La diazotación de la sulfanilamida en medio ácido y su posterior

Daniel González Mancebo
Trabajo experimental 1
Determinación de nitritos en aguas naturales
mediante análisis por inyección en flujo.
Daniel González Mancebo
Química Analítica Avanzada
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Daniel González Mancebo
Trabajo experimental 1
Resumen
Se ha realizado un análisis de una muestra de agua natural, para la cual se ha
determinado su contenido en nitritos). También se ha realizado un estudio de la
influencia del caudal en los picos del fiagrama, así como la utilización de test de
comparación para eliminar todas las posibles fuentes de errores presentes en el
análisis.
El análisis se ha llevado a cabo mediante una metodología FIA (análisis por
inyección en flujo).
Se ha obtenido un resultado, para la concentración de nitritos en el agua, de
14.5 ± 0.6 ppm. Obteniéndose asimismo un resultado para la recta de calibrado de: R²
= 0.9952 y una pendiente de 0.1521.
Introducción
Los nitritos son aniones incoloros que contienen nitrógeno y oxígeno,
pueden comportarse bien con oxidantes o como reductores. Los podemos encontrar en
diversas áreas como son en los abonos que se utilizan en la agricultura, en muchos de
los aditivos que usan las industrias alimentarias así como también son constituyentes
naturales de algunos alimentos de origen vegetal (espinacas, remolacha…). Los nitritos
pueden aparecer de dos formas diferentes bien por la oxidación del amoniaco o bien
en la reducción del nitrato.
Los nitritos en medio ácidos pueden reaccionar con aminas secundarias para
dar una molécula orgánica conocida como nitrosamina que son productos
carcinogénicos. Además cuando el nitrito entra en el flujo sanguíneo reacciona con la
hemoglobina y forma un compuesto llamado metahemoglobina. Este compuesto
reduce la capacidad de la sangre para transportar oxígeno y se desarrolla una
enfermedad conocida como cianosis. Sin embargo es necesaria una pequeña cantidad
porque ayudan a prevenir de una enfermedad conocida como botulismo.
La determinación correspondiente se ha realizado mediante análisis por
inyección de flujo (FIA) que es un método basado en la inyección de una muestra
líquida en una corriente continua no segmentada de un líquido apropiado. La muestra
inyectada forma una zona, la cual es transportada hacia el detector que
continuamente registra la absorbancia. Tiene un fundamento simple, manejo sencillo y
cómodo, instrumentación barata y gran capacidad para lograr resultado con exactitud
y precisión.
Esta determinación se basa en la reacción química que se produce entre la
sulfanilamida y la 1-naftiletilendiamina.
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La diazotación de la sulfanilamida en medio ácido y su posterior reacción con
la 1-naftiletilendiamina da un colorante púrpura susceptible de ser determinado
colorimétricamente, éste va a ser el trasfondo químico que tendrá la determinación
que se va a llevar a cabo, que a nivel de reacciones se puede representar como sigue:
NH2
H2NO2S
+ 2 NO2- + 2 H+
H2NO 2S
+
N N
+
OH2
Sulfanilamida
H2NO 2S
+
N N
+
NHCH2CH2NH2
H2NO 2S
N N
NHCH2CH2NH2
1 - naftiletilendiamina
Por otro lado un esquema del montaje empleado para la realización de la
práctica la podemos observar en la figura 1. En la figura se muestran los componentes
básicos de un sistema de análisis por inyección de flujo.
Experimental
Aparatos:
SISTEMA PROPULSOR: En esta práctica vamos a usar como sistema propulsor
una bomba peristáltica. La función de esta va a ser la de introducir e impulsar a los
analitos y reactivos a través del sistema que hemos montado. El uso de este tipo de
sistema propulsor se debe a que asegura un flujo constante, regular y ausente de
pulsos.
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INYECTOR: En esta práctica vamos a utilizar como sistema inyector una válvula
de inyección de seis vías.
REACTOR: El reactor utilizado en esta práctica va a ser un tubo de teflón
enrollado, en el cual va a transcurrir la reacción química entre los reactivos
introducidos al sistema.
DETECTOR: Para esta práctica vamos a usar un detector fotométrico para
obtener la señal analítica. El detector va a medir la absorbancia del flujo que le llega
una longitud de onda determinada de 540 nm.
Reactivos, en esta práctica hemos usado los siguientes reactivos:
Disolución patrón (intermedia) de nitrito sódico (NaNO2) de 20 ppm: Para ello
hemos partido de una disolución de 100 ppm de nitrito. Pipeteamos 10 mL de la
disolución de 100 ppm y la llevamos a un matraz de 50 mL y enrasamos con agua
destilada:
100 𝑝𝑝𝑚 𝑥
10 𝑚𝐿
= 20 𝑝𝑝𝑚 (𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎).
50 𝑚𝐿
A partir de esta disolución intermedia vamos a preparar los diferentes patrones
que necesitamos para realizar la recta de calibrado. Vamos a necesitar patrones para la
calibración de concentraciones 0.8, 1.6, 2.4, 3.2 y 4.0 ppm. Para ello tenemos que
pipetear de la disolución anteriormente preparada volúmenes de 1, 2, 3, 4, y 5 mL
respectivamente, y llevarlos a un matraz de 25 mL donde se termina enrasando con
agua destilada. A modo de ejemplo:
20 𝑝𝑝𝑚 𝑥
1 𝑚𝐿
= 0.8 𝑝𝑝𝑚 (1º 𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛).
25 𝑚𝐿
Los patrones serán preparados, cada uno de ellos, por triplicado, así como la
muestra problema que preparemos posteriormente.
Muestra problema: Para la preparación de la muestra problema hemos usado
una dilución de 1:5 respecto la muestra que se nos proporciona. Por tanto hemos
pipeteado 5 mL del problema y lo hemos llevado a un matraz de 25 mL, el cual hemos
terminado enrasando con agua destilada. De nuevo vamos a preparar la muestra
problema por triplicado, como ya hiciéramos con las disoluciones patrones.
Disoluciones de sulfanilamida y naftiletilendiamina: Ambas disoluciones se
encuentran previamente preparadas y conectadas al sistema que vamos a usar en la
determinación de los nitritos. Asimismo para su preparación podemos actuar del
siguiente modo:
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Disolución de 250ml de sulfanilamida de concentración 10 g/l en HCl 0.7 M.
Para ello, se parte de una disolución de ácido clorhídrico comercial 12.08 M:
12.08 M x Vdisolución comercial = 0.7 M x 250 mL  Vdisolución comercial = 14.5 mL.
Tal que añadiendo 14.5 mL de disolución de ácido clorhídrico comercial,
2.5 g de sulfanilamida y completando hasta los 250 mL con agua destilada (en matraz
aforado) se tiene esta disolución.
Disolución de 250 mL naftiletilendiamina de concentración 1.0 g/L.
Simplemente hay que pesar 0.25 g de naftiletilendiamina y enrasar con agua destilada
en el matraz aforado de volumen adecuado.
Procedimiento
Una vez preparados todos los reactivos y montado el sistema de análisis,
procedemos a conectar el sistema haciendo pasar una corriente por todo el equipo con
las disoluciones de sulfanilamida y naftiletilendiamina hasta conseguir un flujo
continuo. Nos aseguramos de que todo el sistema funciona correctamente y operamos
con el software indicado para nuestro análisis. Primero vamos a realizar un blanco y
luego lanzamos o ejecutamos el programa cuando observemos una estabilización de la
línea base.
Cuando tenemos el sistema correctamente funcionado procedemos a inyectar
los patrones mediante una jeringa. Para ello, y en posición de carga en la válvula,
cargamos el bucle de muestra con la 1º disolución patrón con la suficiente cantidad
como para eliminar cualquier resto e impureza que pudiera contener. A continuación
inyectamos la muestra en el sistema pasando la válvula a la posición de inyección. Una
vez inyectado observamos mediante la pantalla del sistema operativo hasta reconocer
el pico formado del fiagrama, momento en el cual volvemos a inyectar una segunda
alícuota de la 1º disolución patrón. Vamos a repetir el procedimiento 3 veces por cada
patrón que hemos preparado, obteniendo por tanto 9 medidas para cada
concentración preparada (patrones triplicados e inyecciones triplicadas).
Una vez obtenido el fiagrama completo con todas las disoluciones patrones
introducidas, procedemos también a medir con la misma mecánica las muestras
problemas.
Para finalizar con las medidas vamos a realizar un estudio de la influencia del
caudal en las medidas realizadas. Y para ello utilizamos el patrón más concentrado de
los preparados. Vertemos las 3 disoluciones preparadas en un solo matraz y con este
último será con el que vamos a operar. A continuación vamos a hacer medidas en un
nuevo fiagrama de esta disolución última, variando el caudal, es decir, vamos a variar
la velocidad de flujo que impulsa la bomba (sistema propulsor). Comenzaremos con
una velocidad de la bomba de 15, e iremos variando según: 15, 25, 30, 35 y 40 (rpm).
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Estas velocidades llevan asociados unos caudales de: 2.4, 4.1, 5.0, 5.8 y 7.7 (mL/min).
De nuevo para cada velocidad de la bomba peristáltica realizaremos 3 “pinchazos”
(inyecciones o medidas) de la disolución de trabajo.
Resultados
Tras realizar las medidas correspondientes de los patrones y las muestras con el
fotómetro a la λ=540 nm los resultado obtenido se exponen en la Tabla 1. Con estos
datos hemos obtenido una recta de calibrado para estos patrones que se muestra en el
gráfico 1.
ConcentraciónPatron (ppm)
0.8
1.6
2.4
3.2
4
Absorbancia540nm
1º Medida 2º Medida
3º Medida
0.15880
0.16079
0.16309
0.28992
0.29367
0.29239
0.41713
0.43417
0.42534
0.54656
0.56303
0.52155
0.64151
0.63278
0.62394
0.14708
0.16468
0.15683
0.27949
0.28874
0.30060
0.40735
0.41833
0.42912
0.55111
0.55165
0.52694
0.66808
0.62858
0.64093
0.15076
0.15994
0.16110
0.28573
0.29466
0.28819
0.41964
0.42055
0.42487
0.54511
0.53159
0.52665
0.65515
0.62658
0.65749
Tabla 1. Resultados obtenidos para la medición de los patrones de nitritos.
Gráfico1. Representación grafica de la recta de calibrado.
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Asimismo los datos obtenidos en la medida de las muestras problemas se
muestran en la tabla 2:
Muestra
1º Replica
2º Replica
3º Replica
0.51170
0.48193
0.50257
0.49057
0.47943
0.49583
0.50709
0.48037
0.49432
Tabla 2. Resultados obtenidos en la medición de las muestras.
Por último y haciendo uso de la recta de calibrado obtenida y las medidas de la
muestra problemas podemos determinar en principio que la concentración nitritos en
el agua natural problema es de 2.9 ± 0.1 ppm, que teniendo en cuenta la dilución 1:5
que presentaba, nos queda que la concentración final total de nitritos en el agua
natural problema es de: 14.5 ± 0.5 ppm.
Finalmente el resultado del análisis de la influencia del caudal en el sistema es
el siguiente:
En el ANEXO 1, observamos el fiagrama obtenido para este análisis, en el cual
observamos que la anchura de los picos disminuye progresivamente conforme
aumentamos la velocidad de la bomba, es decir, conforme aumentamos el flujo o
caudal que pasa por el sistema. Asimismo también se observa una disminución de la
altura de los picos en el mismo sentido anterior, comenzando de nuevo a aumentar
ligeramente en los 3 últimos casos. Este último hecho nos hace darnos cuenta de que
siempre, en este tipo de sistemas para análisis, tenemos que llegar a una situación de
compromiso entre varios de los factores que afectan al análisis.
Análisis de resultados.
En este apartado a partir de los resultados obtenidos en el laboratorio y
utilizando el programa ACOC (herramienta estadística para química analítica) vamos
a obtener el gráfico de residuos, la recta de calibrado correspondiente, el test analítico
ANOVA, la concentración de la muestra problema así como los parámetros de calidad.
Primeramente hemos utilizado el programa ACOC para obtener la recta de
calibrado correspondiente para los patrones preparados. Para ello hemos utilizado el
valor medio de las 3 medidas realizadas de cada patrón. Siendo la recta calculada del
tipo y = a + bx, los parámetros que hemos obtenido son los siguientes:
a = 4.5335e-002; Sa = 7.7871e-003; b = 1.5215e-001; Sb = 2.9349e-003
Sy/X = 1.2860e-002; R2 = 9.9519e-001
Quedando la recta de regresión como: y = 0.152 (±0.003) x + 0.045 (±0.008).
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La correspondiente grafica de regresión podemos observarla en la anterior
figura 1, en la que podemos observar que se ajusta bastante bien a una línea recta,
como podíamos deducir, en principio, del valor obtenido del R2, muy próximo a 1.
Seguidamente, y una vez comprobado que hemos preparado una buena recta
de calibrado, pasamos a obtener el valor de los residuales y su grafico mediante el
programa ACOC. Estos valores se presentan en la tabla 3 y en la grafica 2.
X
Y
Y_cal
Y-Y_cal
8.0000e-001 1.5221e-001 1.6705e-001 -1.4845e-002
8.0000e-001 1.6180e-001 1.6705e-001 -5.2547e-003
8.0000e-001 1.6034e-001 1.6705e-001 -6.7147e-003
1.6000e+000 2.8505e-001 2.8877e-001 -3.7240e-003
1.6000e+000 2.9236e-001 2.8877e-001 3.5860e-003
1.6000e+000 2.9373e-001 2.8877e-001 4.9560e-003
2.4000e+000 4.1471e-001 4.1049e-001 4.2167e-003
2.4000e+000 4.2435e-001 4.1049e-001 1.3857e-002
2.4000e+000 4.2644e-001 4.1049e-001 1.5947e-002
3.2000e+000 5.4759e-001 5.3221e-001 1.5377e-002
3.2000e+000 5.4876e-001 5.3221e-001 1.6547e-002
3.2000e+000 5.2505e-001 5.3221e-001 -7.1627e-003
4.0000e+000 6.5491e-001 6.5393e-001 9.7800e-004
4.0000e+000 6.2931e-001 6.5393e-001 -2.4622e-002
4.0000e+000 6.4079e-001 6.5393e-001 -1.3142e-002
Tabla 3. Datos obtenidos para los residuales de la recta de calibrado
GRAFICO DE RESIDUOS
0.025
2S
0.02
0.015
S
0.01
Y-Ycal
0.005
0
-0.005
-0.01
-S
-0.015
-0.02
-0.025
0.5
-2S
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
X
Gráfico 2. Representación grafica de los residuales de la recta de calibrado.
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El estudio detallado de los residuales nos confirma que la recta de calibrado
obtenida es bastante buena y que no existe mucha dispersión en los datos obtenidos en
la determinación. En general los datos presenta una dispersión bastante regular salvo
en el ultimo de los patrones donde si observamos que existe una mayor dispersión de
los mismos.
A continuación, y de nuevo utilizando el programa ACOC, pasamos a obtener
los parámetros de calidad para la recta de calibrado que hemos obtenido. Los
siguientes resultados han sido los obtenidos para un valor de 0.05 para el nivel de
significación “α”:
 Linealidad (%) = 98.071
 Resolución analítica (gamma-1) = 8.4522e-002
 Limites de detección(LDD):

Según el criterio de Long-Winefordner = 1.5451e-001 ppm

Según el Criterio de Clayton = 2.4600e-001 ppm
Asimismo también podemos comprobar la curva de precisión para los datos
obtenidos en nuestro análisis
(gráfico
3),
donde
8
se
representa el RSD (desviación
7
estándar relativa) frente a la
6
este gráfico observamos que a
concentraciones
bajas
la
RSD(%)
concentración de analito. En
5
4
desviación que se produce en
el resultado es relativamente
alta, mientras que a altas
concentraciones la línea se
hace prácticamente paralela al
3
2
1
0.5
1
2
2.5
3
3.5
4
CONCENTRACIÓN
eje de abscisas disminuyendo
mucho el % de RSD.
1.5
Gráfico 3. Representación del RSD (%) frente a la concentración
Seguidamente realizamos un test ANOVA para la comprobación de los datos
obtenidos, obteniendo como resultado que nuestra recta de regresión (en definitiva los
datos obtenidos en el análisis) no pasan el test ANOVA para el valor normal de
significación de α de 0.05. Sin embargo nosotros observamos que la recta de regresión
se asemeja muchísimo a una línea recta, con lo cual debemos de suponer que este
error se debe a la baja dispersión que muestran las medidas realizadas y que son una
fuente de error para este análisis. Asimismo también se realizó un test ANOVA para un
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mayor valor de la significación, α = 0.10, obteniéndose en este caso un resultado
positivo para el test, con unos valores de:
Fcal = 4.987
Ftab = 6.55
MSLOF = 4.2955e-004
MSPE = 8.6128e-005
Por ultimo realizamos una predicción, mediante un ajuste sin ponderar, del
valor que obtendríamos sobre nuestra recta de calibrado para la muestra analizada.
Para ello hemos introducido en el programa el valor medio de las medidas realizadas
para cada uno de las replicas, así como también el valor medio de cada uno de las
replica. El resultado obtenido para el valor de 0.49376 ppm con un grado de
significación de 0.05 es el siguiente:
X = 2.9473e+000
Sx = 1.1770e-001.
Por lo tanto con todos estos datos podemos afirmar que el resultado del análisis,
tras aplicar el factor de dilución introducido en las replicas de la muestra (1:5), es el
que sigue:
Concentración de nitritos en aguas naturales = 14.5 ± 0.6 ppm
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