1 proteasas - Universidad Complutense de Madrid
Anuncio
PROTEASAS Dr. Sinisterra Biotransformations Group Faculty of Pharmacy Universidad Complutense www.biotransformaciones.com HYDROLYSIS OF THE AMIDE BOND The enzymatic hydrolysis of the carboxamide bond is naturally linked to the chemistry of amino acids and peptides. The world production of enantiomerically pure amino acids accounted for more than 0.8 million tons of materials and a market of 4.1 billion US $ per annum in 2008. The three amino acids dominating this area with respect to output and value (L-glutamic acid, L-Lysine and D,L-methionine) are produced by fermentation or by synthesis. However, a considerable number of other optically pure D- and L-amino acids are prepared using one of the available enzymatic methods discussed. HYDROLYSIS OF THE AMIDE BOND COOR1 NHR2 RESOLUTIOM BY HYDROLYSIS (HYDROLASE) COOH H2N R R DL L ESTERASE METHOD AMIDASE METHOD ACYLASE METHOD HYDANTOINASE METHOD LACTAMASE METHOD 1 ESTERASE METHOD the resolution is performed by hydrolysis of the ester bond COOR1 NHR2 ESTERASE or PROTEASE COOH R R DL COOMe NHAc -chymotrypsin DL Structure of α-chymotrypsin NHR2 R L COOH D COOH + AcHN R R COOH + R2HN L NHAc R D Catalytic machinery: Ser-195; His-57; Hidrólisis catalizada por proteasas Mecanismo de acción de las proteasas dependientes de serina PASO 1 2 Mecanismo de acción de las proteasas dependientes de serina PASO 2 Mecanismo de acción de las proteaasas dependientes de serina PASO 3 Mecanismo de acción de las proteasas dependientes de serina PASO 4 3 Mecanismo de acción de las hidrolasas dependientes de serina PASO 5 Mecanismo de acción de las proteasas dependientes de serina PASO 6 Mecanismo de acción de las proteasas dependientes de serina PASO 7 4 Other examples of the ESTERASE METHOD COOR2 ALCALASE (Bacillus licheniformis) H2N R1 t-BuOH/H2O (19:1) DL COOH + R2-OH H2N R1 L in situ racemization pyridoxal 5-phosphate H COOR2 HC N H2 C N H COOR2 O H R1 R1 O C HO PO32- N H+ Pyridoxal-5-phosphate AMIDASE METHOD The resolution is performed by hydrolysis of the C- terminal amide bond AMIDASE CONH2 COOH CONH2 NH2 NH2 + H2N R R DL R L D ACYLASE METHOD The resolution is performed by hydrolysis of the endo-amide group COOH NHAcyl COOH ACYLASE R R DL COOH + H2N NHAcyl R L D HYDANTOINASE METHOD O D-HYDANTOINASE O R COOH H N NH2 R L-HYDANTOINASE N H DL COOH HN H2N R O O D-N-carbamoyl D N carbamoyl amino acid CARBAMOYLASE COOH NH2 R D H N L-N-carbamoyl L N carbamoyl amino acid CARBAMOYLASE COOH NH2 R L 5 LACTAMASE METHOD O O NH NH E E O (S) O (R) O NH (R) + (S) + NH2 (R) O NH OH (S) OH (S) NH2 (R) Blue: converted enantiomer; Red: non-converted enantiomer The enzyme is selected according to the DESIRED ENANTIOMER Peptide synthesis Dr. Sinisterra Biotransformations Group Faculty of Pharmacy Universidad Complutense www.biotransformaciones.com PEPTIDE SYNTHESIS 6 AMIDE SYNTHESIS.Can be performed using proteasas or lipases R3 O NH2 R1 + HN O OH R2 OH HIDROLASE ORGANIC SOLVENT R1 O R2 R3 R2 O R3 NH NH2 + R1 O LIPASE R1 NH 2 Acyl Donor NH or R R HN NH R3 O NH R1 R R1 -COO-R 2 SÍNTESIS DE PEPTIDOS 1.- Síntesis secuencial.- se usa para sintetizar fragmentos 2.- Síntesis convergente.- es la mas utilizada en procesos industriales Ventajas de la síntesis enzimática de péptidos 1.- ocurre en condiciones sostenibles.- P y T ambiente. Ausencia de disolventes contaminantes 2.- no hay epimerización de centros estereogénicos 3.- no hay que usar pasos de protección-desprotección 4.- se obtiene un péptido homogéneo 5.- permite hacer síntesis convergente con fragmentos péptidos Desventajas j de la síntesis enzimática de péptidos p p 1.- las concentraciones a las que se trabajan son pequeñas 2.- la selectividad de las enzimas hacia cierto tipo de sustratos limita su uso. peptido P2 S2 P1 S1 union active site P1’ P2’ S1’ S2’ proteasa PEPTIDE SYNTHESIS Enzyme-catalyzed peptide synthesis may be conduced via three basic ways: REVERSAL HYDROLYSIS, TRANSPEPTIDATION (which is used to a lesser extent) AMINOLYSIS OF ESTERS. 7 PEPTIDE SYNTHESIS THERMODYNAMIC APPROACH: under physiological conditions the equilibrium position in proteases catalyzed reactions is far over on the side of proteolysis. In order to create a driving force in the reverse direction towards peptides synthesis the following constraints may be applied: One of the reactants is used in excess Removal of product via formation of an insoluble derivative by specific complex formation or by extraction of the product into an organic phase by using a water-immiscible organic cosolvent. Lowering the water-activity (concentration) of the system by addition of water-miscible organic cosolvent. PEPTIDE SYNTHESIS KINETIC APPROACH: the aminolysis of esters, involves a kinetically controlled irreversible type of reaction, in which two nucleophiles (water and an amine) are competing for the acyl-enzyme intermediate. As mentioned above this reaction can be regarded as irreversible. PEPTIDE SYNTHESIS 8 CHEMO-ENZYMATIC SYNTHESIS OF AN ENKEPHALIN DERIVATIVE CHEMO-ENZYMATIC SYNTHESIS OF AN ENKEPHALIN DERIVATIVE ALCÁNTARA et al.: Peptide synthesis in organic-aqueous media catalysed by α-chymotrypsin immobilized on different supports. Fundamental of biocatalysis in non conventional media, Elsevier Pub., 1992, pp.443-50. ENZYMATIC SYNTHESIS OF ASPARTAME Z Asp + 2 Phe OMe Phe Thermolysin OMe + Z Asp Phe OMe Purificatión Asp Phe OMe Desprotection Z Asp Phe OMe 9 OBTENCIÓN DE INSULINA CATALIZADA POR PROTEASAS Insulina.-Aislada por primera vez en 1921 a partir de páncreas de perro. Secuencia identificada por Sanger en 1955. Regula los niveles de azúcar en sangre, usada para el tratamiento de la diabetes mellitus (aprox. 5% población occidental). Es una proteína, no puede suministrarse oralmente (proteolisis) Hoy día existen 4 rutas de obtención de insulina: 1. Extracción de páncreas humano 2. Síntesis a partir de los aminoácidos individuales 3. Conversión de insulina porcina en humana 4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente Conversión de insulina porcina en humana Cadena A Cadena B Proteasa I de Achromobacter lyticus 4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente 4.1. Producción de pro-insulina, transformada en insulina por transpeptidación (Novo Nordisk) Pro-insulina Obtenida a través de fermentación de células de S. cerevisiae Genéticamente modificadas Ester de la insulina humana 10 4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente 4.2. Producción de mono/di-arg-insulina usando células de E. coli modificadas genéticamente y posteriores pasos de síntesis y purificación (ELI LILY) Pro-Arg -insulina Conversión: sobre 70 %. Reactor tipo batch Mono/di-Arg -insulina Mono/di-Arg -insulina Insulina humana 11 4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente 4.3. Producción de pre-pro-insulina usando células de E. coli modificadas genéticamente y posteriores pasos de síntesis y purificación (Hoechst, Marion Roussel) Pre-pro-Arginsulina Mono/di-Arg -insulina Mono/di-Arg -insulina Insulina humana 12 PROTEASAS EN SÍNTESIS DE FÁRMACOS Poteasa usada como esterasa para resolver un racémico 13
