síntesis de compuestos tipo éster derivados del ácido ferúlico y
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA BIOLÓGICA CAMPUS XALAPA UNIDAD DE SERVICIOS DE APOYO EN RESOLUCIÓN ANALÍTICA SÍNTESIS DE COMPUESTOS TIPO ÉSTER DERIVADOS DEL ÁCIDO FERÚLICO Y ESTUDIO DE SU OXIDACIÓN ELECTROQUÍMICA EN UN MEDIO APRÓTICO. TESIS QUE PARA ACREDITAR LA EXPERIENCIA RECEPCIONAL DE LA CARRERA DE QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO. PRESENTA: YAMILETH VARGAS ÁLVAREZ DIRECTORA DEL TRABAJO RECEPCIONAL: DRA. MAGALI SALAS REYES CO-DIRECTORA: DRA. ZAIRA JULIETA DOMINGUEZ ESQUIVEL XALAPA, VERACRUZ SEPTIEMBRE 2013 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA BIOLÓGICA CARTA DE ACEPTACIÓN DE TRABAJO RECEPCIONAL CONCLUIDO “SÍNTESIS DE COMPUESTOS TIPO ÉSTER DERIVADOS DEL ÁCIDO FERÚLICO Y ESTUDIO DE SU OXIDACIÓN ELECTROQUÍMICA EN UN MEDIO APRÓTICO” MODALIDAD TESIS QUE PARA ACREDITAR LA EXPERIENCIA RECEPCIONAL DE LA CARRERA DE QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO PRESENTA YAMILETH VARGAS ÁLVAREZ DIRECTORA DEL TRABAJO RECEPCIONAL DRA. MAGALI SALAS REYES CO-DIRECTORA DEL TRABAJO RECEPCIONAL DRA. ZAIRA J. DOMÍNGUEZ ESQUIVEL SINODAL DR. ERNESTO JUÁREZ LOERA XALAPA, VERACRUZ SINODAL DR. RICARDO TOVAR MIRANDA 27 DE SEPTIEMBRE DEL 2013 El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Fisicoquímica y Productos Naturales de la Unidad de Servicios de Apoyo en Resolución Analítica (SARA) de la Universidad Veracruzana, bajo la dirección de la Dra. Magali Salas Reyes y la co-dirección de la Dra. Zaira Julieta Domínguez Esquivel, y con el apoyo económico del proyecto CB2009134275-Q otorgado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), el proyecto de redes PROMEP/103.5/12/2181 y el proyecto de fondos mixtos FOMIX-VER2009-C03-127523. Algunos de los resultados de esta tesis fueron presentados en: 9ª REUNIÓN DE LA ACADEMIA MEXICANA DE QUÍMICA ORGÁNICA. Boca del Río Veracruz, del 22 al 26 de Abril 2013. Dedicatorias A Dios Por permitirme alcanzar este peldaño de mi vida, por acompañarme en mis angustias y alegrías, por guardar mi camino. A mis padres Daniel Vargas Cortés, Patricia Álvarez Morales, por su amor, paciencia y apoyo en cada decisión de mi vida, los amo. A mis hermanas Liliana y Evelyn, por su gran ejemplo, amistad y cariño. A mis amigos y compañeros Por los momentos que compartimos, porque siempre hubo algo que aprender de cada uno. He peleado la buena batalla, he acabado la carrera, he guardado la fe. 2 Tim 4:7 AGRADECIMIENTOS A la Dra. Magali, por su gran apoyo, confianza y paciencia. Por guiarme durante el desarrollo de este proyecto y enseñarme que siempre hay algo más que aprender. A la Dra. Zaira, por sus valiosas aportaciones durante la elaboración de este trabajo. A los miembros del jurado: Dr. Ricardo Tovar Miranda y Ernesto Juárez Loera, por sus acertadas observaciones a este trabajo. Al Dr. Felipe González (Departamento de Química del CINVESTAV) por las facilidades prestadas para la obtención de la espectrometría de masas y los espectros de Resonancia Magnética Nuclear del equipo JEOL GSX270. Al I. Q. Geiser Cuellar Rivera por su asistencia en la obtención de la espectrometría de masas. A la Dra. Rosa Blanca Díaz Sánchez por su asistencia en la obtención de los espectros de RMN del equipo JEOL GSX270. Al Dr. Javier por su apoyo e instrucción durante mi estancia en el laboratorio, así como por la beca otorgada. A la Dra. Mirna, por su cordialidad y sus comentarios durante la elaboración de éste trabajo. A la Dra. Yolanda Cocotle Ronzón y el Dr. Jesús García Guzmán, por brindarme su apoyo y confianza, por su trato siempre amable, por impulsarme a seguir adelante. A mis compañeros y amigos del laboratorio, Daniel, Omar, Erick, Roberto, Iván, Anita y Evelin, por darme ánimos, por acompañarme en esta ardua tarea, por hacer más amena la elaboración de esta tesis. A Pablo Cisneros, por su cariño, comprensión y apoyo durante la elaboración de este proyecto, por ser algo más que un amigo y motivarme a lograr mis sueños y metas. A mis amigos que me han acompañado durante mi formación universitaria, Dora, Benjamin, Tamara, Ulises, Karen, Carol, Nelly, Daphne, Rafa, Lú, Jacob, Luis, Brianda, Karla, entre otros, por los momentos compartidos, por las experiencias que siempre nos dejaron algo más que un recuerdo, porque su amistad que ha sido una bendición. A mis amigos y compañeros de la facultad de QFB, por la grata experiencia de convivir durante esta inolvidable etapa, por hacer juntos ciencia. CONTENIDO RESUMEN ............................................................................................................. iii ABREVIATURAS .................................................................................................... iv INTRODUCCIÓN .....................................................................................................1 1. ANTECEDENTES ...........................................................................................3 1.1. Acidos hidroxicinámicos .......................................................................3 1.2. Antioxidantes .......................................................................................4 1.3. Ácido ferúlico .......................................................................................5 1.3.1. Actividad antioxidante. .....................................................................6 1.3.2. Otras propiedades biológicas ............................................................6 1.4. Ésteres derivados del ácido ferúlico. .....................................................7 1.4.1. 1.5. Propiedades biológicas y actividad antioxidante. ...............................7 Conceptos fundamentales sobre electroquímica ...................................9 1.5.1. 1.6. Celda y electrodos ........................................................................... 10 Voltamperometría cíclica .................................................................... 11 1.6.1. 1.7. Aplicaciones de la voltamperometría cíclica .................................... 12 Estudios electroquímicos del ácido ferúlico y algunos de sus derivados 13 2. JUSTIFICACIÓN. ......................................................................................... 16 3. HIPÓTESIS ................................................................................................. 17 4. OBJETIVO GENERAL ................................................................................... 18 5. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 18 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 19 6.1 Caracterización espectroscópica de las moléculas sintetizadas ............ 19 6.1.1. Éster bencílico del ácido ferúlico ..................................................... 19 6.1.2. 1,5-bis-feruloilpentanodiol .............................................................. 22 6.1.3. 1,8-bis-feruloiloctanodiol ................................................................ 27 6.2. Estudio electroquímico. ...................................................................... 29 6.2.1. Estudio electroquímico por voltamperometría cíclica del éster bencílico del ácido ferúlico. ......................................................................................... 29 i 6.2.2. Estudio electroquímico por voltamperometría cíclica de los sistemas biséster derivados del ácido ferúlico. ............................................................ 36 7. CONCLUSIONES ......................................................................................... 48 8. METODOLOGÍA ......................................................................................... 50 8.1. Metodología Sintética ........................................................................ 50 8.1.1. 8.2. Síntesis de ésteres derivados del ácido ferúlico. .............................. 50 Metodología e instrumentación electroquímica .................................. 53 8.2.1. Estudio electroquímico de los ésteres del ácido ferúlico en ACN ...... 55 9. REFERENCIAS ............................................................................................ 56 10. APENDICE ................................................................................................. 60 ii RESUMEN El ácido ferúlico (AF) es un constituyente fenólico ubicuo en los tejidos de plantas, originado a partir del metabolismo de la fenilalanina y tirosina. Posee una amplia gama de efectos terapéuticos, en su mayoría atribuidos a su capacidad antioxidante. Se ha demostrado que la esterificación del AF ha dado como resultado un aumento de la capacidad antioxidante. Por otro lado, la voltamperometría cíclica es una técnica utilizada para estudiar los mecanismos de oxidación, que permite establecer la habilidad para donar electrones en torno al potencial de pico anódico, así como el número de electrones transferidos durante la oxidación, por lo que se considera una valiosa herramienta en la investigación de sistemas antioxidantes. Por lo anterior, en el presente trabajo se presenta la síntesis del éster bencílico del AF (EBAF) y dos nuevos sistemas biséster derivados del ácido ferúlico: 1,5-bis-feruloilpentanodiol (BEPAF) y 1,8-bis-feruloiloctanodiol (BEOAF), así como el correspondiente estudio de oxidación electroquímica mediante voltamperometría cíclica (VC) en ACN. Los resultados mostraron que el EBAF sufre dos mecanismos de oxidación, siendo el mecanismo ECE el predominante, lo que explica la presencia de un pico bielectrónico irreversible. Una quinona catiónica se genera durante la oxidación y a partir de esta se obtiene la o-quinona, como queda evidenciado en el proceso de reducción. Por otro lado, el BEOAF tanto como el BEPAF revelaron un comportamiento semejante, considerando las características de sus voltamperogramas. Para ambos se observó una estequiometría electrónica mayor a dos electrones durante el proceso de oxidación, además de fenómenos adsorción. De acuerdo a estos resultados y dada la aparición de un nuevo pico anódico en la oxidación electroquímica de los sistemas biséster, es posible inferir que la manera en la que los radicales generados se acoplan al electrodo, en el caso de los sistemas bis, podría ser distinta a la que sucede para el EBAF. Por lo anterior, se plantea que las formas de unión de los sistemas bis con el carbón vítreo pueden ser diferentes para cada unidad guayacol presente en ellos, considerando la diferencia en reactividad de los radicales generados. Finalmente este trabajo reporta por primera vez evidencias que demuestran que tanto la topología bis como la longitud de la cadena hidrocarbonada en este tipo de sistemas, tienen un efecto importante en el mecanismo de oxidación electroquímico y en la predominancia de fenómenos de quimisorción en acetonitrilo. iii ABREVIATURAS ACN: Acetonitrilo EA: Electrodo auxiliar AF: Ácido ferúlico APPH: 2,2-azo-bis-(2-amidino-propano)-dihidrocloruro BEPAF: 1,5-bis-feruloilpentanodiol BEOAF: 1,8-bis-feruloiloctanodiol DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo EBAF: Éster bencílico del ácido ferúlico ECE: Electroquímico-Químico-Electroquímico. ECV: Electrodo de carbón vítreo ECS: Electrodo de Calomel saturado. FMLP/CB: Formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina/Citocalasina B FNT-ɑ: Factor de necrosis tumoral alfa ITO: Óxido de Indio y Estaño ER: Electrodo de referencia RMN: Resonancia Magnética Nuclear. VC: Voltamperometría cíclica ET: Electrodo de trabajo. 5NFAA: ácido-3-(5-nitro-2-furil)-acrílico iv INTRODUCCIÓN En la actualidad ha surgido un gran interés por el uso de antioxidantes naturales en diversas aplicaciones terapéuticas e industriales. Particularmente, los compuestos fenólicos son considerados como potentes agentes terapéuticos contra una amplia variedad de enfermedades, además de su aplicación en la industria alimentaria, como conservadores y aditivos [1, 2]. Los ácidos fenólicos y particularmente los ácidos hidroxicinámicos, como el ácido cafeico, ferúlico y sinápico, han sido considerados como atractivos potenciales antioxidantes, debido a su origen natural [3]. Estudios recientes han demostrado que estos compuestos poseen efectos terapéuticos en numerosas enfermedades como la arterioesclerosis, lesiones inflamatorias, cáncer y diabetes, entre otras [4, 5, 6]. Sin embargo, por su naturaleza hidrofílica, los ácidos hidroxicinámicos no pueden ser usados apropiadamente en productos de base oleosa, lo cual es un factor determinante para las aplicaciones industriales, farmacéuticas y biológicas [6]. Se considera que los ácidos fenólicos son importantes agentes terapéuticos debido a su actividad antioxidante, la cual está estrechamente ligada a su habilidad para donar protones y/o electrones, y así estabilizar los radicales fenoxilo resultantes tras el proceso antioxidante. Sin embargo, pueden existir otros mecanismos de acción que involucren la quelatación de iones metálicos y la inhibición de enzimas oxidantes [1, 7, 8]. Se ha comprobado que las modificaciones estructurales de los ácidos fenólicos permiten mejorar su procesabilidad (incrementando su lipofilicidad, por ejemplo). En particular, los ésteres de los ácidos cinámicos han demostrado ofrecer un importante aumento en la capacidad antioxidante [4, 6, 8], la inhibición de líneas celulares cancerosas [6, 9], así como un mayor efecto antimicrobiano con respecto a los ácidos precursores [10]. El ácido ferúlico (AF) es un ácido hidroxicinámico que está presente en todas las plantas, ya sea en forma libre o unido covalentemente a diversos metabolitos. Debido a su capacidad antioxidante se le han atribuido diversas propiedades terapéuticas [1], constituyéndose como un excelente candidato para el diseño de nuevas moléculas antioxidantes [3]. 1 Por otro lado, la voltamperometría cíclica es una técnica muy empleada en electroquímica analítica, de gran utilidad cuando se inicia el estudio electroquímico de un sistema desconocido [11]. Ésta permite determinar propiedades redox de moléculas en disolución, y la habilidad de un compuesto para donar electrones mediante el potencial de pico anódico, por lo que puede ser una valiosa herramienta en el estudio de sistemas antioxidantes [12]. Por lo anterior, en este trabajo se realizó la síntesis de nuevos derivados del ácido ferúlico y el estudio de su comportamiento electroquímico mediante la técnica de voltamperometría cíclica, utilizando acetonitrilo como disolvente. Consiguiendo así un punto de partida necesario para el diseño de nuevos sistemas antioxidantes que presenten aplicaciones terapéuticas e industriales. 2 1. ANTECEDENTES 1.1. Acidos hidroxicinámicos Los ácidos hidroxicinámicos son una clase de compuestos fenólicos de estructura C6-C3 (compuestos bencénicos unidos a una cadena de 3 átomos de carbono), derivados del Ácido-(E)-3-fenilprop-2-enóico, con uno o más grupos hidroxilos unidos al anillo aromático, algunos de los cuales pueden ser metilados. Los principales ácidos hidroxicinámicos presentes en los alimentos son el ácido p-cumárico, cafeico, ferúlico y sinápico (figura 1). Generalmente se encuentran como glucósidos o ésteres del ácido quínico, shikímico o tartárico, así como éteres o ésteres de polisacáridos, formando la pared celular de diversas plantas. Estos ácidos se encuentran raramente en su forma libre, excepto en los alimentos procesados que han sido objeto de congelación, esterilización, o fermentación [13, 14]. Figura 1. Estructura molecular de los principales ácidos hidroxicinámicos. La presencia del doble enlace en su estructura da lugar a dos isómeros, cis y trans. Los ácidos cinámicos naturales están en forma trans, que es la más estable, aunque pueden pasar a forma cis por efecto de la luz o cuando están presentes en solución [15]. Los ácidos cinámicos pueden formar: - Glucósidos con los azúcares. Los carbohidratos que participan en éstos son la glucosa, galactosa y la ramnosa. - Heterósidos con los compuestos fenólicos como las antocianinas y flavonoides [15]. 3 Los ácidos o-hidroxicinámicos se ciclan fácilmente dando lugar a cumarinas, compuestos que pertenecen al grupo de los compuestos fenólicos C6-C3, en los que C3 es un heterociclo oxigenado. Aunque poco frecuentes, existen también isocumarinas. Las cumarinas y las isocumarinas se diferencian en las posiciones de los grupos CO y O en el heterociclo (figura 2) [15]. Figura 2. Estructura molecular general de las cumarinas (a) e isocumarinas (b). 1.2.Antioxidantes Los antioxidantes son sustancias presentes en los alimentos o el organismo en bajas concentraciones, que retrasan o previenen la oxidación de alguna otra molécula o sustrato. Debido a esto, los antioxidantes han despertado el interés de bioquímicos y médicos por su utilidad como protectores contra el daño celular, especies reactivas de oxígeno y enfermedades degenerativas. Por otra parte, la industria alimentaria ha usado antioxidantes para prevenir el deterioro de la calidad y mantener el valor nutricional de los alimentos. Entre los antioxidantes naturales que se obtienen de los alimentos se encuentran compuestos fenólicos y polifenólicos, quelatos, vitaminas y enzimas, así como carotenoides y carnosina [16]. Los antioxidantes son conocidos por actuar a diferentes niveles en la secuencia oxidativa que involucra a moléculas lipídicas. Pueden actuar disminuyendo la concentración de oxígeno, interceptando oxígeno singulete, previniendo las reacciones radicalarias al eliminar los radicales iniciales, catalizando la unión de iones metálicos, etcétera. La medida en que se produce la oxidación de los lípidos también depende de la estructura química de los ácidos grasos que intervienen, así como otros factores relacionados con el almacenamiento de alimentos y condiciones de reacción [16]. 4 El proceso antioxidante de los compuestos fenólicos se divide en dos etapas: 1) Captura de radicales: S-OO• + AH S-OOH + A• 2) Terminación radicalaria: A• + X• Productos no radicalarios Donde S es la sustrato de la oxidación, S-OO• el radical peróxido de S, AH es el antioxidante, A• es el radical antioxidante, y X• es otra especie radicalaria nociva. Aunque la primera etapa es un proceso reversible, la segunda etapa es irreversible y debe producir productos de terminación estables. Particularmente, la información estructural sobre estos productos no radicales ha proporcionado importantes contribuciones a los estudios de los mecanismos de oxidación [7]. 1.3.Ácido ferúlico El ácido-(E)-3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)prop-2-enoico o ácido ferúlico (figura 3), es un constituyente fenólico ubicuo en los tejidos de plantas, originado a partir del metabolismo de la fenilalanina y la tirosina. Se presenta en las semillas y las hojas, tanto en su forma libre como unido covalentemente a la lignina y otros biopolímeros [1]. Es un ingrediente bioactivo en frutas y vegetales como la naranja, tomate, plátano, berenjena y brócoli [1, 8, 14, 18, 19]. Muestra dos isómeros: cis (de color amarillo, líquido aceitoso) y trans (cristalino). Su nomenclatura proviene de la umbelífera Ferula foetida, a partir de la cual se aisló el compuesto activo por primera vez en 1866 [19]. El isómero trans predomina y representa el 90% de los ácidos fenólicos en la harina común [1]. Figura 3. Estructura molecular del ácido ferúlico. 5 1.3.1. Actividad antioxidante. El AF posee tres grupos funcionales que contribuyen a su actividad antioxidante. La presencia de dos grupos electrodonadores en el anillo de benceno (3-metoxi y 4-hidroxi) le proporcionan la propiedad de inhibir las reacciones en cadena producidas por radicales libres. A su vez el ácido carboxílico en el AF, adyacente a un doble enlace C-C, provee sitios adicionales de ataque a los radicales libres, lo que contribuye a evitar que dañen a la membrana celular. Además, este grupo carboxílico también actúa como una ancla cuando se une a la bicapa lipídica, proporcionando cierta protección contra la peroxidación lipídica [1]. 1.3.2. Otras propiedades biológicas El AF está recibiendo mayor atención en el mundo de la investigación debido a su amplia gama de efectos terapéuticos. Por ejemplo, algunos de sus derivados tipo éster poseen cierto potencial preventivo anticancerígeno [4, 9], por su parte, otros disminuyen los niveles de algunos mediadores de la inflamación, como prostaglandinas y el factor alfa de necrosis tumoral (FNT-ɑ) [20]. Otros estudios han demostrado que el nivel de glucosa sanguíneo en ratas con diabetes inducida por estreptozotocina se reduce por la administración de ácido ferúlico, el cual debido a su capacidad antioxidante promueve la neutralización de radicales libres producidos por estreptozotocina en el páncreas, lo que disminuye su toxicidad. Este decremento oxidativo en el páncreas puede ayudar a la proliferación de células beta y a una mayor secreción de insulina. Así mismo, se ha dicho que la presencia de propiedades antioxidantes y antiinflamatorias del ácido ferúlico pueden habilitarlo para inhibir la producción de leucotrienos y reducir el estrés oxidativo en el cerebro [1]. Estudios en el metabolismo de lípidos en ratones ponen de manifiesto que el AF posee acciones hipolipemiantes y que podría ser eficaz para reducir la obesidad debida al consumo de un alto contenido en grasas en la dieta [21]. 6 Así mismo, estudios sobre la cepa Salmonella typhimurium TA 100 han demostrado que el ácido ferúlico disminuye aproximadamente 50% el efecto mutagénico inducido por 5NFAA [ácido-3-(5-nitro-2-furil)-acrílico] y azida de sodio [22]. Por otra parte, considerando que el AF genera radicales fenoxilo estables cuando éste es irradiado por luz UV, y que éstos tienen la capacidad de interrumpir la cadena de reacciones de radicales libres, el AF se ha considerado como un agente importante para la protección de la piel, pudiendo utilizarse como un bloqueador solar [1, 19, 23]. 1.4. Ésteres derivados del ácido ferúlico. El AF, que está ampliamente distribuido en la naturaleza, se encuentra esterificado con esteroles, polisacáridos y otros metabolitos, recibiendo éstos el nombre de ferulatos [23]. Así mismo, diversos monoésteres del AF, con cadenas alquílicas de 1 a 12 átomos carbonos [4, 17], se han aislado de plantas y propóleos [9, 24, 25]. Del mismo modo, sistemas tipo biséster se encuentran presentes en plantas como Pachycentria formosana [26], Ficus foveolata [27], Stereospermum acuminatissimum [28]. Numerosos ferulatos se han sintetizado con el fin de encontrar moléculas con mayor actividad terapéutica que el ácido ferúlico, como por ejemplo: ésteres aromáticos [10], derivados de polisacáridos [30, 31], ferulatos de esterol [19], ésteres derivados de triterpenos [26] y sistemas bis como el 1,4 bis-feruloilbutanodiol [29]. 1.4.1. Propiedades biológicas y actividad antioxidante. Existen diversos estudios y valoraciones terapéuticas de algunos ésteres del ácido ferúlico, entre ellos podemos mencionar la evaluación de la actividad fungicida, estudio en el que se observó un porcentaje de inhibición superior al 98% de la cepa S. cerevisiae con metil, etil y propil ferulatos, lo que revela una posible preferencia del sitio receptor de la bioactividad por compuestos hidrófobos, pero con limitaciones del espacio disponible en la longitud de la cadena del éster [4]. Así mismo, se han aislado diferentes ésteres derivados de ácidos cinámicos en propóleos [9,25], por ejemplo, Serkedjiev y colaboradores aislaron 6 ésteres derivados de ácidos cinámicos de un extracto etéreo de propóleos de Bulgaria, a los que realizaron ensayos de actividad antiviral contra diversas cepas del virus de la influenza. En ellos encontraron que 7 sólo el ferulato de isopentilo fue capaz de inhibir de manera significativa la actividad infecciosa del virus H3N2 in vitro [25]. Por otra parte, se han reportado estudios donde se evalúan tanto la actividad antioxidante como la capacidad atrapadora de radicales libres de este tipo de derivados. Los resultados han señalado que la actividad antioxidante de los compuestos no siempre está relacionada con su capacidad atrapadora de radicales libres [17, 32]. Así fue que Kikuzaki y colaboradores demostraron que la esterificación del ácido ferúlico da como resultado un aumento de la actividad antioxidante influenciada por la longitud de la cadena, ya que en el ensayo de oxidación de liposomas inducido por AAPH, los ferulatos alquílicos: hexil, octil, y 2-etil-hexil, fueron más activos que otros ésteres de alquilo, a pesar de que la actividad atrapadora de radicales libres (ensayo de DPPH) no se viera mayormente favorecida con la presentada por el AF [17]. Así mismo, se han realizado investigaciones acerca de la actividad antioxidante de diferentes ferulatos de alquilo en membranas microsomales de ratas para comprender la actividad biológica de éstos compuestos en sistemas in vivo más complejos. La evaluación de la capacidad atrapadora de radicales libres con DPPH no mostró variaciones significativas entre los ésteres de AF, sin embargo la valoración de la capacidad antioxidante en los microsomas de hígado de rata mostró diferencias notables, siendo el sistema más eficaz el dodecilferulato y el ácido ferúlico el menos activo. Todas las moléculas presentaron coeficientes similares de partición. Estudios tridimensionales indicaron que este comportamiento podría ser debido a un anclaje diferente de las moléculas con la cadena lateral del éster a la bicapa fosfolipídica microsomal y una consecuente orientación/posición diferente del grupo fenoxi fuera de la superficie de la membrana contra el flujo de radicales libres. Fue así como llegaron a la conclusión de que, con base en los mecanismos y fuerza de unión de estos compuestos con los lípidos de la superficie de la piel, podrían diseñarse como nuevos agentes fotoprotectivos, filtros UV y antioxidantes [32]. También ha sido reportado que el éster de la vitamina E del AF disminuye la generación de melanina, con la expectativa de un prometedor depresor de pigmentación UV [19]. Por otro lado, se ha reportado el aislamiento de ferulatos de diversas plantas, entre las cuales podemos mencionar a la Pachycentria formosana, un arbusto rastrero endémico de 8 Taiwán, en el que se encontraron 4 ferulatos, dos bisésteres separados por una cadena alifática de 24 carbonos, que sólo diferían en la configuración del doble enlace (E y Z, respectivamente), un monoéster de 28 carbonos y un ferulato unido a un triterpeno (ácido ursónico). De estos, sólo el último presentó efectos importantes en la inhibición de la liberación de elastasa (inducida por fMLP/CB), relacionada con los procesos inflamatorios [26]. Así mismo, estudios recientes de ésteres aromáticos derivados del ácido ferúlico, algunos acetilados en el grupo hidroxilo del anillo guayacol y otros con este grupo hidroxilo libre, han demostrado que poseen una importante capacidad atrapadora de radicales superóxido, incluso dos veces más activa que la presentada por el α-tocoferol. Del mismo modo se evaluó su actividad antimicrobiana contra bacterias Gram positivas, tales como Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, y algunos hongos del género Candida, encontrando que algunos de ellos y, especialmente, el (4-cloro-3-metil)fenil-3-(4-hidroxi-3metoxifenil)-2-propenoato, posee una potente inhibición contra S. aureus, incluso 64 veces más potente que Ofloxacina y 128 más que Vancomicina, respectivamente [10]. 1.5. Conceptos fundamentales sobre electroquímica La electroquímica es la rama de la química concerniente a la interrelación de electricidad y sus efectos químicos. De manera general, en electroquímica se llevan a cabo estudios relacionados con la generación de energía eléctrica a través de una reacción química o la promoción de una reacción química por el paso de corriente en una interfase líquida sólida. En consecuencia, el campo de la electroquímica abarca una enorme gama de fenómenos (por ejemplo, electroforesis y corrosión), dispositivos (pantallas electrónicas, sensores electroanalíticos, baterías y pilas de combustible) y tecnologías (electrodeposición de metales, producción a gran escala de aluminio y cloro, etcétera). Los científicos también hacen mediciones electroquímicas para obtener datos termodinámicos acerca de una reacción, generar intermediarios inestables como radicales iónicos, así como analizar pequeñas cantidades (trazas) de iones metálicos o especies orgánicas en un sistema químico [11, 33]. El estudio de sistemas electroquímicos, se concentra en los procesos y factores que afectan el transporte de carga a través de la interface entre fases químicas, por ejemplo, entre un 9 conductor electrónico (un electrodo) y un conductor iónico (un electrolito). La carga es transportada a través del electrodo por el movimiento de electrones. Típicamente el material de los electrodos incluye metales sólidos (Pt, Au, etc.), metales líquidos (Hg), carbón (grafito), y semiconductores (ITO, Si). En la fase líquida, que contiene el electrolito, la carga es transportada por el movimiento de iones. En soluciones acuosas, numerosas sales pueden ser empleadas como electrolitos soporte, las cuales incluyen iones cloruro, sulfato, nitrato, perclorato, fosfato, entre otros. Los electrolitos utilizados en solventes orgánicos tienden a ser más limitados debido a la baja constante dieléctrica de los disolventes, sin embargo entre los más comunes se encuentran el perclorato de tetrabutilamonio (NEt4ClO4), perclorato de sodio (NaClO4) perclorato de litio (LiClO4) y el hexafluorofosfato de tetrabutilamonio (NBu4PF6), siendo éste el más común. Por otra parte, es conveniente que en una celda electroquímica, el sistema solvente/electrolito posea una determinada resistencia (baja para que exista suficiente conductividad) dentro un experimento específico [33, 34, 35]. La mayoría de las técnicas electroanalíticas se pueden utilizar para la determinación de concentraciones de especies electroactivas incluso en trazas (por ejemplo polarografía y sus vertientes más recientes: la detección electroquímica en cromatografía y la electroforesis capilar), su principal área de aplicaciones está relacionada con la elucidación de transferencia de electrones y las reacciones químicas iniciadas por el acoplamiento de procesos redox en un electrodo, así como la caracterización de moléculas orgánicas o materiales con propiedades tales como la conductividad eléctrica intrínseca, interacciones magnéticas de alto spin, o electrocromismo [34]. Así, los métodos electroquímicos, tales como la voltamperometría cíclíca, cronamperometría, polarografía, entre otros, son empleados como herramientas en el estudio de mecanismos de oxidación o reducción de sistemas químicos, semejantes a los estudios de seguimiento de reacciones químicas utilizando métodos espectroscópicos [33]. 1.5.1. Celda y electrodos El diseño exacto de una celda electroquímica varía con la necesidad específica del experimento. Las celdas de 3 electrodos son las más utilizadas para la realización de 10 estudios electroquímicos, especialmente cuando la resistencia es relativamente alta. En esta configuración, el potencial del electrodo de trabajo es monitoreado en relación a un potencial de referencia; sin embargo, la corriente pasa entre el electrodo de trabajo y un electrodo auxiliar separado. Debido a que no pasa corriente al electrodo de referencia (ER), este se aproxima a la no polarizabilidad ideal y es por lo tanto una referencia segura para el control de potencial. Experimentalmente, la punta del electrodo de referencia está situada tan cerca como sea posible del electrodo de trabajo, a fin de minimizar la resistencia de la solución (descompensación de caída Óhmica). La posición del electrodo de referencia no interfiere con la transferencia de masa de las especies del electrolito [35]. La reacción química global que tiene lugar en una celda electroquímica se compone de dos semi-reacciones independientes, las cuales describen los cambios químicos reales en los dos electrodos. Cada semireacción responde a la diferencia de potencial interfacial en el electrodo correspondiente. Casi siempre el interés del experimento radica en una sola de estas reacciones, y el electrodo en el que ocurre ésta recibe el nombre de electrodo de trabajo (ET) [33]. Por su parte, el contraelectrodo o electrodo auxiliar (EA) es utilizado únicamente en sistemas de tres electrodos. En este sistema, la corriente fluye entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo. Cualquier hoja o alambre de platino o titanio, así como las barras de carbón, son empleadas como contraelectrodo. Es recomendable que el área del electrodo auxiliar sea sustancialmente mayor que la del electrodo de trabajo, si esta condición se cumple, el contraelectrodo no debe afectar la medición de corriente debido a pasivación, desactivación o bloqueo de la superficie [36]. 1.6. Voltamperometría cíclica La voltamperometría cíclica es un experimento electroquímico que comprende la aplicación de un potencial en el electrodo de trabajo, el cual varía con el tiempo. En el experimento se registra la corriente que fluye a través del electrodo de trabajo en función del potencial aplicado y como resultado se obtiene un gráfico de corriente contra potencial, el cual es conocido como voltamperograma. El potencial del electrodo de trabajo comienza con un valor, E1 típicamente, seleccionado de manera tal que las especies químicas bajo 11 investigación no se oxiden o reduzcan inicialmente. El potencial sufre entonces un barrido linear hasta un voltaje E2, punto en el cual la dirección del barrido se invierte y el potencial del electrodo de trabajo regresa, comúnmente, a su valor original (figura 4, inciso a). El potencial E2 es seleccionado de tal forma que el potencial del intervalo de potencial (E2E1) contiene un proceso de oxidación o reducción de interés (figura 4, inciso b). Si existen reacciones químicas acopladas a la transferencia electrónica que genere nuevas especies, entonces el barrido de reversa puede ser extendido más allá de E1 a fin de permitir la observación de nuevos picos y con ello obtener una mayor información para la caracterización del proceso redox [33]. A - e- A+ A+ + e- A Figura 4. a) Barrido de potencial cíclico, b) Voltamperograma cíclico resultante 1.6.1. Aplicaciones de la voltamperometría cíclica La voltamperometría cíclica es ampliamente utilizada para la caracterización inicial de sistemas electroquímicamente activos. Además de indicar el número de diferentes estados de oxidación y sus energías relativas, la VC puede también ser usada para estudiar los mecanismos de oxidación de sistemas en los cuales las reacciones de transferencia de electrones están acopladas con reacciones químicas, debido a los cambios en la forma de los picos en los voltamperogramas asociados a diferentes mecanismos [37]. Los datos obtenidos de la VC no sólo se refieren a valores termodinámicos como el potencial redox, también proporcionan datos directos acerca de la cinética de reacciones en los electrodos, que incluyen tanto transferencias electrónicas heterogéneas y homogéneas, como reacciones químicas acopladas. Además, la voltamperometría se está utilizando como 12 una técnica de estudio de todos los tipos de procesos interfaciales potencial-dependientes, estos incluyen, entre otros, los procesos de adsorción, fenómenos de electrocristalización, y reacciones de transferencia de carga en electrodos semiconductores o entre electrolitos no misibles [38]. 1.7. Estudios electroquímicos del ácido ferúlico y algunos de sus derivados El estudio electroquímico de sistemas como el ácido ferúlico y sus derivados, permite determinar sus propiedades redox, proporcionando por ejemplo, la habilidad para donar electrones en torno al potencial de pico anódico, o el número de electrones transferidos durante la oxidación, por lo que se considera una valiosa herramienta en la investigación de sistemas antioxidantes [12]. Es por ello que diversos grupos de investigación se han interesado en el estudio de estas moléculas. Hapiot y colaboradores, estudiaron el mecanismo de oxidación de los ácidos caféico, cumárico y ferúlico. Los primeros intermediarios de la oxidación fueron caracterizados por espectrometría UV, así como por sus respectivos potenciales de oxidación. Se determinó que para el caso de los ácidos cinámico y ferúlico, la oxidación, en mezclas de solventes orgánicos y agua, mostraron un pico de oxidación irreversible de un solo electrón, y en el caso del barrido inverso, se determinó la formación de dímeros resultantes del acoplamiento de los radicales fenoxilos generados [43]. Así mismo, Trabelsi estudió la oxidación electroquímica del ácido ferúlico en soluciones acuosas utilizando un electrodo de oro mediante la técnica de voltamperometría cíclica. Entre sus resultados, reportó que a bajas concentraciones el AF mostró un pico anódico irreversible. Sin embargo, a mayores concentraciones de AF (más de 20 mM), el voltamperograma muestra dos picos anódicos. Se propuso un mecanismo basado en la hipótesis de una oxidación bielectrónica del ácido ferúlico que involucra 3 intermediarios catiónicos mesómeros. La hidrólisis de estos mesómeros conduce a la formación de ácido caféico, entre otros derivados similares [44]. Por su parte, Petrucci y colaboradores realizaron la oxidación química y electroquímica de algunos ácidos hidroxicinámicos en un medio aprótico. Los resultados mostraron que éstos se comportan como donadores de electrones en medios pobres en electrones, además de que 13 siguen una oxidación anódica bielectrónica de un solo paso, dando como resultado el correspondiente catión fenoxilo, el cual puede llevar a la formación de dímeros y heterociclos [42]. Otras investigaciones han combinado una serie de derivados sintéticos de los ácidos hidroxicinámicos para realizar la evaluación de sus parámetros fisicoquímicos (potenciales redox y coeficientes de partición), además de la actividad antioxidante correspondiente. Los resultados obtenidos permiten concluir que los potenciales redox podrían contribuir a la comprensión de la actividad antioxidante y que la presencia de un grupo aceptor de electrones de tipo halógeno, en una posición orto al grupo fenólico no ejerce ninguna influencia sobre la actividad antioxidante. Por otra parte, después de la introducción de este sustituyente se observó un aumento significativo en la lipofília de los derivados cinámicos, la cual es una característica de extrema importancia en el desarrollo de nuevos antioxidantes lipófilos. En general, los resultados obtenidos revelan la existencia de una relación entre los potenciales redox y la actividad antioxidante (la cual se determinó mediante ensayos de capacidad atrapadora de radicales libres), de los ácidos hidroxicinámicos y sus derivados. Así, concluye que la eficacia antioxidante, es mayor cuando el potencial redox de las moléculas es menor [3]. Por su parte Salas y colaboradores estudiaron la oxidación electroquímica de una serie de sistemas derivados del ácido cafeico y ferúlico, así como de catecol y guayacol (las cuales son sus correspondientes unidades electroactivas) en medios apróticos. Los resultados revelaron que el ácido ferúlico y el guayacol en ACN, siguen un mecanismo de oxidación electroquímico-químico-electroquímico (ECE), que implica la formación de una o-quinona. También se demostró que, en el caso del AF, las reacciones de transferencia de electrón y protón son consecutivas y ocurren bajo un control cinético mixto. Por su parte, la oxidación electroquímica de amidas derivadas del ácido ferúlico reveló que el átomo de nitrógeno juega un importante rol en la pasivación de la superficie del electrodo. Así mismo se evaluó la capacidad atrapadora de radicales libres, mediante un ensayo de DPPH, el cual mostró una buena relación con los potenciales de oxidación de las moléculas, revelando que los sistemas con un menor potencial de oxidación muestran una mayor inhibición del radical DPPH [40]. 14 Manaia y colaboradores, estudiaron el comportamiento electroquímico de la curcumina y capsaicina, dos compuestos polifenólicos con una amplia variedad de aplicaciones médicas, mediante voltamperometría cíclica de pulso diferencial y de onda cuadrada. El mecanismo de oxidación del ácido ferúlico es comparado con el de estos compuestos y se pudo observar que la oxidación del ácido ferúlico es similar a la de la curcumina, la cual incluye dos pasos consecutivos de oxidación, mientras que la oxidación de la capsaicina implica sólo un paso de oxidación. A partir de esta investigación se propuso un mecanismo de oxidación para la curcumina, sin embargo, es importante mencionar que las mediciones se realizaron a diferentes valores de pH y en un medio acuoso, y se encontró que la oxidación es dependiente del pH [39]. Por último, con el fin de incrementar la lipofilicidad de los ácidos hidroxicinámicos y aumentar su absorción celular, Garrido y colaboradores, sintetizaron los ésteres metílico, etílico, propílico y butílico de los ácido ferúlico y cafeico, y realizaron estudios de capacidad atrapadora de radicales libres, mediante la técnica de DPPH y ensayos de Potencia Antioxidante Reductora Férrica (FRAP). De este modo, encontraron que las propiedades redox de los ácidos hidroxicinámicos estaban en concordancia con sus capacidades antioxidantes, por lo que los compuestos con mayor inhibición del radical DPPH tenían menores potenciales de oxidación. En conclusión, los resultados sugieren que la esterificación alquílica de algunos ácidos hidroxicinámicos aumenta sus propiedades antioxidantes, así como su lipofília y, como consecuencia, mejora su capacidad de protección celular contra el estrés oxidativo [41]. En conclusión, estos resultados confirman la importancia de conocer la facilidad de oxidación de sistemas antioxidantes a través del potencial de oxidación y otras propiedades fisicoquímicas a fin de explorar nuevos sistemas de ácidos cinámicos para obtener nuevos y más eficientes antioxidantes. 15 2. JUSTIFICACIÓN. El estudio de los derivados tipo éster del AF se ha convertido en un importante campo de investigación en los últimos años, ya que se ha comprobado que su actividad antioxidante es mayor con respecto a la del ácido ferúlico [19, 34]. Sin embargo no se conocen los mecanismos de oxidación de los sistemas de tipo biséster derivados del ácido ferúlico, lo que resulta importante estudiar ya que dicha característica química está relacionada directamente con la capacidad antioxidante, misma que le confiere al ácido ferúlico efectos terapéuticos tales como anti-inflamatorios, antiaterogénicos, anti-envejecimiento, neuroprotectores, radioprotectores y hepatoprotectores [23]. Por otro lado, es importante destacar que las técnicas electroquímicas como la voltamperometría cíclica ofrecen información relevante sobre propiedades redox de sistemas antioxidantes y su mecanismo de oxidación, lo que se puede relacionar con su capacidad antioxidante in vitro o in vivo. Por lo anterior, un estudio como el planteado en este trabajo resulta necesario para el desarrollo de moléculas derivadas del ácido ferúlico con mayores efectos terapéuticos que los encontrados hasta ahora. 16 3. HIPÓTESIS El estudio electroquímico de sistemas antioxidantes como ésteres y bisésteres derivados del ácido ferúlico a través de la voltamperometría cíclica, permite conocer el mecanismo de oxidación de los sistemas evaluados y parámetros fisicoquímicos importantes como lo son el potencial de oxidación y número de electrones involucrados, y dadas las características estructurales, particularmente de los sistemas bis, se infiere que deben presentar procesos de oxidación de 4 electrones. 17 4. OBJETIVO GENERAL Realizar la síntesis y estudio de la oxidación electroquímica mediante voltamperometría cíclica en ACN del éster bencílico del ácido ferúlico (EBAF), y dos nuevos sistemas biséster derivados del ácido ferúlico: 1,5-bis-feruloilpentanodiol (BEPAF) y 1,8-bisferulioiloctanodiol (BEOAF). EBAF BEPAF BEOAF 5. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Realizar la síntesis y purificación del EBAF, BEPAF y BEOAF. Llevar a cabo la caracterización mediante RMN y espectrometría de masas de los compuestos sintetizados. Realizar el análisis de la oxidación electroquímica de EBAF, BEPAF y BEOAF a través de la técnica de voltamperometría cíclica y elucidar sus mecanismos de oxidación. 18 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Caracterización espectroscópica de las moléculas sintetizadas 6.1.1. Éster bencílico del ácido ferúlico En el espectro de 1H RMN (figura 5), se observa una señal simple a 3.92 ppm que integra para 3 protones, asignada para el grupo metoxilo 10. A campo más bajo, se encuentra una señal en 5.25 ppm que integra para dos protones, asignada al grupo metileno 11. Figura 5. 1H RMN (CDCl3) del éster bencílico del ácido ferúlico. A un desplazamiento de 5.93 ppm se observa una señal ancha que integra para un protón y que corresponde al grupo hidroxilo sobre el carbono 7. El protón vinílico 2 se observa como una señal doble a 6.32 ppm (3JHH= 16.0 Hz), a diferencia del protón vinílico 3, que se encuentra más desprotegido, observándose una señal doble en 7.64 ppm (3JHH= 16.0 Hz). En 7.02 ppm, se observa una señal doble perteneciente al protón 5 (4JHH= 2.0 Hz), acoplada al protón 9, el cual posee un desplazamiento en 7.06 ppm, observándose como una señal 19 doble de dobles (3JHH= 8.0, 4JHH= 2.0 Hz). Por su parte, el protón 8 posee una señal doble con un desplazamiento a 6.90 ppm y un acoplamiento orto (3JHH= 8.0 Hz). De 7.34 a 7.43 ppm, observamos un conjunto de señales múltiples que integran para 5 hidrógenos y fueron asignadas a los protones H-13 - H17, respectivamente. 20 Por otro lado, en el espectro 13C RMN (figura 6), el carbonilo 1 posee un desplazamiento a ppm, para los carbonos 2 y 3 un desplazamiento en 115.2 y 145.3 ppm respectivamente. La señal en 127.0 ppm fue asignada al carbono 4, mientras que a 109.3 ppm se observa la correspondiente al carbono 5. Por su parte, los carbonos 6, 7, 8 y 9 mostraron los siguientes desplazamientos: 148.1, 146.7, 114.8 y 123.9 ppm. Figura 6. Espectro 13C RMN (CDCl3) del EBAF En 56.0 ppm se observa una señal que fue asignada al carbono 10, mientras que para el carbono 11 una señal en 66.3 ppm. El carbono 12 mostró un desplazamiento químico en 136.2 ppm y entre 128.3 y 128.6 ppm observamos un conjunto de señales que fueron asignadas a los carbonos C13-17, respectivamente. 21 6.1.2. 1,5-bis-feruloilpentanodiol En el espectro 1H RMN (figura 7), puede observarse una señal múltiple appm que integra para 2 protones, perteneciente al metileno 13. A 1.75 ppm se observa una señal múltiple que integra para 4 protones, pertenecientes a los metilenos 12. Figura 7. 1H RMN (CDCl3) del BEPAF. La señal en 3.91 ppm, integra para 6 protones, y pertenece a los grupos metoxilo en 10, respectivamente. Los protones pertenecientes a los metilenos 11 se encuentran a 4.22 ppm, 22 como una señal triple. Para los grupos hidroxilos, corresponde un desplazamiento químico a 5.89 ppm. Los protones vinílicos 2 y 3 se observan como señales dobles, observándose para los primeros un desplazamiento a 6.27 ppm (3JHH= 16.0 Hz) y los segundos a 7.60 ppm (3JHH= 16.0 Hz). Los protones 5, presentaron una señal doble a 7.02 ppm, con un acoplamiento meta (4JHH= 2.0 Hz), mientras los protones 8 mostraron una señal doble a 6.89 ppm con un acoplamiento orto (3JHH= 8.0 Hz), por su lado los protones 9 mostraron una señal doble de dobles en 7.05 ppm, con un acoplamiento orto y meta, respectivamente (3JHH= 8.0 Hz, 4 JHH= 2.0 Hz). 23 Así mismo, en el espectro de 13 C RMN (figura 8), se observan los desplazamientos químicos típicos de los carbonos de la molécula simétrica, así para los carbonilos 1 se tiene una señal a 167.4 ppm, para los carbonos 2 y 3 un desplazamiento a 115.5 y 144.9 ppm respectivamente, en 56.0 ppm se observa una señal que fue asignada a los carbonos 10, mientras que para los carbonos 11 una señal en 64.3 ppm. Figura 8. 13C RMN (CDCl3) del BEPAF. 24 Para los carbonos 12, se observó un desplazamiento a 28.5 ppm, mientras que para el carbono 13 una señal a 22.7 ppm, respectivamente. La señal en 127.0 ppm fue asignada para los carbonos 4, mientras que a 109.3 ppm se observa el carbono 5. Los carbonos 6, 7, 8 y 9 mostraron los siguientes desplazamientos: 148.0, 146.8, 114.7 y 123.1 ppm, respectivamente. Estos desplazamientos se pudieron corroborar con el experimento de RMN de dos dimensiones HETCOR, mostrado en la figura 9. 25 Figura 9. Experimento HETCOR (CDCl3) del 1,5-bis-feruloilpentanodiol. 26 6.1.3. 1,8-bis-feruloiloctanodiol Las señales correspondientes a la unidad del ácido ferúlico del BEOAF se asignaron de manera similar a las indicadas para el BEPAF (figura 10). Por otro lado, las señales correspondientes a los protones alifáticos se asignaron de la siguiente forma: a campo alto, la señal múltiple enppm pertenece a los metilenos 13 y 14 y sus respectivos análogos simétricos. A 1.68 ppm se observa una señal múltiple, perteneciente a los metilenos 12. Los protones pertenecientes a los metilenos 11 se encuentran a 4.17 ppm, presentando una señal triple, integrando para 4 protones, respectivamente. Figura 10. 1H RMN (CDCl3) del BEOAF. 27 En el espectro de 13 C RMN (figura 11), las señales pertenecientes a los carbonos de la unidad de ácido ferúlico se asignaron de manera similar al BEPAF; para el caso de los carbonos alifáticos correspondientes se asignaron los siguientes desplazamientos: Carbonos 11, desplazamiento a 64.6 ppm; Carbonos 14, 25.9 ppm; carbonos 13, 28.8 ppm. Por su parte, los carbonos 12 mostraron un desplazamiento a 29.2 ppm respectivamente. Figura 11. 13C RMN (CDCl3) del BEOAF. 28 6.2. Estudio electroquímico. 6.2.1. Estudio electroquímico por voltamperometría cíclica del éster bencílico del ácido ferúlico. Para comprender el comportamiento electroquímico de los ésteres del ácido ferúlico, es necesario tomar como punto de partida el comportamiento electroquímico de AF, ya que su mecanismo de electrooxidación es conocido, por lo que se realizó el correspondiente voltamperograma para utilizarlo como sistema de referencia. Así el AF mostró un pico típico de oxidación irreversible (I) y su correspondiente pico de reducción (II) en el barrido inverso (figura 12). Estudios anteriores han determinado que en el pico de oxidación, están involucrados dos electrones (esquema 1), donde las reacciones de transferencia de electrón y protón iniciales son consecutivas [40, 42]. 120 I / A 100 80 60 40 20 0 -20 E / V vs ECS -40 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 Figura 12. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) a 0.1 Vs-¹ de AF 2 mM. En el esquema 1, se muestra el mecanismo de oxidación que sigue el AF, el cual ha sido determinado como ECE (electroquímico-químico-electroquímico), donde el primer paso es la pérdida de un electrón, seguida de una desprotonación y una segunda pérdida de un electrón: 29 Esquema 1. Mecanismo de oxidación del AF. Así mismo, estudios previos señalan la existencia de una estabilización de los radicales cationes generados a través de la oxidación de la unidad guayacol, debido al doble enlace conjugado del AF (esquema 2), radicales que a su vez pueden generar especies diméricas [42]. Esquema 2. Estabilización del radical catión generado tras la pérdida de un electrón en la oxidación del ácido ferúlico. Partiendo del anterior análisis mecanístico de AF, fue realizado el correspondiente voltamperograma de EBAF en ACN el cual mostró un pico típico de oxidación irreversible bielectrónico (I) y su correspondiente pico de reducción (II) en el barrido inverso (figura 13) similar a AF. Ya que la intensidad de corriente de pico anódico (ipa) para este sistema es similar a la registrada para el AF, en las mismas condiciones de disolvente, velocidad de barrido y concentración, se deduce que la estequiometría electrónica es también de dos electrones para este sistema [40, 42]. 30 120 I I / A 100 80 60 40 20 0 -20 E (V vs ECS) II -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 Figura 13. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) a 0.1 Vs-¹ del EBAF 2 mM. Considerando que en nuestro grupo de investigación fueron observados fenómenos de adsorción química sobre la superficie del electrodo de carbón vítreo en sistemas tipo monoamida y bisamida [40, 45], se realizaron 25 ciclos consecutivos de voltamperometría cíclica a EBAF. El resultado de esta experimentación se muestra en la figura 14 y como se observa, conforme son registrados varios ciclos consecutivos de oxidación, el pico (tanto de oxidación como reducción) disminuye en intensidad, con lo cual queda evidenciada la existencia de un proceso que bloquea la superficie activa del electrodo de trabajo (pasivación). 31 120 I I / A 100 a) b) c) 80 60 40 20 0 -20 E / V vs ECS II -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 Figura 14. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) a 0.1 Vs-¹ de EBAF, 2 mM, a) Ciclo 1, b) Ciclo 10, c) Ciclo 25. Esta pasivación que sufre el electrodo de trabajo puede deberse a una adsorción física (fisisorción) o química (químisorción, la cual implica una unión covalente). Para descartar que el proceso que se está llevando a cabo sea de tipo físico, el electrodo fue enjuagado en un limpiador ultrasónico para posteriormente realizar un ciclo más de oxidación y así confirmar o descartar fisisorción, el resultado reveló que el pico I no se recuperó. Posteriormente, se realizó el pulido de la superficie del electrodo y se volvió a correr el experimento de VC, comprobando que el pico de oxidación y el de reducción se restablecían completamente (figura 15). Este último experimento confirma la presencia de un fenómeno de quimisorción. 32 120 I (A) 100 a) b) c) 80 60 40 20 0 E/V vs ECS -20 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 Figura 15. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) a 0.1 Vs-¹ de EBAF, 2 mM, a) Ciclo 1, b) Ciclo 25, c) Ciclo después de pulir el electrodo de trabajo. El proceso de quimisorción encontrado en el sistema monoéster, es menos eficiente y menos favorable que el encontrado anteriormente en el sistema monoamida derivada del ácido ferúlico, ya que éste último compuesto requirió un menor número de ciclos para bloquear la superficie de carbón vítreo [40]. Para conocer un poco más de este proceso y el efecto del grupo funcional, se llevaron a cabo también varios ciclos de oxidación en el sistema base AF. Los voltamperogramas obtenidos se muestran en la figura 16. 33 120 100 I / A I' a) b) c) 80 60 40 20 0 -20 II' E / V vs ECS -40 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 Figura 16. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) a 0.1 Vs-¹ de AF 2 mM, a) Ciclo 1, b) Ciclo 10, c) Ciclo 25. Como se muestra en la figura 16, existe una disminución de los picos de oxidación (I’) y reducción (II’) conforme incrementa el número de ciclos de VC, haciéndose más evidente este comportamiento en el ciclo 25, al igual que en el sistema mono éster. Este resultado sugiere la existencia, también, de un fenómeno de adsorción de las especies generadas tras la oxidación del AF sobre la superficie del electrodo de trabajo, revelando a su vez que la especie generada tras la oxidación del AF es un sistema orgánico no conductor, ya que además de que no se observan picos adicionales, no permite el paso de corriente de manera eficiente. El fenómeno de adsorción sobre el electrodo de trabajo, al igual que el mono éster, no es importante durante la experimentación, ya que se requiere de varios ciclos para poder observarse. Estos experimentos nos permiten deducir que el EBAF, al igual que el AF, sufre dos mecanismos de oxidación (incisos a y b), los cuales se presentan en el esquema 3: 34 Esquema 3. Mecanismo de oxidación del EBAF y AF en ACN a) Esta ruta de oxidación considera la secuencia reportada (mecanismo ECE, esquema 1), que explica la presencia del pico I y que incluye una segunda pérdida de un electrón, lo que genera como producto de la oxidación una especie quinona catiónica 1, que en el proceso de reducción llega al sistema o-quinona [44], generando el pico II de reducción en el experimento de VC. b) El radical R, al ser una especie muy reactiva, genera dos productos posibles: el primero se describe como una forma dimérica del sistema (2), generada tras la reacción del radical R consigo mismo [43, 45], mientras el segundo como una especie que se adhiere al electrodo de forma química, mediante un enlace covalente (3), ruta que puede explicar el proceso de quimisorción observado. 35 6.2.2. Estudio electroquímico por voltamperometría cíclica de los sistemas biséster derivados del ácido ferúlico. El comportamiento del 1,5-bis-feruloilpentanodiol mostró un pico de oxidación de naturaleza irreversible (I), con el respectivo pico de reducción (II) en el barrido inverso (Figura 17). Al realizar una comparación entre el comportamiento electroquímico de AF y EBAF vs BEPAF, se logra notar que existe una diferencia significativa entre la intensidad del pico de oxidación I, este resultado sugiere que la electrooxidación del BEPAF posee una estequiometría electrónica que es mayor a dos electrones. 160 140 I I / A 120 AF EBAF BEPAF 100 80 60 40 20 0 -20 E / V vs ECS II -40 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 Figura 17. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) a 0.1 Vs-¹ de AF, EBAF Y BEPAF 2 mM. Por otro lado, tras la realización de 6 ciclos consecutivos de VC, los picos de oxidación y reducción disminuyen de manera importante, desapareciendo casi totalmente (figura 18), lo que indica una rápida adsorción de las especies generadas tras la oxidación sobre el electrodo de carbón vítreo. 36 140 I / A 120 1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo 4 ciclo 5 ciclo 6 ciclo 100 80 60 40 20 0 -20 -40 -0,2 E / V vs ECS 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 Figura 18. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) de BEPAF, 2 mM. Se muestran varios ciclos consecutivos de VC a 0.1 Vs-¹. Tales especies, al no ser sistemas orgánicos conductores, producen una disminución de la superficie activa del electrodo y por tanto su pasivación, fenómeno que sólo es revertido tras el pulido del electrodo de trabajo (figura 19). Esto confirma que la pasivación es debida a una unión química covalente entre las especies generadas en la oxidación electroquímica y el electrodo de trabajo. 37 140 I /A 120 100 a) b) c) 80 60 40 20 0 -20 -40 -0,2 E / V vs ECS 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 Figura 19. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) de BEPAF, 2 mM a 0.1 Vs-¹, a) Ciclo 1, b) Ciclo 6, c) VC después de pulir electrodo. Es importante mencionar que no se observa algún pico de reducción tras la pasivación del electrodo de trabajo, lo que comprueba que la película formada durante este proceso no es electroquímicamente activa, en otras palabras se forma una película orgánica no conductora sin grupos funcionales reducibles en potenciales catódicos (figura 20). Considerando además que una vez que se registra el voltamperograma en potenciales catódicos tampoco se observa una recuperación del pico I al registrar nuevamente el experimento de oxidación (figura 20 d), es posible inferir que el fenómeno de adsorción sobre la superficie del electrodo es irreversible (figura 20). 38 140 I / A 120 a) b) c) d) 100 80 60 40 20 0 -20 -40 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 E / V vs ECS Figura 20. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) de BEPAF 2 mM a 0.1 Vs-¹, a) Ciclo 1, b) Ciclo 6, c) Ciclo 7, hacia valores de reducción, d) Ciclo 8, hacia valores de oxidación, posterior a reducción. Por otro lado, partiendo de la observación de que el pico I en el biséster BEPAF es ligeramente más ancho que los correspondientes al monoéster EBAF y sistema AF, se realizó un registro de voltamperogramas a diferentes velocidades de barrido, de este modo, como puede observarse a partir de la figura 21, a una velocidad alta de barrido (0.5 Vs-1), la intensidad de la pre onda cerca de I se observa incrementada. 39 300 I I (A) 250 0.050 Vs 0.100 0.200 0.500 200 150 -1 100 50 0 -50 E / V vs ECS II -100 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 Figura 21. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) de BEPAF, 2 mM a diferentes velocidades de barrido. Este comportamiento podría ser asociado a la topología bis de las moléculas y fue confirmado en estas experimentaciones, ya que el fenómeno se presenta de manera más acentuada en el BEOAF (figura 22). De lo anterior se presume que el comportamiento electroquímico de las dos unidades guayacol, presentes en el par de sistemas bis, no es equivalente y esta característica llega a ser más notoria mientras mayor es la longitud de la cadena que las separa. 40 140 I / A 120 BEPAF BEOAF 100 80 60 40 20 0 -20 -40 -0,2 E / V vs ECS 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 Figura 22. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm de BEOAF y BEPAF, 2 mM y 0.1 Vs-¹ para ambos compuestos. Por otra parte, el 1,8-bis-feruloiloctanodiol, reveló un comportamiento semejante al BEPAF, mostrando un pico típico de oxidación irreversible ancho (I), y su respectivo pico de reducción (II) en el barrido inverso (figura 23). Estas características de picos, al igual que el sistema biséster BEPAF y monoéster, sugieren que se encuentra presente, además de otros procesos como la adsorción, un mecanismo ECE. 41 140 120 I I / A 100 80 60 40 20 0 -20 II -40 -0,2 0,0 0,2 E / V vs ECS 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 Figura 23. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) de BEOAF, 2 mM a 0.1 Vs-¹. De igual manera para conocer con mayor detalle el comportamiento del pico de oxidación del BEOAF se realizó un experimento a diferentes velocidades de barrido, observándose la formación de dos picos de oxidación, que a velocidades más lentas (0.025 y 0.050 Vs-1) se observan con mayor claridad (figura 24), y a velocidades de 0.50 Vs-1 se unen. Cabe mencionar que para llevar a cabo cada barrido se debió pulir el electrodo de trabajo, ya que la superficie era modificada desde el primer ciclo de VC, lo que confirmó una vez más que la pasivación es debida a la unión química covalente entre las especies generadas en la oxidación electroquímica y el electrodo de trabajo. 42 300 I / A 250 200 -1 0.025 Vs 0.05 0.1 0.5 150 100 50 0 -50 E / V vs ECS -100 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 Figura 24. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) de BEOAF, 2 mM a diferentes velocidades de barrido. Así mismo, para el BEOAF se observó un fenómeno de pasivación más acentuado que el sistema biséster BEPAF, ya que al cabo de 4 ciclos consecutivos de VC, los picos de oxidación y reducción disminuyeron de manera importante, desapareciendo casi totalmente (figura 25). Este resultado sugiere la existencia de un efecto notable en la eficiencia de la pasivación, relacionado con la longitud de la cadena, que pudiera estar asociado a un mayor grado de libertad de los grupos oxidables para unirse en los sitios más reactivos presentes en la superficie de carbón vítreo. Del mismo modo, se realizó un barrido de VC hacia potenciales catódicos (llegando hasta 2.0 V), y así se pudo observar que para este sistema tampoco existe un grupo proclive a la reducción después de la pasivación del electrodo (figura 26), comportamiento similar al observado para el sistema BEPAF. 43 140 I / A 120 100 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4 Ciclo 80 60 40 20 0 -20 E / V vs ECS -40 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 Figura 25. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) a 0.1 Vs-¹ de BEOAF 2 mM, presentación de 4 ciclos consecutivos de VC. 140 120 I / A 100 a) b) c) d) e) f) 80 60 40 20 0 -20 E / V vs ECS -40 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Figura 26. Voltamperometría cíclica en ACN + 0.1M Bu4NPF6 sobre grafito vidriado (3 mm ) a 0.1 Vs-¹ de BEOAF 2 mM, a) ciclo 1, b) ciclo 2, c) ciclo 3, d) ciclo 4, e) ciclo 5, hacia reducción, f) ciclo 6, hacia oxidación, posterior a reducción. 44 De acuerdo a estos resultados y dada la aparición de una pre onda de oxidación muy cercana al pico I en la oxidación electroquímica de los sistemas biséster, es posible inferir que la manera en la que los radicales generados se acoplan al electrodo, en el caso de estos dos sistemas, podría ser distinta a la observada para el AF y el EBAF. Es importante mencionar que estudios teóricos sobre sistemas bis y tripodal derivados del ácido ferúlico señalan que estos pueden tener más de un sitio favorable energéticamente donde puede llevarse a cabo una reacción radicalaria [47], lo que da una idea acerca de los acoplamientos que se llevan a cabo en estos sistemas. Por otro lado, también se ha reportado la formación de especies diméricas a través de la oxidación de ácidos hidroxicinámicos y sus derivados en la posición al grupo carbonilo [40, 42, 46, 50]. Por lo anterior, es posible la propuesta del siguiente mecanismo de oxidación para los sistemas biséster del ácido ferúlico: Esquema 4. Mecanismo de oxidación de BEPAF y BEOAF 45 A pesar de que el carbón vítreo (CV) es considerado como un material inerte, enlaces covalentes sobre la superficie del electrodo, como: CV-C, CV-N, CV-O, CV-Ar, han sido descritos por diversos grupos de investigación con anterioridad [48, 49, 50, 51]. Asimismo, estas modificaciones sobre la superficie del electrodo (CV) han involucrado la formación de radicales, quienes se acoplan con los carbonos de la superficie de CV, formando enlaces covalentes. Además de la existencia de diferentes formas de unión de los radicales neutros formados en estos sistemas, otro aspecto relevante a considerar es aquel relacionado con la inhomogeneidad de sitios reactivos presentes en el CV [52]. En éste estudio resulta importante señalar que al igual que lo encontrado en sistemas bisamida derivadas de AF por nuestro grupo de investigación [45], la topología biséster muestra una predominancia en el proceso de quimisorción, que también es afectado por la longitud de la cadena hidrocarbonada que separa a las unidades guayacol. Por otro lado, en éste estudio se encontró que los ésteres derivados del ácido ferúlico muestran potenciales de oxidación mayores que su precursor (tabla 1), por tanto, se podría predecir que estos derivados tengan una actividad antioxidante menor que el AF. Sin embargo, es importante recordar que además del potencial de oxidación, el número de electrones potencialmente donables por parte del antioxidante es otro parámetro fundamental a considerar. En los sistemas bis ésteres estudiados, los potenciales de oxidación observados y medidos para los mismos son el resultado de dos picos de oxidación incluidos en el pico anódico I y que son consecuencia de una no equivalencia química de los grupos guayacol, cuyo origen se encuentra actualmente en investigación, por otra parte se demostró la existencia de una estequiometría mayor a dos electrones, este último resultado junto con la baja polaridad en estos sistemas, podría ser una característica que favorezca su capacidad antioxidante. Tabla 1. Potenciales de oxidación de los sistemas estudiados Sistema Ácido ferúlico EBAF BEPAF BEOAF Potencial de oxidación (V) 1.18 1.21 1.38 1.41 46 En apoyo a la importancia del presente trabajo, un aspecto interesante encontrado por Neudörffer y colaboradores, interesados por el estudio de la actividad antioxidante de dímeros generados a través de la oxidación electroquímica de ésteres del ácido ferúlico, fue el observar potentes propiedades antioxidantes en los sistemas diméricos [46]. 47 7. CONCLUSIONES Se sintetizaron los ésteres EBAF, BEPAF y BEOAF del ácido ferúlico con rendimientos moderados, reportándose por primera vez la síntesis de los sistemas biséster. Las tres moléculas obtenidas se caracterizaron mediante técnicas de resonancia magnética nuclear, en el caso de los sistemas biséster, se utilizó adicionalmente la espectrometría de masas. Se estudió por primera vez la oxidación electroquímica en acetonitrilo de los tres sistemas a través de la técnica de voltamperometría cíclica, pudiéndose concluir a partir de los resultados obtenidos lo siguiente: El EBAF posee un mecanismo de oxidación ECE (Electroquímico-Químico- Electroquímico) predominante, donde el primer paso es la pérdida de un electrón, seguida de una desprotonación y una segunda perdida de un electrón, originando como producto final una o-quinona catiónica que en el proceso de reducción llega hasta el sistema oquinona. Además, este monoéster, al igual que el AF, evidenció por primera vez un fenómeno de quimisorción sobre la superficie del electrodo de trabajo, que no es importante durante la experimentación, ya que se requiere de varios ciclos para poder observarse. Para los sistemas biséster derivados del ácido ferúlico, el comportamiento en el proceso de oxidación presentó una estequiometría electrónica mayor a dos electrones, lo cual es un aspecto que favorecería la actividad antioxidante de estos nuevos sistemas. Por otro lado, fue observable la presencia de procesos de quimisorción importantes de las especies generadas tras la oxidación sobre el electrodo de carbón vítreo y se determinó que la película formada tras la pasivación del electrodo no es electroquímicamente activa. Las características de los voltamperogramas en el primer ciclo de oxidación sugieren que se encuentra presente, además de los procesos de adsorción, un mecanismo ECE en ambos sistemas. A partir de la naturaleza del pico de oxidación de los sistemas BEPAF y BEOAF se infiere que el comportamiento electroquímico de las dos unidades guayacol presentes en el par de sistemas bis no es equivalente y llega a ser más notorio mientras mayor es la longitud de la cadena que los separa. 48 Se logró el planteamiento de un mecanismos para explicar la manera en la que los radicales generados se acoplan al electrodo: mediante una unión covalente entre el carbono al grupo carbonilo y el electrodo de trabajo, y entre el oxígeno fenólico y el electrodo de trabajo. Sin embargo, aunque dichas rutas pueden explicar el proceso de quimisorción sobre la superficie del electrodo de carbón vítreo, se hacen necesarios estudios adicionales que arrojen resultados sobre la reactividad de las especies radicalarias para la confirmación de éstas propuestas. Finalmente en este trabajo fue evidenciado que tanto la topología bis como la longitud de la cadena hidrocarbonada tienen un efecto importante en la predominancia de la quimisorción en los sistemas evaluados en acetonitrilo. 49 8. METODOLOGÍA 8.1.Metodología Sintética Generalidades: La reacciones de síntesis se llevaron a cabo a temperatura ambiente, bajo atmósfera de Nitrógeno. La Dimetilformamida (DMF) y el acetonitrilo (ACN) utilizados para la síntesis fueron grado HPLC. El cloruro de metileno y el dietiléter utilizado para la extracción fue grado reactivo. La purificación de los compuestos se llevó a cabo mediante cromatografía en columna. Para la columna cromatográfica se utilizó gel de sílice 230-400 marca Natland. Reactivos: Ácido ferúlico (99%), 2-bromo-etilbenceno, perlas de hidroxido de sodio 98%, 1,5-dibromopentano (97%), 1,8-dibromooctano (98%), Solución de hidroxido de tetrabutil amonio 0.1 M en metanol. Todos los reactivos se obtuvieron comercialmente en SigmaAldrich. Instrumentación: Los puntos de fusión se determinaron con un aparato Melting-point modelo SMP10 marca Stuart en capilares abiertos. Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear se obtuvieron en el espectrómetro JEOL GSX-270 NMR 270 MHz, con sonda de gradiente y habilitado para hacer experimentos a temperatura variable. Los espectros de 1H se realizaron a 270 MHz y los de 13C a 100.5 MHz. Las constantes de acoplamiento (J), se reportaron en Hertz (Hz) y para indicar la multiplicidad de las señales se abrevia: simple (s), doble (d), doble de dobles (dd), triple (t), señal múltiple (m). La espectrometría de masas se determinó con un Espectrómetro Gi969A LC/MSD-TOF Agilent. 8.1.1. Síntesis de ésteres derivados del ácido ferúlico. El sistema EBAF fue sintetizado a partir de AF y bromuro de bencilo, de acuerdo al procedimiento informado por Son y col [53]. 50 Para el caso de los sistemas 1,5- bis-feruloilpentanodiol y 1,8- bis-feruloiloctanodiol se siguió la siguiente metodología sintética: EBAF. A una solución de ácido ferúlico (0.7 g) en 25 ml de DMF, se le agregaron 0.8 ml de NaOH al 25%. Se dejó en agitación por una hora, posteriormente se adicionaron 1.7 ml de bromuro de bencilo disuelto en 10 ml de DMF mediante un embudo de adición. La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 48 horas, posteriormente se agregaron 50 ml de agua helada, el producto se extrajo con dietil éter. El extracto de reacción fue secado con MgSO4 y evaporado al vacío. La purificación del compuesto se realizó en cromatografía en columna, fase estacionaria: silica gel, fase móvil: mezcla hexano/acetato, polaridad 80:20. Rendimiento de la reacción 30%. Se obtuvo un Líquido amarillo viscoso que presentó las siguientes Características espectroscópicas: RMN 1H (270 MHz, CDCl3) δ (ppm): 3.92 (s, 3H, H-10), 5.25 (s, 2H, H-11), 5.93 (s, OH), 6.32 (d, 1H, H-2), 7.64 (d, 1H, H-3), 6.90 (d, 1H, H-8, 3JHH= 8.0 Hz), 7.02 (d, 1H, H-5, 4 JHH= 2.0 Hz), 7.06 (dd, 1H, H-9, 3JHH=8.0 Hz, 4JHH=2.0), 7.34-7.43 (m, 5H). RMN 13 C (270 MHz, CDCl3) δ=167.2 (C=O, C1), 115.2 (CH, C2), 145.3 (CH, C3), 127.0 (C4), 109.3 (C5), 148.1 (C6), 146.8 (C7), 114.8 (C8) y 123.2 (C9), 56 (C10), 63.3 (C11), 136.2 (C12), 128.3-128.7 (C13-17). 51 BEPAF A una solución de ácido ferúlico (1 g) en 80 ml de ACN, se le agregaron 5.2 ml de hidroxido de tetrabutilamonio (5.14 mmol), y se dejo en agitación por 30 minutos. Posteriormente se adicionaron 0.35 ml de 1,5-dibromo pentano (2.5 mmol). La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 52 horas, posteriormente se agregaron 50 ml de agua helada, y se extrajo el producto con cloruro de metileno. El extracto fue secado con MgSO4 y evaporado al vacío. La purificación del compuesto se realizó en cromatografía en columna, fase estacionaria: silica gel, fase móvil: mezcla hexano/acetato, polaridad 80:20. Rendimiento de la reacción 15%. Se obtuvo un sólido blanco con un punto de fusión de 126 ºC, que presentó las siguientes características espectroscópicas: RMN 1H (270 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1.52 (m, 2H, H-13), 1.75 (m, 4H, H-12), 3.91 (s, 6H, H-10), 4.22 (t, 4H, H-11), 5.89 (s, 2H, OH), 6.27 (d, 2H, H-2, 3JHH=16.0 Hz), 7.6 (d, 2H, H-3, 3JHH=16.0 Hz), 7.02 (d, 1H, H-5, 4JHH=2.0 Hz), 6.89 (d, 1H, H-8, 3JHH=8.0 Hz), 7.05 (dd, 1H, H-9, 3JHH=8.0 Hz, 3JHH=2.0 Hz). RMN 13 C (270 MHz, CDCl3), δ=167.4 (C=O, C1), 115.5 (CH, C2), 144.9 (CH, C3), 127.0 (C4), 109.3 (C5), 148.0 (C6), 146.8 (C7), 114.7 (C8) y 123.1 (C9), 56.0 (C10), 64.3 (C11), 28.5 (C12). 22.7 (C13). Masa exacta calculada para C25H28O8: 456.49, observada (M+1): 457.185 BEOAF. solución A de una ácido ferúlico (1 g) en 80 ml de ACN, se le agregó 5.2 ml de hidroxido de tetrabutilamonio (5.14 mmol). Se dejó en agitación por 30 minutos, posteriormente se adicionaron 0.37 ml 1,8-dibromo-octano (2.5 mmol). La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 52 horas, posteriormente se agregaron 50 ml de agua helada, y el producto se extrajo con cloruro de metileno. El extracto fue secado con MgSO4 y evaporado al vacío. La purificación del compuesto se realizó en cromatografía en columna, fase estacionaria: silica gel, fase móvil: mezcla hexano/acetato, polaridad 75:25. Rendimiento de la reacción 13%. Se obtuvo un sólido 52 amarillo con punto de fusión de 94ºC, presentando las siguientes características espectroscópicas: RMN 1H (270 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1.36 (m, 8H, H-13 - H-14), 1.68 (m, 4H, H-12), 3.90 (s, 6H, H-10), 4.17 (t, 4H, H-11), 5.90 (s, 2H, OH), 6.24 (d, 2H, H2, 3JHH=16.0 Hz), 7.56 (d, 2H, H3, 3JHH=16.0 Hz), 7.01 (d, 1H, H-5, 4JHH=2.0 Hz ), 6.88 (d, 1H, H-8, 3JHH= 8.0 Hz), 7.05 (dd, 1H, H-9, 3JHH= 8.0, 4JHH=2.0 Hz). RMN 13C (270 MHz, CDCl3) 167.4 (C=O, C1), 115.6 (CH, C2), 144.7 (CH, C3), 127.0 (C4), 109.3 (C5), 148.0 (C6), 146.8 (C7), 114.7 (C8) y 123.1 (C9), 56.0 (C10), 64.6 (C11), 29.2 (C12). 28.8 (C13), 25.9 (C14). Masa exacta calculada para C28H34O8: 498.23, observada (M+1): 499.23. 8.2. Metodología e instrumentación electroquímica Reactivos: Se utilizó como disolvente acetonitrilo de alta pureza CROMASOLV Plus, como electrolito soporte, hexafluorofosfato de tetrabutilamonio amonio 99%. Obtenidos comercialmente de Sigma-Aldrich. Instrumentación, celda y electrodos: La instrumentación electroquímica consistió de un potenciostato VoltaLab40 de Radiometer con compensación de caída Óhmica, el instrumento fue controlado por computadora (figura 27) mediante el programa Voltamaster 32. Para la experimentación se utilizó una celda convencional de 3 electrodos. El electrodo de trabajo utilizado fue un disco de carbón vítreo de 3 mm de diámetro, el cual fue pulido con polvo de alúmina de 0.04 µm y posteriormente enjuagado en ultrasonicado con acetonitrilo y metanol absoluto; como electrodo auxiliar se utilizó una malla de platino. El electrodo de referencia fue un electrodo de calomel saturado (ECS), el cual se conectó a la solución de trabajo mediante un puente salino con disolvente y electrolito a la misma concentración que la celda. Adicionalmente se utilizó un dispositivo de vidrio para desgasificar la solución de trabajo y mantenerla bajo atmósfera inerte (Nitrógeno de alta pureza) a lo largo de todas las mediciones (figura 28). Los datos obtenidos fueron analizados posteriormente utilizando el software Origin 6.0. 53 Figura 28. Esquema general del equipo (potenciostato) y computadora utilizado para controlar la experimentación en la celda electroquímica. a) b) c) d) Figura 28. Celda convencional de tres electrodos provista de a) Electrodo de trabajo (disco de carbón vítreo 3mm , b) Electrodo auxiliar (malla de Pt), c) Electrodo de referencia (ECS) y d) burbujeador de Nitrógeno de alta pureza. 54 8.2.1. Estudio electroquímico de los ésteres del ácido ferúlico en ACN Una solución de 10 mL, concentración 2.0 mM de cada compuesto, la cual también contenía electrolito soporte a una concentración 0.1 M (Hexafluorofosfato de tetrabutilamonio), se agregó en la celda equipada con tres electrodos y se mantuvo en atmósfera inerte mediante burbujeo con Nitrógeno antes de cada experimentación. Todos los barridos de voltamperometría cíclica se realizaron a temperatura ambiente. 55 9. REFERENCIAS [1] M. Srinivasan, A.R. Sudheer, V.P. Menon. J. Clin. Biochem. Nutr. 40 (2007) 92-100. [2] R. Keyrouz, M. Abasq, C.L. Bourvellec, N. Blanc, L. Audibert; E. ArGall, D. Hauchard. Food Chem. 126 (2011) 831-836. [3] A. Gaspar, E.M. Garrido, M. Estevs, E. Quezada, N. Milhazes, J. Garrido, F. Borges. Eur. J. Med. Chem. 44 (2009) 2092-2099. [4] J.J. Beck, J.H. Kim, B.C. Campbell, S.C. Chou. J. Nat. Prod. 70 (2007) 779-782. [5] J.Z. valos, R. Herrero, A. Chana, A.S. Guerrero, . im ne , . . Santiuste. J. Phys. 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