 semanas, salvo (en
bovinos) en primavera que
dura 4 meses (hipobiosis).
Fase parasitaria: L4-L5-Adultos
Fase de vida libre
Ciclo de vida de los nematodos gastrointestinales. Adaptado de Steffan et al.,
2012.
Control actual y sus consecuencias
Como medida de control de los NGI para contrarrestar los efectos mencionados
con anterioridad, en Argentina se adopta casi exclusivamente el uso de
antihelmínticos (ATH) químicos (Caracostantólogo et al., 2013). Sin embargo
su uso desmedido e indiscriminado ha hecho que en la actualidad la aparición
de resistencia a los mismos sea cada día mayor, surgiendo además la
posibilidad de que aumenten los niveles de sus residuos tanto en carne como
en leche, así como también la contaminación del medio ambiente (Nari y
Hansen, 1999). Haciendo hincapié en la resistencia a las drogas utilizadas hoy
en día, cabe mencionar que el impacto que genera en la producción es cada
vez mayor, produciéndose en su mayoría pérdidas subclínicas que favorecen la
diseminación de los genes resistentes, así como también pérdidas clínicas
cuando los géneros involucrados son Haemonchus y Ostertagia (Anziani y Fiel,
2015). Fiel et al. (2011a) demostraron que la resistencia a la ivermectina
4
puede llegar a disminuir hasta el 50% la ganancia diaria de peso en bovinos
durante un período de 90 días de pastoreo. En cuanto a la situación actual en
Argentina, en ovinos ya se han detectado casos de resistencia simultánea a
dos o a varios antihelmínticos (Anziani y Fiel, 2015); en cuanto a bovinos la
resistencia también se incrementó aunque los casos de resistencia múltiple no
son tan numerosos y los imidazotiazoles (levamisol) permanecen aún efectivos
(Anziani y Fiel, 2015). Más recientemente, pero no menos relevante, surge la
importancia que los residuos de los ATH en alimentos están teniendo. Desde el
punto de vista económico, en el 2012 disminuyó la exportación de carnes
termoprocesadas a los EE.UU. por encontrarse residuos de IVM en embarques
de Argentina con ese destino; lo mismo había ocurrido en el 2011 en Brasil,
donde en el 2014 se prohibió la fabricación, el fraccionamiento, la importación
y la comercialización de antiparasitarios de larga duración que contengan
lactonas macrocíclicas (Anziani y Fiel, 2015). Otro inconveniente que se
presenta es que una vez que dichas drogas son eliminadas con la materia
fecal, se produce la contaminación del medio ambiente y los niveles de ATH
que quedan activos generan desórdenes sobre la biodiversidad (ecotoxicidad)
de los organismos que utilizan las heces como medio de alimentación y
desarrollo (Iglesias et al., 2006, 2011, Nari et al., 2013;). Sumado a todo esto,
se encuentra el creciente aumento de las producciones orgánicas en nuestro
país, con una superficie estimada en el 2013 de 3 millones de ha destinadas a
la producción ganadera orgánica (SENASA, 2014), demandando, el muy
limitado o nulo uso de ATH sintéticos.
Alternativas de control
Los inconvenientes que presenta el uso de ATH sintéticos generaron la
búsqueda de alternativas sustentables para el control de los NGI del ganado.
Dentro de las alternativas se encuentran las que buscan estimular la inmunidad
del animal, como son la resistencia genética natural del animal, el desarrollo de
vacunas, así como también el desarrollo inmunitario a partir de la nutrición que
se le brinda al animal. Otro tipo de alternativas que surgieron son las que
actúan directamente sobre los NGI ya sea en su fase parasitaria como de vida
libre. Dentro de este grupo se mencionan los vegetales con propiedades
antihelmínticas, los nutracéuticos y el control biológico (Saumell et al., 2005;
5
Hoste y Torres-Acosta, 2011; Nari, 2011). Hoy en día no se plantea un solo
método de control sino que se busca un control integrado de los parásitos con
el fin de aumentar la producción animal, racionalizar la necesidad del uso de
ATH sintéticos, reducir los riesgos debido a los residuos en productos animales
y disminuir la contaminación y ecotoxicidad por pesticidas; todo esto se logra
combinando estrategias de tratamientos y prácticas de manejo que requerirán
mayor trabajo y monitoreo (Nari et al., 2013).
Control biológico
El control biológico es una de las alternativas más prometedoras; el mismo se
define como “un método ecológico diseñado por el hombre para reducir una
población parasitaria a densidades subclínicas aceptables o para mantener
estas poblaciones en un nivel no perjudicial utilizando antagonistas vivos”
(Grønvold et al., 1996a). El objetivo del mismo no es eliminar la totalidad de los
parásitos sino disminuir su población para así disminuir sus efectos
contraproducentes (Sagüés et al., 2011a) al mismo modo que una baja carga
parasitaria estimule la inmunidad del hospedador.
Artrópodos coprófagos, bacterias y hongos nematófagos han sido estudiados
en mayor o menor medida como agentes de control biológico. Los hongos
nematófagos tienen como ventajas que se pueden combinar con otras
estrategias de control, no generan resistencia, se pueden utilizar en
producciones orgánicas, disminuyen el uso de ATH químicos y, por ende, la
producción de residuos y no se han demostrado efectos adversos ni toxicidad
ambiental; dentro de sus desventajas se encuentran con las limitantes de que
hoy en día no hay productos disponibles en nuestro país, hay escaso control de
las variables ambientales, se necesita mayor conocimiento epidemiológico y
presentan variabilidad en los recursos financieros para desarrollar esta
tecnología a nivel industrial (Etchepare et al., 2004). Los hongos nematófagos
se clasifican en 4 grupos de acuerdo a la manera de actuar sobre sus presas,
1) predadores, que poseen órganos de captura como hifas adhesivas, bulbos
adhesivos, anillos constrictores y no constrictores, o redes bidimensionales y
tridimensionales, los cuales utilizan para atrapar los nematodos de los que se
alimentan; 2) endoparásitos, que son parásitos obligados, por lo que deben ser
previamente ingeridos por los nematodos para desarrollarse dentro de los
6
mismos y producirles su muerte; 3) ovicidas, que son hongos facultativos
saprófitos del suelo y oportunistas que parasitan huevos de NGI y quistes de
nematodos fito-parásitos; y 4) hongos que producen toxinas (Fernández y
Saumell, 2012).
Hongos nematófagos: Duddingtonia flagrans
Sobre hongos nematófagos se basa el presente trabajo, y específicamente uno
en particular que es Duddingtonia flagrans. La elección del mismo se debió a la
alta eficacia (valores de eficacia entre 60 y 90% aplicado a campo) y actividad
predadora que presenta tanto in vitro como in vivo sobre las fases de vida libre
de diversos géneros de nematodos (incluido Nematodirus spp. y Dictyocaulus
viviparus) de distintos hospedadores. A su vez, está comprobado que tiene la
capacidad de atravesar el tracto gastrointestinal en forma de clamidosporas
(forma de resistencia con una gruesa pared que tolera condiciones extremas),
sin que esto modifique su capacidad predadora y siendo inocuas para el
animal. Se suma a esto que las clamidosporas son producidas en gran
cantidad lo que facilita la obtención del material fúngico para los estudios que
se precisen realizar, (Larsen et al., 1992; Fernández et al., 1997; Grønvold et
al., 1999; Larsen, 1999; Saumell, 2002; Fernández y Saumell, 2012;).
Duddingtonia flagrans es administrado de forma oral al animal y eliminado
como clamidosporas por materia fecal, donde desarrolla las formas vegetativas
(hifas y conidios). Pertenece al grupo de hongos predadores por desarrollar
redes tridimensionales adhesivas como órganos de captura, la red posee una
capa mucilaginosa a la que quedan adheridos los nematodos debido al
estímulo de los mismos. Este estímulo dependería en parte de los géneros
parasitarios, por este motivo los géneros que poseen larvas más móviles como
Cooperia, Ostertagia y Haemonchus, estimularían una mayor producción de
redes tridimensionales, caso contrario a lo que sucede con las larvas de
movimientos más lentos, como es el caso de Oesophagostomum (Nansen et
al., 1988). Sin embargo, esto no se cumple con las distintas formas larvarias ya
que a pesar de las L1 y L2 poseer escaso movimiento son más susceptibles a
la acción del hongo que las L3 que, al conservar la vaina de la L2, son más
resistentes a la mortalidad que el hongo pueda originarle (Nansen et al., 1986).
7
Nematodo atrapado en la
red tridimensional (Grønvold
et al., 1993)
La formación de la red
tridimensional comienza por
una rama lateral que crece
fuera de la hifa (Grønvold et
al., 1996b).
Formación de una clamidospora a partir de una hifa (a-c); (d) clamidospora
madura con las protuberancias en su superficie (Grønvold et al., 1996b).
Microscopia
electrónica
de
una
clamidospora madura de D. flagrans
(Grønvold et al., 1996b).
8
Duddingtonia flagrans coloniza la materia fecal de los rumiantes como esporas
y una vez que germina actúa sobre la fase no parasitaria de los NGI y debido a
que más del 95% de la población total de parásitos se encuentra en el
ambiente (Herd, 1985), actuaría sobre el punto de mayor importancia para el
control, disminuyendo el número de L3 en la materia fecal y por consiguiente la
infectividad de las pasturas (Wright et al., 2003; Ketzis, 2006). Por lo tanto, el
substrato de desarrollo y acción nematófaga del hongo es la materia fecal y es
ahí donde ocurre la interacción hongo-parásito, siendo el hongo afectado por
factores abióticos (clima y suelo) y bióticos (coprofauna, fungistasis y pasturas),
como así también por las características físicas de la materia fecal, las que van
a depender tanto de la especie animal como de la dieta que reciban los mismos
(Saumell et al., 2008). En este sentido, Grønvold et al. (1999) evaluaron la
influencia de estos factores y demostraron que a temperatura constante de
20ºC y 30ºC y siendo estimulado por L3 de C. oncophora, D. flagrans formó
redes tridimensionales eficazmente, y que la máxima cantidad de esas redes la
alcanzó al día uno post-estimulación. En cuanto al volumen de oxígeno, el
hongo no creció en anaerobiosis; sin embargo, en una atmósfera microaerófila
(6% vol O2) creció en forma similar a lo propio en una atmósfera normal (21%
vol O2). Otro factor que estos autores estudiaron fue el pH, siendo entre 7 y 8 el
óptimo para la producción de redes tridimensionales. A su vez, incubaron al
hongo tanto en materia fecal seca como húmeda durante 15 días y midieron el
crecimiento del micelio, el cual fue mayor en la materia fecal húmeda (15-20
mm) que en la seca (7-10 mm); por último observaron que D. flagrans produjo
más redes tridimensionales cuando mayor fue el número de L3 con las que se
incubó. En cuanto a las características de las heces, D. flagrans tiene la
capacidad de desarrollar tanto en materia fecal bovina como ovina, lo que
demuestra su gran versatilidad en la naturaleza (Fernández y Saumell, 2012).
Según su capacidad de crecimiento en el ambiente, D. flagrans se clasifica
dentro del grupo de los hongos nematófagos no formadores espontáneos de
trampas, que tiene como característica la capacidad saprófita, por lo que
poseen mayor resistencia en el ambiente (Saumell et al., 2008). Ante esta
particularidad cabe destacar que el uso masivo de este hongo no afecta las
tasas de degradación de la materia fecal, ni modifica el número de los
9
microartrópodos, la macrofauna ni las lombrices de tierra, así como también
está corroborado que no tienen un efecto relevante sobre los nematodos del
suelo (Fernández y Saumell, 2012; Saumell et al., 2015). Todo esto indicaría
que el uso del hongo como agente de control biológico no genera impacto
ambiental en los aspectos evaluados.
Se han estudiado varias formas de vehiculizar las esporas del hongo de
manera práctica para su administración oral al ganado, entre las cuales se
encuentran los granos de cereales, bloques minerales, bloques energéticos,
pellets de alginato, bolos de liberación controlada (Sagüés, 2011a). Se utilizan
las clamidosporas debido a que se ha comprobado su capacidad de sobrevivir
a los procesos industriales de manufactura de pellets para alimentación animal
(Arias et al., 2015), siendo en la actualidad los pellets nutricionales elaborados
en México los únicos disponibles en el mercado que, además de contener
clamidosporas de D. flagrans, son fuente de energía y proteína (Mendoza de
Gives y Valero Coss, 2009). En lo que a la Argentina respecta, no se encuentra
disponible en el mercado, sin embargo se han utilizado experimentalmente
bloques energéticos con clamidosporas de D. flagrans en ovinos infectados
naturalmente con NGI, obteniéndose reducciones del 100% para H. contortus y
T. circumcinta, 89.9% contra T. colubriformis, 87.5% contra C. oncophora y
90% contra T. axei (Sagüés et al., 2011b)
Materiales y métodos
Diseño experimental
El ensayo fue llevado a cabo del 2 al 30 de marzo del 2015 en una parcela
experimental ubicada en el predio de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
UNCPBA en Tandil. Previamente se recolectó materia fecal de ovinos y
bovinos infectados con NGI. De ovinos en total se juntaron 9 kg de materia
fecal que fue ligeramente desmenuzada manualmente y mezclada, y con la que
se realizaron tres conteos de huevos de nematodos (hpg) para asegurar la
homogeneidad de la misma. La materia fecal se dividió en 2 partes iguales, una
de las cuales fue adicionada con clamidosporas de D. flagrans. Posteriormente,
cada parte fue dividida en 22 porciones de 200 g cada una. De bovinos se
10
colectaron 25 kg de materia fecal que fue homogeneizada manualmente y se
procedió igual que con la de ovinos: se realizaron tres hpg para asegurar su
homogeneidad; una vez corroborado esto, se dividió en dos y a una mitad se le
agregó clamidosporas de D. flagrans, luego se armaron 22 porciones
individuales de 500 g de materia fecal cada una para los grupos tratados y con
la mitad que quedó sin tratar se hicieron 22 porciones individuales con la
misma cantidad para los grupos controles.
Luego que se prepararon las porciones individuales, las mismas fueron
llevadas a la parcela de pastura consociada y se depositaron de la siguiente
manera: la mitad de las porciones tratadas y controles se depositaron en un
sector que se encontraba expuesto al sol, mientras que la otra mitad se
depositaron en un sector cubierto con una media sombra (bloqueaban 80-90%
la irradiación solar) para que estuvieran bajo sombra continua. De manera que
tanto en el sector al sol como en el sector a la sombra se depositaron 44
muestras, las cuales consistieron en 10 controles y 10 tratadas de ovinos, y 10
controles y 10 tratadas de bovinos, y las restantes 4 se establecieron como
deposiciones artificiales centinelas, uno por cada grupo. Estas deposiciones
centinelas permitieron detectar, mediante muestreos semanales, la aparición
de L3 en la materia fecal, y así determinar el momento oportuno de comenzar a
muestrear la pastura. Todas las masas fecales fueron colocadas sobre rejillas
plásticas de 1 cm de apertura y de un tamaño de 10 x 10 cm y de 15 x 15 cm
para ovinos y bovinos, respectivamente. Estas rejillas facilitaron la recuperación
de las deposiciones fecales a la vez que permitieron la interacción natural entre
suelo y materia fecal de la micro y macrofauna. Las deposiciones se colocaron
a 1,5 m de distancia entre una y otra. Las muestras extraídas de las
deposiciones centinelas pesaron 12-21g (ovinos) y 25-37g (bovinos). Con estas
muestras se realizó la recuperación de larvas mediante la técnica de
Baermann.
Con los resultados de los muestreos de las deposiciones centinelas a la
semana 1 se decidió comenzar con el primer muestreo de pasto a la semana
siguiente (día 16 post-deposición), mientras que el segundo muestreo y las
deposiciones fecales se recolectaron dos semanas después (30 días postdeposición). Las deposiciones fecales recolectadas fueron sometidas a la
11
técnica de Baermann para recolectar las L3 remanentes. Las larvas extraídas
tanto del pasto como de la materia fecal fueron conservadas a 5ºC para su
posterior conteo e identificación.
Con parte de la materia fecal tratada y control se realizaron 40 coprocultivos,
10 de cada grupo (ovino control y tratado, bovino control y tratado) para
establecer los géneros presentes en la infección parasitaria y corroborar la
actividad predadora del hongo bajo condiciones de laboratorio.
Parcela experimental
La parcela seleccionada se encontraba libre de animales en pastoreo, sin
embargo, previo a la deposición de las masas fecales artificiales, se recolectó
pasto de la parcela para corroborar la ausencia de L3 de NGI de rumiantes
que pudieran influir en los resultados finales. El suelo de la parcela es
caracterizado como argiudol típico, cubierto por una pastura compuesta por
trébol blanco (Trifolium repens), trébol rojo (T. pratense), raigrás (Rye grass) y
pasto ovillo (Dactylis glomerata) (Iglesias et al., 2004).
Donantes de materia fecal
En el caso de ovinos se utilizaron machos Corriedale de 8 meses de edad,
experimentalmente infectados con H. contortus y mantenidos en la Chacra de
la Facultad de Ciencias Veterinarias de Tandil. Las muestras de materia fecal
de ovinos se extrajeron colocándole a los mismos arneses de colecta y
recolectándola a intervalos de 24 Hs. En cuanto a bovinos, se utilizaron
terneros Holando Argentino naturalmente infectados con NGI y que no
recibieron tratamientos químicos, pertenecientes a un tambo comercial cercano
a la unidad experimental. La materia fecal se recolectó como pool fresco a
primera hora de la mañana después de encerrar a los animales en corral con
piso de cemento para permitir la defecación. Se realizó conteo de hpg de la
materia fecal y luego se conservó a 5ºC en una cámara hasta su utilización.
Material fúngico
Se utilizaron clamidosporas de una cepa local de D. flagrans mantenida en el
laboratorio de Parasitología y Enfermedades Parasitarias (Saumell et al., 2015),
las cuales previamente habían sido sembradas en una placa de agar agua con
12
el agregado de Panagrellus sp. para estimular el desarrollo del hongo y así
poder corroborar su capacidad de crecimiento y desarrollo (formar hifas, redes
tridimensionales y micelios) y su utilidad para el ensayo. La cepa que se usó
fue sembrada el 2-07-2014 y cosechada 28 días después. La cantidad de
material fúngico que se utilizó fue de 11.000 clamidosporas/g de materia fecal;
la decisión de usar dicha cantidad surgió de ensayos previos realizados en el
mismo laboratorio (Fernández, S., comunicación personal).
Monitoreo de temperatura
La temperatura dentro de las deposiciones fecales fueron monitoreadas
mediante la introducción en las mismas de sensores electrónicos (Datalogger
Hygrochron iButton®), uno para cada uno de los 8 grupos. Cada sensor se
colocó en una deposición seleccionada al azar.
Las temperaturas ambientales se obtuvieron de la Estación Meteorológica del
Campus Universitario de la UNCPBA, perteneciente al Instituto de Hidrología
de Llanuras “Dr. Eduardo J. Usunoff” y las mismas fueron medidas a 2 m de
altura con respecto al suelo.
Técnicas de laboratorio
Los conteos de huevos por gramo (hpg) se realizaron mediante la técnica Mc
Master modificada (Fiel et al., 2011).
Los coprocultivos se realizaron mediante una técnica estándar (Fiel y cols,
2011) y luego de un período de incubación de 14 días a 22-24 ºC, las L3 fueron
recuperadas mediante la técnica estándar de migración larval de Baermann.
Las L3 se mantuvieron refrigeradas a 4ºC hasta su posterior conteo e
identificación (Niec, 1968) bajo el microscopio óptico.
Los lavados de pastos se realizaron mediante técnica estándar (Ministry of
Agriculture, Fisheries and Food, 1986) con la modificación que después del
lavado se sacó el pasto, se escurrió y se colocó en bolsas de red para su
secado, y una vez que este alcanzó un peso constante en el tiempo, ese peso
fue el que se expresó en materia seca. En cuanto a las L3 recuperadas, las
mismas se conservaron a 5ºC para su posterior lectura e identificación. La
13
infectividad del pasto se expresó como número de larvas por kg de pasto seco
(PS) usando la fórmula:
L3/ kg PS= (Nº de L3 contadas/ peso del PS en g) x 1.000
Con las deposiciones fecales recolectadas de la parcela se realizó un
macrobaermann (Grønvold, 1984) durante 48 hs, luego con el líquido
recuperado se realizó otro Baermann (Fiel et al., 2011). Previo a realizar la
recuperación de larvas, fue necesario sumergir la materia fecal bovina en agua
por 3-4 h para lograr un correcto desmenuzado de la misma y recuperando el
agua utilizada para este fin junto con la materia fecal.
Análisis estadísticos
Los análisis estadísticos fueron realizados usando el software GraphPad Prism
(GraphPad Software, Inc), versión 5.04. En todos los casos se realizó el Test
no paramétrico Kruskal-Wallis y el post-test Dunn siendo para todos el intervalo
de confianza de 95%.
Resultados
Coprocultivos
Bajo condiciones de laboratorio controladas los coprocultivos de ovinos
mostraron buen desarrollo larval. Partiendo de que la materia fecal de ovinos
presentaba un Hpg promedio de 3007 huevos, y de acuerdo a lo recuperado en
los controles, hubo un 64,2% de desarrollo larval, mientras que en bovinos ese
porcentaje fue de 24% de acuerdo a los 237 Hpg promedio. En cuanto a los
géneros
que
se
presentaron
en
ovinos,
sabiendo
que
estaban
experimentalmente infectados, predominó Haemonchus siendo 99,7 y 99,5 %
en control y tratado, respectivamente, las larvas restantes fueron de
Oesophagostomum. Los géneros en bovinos fueron más variados presentando
los
controles
42,5%
de
Ostertagia,
16,7%
Trichostrongylus,
17,5%
Haemonchus, 22,3% Cooperia y 1% Oesophagostomum y para los tratados
29,6% de Ostertagia, 23,1 % Trichostrongylus, 17,5% Haemonchus, 28,8%
Cooperia y 1% Oesophagostomum. Con respecto a la eficacia del hongo
(Gráfico 1), la misma resultó de 31,6 % en la materia fecal de ovinos y de 44%
14
en la de bovinos, en ambos casos no se halló diferencia significativa entre el
grupo control y tratado (P>0,05).
25000
L3/10 g MF
20000
15000
10000
31.6%
5000
44%

B
T
B
C
O
T
O
C
0
Gráfico 1: promedio de L3 recuperadas por 10g de materia fecal de
ovino control (OC), ovino tratado con D. flagrans (OT), bovino control
(BC) y bovino tratado con D. flagrans (BT). Se muestran los porcentajes
de eficacia de D. flagrans.
Larvas en pasto
En la recuperación de larvas del pasto (Gráfico 2) no se detectaron diferencias
estadísticas significativas entre tratados y controles debido al bajo número de
L3 que en general fue recuperado. La única diferencia con significancia
estadística fue la que se encontró entre OCS 30 y OCSb 30 (P<0,01). En el
apéndice se adjunta el total de L3/kg de PS para los controles y para los
tratados, a su vez se adjunta un cuadro con los pesos promedio de PS de cada
grupo.
15
40
35
30
L3/kg PS
25
20
15
10
5

16
O
TS
b
16
B
C
S
16
B
TS
16
B
C
Sb
16
B
TS
b
16
O
C
S
30
O
TS
30
O
C
Sb
30
O
TS
b
30
B
C
S
30
B
TS
30
B
C
Sb
30
B
TS
b
30
Sb
16
O
C
O
TS
O
C
S
16
0
Gráfico 2: Promedios y sus respectivos desvíos estándar de L3 por kg
de pasto seco que fueron recuperadas a mitad (día 16) y al final (día 30)
del ensayo. O: ovinos, B: bovinos, C: controles, T: tratados, S: sol, Sb:
sombra.
Larvas en materia fecal
En cuanto a la recuperación de las L3 de la materia fecal, no se encontró
diferencia significativa entre los grupos controles y tratados; pero hubo
diferencias significativas entre muestras depositadas al sol y a la sombra en el
caso de la materia fecal de bovinos, es decir, entre el BCS y BCSb (P<0,001) y
entre BTS y BTSb (P<0,05). El Gráfico 3 muestra el promedio del total de
larvas recuperadas en el total de materia fecal de cada grupo. Al ser tan bajo el
número de L3, expresarlas en L3/ g de materia fecal no permitió apreciar si
hubo diferencia alguna, por lo que el mismo se encuentra adjunto en el
apéndice (Apéndice: Gráfico 2).
16
3000
2500
2000
1500
1000
500
200
180
L3
160
140
120
100
80
60
40
20

TS
b
B
Sb
C
B
B
TS
S
C
B
O
TS
b
O
C
Sb
O
TS
O
C
S
0
Gráfico 3: promedio del total de L3 que se recuperaron de cada grupo al
finalizar el ensayo. O: ovinos, B: bovinos, C: controles, T: tratados, S:
sol, Sb: sombra.

En cuanto al peso de la materia fecal recuperada, en el cuadro siguiente se
detalla el promedio de pesos por grupo y entre paréntesis el desvió estándar de
los mismos.
Tabla 1: peso (g) de la masa fecal recuperada al finalizar el ensayo
Día
30
Grupos
Ovino
Bovino
CS
81,52 (11,8)
81,37 (2,2)
TS
56,63(16,3)
82,86(2,9)
CSb
73,62 (11,3)
98,13 (12,1)
TSb
37,51 (15,5)
91,2 (6,5)
El peso de la materia fecal, sobre todo en el caso de bovinos que se usaron
500g, refleja el grado de deshidratación que sufrió durante los 30 días en la
17
pastura. La materia fecal de bovino recuperada en promedio de todos los
grupos fue de 88,4g lo que representa el 17,7% de lo que había en un principio.
Con las deposiciones de ovinos, en cambio, fue menos brusco debido a que de
por sí ya es más seca, sin embargo, al poseer menor contenido acuoso se seca
menos pero más rápido. Por otra parte, la comparación de pesos de las
deposiciones fecales recuperadas refleja que la inclusión masiva de
clamidosporas no modificó las características físicas de la materia fecal.
Temperaturas ambientales y dentro de la materia fecal
Las condiciones ambientales entre el 1 y el 30 de marzo fueron típicas de un
verano caluroso y seco, esto se debió a las temperaturas registradas y a que
no hubo registro de precipitaciones durante esos 30 días. Las temperaturas
registradas tuvieron un rango de 5,6-33ºC con un promedio de 20ºC. Se
tomaron como límites de temperaturas de supervivencia larval las que tienen
H. contortus y Ostertagia en laboratorio, debido a que fueron éstos los géneros
predominantes en los coprocultivos de ovinos y bovinos respectivamente. La
temperatura ambiental fue registrada cada 15 minutos, mientras que la
temperatura dentro de la materia fecal fue registrada mediante sensores cada
30 minutos.
Temperaturas en materia fecal de ovinos:
La temperatura registrada dentro de la materia fecal de ovinos por los sensores
fue mayor en las deposiciones al sol que a la sombra, superando en el OTS los
37ºC un total 75 h y en el caso de OCS 38 h, mientras que a la sombra no
alcanzó esa temperatura, sin embargo, en un total 34 h se encontró por encima
de los 30ºC el OCSb y 19 h en el OTSb.
18
50
45
Temperatura (ºC)
40
37
35
30
25
20
15
10
5
0

2
4
6
8
10
12
14 16 18 20
Marzo 2015 (días)
22
24
26
28
OTS - T max
OTSh - T max
OCS - T max
OCSh - T max
OTS - T min
OTSh - T min
OCS - T min
OCSh - T min
T ambiente max
T ambiente min
30
Gráfico 4: Temperaturas máximas (T max) y mínimas (T min) registradas
por los sensores dentro de las deposiciones de cada grupo, y
temperatura
ambiental
máxima
y
mínima
durante
el
periodo
experimental. La línea horizontal a 37ºC marca el límite de supervivencia
para H. contortus en condiciones de laboratorio (Mahmood, 1974).
Temperaturas en materia fecal de bovinos:
Se registraron temperaturas por encima de los 35ºC en la materia fecal de
bovinos en un total de 63 y 91 h para los grupos BCS y BTS respectivamente,
no siendo esta temperatura superada en la sombra, donde se registraron
temperaturas superiores a los 30ºC por 34 y 26 h para los grupos BCSb y
BTSb respectivamente (Gráfico 5).
19
50
45
Temperatura (ºC)
40
35
30
25
20
15
10
5
0

2
4
6
8
10
12
14 16 18 20
Marzo 2015 (días)
22
24
26
28
30
BTS - T max
BTSh - T max
BCS - T max
BCSh - T max
BTS - T min
BTSh - T min
BCS - T min
BCSh - T min
T ambiente max
T ambiente min
Gráfico 5: Temperaturas máximas (T max) y mínimas (T min) registradas
por los sensores dentro las deposiciones de cada grupo, y temperatura
ambiental máxima y mínima. La línea horizontal a 35ºC marca el límite
de supervivencia para Ostertagia en condiciones de laboratorio (Pandey,
1992).
Discusión
Los resultados obtenidos evidenciaron que el ambiente tuvo un fuerte efecto
sobre la supervivencia larval pero no así sobre su desarrollo. Los huevos
fueron capaces de eclosionar y las fases pre-infectivas lograron desarrollar
según lo evidenciado por las deposiciones centinelas (Tabla 2 del Apéndice),
que mostraron que a los 9 días post-deposición ya había un alto desarrollo de
L3. La fase de vida libre de los NGI es controlada por los factores climáticos,
siendo la temperatura y humedad los que mayor influencia tienen sobre la
epidemiología de los mismos (O'Connor et al., 2006). La temperatura óptima de
20
las L3 de H. contortus es de 30ºC con límite máximo de 37ºC siendo 27 días la
supervivencia de las L3 a esa temperatura (Mahmood, 1974). El bajo número
de L3 recuperadas se debió a las altas temperaturas alcanzadas en el mes de
marzo del 2015 tanto en el ambiente como dentro de la materia fecal. Las
temperaturas altas aceleran el metabolismo y la movilidad de las L3 que
consumen su reserva energética y por ende disminuye el tiempo de sobrevida
de las mismas en el medio (Rossanigo, 1999). A su vez la falta de
precipitaciones durante este periodo hizo que a las altas temperaturas se le
agregue una desecación extrema de la materia fecal, sabiendo que cuanto más
rápida sea la desecación sobrevivirán menos larvas y por menos tiempo (Fiel et
al., 2013). Al respecto, Rossanigo (1999) demostró que entre 25 y 30ºC la
sobrevida promedio de las L3 no fue mayor a 30 días en un verano donde el
27% de los días la temperatura superó los 30ºC. A modo de comparación, en el
presente ensayo se registraron temperaturas mayores a 30ºC en el 36,7% de
los días. También Williams y Mayhew (1967) notaron que desde fines de
primavera a fines de verano se produjo la reducción más abrupta en el número
de larvas y coincidió con el tiempo más corto de supervivencia larval. Por su
parte, Bessier y Dunsmore (1993), comprobaron que durante un verano seco y
caluroso, cuando las pasturas estaban completamente secas, las L3 no
desarrollaban, generándose así una efectiva barrera para H. contortus. Los
mismos autores realizaron otro ensayo donde a la materia fecal la colocaron en
una parcela con pasturas perennes verdes y así demostraron que a mayor
cantidad de material vegetal verde, más se incrementó el periodo de
supervivencia de las L3 en verano, esto se debe a la humedad que aporta la
vegetación. El presente ensayo concuerda con el primer caso descripto por
estos autores, ya que el pasto había sido cortado previamente al ensayo y,
gracias a las altas temperaturas y a la ausencia de lluvias, no creció en
absoluto como para ser una fuente extra de humedad para las deposiciones
fecales; esto se refleja en el bajo peso de las deposiciones fecales al final del
ensayo debido a la alta pérdida de humedad experimentada. El nivel de
material vegetal verde influye en la humedad de la deposición fecal, tanto
directamente como determinante del contenido acuoso de la materia fecal
eliminada por el animal, como indirectamente por el efecto de microclima dado
por especies vegetales en la pastura evitando o retardando la desecación
21
(O'Connor et al., 2006). El efecto sombra tuvo mejor respuesta en cuanto al
número de larvas obtenidas, sin embargo este número fue tan bajo que no se
puede afirmar que la sombra evita la muerte de las larvas; lo que sí se constató
fue que bajo estas condiciones los grupos tratados no mostraron diferencias en
los números de L3 ni en la sombra ni expuesto al sol en comparación con los
controles.
Lo mencionado en el párrafo anterior justifica el bajo número de larvas
recuperadas pero no esclarece lo que pudo haber pasado con D. flagrans. La
eficacia del hongo no pudo establecerse porque las larvas no sobrevivieron, y
al haber tan bajo número de larvas tanto en deposiciones controles como
tratadas, ese efecto no se le puede atribuir al hongo sino más bien a un efecto
ambiental. No hay resultados certeros de lo que ocurrió con las clamidosporas
de D. flagrans ya que en este sentido no se analizó la materia fecal post
ensayo en busca de las mismas. Sin embargo, muchos estudios previos
pueden llegar a dilucidar y predecir lo ocurrido. En este sentido, es sabido que
D. flagrans es capaz de producir trampas entre 10 y 30ºC sin embargo la
destrucción de las redes es mayor a 30ºC que a 20ºC, esto se explica porque a
30ºC hay una fuerte actividad microbiológica, lo que resulta en una lisis de las
hifas y redes (Grønvold et al., 1999). La actividad predadora de D. flagrans se
ve afectada in vitro por encima de los 35ºC, mientras que estudios realizados
en el ambiente a temperaturas fluctuantes entre 13 y 51ºC expuestos al sol
demostraron una eficacia del 77,4% mientras que a la sombra, al ser menor el
rango de temperatura, la eficacia fue del 100% (Sagüés et al., 2009). En un
estudio realizado in vitro simulando 4 regímenes de temperaturas en la época
típica de partos de ovejas en Australia (6-19ºC, 9-25ºC, 14-34ºC y 14-39ºC)
para simular la variación diurna normal de temperatura, se obtuvo una eficacia
promedio contra larvas de H. contortus de 96.4% indicando que las
temperaturas no son una barrera para el uso de D. flagrans como control
biológico bajo esas condiciones (Kahn et al., 2007). Otro estudio, evaluó el
crecimiento radial y la actividad predadora in vitro bajo tres regímenes
diferentes de temperaturas constantes y fluctuantes (Fernández et al., 1999).
Este estudio mostró la mayor tasa de crecimiento fúngico a temperatura
constante de 20ºC. Al incubarse coprocultivos con C. oncophora durante 14
22
días bajo los mismos regímenes de temperaturas, se obtuvo una eficacia de
63-98% a 20ºC constantes en comparación con 0-25% de eficacia obtenida a la
misma temperatura pero fluctuante con picos de 35ºC. Con esos datos se
concluyó que 35ºC, incluso por pocas horas al día, era una temperatura
demasiado alta y que, además, afectó también negativamente el número de
larvas desarrolladas según se vio reflejado en los controles. Los autores
estimaron, por lo tanto, que no fueron los cambios de temperatura en sí lo que
afectó al desarrollo larval y del hongo sino que la temperatura se elevó por
encima de los límites superiores de supervivencia tanto para D. flagrans como
para las L3. Al respecto, Peloille (1991) registró un límite superior para el
crecimiento de D. flagrans de 35ºC, no encontrando desarrollo a los 37ºC. Es
de destacar la capacidad de D. flagrans de crecer en sustratos pobres o con
poca humedad y su intensa capacidad saprófita, sin embargo su desarrollo es
mayor en condiciones de periodos lluviosos, lo que coincide con el mayor
desarrollo de las formas de vida libre de los NGI de rumiantes (Saumell et al.,
2008). Las condiciones ambientales toman importancia en determinar la
velocidad de inducción de la actividad predadora del hongo y en consecuencia
la eficacia de este método (Paraud et al., 2006). Con todo lo anteriormente
mencionado, es de esperar que D. flagrans no haya tenido la capacidad de
crecimiento y de actividad predadora que se esperaría. A esto hay que
agregarle que las altas temperaturas habrían sido también responsables de los
bajos números de larvas, los que no habrían sido suficientes como para
estimular el desarrollo y crecimiento del hongo. Sumado a la temperatura y
humedad como último, pero no menos relevante para tener en cuenta, es la
observación cualitativa de la ausencia de macrofauna en las deposiciones
recuperadas, por lo que se podría pensar en que esa materia fecal no se
encontraba en condiciones óptimas en un principio de oxigenación y luego de
humedad para el desarrollo de la misma, factores que adquiere importancia
tanto para las larvas como para el hongo.
El diseño experimental descripto en esta tesina fue realizado en la primavera
del 2014, durante 28 días, con temperaturas promedio dentro de las
deposiciones fecales al sol de 17,1ºC y 16,7ºC para ovino y bovino
respectivamente y a la sombra de 14,17ºC para ovino y 15ºC para bovino.
23
Dicho ensayo mostró reducciones en la recuperación de L3 ovinas en pasto de
92,8% (P<0,0001) en el sol y 77,9% (P=0,14) en la sombra, mientras para
bovinos esta reducción fue de 88,6% (P=0,00011) expuesto al sol y de 72,2%
(P=0,0265) bajo la sombra (Fernández et al., 2015). Otro ensayo con similares
características realizado en esta zona a fines de primavera-principios de verano
del 2012, con temperaturas medias ambientales entre 15 y 20ºC y picos de casi
33ºC (similar al presente ensayo) y precipitaciones acumuladas de 65 mm en
15 días, dieron un total de reducción a la sombra de 92,3% (P<0,0001) y al sol
de 58,7% (P<0,01) (Bilotto, 2013). Este último estudio da una idea de lo que se
supone sucedió con la materia fecal bajo sombra en el presente ensayo. Si
bien no se alcanzaron las temperaturas límites de supervivencia larval (como
sucedió con las deposiciones expuestas al sol), hubo una alta mortandad de L3
debido a la ausencia de humedad por la falta de precipitaciones, que hizo que
la desecación fuera un factor determinante en dicha mortandad.
Con respecto a la baja eficacia del hongo que se obtuvo en los coprocultivos
bajo condiciones controladas de laboratorio, esta pudo deberse a una falla en
el almacenamiento de las clamidosporas de D. flagrans utilizadas en el
presente ensayo. Esto puede ser posible porque se corroboró su eficacia
previamente al ensayo sólo cualitativa pero no cuantitativamente, es decir, sólo
se comprobó que las clamidosporas podían desarrollar su capacidad predadora
al adicionar nematodos del suelo pero sin cuantificar los niveles de predación.
La atribución a las malas condiciones de almacenamiento se debe a que desde
fines de julio a la fecha de su utilización las mismas fueron mantenidas en
forma líquida bajo refrigeración, lo que las pudo haber afectado, sabiendo que
la exclusión del agua frena el metabolismo fúngico, la depleción de nutrientes,
la acumulación de metabolitos tóxicos y la desnaturalización de proteínas. Se
puede suponer entonces que la eliminación del agua hubiese asegurado la
estabilidad, viabilidad y actividad post-almacenamiento (Burges y Jones, 1998
citados por Etchepare et al., 2004). Esto se constata porque previamente, en la
primavera del 2014, se utilizó el mismo lote de clamidosporas, que tenía menos
tiempo de almacenamiento y la eficacia fue mayor, lográndose para ovinos una
eficacia del 78,3% (P<0.05) mientras que para bovinos fue de 67,7%(P<0.05)
(Fernández et al., 2015).
24
Conclusiones
Bajo las condiciones experimentadas durante el presente ensayo, de altas
temperaturas y sequedad extrema durante los 30 días, no se puede concluir si
D. flagrans puede o no aplicarse en verano. Sin embargo, sí se puede asegurar
que de llegar a presentarse finales de veranos con similares condiciones, el
uso de este método como control biológico no sería necesario porque el
ambiente por si sólo ya estaría disminuyendo las formas de vida libre de los
NGI parásitos de rumiantes en la pastura.
Cabe recordar que el control biológico con D. flagrans no puede usarse aislado
para controlar los NGI, necesita complementarse y ser incorporado dentro de
un sistema de control integrado de parásitos. En este sentido, el efecto
ambiental debe ser tenido en cuenta como parte de ese manejo integrado,
destacando la necesidad de más estudios a campo que determinen la relación
entre las variables climáticas en el ambiente y la temperatura y humedad
dentro de la materia fecal, y de esta forma tener las herramientas para tomar
decisiones precisas y específicas adaptadas a cada sistema productivo en
cada estación en particular.
En cuanto a la forma de almacenamiento del hongo, en ensayos futuros donde
se utilicen clamidosporas de D. flagrans, se deberá tener la cautela de
conservarlas con la menor cantidad de líquido posible y, de no ser posible, usar
las clamidosporas que hayan estado almacenadas por menos tiempo.
Debiendo, de ser necesario, un mes previo a un ensayo, sembrar más
clamidosporas y así asegurarse de que no estén influidas por ningún efecto de
almacenamiento, así como también pruebas que garanticen la viabilidad y
actividad fúngica.
Bibliografía
Anziani, O. S.; Fiel, C. A. (2015). Resistencia a los antihelmínticos en
nematodos que parasitan a los rumiantes en la Argentina. Revista de
Investigaciones Agropecuarias. 41, 34-46.
Arias, M. S.; Cortiñas, F. J.; Riádigos, S.; Cazapal-Monteiro, C.; Arroyo, F.;
Hernández, J. A.; Suárez, J.; Ramírez, M.; Francisco, I.; López-Arellano, M. E.;
25
Sánchez-Andrade, R.; Mendoza de Gives, P.; Paz-Silva, A. (2015). Industrial
Pelleting of Feed with Fungal Spores to Prevent Equine Strongylosis.
Proceedings of the 25th International Conference of the WAAVP, 16-20 de
Agosto, Liverpool, Inglaterra.
Bessier, R. B., Dunsmore, J. D. (1993). The Ecology of Haemonchus
contortus in a Winter Rainfall Region in Australia: The Development of Eggs to
Infective Larvae. Veterinary Parasitolology. 45, 275–292.
Bilotto, F. M. 2013. Bioecología de Hongos Nematófagos para el Control de
Nematodos Parásitos de Rumiantes y Equinos. Informe de Beca de
Entrenamiento, Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de
Buenos Aires, 45 p.
Burges, H. D.; Jones, K. A. (1998). Trends in formulation of microorganisms
and future research requirements. In: Formulation of Microbial Biopesticides,
Beneficial Microorganisms, Nematodes and Seed Treatments (H. D. Burges,
ed.), pp.311–332. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.
Caracostantógolo, J.; Anziani, O. S.; Romero, J.; Suárez, V.; Fiel, C.
(2013). Resistencia a los Antihelmínticos en Argentina, pp. 257-299. En: C. Fiel
y A. Nari (eds.), Enfermedades Parasitarias de Importancia Clínica y Productiva
en Rumiantes. Fundamentos Epidemiológicos para su Prevención y Control.
Editorial Hemisferio Sur, SRL, Montevideo, Uruguay.
Etchepare, J. M; Saumell C. A; Freije, E. E. (2004). Hongos Nematófagos
Arthrobotrys conoides y Duddingtonia flagrans. Evaluación In-vivo de Pasaje a
Través del Tracto Gastro-intestinal, e In-vitro, Reducción de L3 de
Trichostrongilideos en Ovinos con Infección Natural. Tesina de Grado. Dpto.
SAMP, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA. 48p.
Fernández, A. S.; Larsen, M.; Nansen, P.; Grønvold, J.; Henrikzen, S. A.;
Wolstrup, J. (1997). Effect of the nematode-trapping fungus Duddingtonia
flagrans on the free-living stages of horse parasitic nematodes: a plot study.
Veterinary Parasitology. 73, 257-266.
26
Fernández, A. S.; Larsen, M.; Wolstrup, J.; Grønvold, J.; Nansen, P.; Bjørn,
H. (1999). Growth Rate and Trapping Efficacy of Nematode-trapping Fungi
under Constant and Fluctuating Temperatures. Parasitology Research. 85, 661668.
Fernández, A. S.; Saumell, C. A. ( 2012). Biological Control of Parasites
in Veterinary Medicine, pp 309-340. En: A. Paz Silva M. S. Arias Vázquez
(eds.), Fungi: Types, Environmental Impact and Role in Disease, Nova Science
Publishers Inc.: New York, USA, ISBN 978-1-61942-671-9, p. 309-340.
Fernández, S.; Sagües, F.; Iglesias, L.; Zegbi, S.; Saumell, C. (2015).
Trapping Behaviour of the Biological Control Agent Duddingtonia flagrans
against Gastrointestinal Nematodes of Sheep and Cattle in the Environment
under Spring Conditions. Proceedings of 25th International Conference of the
World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology, 16-20 de
Agosto, Liverpool, Inglaterra.
Fiel, C.; Steffan, P.; Entrocasso, C. (2013). Epidemiología e Impacto
Productivo de Nematodos en la Pampa Húmeda, pp. 29-58, En: C. Fiel y A.
Nari (eds.), Enfermedades Parasitarias de Importancia Clínica y Productiva en
Rumiantes. Fundamentos Epidemiológicos para su Prevención y Control.
Editorial Hemisferio Sur, SRL, Montevideo.
Fiel, C.; Guzman, M.; Steffan, P.; Riva, E.; Rodríguez, E. (2011a). Cattle
Worms
Resistance
to
Ivermectin
Treatments:
Effects
on
Production.
Proceedings of 23rd International Conference of the World Association for the
Advancement of Veterinary Parasitology, 21-25 de Agosto, Buenos Aires,
Argentina.
Fiel, C. A.; Steffan, P. E.; Ferreyra, D. A. (2011b). Diagnóstico de las
Parasitosis más Frecuentes de los Rumiantes: Técnicas de Diagnóstico e
Interpretación de los Resultados. Primera edición, Abad Benjamín. Tandil,
Argentina.131p.
Giudici, C.; Entrocasso, C.; Steffan, P. (2013). Biología, Fisiopatología e
Inmunidad en Nematodos Gastrointestinales y Pulmonares, pp. 1-28, En: C.
Fiel y A. Nari (eds.), Enfermedades Parasitarias de Importancia Clínica y
27
Productiva en Rumiantes. Fundamentos Epidemiológicos para su Prevención y
Control. Editorial Hemisferio Sur, SRL, Montevideo, Uruguay.
Grønvold, J.; Wolstrup, J.; Nansen, P.; Larsen, M.; Henriksen, S. A.; Bjorn,
H.; Kirchheiner, K.; Lassen, K.; Rawat, H.; Kristiansen, H. L. (1999). Biotic and
abiotic factors influencing growth rate and production of traps by the nematodetrapping fungus Duddingtonia flagrans when induced by Cooperia oncophora
larvae. Journal of Helminthology. 73, 129-136.
Grønvold, J.; Henriksen, S. A.; Larsen, M.; Nansen, P.; Wolstrup, J.
(1996a). Biological Control. Aspects of Biological Control, with Special
Reference to Arthropods, Protozoans and Helminths of Domesticated Animals.
Veterinary Parasitology. 64, 47-64.
Grønvold, J.; Nansen, P.; Henriksen, S. A.; Larsen, M.; Wolstrup, J.;
Bresciani, J.; Rawat, H.; Fribert L. (1996b). Induction of Traps by Ostertagia
ostertagi Larvae, Chlamydospore Production and Growth Rate in the
Nematode-Trapping Fungus Duddingtonia flagrans. Journal of Helminthology.
70, 291-297.
Grønvold, J.; Wolstrup, J.; Nansen, P.; Henriksen, S. A. (1993). NematodeTrapping Fungi against Parasitic Cattle Nematodes. Parasitology Today. 9, 137140.
Grønvold, J. (1984). Isolation of Infective Cooperia spp. Larvae from Soil
Samples. Acta Veterinaria Scandinavica. 25, 139-142.
Herd, R. (1985). Strategies for Nematode Control in Cattle. Modelling
Veterinary Practice Food Animal. 66, 741-744.
Hoste, H.; Torres-Acosta, J .F. (2011). Non Chemical Control of Helminths
in Ruminants: Adapting Solutions for Changing Worms in a Changing World.
Veterinary Parasitology. 180, 144-154.
Iglesias, L. E.; Fusé, L. A.; Lifschitz, A. L.; Rodríguez, E. M.; Sagüés, M.
F.; Saumell, C. A. (2011). Environmental Monitoring of I vermectin Excreted in
Spring C limatic Conditions by T reated Cattle on Dung Fauna and Degradation
of Faeces on Pasture. Parasitology Research. 108, 1185-1191.
28
Iglesias, L. E.; Saumell, C. A.; Fernández, A. S.; Fusé, L. A.; Lifschitz, A. L.;
Rodríguez, E. M.; Steffan P. E.; Fiel, C. A. (2006). Environmental Impact of
Ivermectin Excreted by Cattle Treated in Autumn on Dung Fauna and
Degradation of Faeces on Pasture. Parasitology Research. 100, 93-102.
Kahn, L.P.; Norman, T.M.; Walkden-Brown, S.W.; Crampton, A.; O’Connor,
L. J. (2007). Trapping Efficacy of Duddingtonia flagrans at Temperatures
Existing at Lambing in Australia. Veterinary Parasitology. 146, 83-89.
Ketzis, J. K.; Vercruysse, J.; Stromberg, V. E.; Larsen, M.; Athanasiadou S.;
Houdijk, J. G .M. (2006). Evaluation of Efficacy Expectations for Novel and NonChemical Helminth Control Strategies in Ruminants. Veterinary Parasitology.
139, 321–335.
Larsen, M. (1999). Biological Control of Helminths. International Journal for
Parasitology. 29,139-146.
Larsen, M.; Wolstrup, J.; Henriksen, S.A.; Grønvold, J.; Nansen, P. (1992).
In Vivo Passage through Calves of Nematophagous Fungi Selected for
Biocontrol of Parasitic Nematodes. Journal of Helminthology. 66, 137-141.
Mahmood, J. (1974). The Effects of Temperature on the Survival and
Development of the Free-Living Stages of Twisted Wire Worm Haemonchus
contortus Rudolphi, 1803 of Sheep and other Ruminants. Zeitschrift für
Parasitenkunde. 43, 197-208.
Mendoza de Gives, P.; Valero Coss, R. O. (2009). Uso de Hongos
Nematófagos: una Herramienta Biotecnológica para el Control de Nematodos
Parásitos del Ganado. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales
Agricolas y Pecuarias. Folleto Técnico Nº 7.
Ministry of Agriculture, Fisheries and Food. (1986). Manual of Veterinary
Parasitological Laboratory Techniques. Reference Book 418. Londres, Reino
Unido, 160 p.
Nansen, P.; Grønvold, J.; Henriksen, S.A.; Wolstrup, J. (1986). Predacious
Activity of the Nematode-Destroying Fungus, Arthrobotrys oligospora, on Pre-
29
Parasitic Larvae of Cooperia oncophora and on Soil Nematodes. Proceedings
of the Helminthological Society of Washington. 53, 237-243.
Nansen, P.; Grønvold, J.; Henriksen, S. A.; Wolstrup, J. (1988). Interactions
Between the Predacious Fungus Arthrobotrys oligospora and Third-Stage
Larvae of a Series of Animal-Parasitic Nematodes. Veterinary Parasitology. 26,
329-337.
Nari, A.; Solari, M. A.; Cuore, U. (2013). Bases Teóricas y Niveles de
Aplicación del Control Integrado de Parásitos, pp. 689-743, En: C. Fiel y A. Nari
(eds.), Enfermedades Parasitarias de Importancia Clínica y Productiva en
Rumiantes. Fundamentos Epidemiológicos para su Prevención y Control.
Editorial Hemisferio Sur, SRL, Montevideo, Argentina.
Nari, A. (2011). Towards Sustainable Parasite Control Practices in
Livestock Production with Emphasis in Latin America. Veterinary Parasitology.
180, 2-11.
Nari, A.; Hansen, J. W. (1999). Resistance of Ecto-and Endo-Parasites:
Current and Future Solutions, PP 17-21, 67th General Session, International
Committee, Office International des Epizooties. Paris.
Niec, R. A. (1968). Cultivo e Identificación de Larvas Infectantes de
Nematodes Gastrointestinales de Bovino y Ovino. INTA. Boletín Técnico Nº 5.
O'Connor, L. J.; Walkden-Brown, S. W.; Kahn, L. P. (2006). Ecology of the
Free-Living Stages of Major Trichostrongylid Parasites of Sheep. Veterinary
Parasitology. 142, 1-15.
Paraud C., Pors I., Chicard C., Chartier C. (2006). Comparative Efficacy of
the Nematode-Trapping Fungus Duddingtonia flagrans against Haemonchus
contortus, Teladorsagia circumcincta and Trichostrongylus colubriformis in Goat
Faeces: Influence of the Duration and the Temperature of Coproculture.
Parasitology Research. 98, 207−213.
Pandey, V. S. (1972). Effect of Temperature on Survival of the Free-Living
Stages of Ostertagia ostertagi. Journal of Parasitology. 58, 1042-1046.
30
Peloille, M. (1991). Selection of Nematode-Trapping Fungi for Use in
Biological Control, PP. 13-17. En: B. R. Kerry y D. H. Crump (eds), Working
Group
“Integrated
Control
of
Soil
Pests”,
“Methods
for
Studying
Nematophagous Fungi”. IOBC/WPRS Bulletin 1991/XIV/2.
Rosssanigo, C. E. (1999). Sobrevida de Larvas Infestantes de Nematodes
Gastrointestinales del Bovino en Condiciones Naturales. Therios. 28, 105–113.
Sagüés, M.; Purslow, P.; Fernández, S.; Fusé, L.; Iglesias, L.; Saumell, C.
(2011a). Hongos Nematófagos Utilizados para el Control Biológico de
Nematodos Gastrointestinales en el Ganado y sus Formas de Administración.
Revista Iberoamericana de Micología. 28, 143-147.
Sagüés, M.; Fusé, L.; Fernández, A.; Iglesias, L.; Moreno, F.; Saumell, C.
(2011b). Efficacy of an Energy Block Containing Duddingtonia flagrans in the
Control of Gastrointestinal Nematodes of Sheep. Parasitology Research.109,
707-713.
Sagüés, F.; Saumell, C.; Fusé, L.; Iglesias, L.; Fiel, C. (2009). Evaluación
de la Capacidad Predadora de Duddingtonia flagrans en Materia Fecal
Expuesta al Sol y a la Sombra. Acta de Bioquímica Clínica Latinoamericana,
Suplemento 1, 96.
Saumell, C. (2002). Control Mediante Hongos Nematófagos. Reunión de
Especialistas en Parasitología Veterinaria de Argentina, Brasil, Chile, Paraguay
y Uruguay. 11º Encuentro de Veterinarios Endoparasitólogos Rioplatenses, 2224 de mayo, Tandil, Argentina.
Saumell, C. A.; Fernández, A. S.; Echevarria, F.; Gonçalves, I.;
Iglesias, L.; Sagües, M. F.; Rodríguez, E. M. 2015. Lack of Negative
Effects of the Biological Control Agent Duddingtonia flagrans on Soil
Nematodes and Other Nematophagous Fungi. Journal of Helminthology
(accepted).
Saumell, C.A.; Fernández, A.S.; Fusé, L.A.; Rodríguez, M.; Sagüés, M.F.;
Iglesias, L.E. (2015). Nematophagous Fungi from Decomposing Cattle Faeces
in Argentina. Revista Iberoamericana de Micología. 32, 252-256.
31
Saumell, C.; Fusé, L.; Iglesias, L.; Fernández, S.; Fiel, C. (2008). Enfoque
Bioecológico del Potencial de los Hongos Nematófagos en el Control Biológico
de Tricostrongilideos de Rumiantes. Revista de Medicina Veterinaria. 89, 45-54.
Saumell, C.; Fusé, L.; Iglesias, L.; Steffan, P.; Fiel, C. (2005). Alternativas
Adicionales al Control Químico de Nematodes Gastrointestinales en Animales
Domésticos, pp. 80-84. En: Resistencia a los Antiparasitarios en Argentina.
FAO, Roma, Italia.
SENASA (2014). Situación de la Producción Orgánica en la Argentina
Durante el año 2013. Coordinación de Productos Ecológicos, Dirección
Nacional de Inocuidad y Calidad Agroalimentaria, Servicio Nacional de Sanidad
y
Calidad
Agroalimentaria
(SENASA).
Disponible
en:http://argencert.com.ar/sitio/wpcontent/uploads/SENASA_Informe_estadistico_produccion_organica_2013.pdf,
Fecha de acceso 12 de octubre del 2015.
Steffan, P. E.; Fiel, C. A.: Ferreyra, D. A. (2012). Endoparasitosis más
Frecuentes de los Rumiantes en Sistemas Pastoriles de Producción: Aspectos
Básicos de Consulta Rápida. Grupo Reencuentro. Tandil, Argentina, 112 pp.
Soulsby, E. J. L. (1987). Parasitología y Enfermedades Parasitarias en los
Animales Domésticos. 7ma ed. Nueva Editorial Interamericana S. A de C. V.
México.
Williams, J. C., Mayhew, R. L. (1967). Survival of Infective Larvae of the
Cattle
Nematodes
Cooperia
punctata,
Trichostrongylus
axei
and
Oesophagostomum radiatum. American Journal of Veterinary Research. 28,
629–640.
Wright, D. A.; Mcanulty, R. W.; Noonan, M. J.; Stankiewicz, M. (2003). The
Effect of the Duddingtonia flagrans on Trichostrongyle Infections of Saanen
Goats on Pasture. Veterinary Parasitology. 118, 61-69.
32
Apéndice
L3 en pasto
50
45
40
30
25
20
15
10
5

B
T
B
C
O
T
0
O
C
L3 / kg PS
35
Grafico 1: promedio del total de L3 por Kg de pasto seco (PS). Es la
sumatoria de L3 en pasto de todos los grupos controles ovinos (OC) y
bovinos (BC) y todos los grupos tratados ovinos (OT) y bovinos (OT).
33
Peso del PS
Tabla 1: Promedios de los pesos de PS(g) y entre paréntesis el desvió estándar
a los 16 y 30 días pos deposición (o del inicio de ensayo).
Día
16
30
Grupos
Ovino
Bovino
CS
116,8 (9,31)
87,87 (20,7)
TS
116,91 (32,04)
129,54 (26,3)
CSb
119,65 (23,99)
117,59 (30,3)
TSb
142,51 (20,8)
125,06 (15,07)
CS
74,52 (18,7)
79,9 (10,3)
TS
121,56 (28,7)
114,38(35)
CSb
79,59 (41)
94,19 (23,3)
TSb
109,64 (22,5)
148,24 (58,1)
L3/g de materia fecal
32
28
24
16
12
8
4
b
TS
B
B
C
Sb
TS
B
S
C
B
O
TS
b
Sb
O
C
O
TS
S
0
O
C
L3 / g MF
20
34

Gráfico 2: promedio de L3 por g de materia fecal (MF) recuperadas de
los distintos grupos. O: ovinos, B: bovinos, C: controles, T: tratados, S:
sol, Sb: sombra.
Centinelas
Tabla 2: L3/g de materia fecal obtenidas en las distintas fracciones que se
fueron extrayendo semanalmente de una de las muestras de cada grupo
utilizadas como centinelas.
Grupos
9 de Marzo
16 de Marzo
30 de Marzo
BCS
6,1
0,9
0,1
BTS
5,5
9,5
0,7
BCSb
3,8
34,0
7,8
BTSb
6,9
24,6
3,1
OCS
185,8
0,0
1,2
OTS
214,2
0,7
3,3
OCSb
86,0
2,5
OTSb
547,2
47,1
0,0
35