producción de nisina usando agua de remojo de maíz como medio

PRODUCCIÓN DE NISINA USANDO AGUA DE REMOJO DE MAÍZ COMO MEDIO
DE CULTIVO ALTERNATIVO
Piña Suárez, M.D.A., García Almendárez B., Regalado González, C.
Laboratorio de Biotecnología de Alimentos. Departamento de Investigación y Posgrado en
Alimentos, Facultad de Química, Universidad Autónoma de Querétaro
RESUMEN
La nisina es un polipéptido de bajo peso molecular producido por Lactococcus lactis. Su espectro
de inhibición incluye principalmente bacterias Gram-positivas tanto deterioradoras como
patógenos de alimentos. Se evaluó de manera cualitativa y cuantitativa la producción del agente
antimicrobiano natural nisina, producido por una cepa nativa de Lactococcus lactis UQ2 usando
como medio alternativo de bajo costo agua de remojo de maíz (ARM). Se cuantificaron los
sólidos totales del ARM, y se realizaron las diluciones correspondientes. La cinética de la
fermentación se evaluó monitoreando la población y el pH durante 24 h. Se determinó la
actividad antimicrobiana de la nisina de acuerdo al método estándar aplicado en alimentos. Los
resultados indicaron que el ARM es un medio adecuado para el crecimiento de L. lactis UQ2, ya
que se alcanzó una población de aproximadamente 108 ufc/ml, encontrándose además que a las 6
h de fermentación se obtuvieron 0.5 UI/ml de nisina, alcanzándose una concentración máxima a
las 12 h, de 2.3 UI/ml, mientras que a las 24 horas descendió a 1.5 UI/ml.
INTRODUCCIÓN
La nisina es un polipéptido de bajo peso molecular producido por cultivos iniciadores de
bacterias ácido-lácticas, tal como Lactococcus lactis. Tiene un espectro mucho más amplio que la
mayoría de las bacteriocinas. Es activa contra una amplia gama de bacterias Gram-positivas
tanto deterioradoras como patógenas de alimentos, así como sus esporas, por ejemplo Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium butilinum entre otros. Dado
que este grupo de organismos incluyen bacterias termorresistentes, la nisina se ha convertido en
un agente conservador de alimentos ampliamente utilizado por que puede mantener o incluso
extender la vida de anaquel de alimentos tratados térmicamente y contribuir a su seguridad
microbiana (Davison, 2005).
L. lactis necesita compuestos complejos para desarrollar, por lo que el costo de
producción de nisina es alto, y éste se incrementa por la dificultad de su purificación. Por lo
tanto, es razonable sugerir que deben desarrollarse medios de cultivo alternativos que contengan
los componentes necesarios para maximizar la producción de nisina (González-Toledo et al.,
2009).
A nivel industrial el maíz es hidratado en varios pasos, siendo tres los principales;
hidratación de los granos, tratamiento con dióxido de azufre y una fermentación bacteriana.
Después de alguno de éstos pasos, el maíz puede pasar a la molienda húmeda previo remojo. Ésta
agua de remojo del maíz (ARM) está compuesta principalmente por carbohidratos, siendo
glucosa y fructosa los monosacáridos predominantes. Éstos se encuentran mayormente en
aquellos pasos donde no ocurre fermentación microbiana, ya que al ser éstos metabolizados se
convierten en ácido láctico. El ARM también es rica en aminoácidos como glutamina, leucina,
prolina, ácido aspártico, entre otros; lo cual lo hace una buena fuente de nitrógeno.
Adicionalmente, se ha demostrado la presencia de diversas enzimas, principalmente -amilasa y
-D-glucosidasa (Hull et al. 1996).
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MATERIALES Y MÉTODOS
Activación y preparación del inóculo. Se utilizó una conserva a -70°C de Lactococcus lactis
UQ2, aislada en el Laboratorio de Biotecnología de Alimentos, DIPA. La cuenta de vidrio se
colocó en un tubo de ensayo con 5 mL de medio selectivo MRS (de Man, Rogosa y Sharpe), y se
incubó a 30°C por 24 h. Posteriormente, se activó por resiembra colocando 100 µl del primer
tubo en otro conteniendo 5 ml de caldo MRS y se incubó en las mismas condiciones.
Fermentación. Se usó ARM proporcionado por la empresa CPIngredientes. El medio alternativo
(ARM, 25 mL) se ajustó 3% de sólidos totales, con un pH a 6.5 y se esterilizó a 110°C por 12
min. ARM ajustada se suplementó con soluciones estériles de sulfato de magnesio 0.05%, sulfato
de manganeso 0.01%, Tween 20 (20% v/v), adicionando 80 µL/L y 1.86 UI/L de nisina como
inductor, preparada como se indica en el estándar británico (BS 4020, 1974). El ARM
suplementado se inoculó con L. lactis UQ2 al 10% (v/v) y se incubó a 30°C por 24 h, para
adaptar el microorganismo al medio alternativo. El ARM suplementado e incubado se usó como
inóculo (10%, v/v) en 200 mL del ARM suplementado y se incubó a 30°C por 24 h. Se extrajeron
muestras de 15 mL cada 2 h hasta las 12 h y después a las 24 h, y se monitoreó el pH.
Determinación de sólidos totales Los sólidos totales (ST) se cuantificaron de acuerdo a lo que
se indica en la NMX-F-527-1992.
Determinación de la Población microbiana. El recuento en placa se determinó utilizando el
método de la gota o Miles Misra, usando el medio selectivo MRS.
Obtención del extracto libre de células (ELC). Las muestras extraídas durante la fermentación
se calentaron a 80°C durante 30 min, para inactivar proteasas, seguido de una centrifugación
durante 15 min, a 4°C y 15,000 g. El sobrenadante (ELC) se ajustó a pH 6.5 con NaOH 0.1 N.
Determinación de actividad de nisina. Se evaluó según el British Standard 4020 (1974), usando
Micrococcus luteus como microorganismo indicador. M. luteus se activó a partir de una conserva
mantenida en el laboratorio de Biotecnología de Alimentos, DIPA. La chaquira de vidrio se
colocó en un tubo con caldo Assay y se incubó 48 h a 30°C, para luego sembrarse por estriado
en tubo inclinado y en placas con agar (1% p/v) assay, para verificar la pureza de la cepa. El
inóculo para los ensayos de actividad se preparó tomando el cultivo de los tubos, diluyendo con
500 μL de solución Ringer ¼. De esta solución concentrada, se tomaron alícuotas de 1, 2, 3, hasta
15 μL y se agregaron a 1 mL de solución Ringer ¼, para ajustar la concentración del
microorganismo a una absorbancia de 0.3±0.01, leyendo a una longitud de onda de 650 nm
(solución de trabajo).
Las placas para la determinación de actividad se hicieron en cajas de petri de 16 cm de
diámetro y se prepararon con medio assay inoculado con 2% (v/v) de la solución de trabajo de M.
luteus. En cada caja preparada se hicieron perforaciones con horadador No. 4 (7.5 mm de
diámetro). En cada perforación se inocularon 60 μL de diluciones seriadas de dos en dos del ELC
correspondiente, con su respectiva réplica. Las placas inoculadas se incubaron durante 48 h a
30°C, para observar la formación de halos de inhibición alrededor de los pozos. Los halos se
consideraron como el promedio de la medición de dos diámetros del halo de inhibición. La
determinación de la concentración de nisina se hizo en base a una curva estándar (GonzálezToledo et al., 2009).
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La concentración de ST en el ARM fue de 44.75± 0.30 %. A partir de este dato se prepararon 25
mL de ARM al 3% de sólidos y suplementado, para la activación de L. lactis. Finalmente se
prepararon 200 ml del mismo medio a la misma concentración para llevar a cabo la fermentación.
En ambos casos se diluyó con agua destilada hasta alcanzar el volumen requerido. La
suplementación del medio alternativo y las condiciones de crecimiento permitieron el desarrollo
de L. lactis UQ2, así como la producción del metabolito antimicrobiano.
La población inicial que se utilizó como inóculo a partir del medio suplementado usado
para la adaptación de L. lactis, fue de 107 ufc/ml.
La curva de crecimiento de L. lactis se muestra en la Fig. 1. Se observa que la población
al inicio de la fermentación es de 106 ufc/ml. Se tiene una fase de adaptación de
aproximadamente 6 h, durante las cuales se alcanza una población de 107 ufc/ml. La fase
exponencial va desde las 6 h hasta las 12 h, alcanzando una población máxima de 108 ufc/ml,
tiempo al cual se observó el inicio de la fase estacionaria, en donde la población de mantiene en
108 ufc/ml hasta las 24 h, sin observarse fase de decaimiento en este periodo de fermentación.
La variación del pH durante la fermentación se muestra en la Fig. 2. Aquí se observa que
el pH inicial fue de 6.05 y durante las primeras 4 h disminuyó a 5.12, mientras que el pH a las 24
h fue de 4.98, indicando metabolismo de los carbohidratos y producción de ácido láctico
La concentración de nisina a las 6 h fue 0.5 UI/ml, a las12 h de 2.3 UI/ml, mientras que a
las 24 h fue de 1.5 UI/ml (Fig. 3), equivalentes a 0.013, 0.058, y 0.037 mg de nisina/ml de medio.
La actividad de nisina se determinó a las 6, 12 y 24 h como se observa en las Figs. 4 y 5.
Figura 1. Curva de desarrollo de L. Lactis UQ2
durante la fermentación en medio alternativo (ARM
al 3% de sólidos).
Figura 2. Comportamiento del pH durante el periodo
de fermentación.
Figura 3. Concentración de nisina encontrada a las 6, 12 y 24 horas de fermentación.
3
24 h
12 h
Figura 4. Halos de inhibición por triplicado,
a las 6 h de fermentación.
Figura 5. Halos de inhibición por triplicado, a las 12
y 24 h de fermentación
CONCLUSIONES
La importancia de producir nisina en un medio alternativo radica en los altos costos económicos
que implica producir esta bacteriocina en los medios de cultivo tradicionales, dado que L. lactis
es un microorganismo muy exigente en sus requerimientos nutricionales. Siendo el ARM un
subproducto industrial de alta disponibilidad, puede usarse como medio alternativo de bajo costo
para la producción de nisina. Es posible el desarrollo de L. lactis UQ2 en ARM con bajo
contenido de sólidos (3%) y suplementado con sales minerales y cantidades muy pequeñas del
inductor, lo que lo hace económicamente factible. La mayor actividad de nisina se produjo en la
fase exponenicial (12 h) de fermentación, lo cual concuerda con otros reportes de que la nisina es
un metabolito asociado al crecimiento del microorganismo. Se alcanzaron concentraciones de
más de 2 UI/ml, lo cual nos permite decir que éste medio es además adecuado para la producción
de la bacteriocina. Puede incluirse una segunda resiembra en el medio alternativo para reducir la
fase de adaptación.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BS 4020, British Standards, “Methods for the estimation and differentiation of nisin in processed
cheese”, London, 1974.
Davison, P. M., “Antimicrobials in Fooods”, Taylor & Francis Group, US, 2005.
González-Toledo, S., Dominguez-Dominguez, J., García -Almendárez, B., Regalado-González
C., “Optimization of nisin production by Lactococcus lactis UQ2 using supplemented whey as
alternative culture medium.” J Food Science. En prensa. 2009.
R. Hull, S., Peters, E., Cox, C., Montgomery, R., “Composition of Corn Steep Water during
Experimental Steeping” J. Agric. Food Chem. 1996.
SECOFI. Dirección General de Normas de la Secretaria de Comercio y Fomento Industrial,
“Normas Mexicanas”. Sólidos Totales en Alimentos (NMX-F-527-1992). 1992.
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