Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón

Editado por
DR. Ming SOUND Tsao, FRCPC
DR. Fred R. Hirsch, PhD
DR. Yasushi Yatabe, PhD
Atlas de la IASLC
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de Pruebas de ALK en CAncer de PulmOn
international Association for the Study of Lung Cancer
Atlas de la IASLC
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’
de Pruebas de ALK en CAncer de PulmOn
International Association for the Study of Lung Cancer,
Aurora, Colorado, EEUU
Editores:
Dr. Ming Sound Tsao, FRCPC
Dr. Fred R. Hirsch, PhD
Dr. Yasushi Yatabe, PhD
Una publicación de la IASLC publicada por IASLC Press
Patricia Vigués, Spanish translation
Cubierta original y diseño del libro por Biographics
Oficina de Prensa de la IASLC:
IASLC, 13100 East Colfax Ave., Unit 10, Aurora, Colorado 80011, EEUU
www.iaslc.org
Primera publicación por la IASLC Octubre 2013
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
ISBN: 978-1-940488-04-2
Copyright ©2013 International Association for the Study of Lung Cancer
Reservados todos los derechos
Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, almacenada,
introducida o transmitida en cualquier forma o por cualquier medio sin
permiso previo y por escrito del titular del copyright.
Aunque la información de este libro se cree que es verdadera y exacta a
partir de la fecha de publicación, ni la IASLC ni los editores ni la editorial
aceptan ninguna responsabilidad legal por cualquier error u omisión que
pueda haber. La editorial no ofrece ninguna garantía, expresa o implícita,
en cuanto al material contenido en el mismo.
Atlas de la IASLC
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de Pruebas de ALK en CAncer de PulmOn
Editado por
Dr. Ming Sound Tsao, FRCPC
Dr. Fred R. Hirsch, PhD
Dr. Yasushi Yatabe, PhD
international Association for the Study of Lung Cancer
Agradecimientos
La IASLC agradece la generosa aportación y apoyo
proporcionado por Pfizer Oncology para este atlas de
pruebas de ALK.
Los co-editores y todos los colaboradores también
agradecen la asistencia editorial de Lori Alexander,
MTPW, ELS, el apoyo de Deborah A. Whippen, Editorial
Rx, Inc., y Rania Gaspo, PhD, Pfizer Oncology, durante
la preparación de esta publicación.
’
Indice
Lista de colaboradores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Abreviaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Fabricantes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Capítulo 1
Candidatos para las pruebas de ALK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Capítulo 2 Obtención de muestras, procesamiento y diagnóstico general
de procedimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Capítulo 3 Hibridación In Situ Fluorescente (FISH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Capítulo 4 La Inmunohistoquímica (IHC). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Capítulo 5 Retrotranscriptasa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR
por sus Siglas en Inglés) y varios ensayos genéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
Capítulo 6 Comparación de diferentes plataformas de ensayo para
pruebas de ALK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Capítulo 7 Análisis de ALK en citología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Capítulo 8 Presentación de informes de la prueba ALK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Capítulo 9
Líneas de actuación y estudios de estandarización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Capítulo 10
Resumen y perspectivas futuras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Anexo 1
Resumen de estudios publicados sobre las pruebas de
reordenamiento del gen ALK en cáncer de pulmón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
Anexo 2Guía de pruebas moleculares propuestas por CAP/IASLC/AMP
para la selección de pacientes con cáncer de pulmón elegibles
para el tratamiento con inhibidores de la tirosina cinasa
para EGFR y ALK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
6
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Lista de colaboradores
Editores
Dr. Ming Sound Tsao, FRCPC
Dr. Fred R. Hirsch, PhD
Yasushi Yatabe, MD, PhD
Patólogo y Científico Senior,
Princess Margaret Cancer Centre,
University Health Network
Profesor, Departamento de Medicina
De Laboratorio y Patobiología,
University of Toronto
Toronto, Canadá
Profesor, Departamento de Medicina
Departamento de Patología
University of Colorado en Denver
Denver, Colorado, EE.UU.
Jefe de Departamento de Patología y
Diagnóstico Molecular,
Aichi Cancer Center
Nagoya, Japón
Autores colaboradores
Dra. Elisabeth Brambilla, PhD
Keith M. Kerr, FRCPath
Dr. Erik Thunnissen, PhD
Profesora, Département d’Anatomie
et Cytologie Pathologiques
INSERM U823 Institut Albert Bonniot
Centre Hospitalier Universitaire de
Grenoble, Université Joseph Fourier
Grenoble, Francia
Profesor, Departamento de Patología
Aberdeen University Medical School
Aberdeen Royal Infirmary
Aberdeen, Escocia, Reino Unido
Patólogo, Consultor, VU University
Medical Center
Amsterdam, Holanda
Dra. Sylvie Lantuéjoul, PhD
Profesora, Departamento de
Medicina/Oncología Médica
Departamento de Patología
University of Colorado en Denver
Denver, Colorado, EE.UU.
Dr. Lukas Bubendorf
Profesor y Jefe de la División de
Citopatología
Instituto de Patología,
University Hospital Basel
Basel, Suiza
Dr. Jin-Haeng Chung, PhD
Profesor, Departamento de Patología
Seoul National University Bundang
Hospital
Seoul, Corea del Sur
Profesor y Presidente del Departement
d’Anatomie et Cytologie Pathologiques
INSERM U 823 Institut Albert Bonniot
Centre Hospitalier Universitair A
Michallon, Université Joseph Fourier
Grenoble, Francia
Dr. Kengo Takeuchi, PhD
Objetivos Moleculares en Patología
Instituto del Cáncer
División de Patología del Cancer
Institute Hospital
Fundación Japonesa para la
Investigación del Cáncer
Tokyo, Japón
Marileila Varella-Garcia, PhD
Dr. Ignacio Wistuba
Profesor y Presidente emérito de Jay
and Lori Eisenberg
Departamento de Patología Molecular
Traslacional
University of Texas MD Anderson
Cancer Center
Houston, Texas, EE.UU.
Dr. Akihiko Yoshida, PhD
Patólogo, Departamento de
Patología
National Cancer Center Hospital
Tokyo, Japón
Asistentes al Workshop IASLC ALK Testing,
Sorrento, Italia, 2013. Primera fila, de izquierda a derecha–Y. Yatabe, M. Varella-Garcia,
E. Brambilla, S. Lanteujoul, R. Gaspo (Pfizer
Oncology), J-H Chung. Última fila, de izquierda
a derecha–A. Yoshida, I. Wistuba, F. R. Hirsch, M.
S. Tsao, E. Thunnissen, L. Bubendorf, K. Kerr.
7
Abreviaturas
Abreviaturas
Las siguientes abreviaturas se usan en el texto:
AEC: 3-amino-9-etilcarbazol
ALK: cinasa del linfoma anaplásico
AMP: Asociación de Patología Molecular
ATS: Sociedad Torácica Americana
CAP: Colegio de Patólogos Americanos
CISH: hibridación in situ cromogénica
CPCP: cáncer de pulmón de células pequeñas
CPCNP: cáncer de pulmón de células no pequeñas
DAB: 3, 3’ diaminobencidina
EBUS: ecografía endobronquial
EDTA: ácido etilendiaminotetraacético
EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico
EML4: proteína 4 asociada al microtúbulo del equinodermo
ERS: Sociedad Respiratoria Europea
ETOP: Plataforma Oncológica Torácica Europea
FDA: US Food and Drug Administration
FFPE: fijado en formol e incluido en parafina
FISH: hibridación in situ fluorescente
H&E: hematoxilina & eosina
HER2: factor de crecimiento epidérmico humano receptor 2
iAEP: polímero intercalado de anticuerpos mejorado
IASLC: Asociación Internacional para el Estudio de Cáncer de Pulmón
IHC: inmunohistoquímica
ISH: hibridación in situ
KIF5B: miembro de la familia cinesia 5B
NOS: no especificado
NGS: secuenciación de nueva generación
PAAF: Punción-aspiración con aguja fina
RET: proto-oncogen ret
ROS1: ros oncogen 1
RT-PCR: retrotranscriptasa-reacción en cadena de la polimerasa
TKI: inhibidor de la tirosina cinasa
USE: ecografía transesofágica
v: variante
8
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Fabricantes
Los siguientes fabricantes y sus productos se destacan en este Atlas. Las localizaciones dadas por
cada fabricante no son únicas. La mayoría de los fabricantes tienen oficinas en todo el mundo.
Abbott Molecular
Abbott Park, Illinois, EE.UU.
Vysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit,
Spectrum Orange Probe, and Spectrum
Green Probe
Leica Biosystems
Buffalo Grove, Illinois, EE.UU.
Wetzlar, Alemania
Bond-Max, Novolink Polymer Detection
System
Abcam
Cambridge, Reino Unido
Anticuerpo Anti-ALK (5A4)
Nichirei Biosciences, Inc.
Tokyo, Japón
Anticuerpo 5A4 (Histofine ALK Detection Kit)
BD (Becton, Dickinson and Company)
Diagnostics
Franklin Lakes, New Jersey, EE.UU.
SurePath
Novocastra
Newcastle, Reino Unido
Anticuerpo 5A4
Cell Signaling Technology
Danvers, Massachusetts, EE.UU.
Anticuerpo D5F3 (ALK [D5F3] XP Rabbit mAb)
Dako
Glostrup, Dinamarca
Carpinteria, California, EE.UU.
ADVANCE, anticuerpo ALK1, EnVision,
EnVision+, EnVision FLEX, y EnVision FLEX+, PT
Link, y Target Retrieval Solution
Hologic, Inc.
Bedford, Massachusetts, EE.UU.
ThinPrep
Invitrogen, Life Technologies Corporation
Carlsbad, California, EE.UU.
Anticuerpo Anti-ALK
NanoString Technologies
Seattle, Washington, EE.UU.
NanoString assay
Pfizer Oncology
New York, New York, EE.UU.
XalkoriTM
Ventana Medical Systems, Inc.
(miembro del grupo Roche)
Tucson, Arizona, EE.UU.
BenchMark XT, iVIEW DAB Detection Kit,
OptiView DAB IHC Detection Kit, OptiView
Amplification Kit, y ultraView Universal
DAB Kit, y Ensayo de Anticuerpo Primario
Monoclonal de Conejo
ZytoVision GmbH
Bremerhaven, Alemania
ZytoDot 2C SPEC ALK break-apart probe
INTRODUCCIÓN
Por Ming Sound Tsao, Fred R. Hirsch y Yasushi Yatabe
En los últimos años, el diagnóstico y el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón avanzado
ha sufrido grandes cambios. El modelo actual para la prescripción de nuevas terapias especializadas se basa en la selección de pacientes de acuerdo a la presencia de anormalidades oncogénicas
específicas en el tumor. Las primeras anomalías en ser descubiertas en el cáncer de pulmón fueron
las mutaciones en el dominio cinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Se
encontró que los tumores con estas mutaciones tenían sensibilidad a los inhibidores de la tirosina
cinasa de EGFR (TKIs). Desde entonces, el gen de la cinasa del linfoma anaplásico (ALK) se ha convertido en el segundo oncogén diana en el cáncer de pulmón para el que se han desarrollado nuevas
terapias altamente efectivas. El nuevo gen de fusión ALK está formado por un reordenamiento que
ocurre en el brazo corto del cromosoma 2 y afecta a los genes que codifican para ALK (2p23.2) y la
proteína 4 asociada al microtúbulo del equinodermo (EML4) (2p21) o, raramente, a los genes en otros
cromosomas. El producto proteíco de este nuevo gen de fusión tiene una cinasa constitutivamente
activa de ALK porque el dominio básico del gen EML4 proporciona un mecanismo para la dimerización de la nueva proteína quimérica. Se han identificado numerosas variantes de reordenamiento
del gen de fusión EML4-ALK en los diferentes tipos de cáncer de pulmón. Las fusiones implican la
parte del extremo N-terminal del gen EML4 y el dominio de cinasa en la parte C-terminal del gen ALK.
Debido a que esta reordenación génica implica una gran inversión y translocación cromosómica,
la hibridación in situ fluorescente (FISH) se ha convertido en el método elegido para la detección
de todas las formas de reordenamiento del gen ALK, y fue el ensayo utilizado para detectar esta
aberración genética en los primeros ensayos clínicos del inhibidor de ALK, crizotinib (Xalkori®, Pfizer
Oncology) (Bang 2010, Kwak 2010, Camidge 2012). Por lo tanto, FISH y las sondas break-apart para
detectar reordenamiento se han convertido en el método estándar para el diagnóstico de cáncer
de pulmón con el reordenamiento ALK, y la Food and Drug Administration (FDA) de los EE.UU.
ha aprobado la prueba Vysis LSI ALK Break-Apart FISH Probe Kit (Abbott Molecular) para ello. Este
ensayo, junto con criterios bien definidos para los resultados positivos y negativos, se utilizó para
identificar a los pacientes con cáncer de pulmón avanzado de células no pequeñas (CPCNP) que eran
positivos para el reordenamiento del gen ALK. En un estudio fase I/II, la tasa de respuesta objetiva con
crizotinib fue del 61% y una mediana de supervivencia libre de progresión de 9,7 meses (Camidge
2012). En un estudio en fase III aleatorizado (PROFILE 1007), en la que crizotinib se comparó con la
quimioterapia en pacientes en los que la enfermedad había progresado durante la quimioterapia
convencional, la tasa de respuesta objetiva con el tratamiento con crizotinib fue del 65 % (comparada
con el 20% para la quimioterapia) y una mediana de supervivencia libre de progresión de 7,7 meses
(en comparación con 3,0 meses para la quimioterapia) (Shaw 2013).
10
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Se ha desarrollado una nueva generación de inhibidores de ALK, y estos inhibidores se están
estudiando en ensayos clínicos continuamente. En cuanto se detectan nuevos reordenamientos
del gen, se ponen en marcha ensayos utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): la
secuenciación para detectar los genes de fusión. Además, los estudios de varias instituciones han
demostrado que la proteína ALK puede ser detectada por inmunohistoquímica (IHC) con amplificación de la señal en casi todos los tumores que son ALK positivo en FISH, y varios informes describen
casos en que los tumores CPCNP que albergan patrones atípicos de ALK en FISH (FISH ALK negativo)
que son ALK positivo en la IHC pueden responder al tratamiento con inhibidores de ALK (Peled 2012).
En este contexto se están desarrollando y validando los kits comerciales de la IHC actualmente.
El desarrollo de estas múltiples plataformas de diagnóstico proporciona métodos alternativos
para que los laboratorios detecten reordenamientos del gen ALK o proteínas de fusión, dependiendo de la experiencia y el equipo técnico disponible. Es necesario estandarizar estos ensayos
dado que las pruebas de diagnóstico clínico requieren ensayos con una sólida reproducibilidad y
fiabilidad. Para abordar esta cuestión, el Comité de Patología de la Asociación Internacional para el
Estudio del Cáncer de Pulmón (IASLC) convocó a un panel de expertos para publicar esta guía que
puede ayudar a los patólogos, científicos de laboratorio y médicos en ejercicio a entender mejor el
trasfondo, el protocolo y la interpretación de los resultados de las pruebas de ALK en pacientes con
CPCNP avanzado.
CAPÍTULO 1
Candidatos para las pruebas de ALK
Por Fred R. Hirsch, Elisabeth Brambilla y Ming Sound Tsao
Es ampliamente reconocido que la detección de reordenamientos del gen ALK es importante para la
selección de la mejor terapia para los pacientes con CPCNP avanzado. Sin embargo, no está claro si
las características clínico-patológicas pueden ayudar a determinar qué pacientes deben someterse
a las pruebas de ALK. Los reordenamientos del gen ALK se encuentran con mayor frecuencia en
los tumores de pulmón de los no fumadores,
ex fumadores ocasionales, los pacientes
CPCNP-Otros
más jóvenes y en los tumores clasificados
(n=376)
ADSC (n=78)
como adenocarcinomas. Pero, ¿es plausible
excluir a los pacientes de edad avanzada y
CCE
fumadores con histología escamosa de las
(n=1411)
CPCNP
(n=4025)
pruebas de ALK? En estudios publicados,
alrededor del 70 % al 80 % de los pacientes
con CPCNP ALK- positivo han sido siempre no
ADC
fumadores (comparado con el 20 % y el 30 %
(n=6775)
de los fumadores actuales o ex fumadores),
y han sido más jóvenes (40 a 50 años) que
las personas con CPCNP en general (60 a 70
años) o personas con CPCNP con mutación
11.1
9
en EGFR (60 a 65 años) (Rodig 2009). Sin
5.7
embargo, en todos los estudios, también se
5.2
4.8
han encontrado tumores que albergaban
1.3
reordenamiento de ALK en pacientes mayores de 70 años o menores de 40.
CPCNP ADC
ADSC CPCNPADC CCE
Otros
(no seleccionado) (seleccionado)
De acuerdo con estos datos, no está
claro que los antecedentes de tabaquismo Figura 1. Resumen de los estudios sobre el reordenamiento del
y la edad debieran excluir las pruebas ALK gen ALK en CPCNP. A. Número de casos de CPCNP que han sido
en ningún paciente. La histología parece estudiados sobre la aberración ALK y descritos en la literatura
hasta mayo de 2013. “CPCNP” se refiere a los casos de los estudios
ser el criterio de selección más importante. que no especificaron los tipos de tumores, y los “CPCNP-otros”
De entre las más de 12.000 muestras de incluyen carcinoma adenoescamoso (ADSC) y carcinoma de
grandes/ sarcomatoide. B. Tasa estimada de casos ALKcáncer de pulmón que se han descrito en células
positivo según la histología del tumor. Para adenocarcinoma
la literatura, los reordenamientos de ALK se (ADC), la figura 1 muestra la prevalencia en los estudios con o
encuentran principalmente en los carcino- sin criterios clínicos de selección (por ejemplo, antecedentes de
tabaquismo, negativo en EGFR o mutación en KRAS). Las cifras se
mas no neuroendocrino y no escamoso de basan en datos que se presentan en el Anexo 1. CCE=carcinoma
pulmón. (Figura 1; Anexo 1). Según estos de células escamosas.
A
B
12
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
datos, varias guías publicadas, incluyendo la guía de más reciente publicación desarrollada por
el Colegio Americano de Patólogos (CAP)/Asociación Internacional para el Estudio del Cáncer de
Pulmón (IASLC)/Asociación para la Patología Molecular (AMP), han recomendado que las pruebas
de ALK no se realicen de forma rutinaria en el CPCNP avanzado con histología escamosa (Lindeman
2013). (Véase el Anexo 2 y el capítulo 9 para una discusión completa de las líneas de actuación para
las pruebas de ALK). Sin embargo, el reordenamiento de ALK se ha detectado en aproximadamente
el 1,3 % de más de 1.400 carcinomas de pulmón de células escamosas (Anexo 1) y en varios informes
de casos en los que el reordenamiento de ALK se verificó mediante la IHC (Alrifai 2013, An 2013,
Ochi 2013). La discordancia entre los estudios de carcinoma de pulmón de células escamosas puede
ser causada por las dificultades que todavía existen para diagnosticar los subtipos histológicos de
CPCNP. Un diagnóstico de cáncer de pulmón a menudo se hace de acuerdo con el examen de una
pequeña muestra de biopsia o muestras citológicas, pero los diagnósticos histopatológicos realizados
en pequeñas muestras de biopsia no siempre son representativos de todo el tumor. En la revisión
de un diagnóstico de cáncer de células escamosas de especímenes que no mostraban evidencia de
mutaciones en EGFR ni mutaciones en KRAS, se demostró la presencia de componentes de adenocarcinoma en 15 de 16 tumores (Rekhtman 2012). Por lo tanto, la guía CAP/IASLC/AMP sugiere que las
pruebas de ALK se hagan sólo a los pacientes con adenocarcinoma y cáncer de pulmón mixto con
un componente de adenocarcinoma en muestras de cáncer de pulmón completamente extirpadas.
La prueba ALK también se recomienda para muestras limitadas, como las muestras de biopsia y de
citología, cuando no se puede excluir por completo el componente de adenocarcinoma.
La detección de ALK con la IHC podría ser una solución ideal para los problemas de las pruebas
de ALK en el carcinoma de pulmón de células escamosas. Teniendo en cuenta su bajo coste y su alta
reproducibilidad, sensibilidad y especificidad, las pruebas de IHC se conciben para los pacientes con
carcinoma de pulmón de células escamosas en combinación con la prueba FISH, que es más cara,
y que se utiliza para confirmar los resultados positivos de la IHC.
Las pruebas para el reordenamiento del ALK no se asocian actualmente con resultados terapéuticos inmediatos en los pacientes con CPCNP localizado o loco-regional. Sin embargo, pueden ser
beneficiosas ya que muchos de estos pacientes, posteriormente, pueden sufrir una recidiva, y los
resultados de las pruebas podrán ahorrar tiempo y esfuerzo en el futuro.
CAPÍTULO 2
Obtención de muestras, procesamiento y
diagnóstico general de procedimientos
Por Keith M. Kerr, Ignacio Wistuba y Yasushi Yatabe
Las pruebas para detectar reordenamientos del gen ALK (en muestras de tejido afectadas por cáncer
de pulmón) es uno de los varios procedimientos de diagnóstico necesarios. En la mayoría de los
pacientes, un único procedimiento de muestreo va a generar una cantidad relativamente pequeña
de tejido que luego debe ser utilizado de la manera más eficiente para permitir el diagnóstico más
completo posible. Deben tenerse en cuenta dos puntos importantes sobre muestras de tejido:
existe la posibilidad de que una muestra no contenga tejido tumoral, y sólo hay una oportunidad
de fijar y procesar el tejido. Por lo tanto, la adquisición y el procesamiento son pasos cruciales en el
control de calidad con el fin de facilitar todos los procedimientos de diagnóstico que se necesiten
hacer sobre una muestra de tejido.
La obtención de tejido para el diagnóstico
En la mayoría de los casos, las pruebas de ALK se realizan en una pequeña muestra de tejido obtenida
por biopsia o en muestras citológicas tomadas de los pacientes con enfermedad avanzada. Con
menos frecuencia, se encuentra disponible todo el tumor de un paciente al que se le practicó una
resección quirúrgica de la enfermedad en etapa inicial y recurrencia posterior. La toma de muestras de
tejido para el diagnóstico debe tener como objetivo la obtención del mayor rendimiento del tumor
en la forma más segura y menos invasiva posible (Thunnissen 2012d). El muestreo puede implicar
al tumor primario, la enfermedad metastásica intratorácica o metástasis extratorácica. Aunque se
han descrito discrepancias en el estado de ALK entre la enfermedad primaria o metastásica (Kim
2013), no hay suficientes datos para recomendar ningún método en concreto para la obtención
de tejido. El tumor primario puede ser muestreado con endoscopia (por biopsia endobronquial o
transbronquial, criobiopsia o punción aspiración con aguja fina [PAAF]), o con una técnica percutánea
transtorácica (por biopsia con aguja o PAAF). Hoy en día la enfermedad metastásica intratorácica
es rutinariamente muestreada usando ultrasonido endobronquial (EBUS) o una ecografía transesofágica (USE). Normalmente la enfermedad pleural (ya sea biopsia pleural o citología del líquido)
es una buena fuente de material diagnóstico. La enfermedad metastásica distante (extratorácica)
se puede muestrear dependiendo de su procedencia; en todos los casos, varias técnicas de imagen
son útiles para determinar la selección de las muestras para mejorar el rendimiento del tumor
(Rivera 2007). En muchos de los centros, se utilizan procedimientos quirúrgicos para obtener tejido
si no se obtiene el material suficiente con los procedimientos guiados por imagen o cuando dichos
procedimientos no han tenido éxito.
Tejido para la prueba de ALK
Para la prueba de ALK se puede utilizar tanto la biopsia de tejido como las muestras procedentes
14
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
de citología; la clave está en que el material debe ser procesado y manipulado de forma adecuada
y la muestra debe contener suficientes células tumorales (Thunnissen 2012b). El número de células
tumorales necesarias para la determinación inmunohistoquímica (IHC) de la proteína ALK aún no
está definido, pero para evaluar la técnica FISH para determinar el reordenamiento del gen ALK, se
requiere un mínimo de 50 células tumorales. Existen diferentes enfoques para las muestras de frotis
citológico, pero el más adecuado con las muestras de citología es generalmente el bloque celular
que permite preparar y tratar las secciones de la misma manera que las secciones de muestras de
biopsia de tejido. En general, todo el tejido o material celular recibido en el laboratorio de patología
debe ser procesado. Los especímenes de resección quirúrgica son una excepción, aunque, como
regla general, los tumores con un diámetro de 3cm o menos deben ser procesados en su totalidad.
Los derrames pleurales abundantes también pueden ser procesados en parte. Se recomienda el
almacenamiento del fluido hasta que todos los procedimientos de diagnóstico hayan concluido.
Procesamiento de tejidos
Se recomienda la fijación por inmersión, o cuando corresponda, por insuflación, con formaldehído
tamponado al 10%. La pre-fijación con algunos fijadores a base de alcohol puede alterar la antigenicidad del tejido o la integridad del DNA. Las soluciones descalcificadoras ácidas utilizadas en
muestras de biopsia ósea pueden interferir con la IHC, con frecuencia comprometer la prueba FISH y
a menudo degradar el DNA, y por ende hacer que las pruebas para determinar las mutaciones sean
menos fiables. También se deben evitar los agentes de fijación que son ácidos (tales como el fluido
de Bouin) o a base de sales de metales pesados. En general, se recomienda un periodo de fijación
de más de 6 horas y menos de 48 horas, especialmente cuando se tengan que hacer pruebas de
biomarcadores (para las que la integridad del DNA es importante) (Wolff 2007, Hunt 2007).
Un defecto o un exceso de fijación pueden tener efectos nocivos en el DNA y sobre los epítopos de una proteína antigénica (Werner 2000, Atkins 2004, Oyama 2007, Bussolati 2008, Eberhard
2008). Una de las partes importantes de dicha fase en la manipulación de tejidos es el periodo de
tiempo que comienza inmediatamente después de extirpar la muestra del paciente y colocarla
en el fijador. La mayoría de los laboratorios no tienen ni el control, ni los datos sobre la cantidad
de tiempo transcurrido entre la extracción de tejidos y la inmersión en un fijador y su llegada al
laboratorio. Además, la mayoría de las máquinas de procesamiento de tejidos tienen una etapa de
fijación, lo que aumenta el tiempo de fijación. En la práctica, la mayoría de los laboratorios ajustan
sus procesos de tinción pertinentes para la IHC y la hibridación in situ (ISH) para determinar su
propio tiempo medio de fijación. La determinación de la naturaleza y duración de la fijación es un
desafío aún mayor en los laboratorios que reciben muestras de muchas fuentes externas con muy
diferentes métodos de fijación.
Manejo de tejidos para pruebas de biomarcadores
La mayoría de las investigaciones con biomarcadores (IHC, ISH, o estudios de RNA / DNA) se llevan
a cabo durante el estudio diagnóstico inicial. En estas circunstancias, se deben utilizar las secciones
recién cortadas para las pruebas de biomarcadores. El tejido previamente cortado y almacenado en
un portaobjetos se deteriorará en cuestión de días o semanas y, ciertamente, a lo largo de los meses.
La degradación depende de las condiciones de almacenamiento y muy probablemente también del
biomarcador específico (Atkins 2004). La estabilidad de la proteína ALK en secciones no teñidas aún
no se ha estudiado sistemáticamente. Por lo tanto, de forma similar que en la determinación de HER2
en cáncer de mama, los cortes de secciones de tejido almacenadas durante más de 6 semanas no
se deben utilizar para las pruebas de IHC para ALK. Si se requiere su almacenamiento, las secciones
15
CAPÍTULO 2: Obtención de muestras, procesamiento y diagnóstico general de procedimientos
deben estar revestidas en cera o un medio similar para evitar la oxidación por aire y además deben
mantenerse en un lugar fresco, oscuro y seco. El tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE)
es menos propenso al deterioro, y en la mayoría de las circunstancias, resulta útil recortar el bloque
de tejido según sea necesario en un momento posterior. Existen diversas estrategias que pueden
ayudar a limitar el número de veces que el bloque debe ser cortado para proporcionar material para
la evaluación inicial morfológica, la tinción IHC, y posterior análisis molecular. Por ejemplo, las secciones adicionales se pueden cortar en la primera sesión de corte, y aunque esta estrategia puede
salvar la inevitable pérdida de material de gran valor en cada nueva sesión de corte, se puede dar
el caso de cortar innecesariamente y ello puede plantear cuestiones relacionadas con el almacenamiento de las secciones cortadas (Figura 1).
El
Procedimiento rutinario actual
Tinción con H&E para
diagnóstico histológico
Repetir cortes
para la IHC
Repetir cortes
para las
pruebas
moleculares
El procedimiento en la era de las terapias molecularmente dirigidas
Tinción con H&E para
diagnóstico histológico
para la IHC
para las pruebas
moleculares
Figura 1. Preparación de las secciones de tejido durante la evaluación diagnóstica. La práctica rutinaria actual consiste en
hacer secciones adicionales para el ensayo IHC y/o pruebas moleculares después de los cortes iniciales para la tinción de
hematoxilina- eosina (H&E) para el diagnóstico histológico. El corte seriado múltiple puede mermar el volumen del tumor cada
vez que se recorte el bloque. En la era de las terapias molecularmente dirigidas, la preparación de las secciones adicionales
sin teñir para posibles análisis de IHC y/o pruebas moleculares puede reducir significativamente la cantidad de muestra de
tejido perdido y mejorar el tiempo de respuesta.
16
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
primer paso en la evaluación de una muestra es identificar la presencia o ausencia de malignidad.
Dependiendo de la selección de pacientes, elección de la técnica de muestreo y la habilidad del
cirujano, la tasa de hallazgos tumorales positivos es generalmente alta, pero puede variar desde
aproximadamente el 60 % hasta más del 90 % (Schreiber 2003). Es bien sabido que, incluso cuando el
tumor está presente en la muestra, puede no estar presente en todos los fragmentos de tejido y por lo
general comprende una pequeña proporción de la muestra (Coghlin 2010). Una vez que se confirma
la malignidad, el siguiente paso es excluir la posibilidad de tumores malignos no epiteliales (tales
como linfoma o sarcoma) y/o la posibilidad de que un cáncer, especialmente el adenocarcinoma,
no sea la metástasis de pulmón de otro órgano (Kerr 2013b). Este paso se suele hacer fácilmente
basándose en la evaluación de la información clínica y radiográfica adecuada que acompaña a
la muestra y la evaluación morfológica básica basada en H&E. La falta de información clínica, sin
embargo, puede conllevar a la realización de pruebas auxiliares de IHC innecesarias en la muestra
en un intento de excluir posibles fuentes extratorácicas de un adenocarcinoma, lo cual puede conllevar a que se agote el material para posteriores estudios moleculares.
Suponiendo que el tumor es un cáncer primario de pulmón, el siguiente paso es distinguir el
cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) de otros tipos, ya que el CPCP avanzado se trata de
manera distinta al CPCNP. Por lo general, esta discriminación se puede hacer con gran precisión
basándose en las características morfológicas (Burnett 1994), pero aún así, la IHC podría llegar a
ser necesaria. La mayoría de los casos que no son CPCP pueden ser diagnosticados con precisión
y clasificados morfológicamente como carcinomas escamosos, adenocarcinomas o, en raras ocasiones, otro tipo de CPCNP. Entre 25% y 40% de los casos, sin embargo, dependiendo del tipo de
muestra y casuística, las características morfológicas no son adecuadas para la clasificación precisa
y consistente del subtipo CPCNP; tales casos deben ser designados inicialmente como CPCNP no
especificado (NOS) (Chuang 1984). A continuación, se puede utilizar la IHC en el diagnóstico para
predecir la probabilidad del subtipo de CPCNP (Loo 2010, Travis 2011, Travis 2013). Este enfoque,
utilizando un panel de IHC limitado, puede reducir la proporción de casos de CPCNP-NOS a menos
del 10% y predecir el subtipo de CPCNP en la mayoría de los casos de NOS con una precisión de
más del 80% (Loo 2010). Los casos descritos juntamente con este uso de IHC deben ser informados
usando la terminología recomendada (por ejemplo, CPCNP, probable adenocarcinoma) en un caso
morfológicamente indiferenciado, donde la IHC puede predecir adenocarcinoma (Travis 2011, Kerr
2013a).
Conclusión
El criterio estándar se basa en la identificación de pacientes con dianas moleculares terapéuticas
en sus tumores. La necesidad de más pruebas moleculares, más allá de las requeridas para el diagnóstico morfológico inicial y el perfeccionamiento de la clasificación de tumores por la IHC cuando
sea necesario, hace que la adquisición, la manipulación, el procesamiento y el aprovechamiento
razonable de tejido tumoral de diagnóstico sea de suma importancia. Se debe hacer todo lo posible
para asegurar que una cantidad suficiente de tejido tumoral esté disponible para los pasos diagnósticos posteriores. Sin embargo, la falta de tejido suficiente puede ser inevitable en algunos casos, y
conlleva a un gran impacto en las pruebas moleculares que siguen al diagnóstico del tumor. Cuando
la cantidad de tejido es insuficiente, es cada vez más frecuente realizar la biopsia de repetición.
CAPÍTULO 3
Hibridación In Situ Fluorescente (FISH)
Por Akihiko Yoshida y Marileila Varella-Garcia
La sonda FISH de rotura (o break-apart) fue originalmente desarrollada para la detección de fusiones de genes creados por translocaciones intracromosomales. FISH break-apart es un método de
diagnóstico fiable en la patología quirúrgica, ya que es fácilmente aplicable a especímenes FFPE,
incluso cuando no se conocen las parejas exactas de fusión. Las sondas FISH ALK break-apart se han
incorporado con éxito en la práctica habitual de diagnóstico de linfomas y de los tumores mesenquimales, y el descubrimiento del reordenamiento de ALK en un subgrupo raro de CPCNP amplió
su aplicación (Soda 2007). Sin embargo, en este último escenario, la prueba FISH se ha enfrentado
a complicaciones inesperadas, principalmente debido a que las variantes comunes de fusión se
producen entre ALK (2p23.2) y el gen situado muy cerca de EML4 (2p21) a través de inversiones
intracromosomales. Rara vez el gen ALK se fusiona con otros genes por translocación intracromosomal. Por lo tanto, la técnica FISH break- apart para detectar el reordenamiento del gen ALK, se debe
realizar prestando mucha atención a los aspectos técnicos y a la interpretación de los resultados.
Diseño de la sonda FISH
La sonda de rotura ALK está originalmente diseñada mediante el marcaje de la región 3' (telomérica)
del punto de rotura con un fluorocromo y la región 5' (centromérica) con otro fluorocromo distinto.
Existen algunas variaciones entre los diferentes reactivos comerciales o hechos a medida para las
zonas genómicas específicas cubiertas por las sondas y los distintos fluorocromos utilizados para el
marcaje. En el kit desarrollado por Abbott Molecular (Figura 1; Vysis LSI FISH ALK break apart Probe
Kit), la región 3' (aproximadamente de
300 kb) se representa por una señal 300 kb 442 kb
3' 5'
naranja (espectro naranja, a menudo
referido como rojo en la literatura
2p23.2
debido a que la señal es detectada por
ALK
EML4
el filtro de interferencia en la longitud
de onda roja), y la región 5' (aproxima- Normal
damente de 442 kb) está representada
~12.5 Mb inversión
por una señal verde (espectro verde).
Gen de fusión EML4- ALK
Este conjunto de sonda fue aprobado
ALK:EML4
como un ensayo de diagnóstico comALK:EML4
plementario para un inhibidor de
ALK por la FDA de EE.UU. y se utiliza
Figura 1. El Vysis LSI FISH ALK Break Apart Probe Kit (Abbott Molecular)
comúnmente en todo el mundo.
para la prueba para detectar la presencia del gen de fusión EML4-ALK (reordenamiento en ALK) en el cáncer de pulmón.
18
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Requisitos de manipulación preanalítica
Como cualquier ensayo basado en el DNA, la técnica FISH tiene una ventaja importante por su
solidez. Sin embargo, el ensayo se ve afectado por muchos factores, especialmente el momento de
la fijación, el tiempo de fijación, y el tipo de fijador, todo lo cual puede conducir a la degradación
del DNA (Tabla 1) (Hunt 2007, Babic 2010). Por ejemplo, la larga isquemia fría, o que transcurra más
de 1 hora desde el momento en que el tejido se extirpa hasta que se fija, puede provocar la degradación del DNA y por consiguiente que las pruebas de FISH no sean valorables (Khoury 2012). Se
considera que el momento ideal para la fijación es de entre 6 y 48 horas (Hunt 2007, Babic 2010);
tanto los tiempos de fijación más cortos como los más largos pueden influir en el rendimiento de
las pruebas de manera significativa.
Tabla 1. Recomendaciones preanalíticas para la obtención de unos buenos resutados de las pruebas FISH
Parámetro
Recomendaciones
Tiempo de fijación
Lo más corto posible, que no exceda 1 hora
Fijador
Formaldehído tamponado al 10%
Tiempo de fijación
6-48 horas
Preparación
Muestras parafinadas cortadas a un grosor de 5 ±1 μm
Almacenamiento de la muestra
Bloques de tejido (ideal)
Tiempo de almacenamiento de
los bloques
No es relevante si las condiciones son adecuadas
Condiciones de almacenamiento de los bloques
Protegidos de la luz, del calor y la humedad
Tiempo de almacenamiento
para los cortes histológicos
4-6 semanas (ideal); los cortes menos recientes requieren un
protocolo personalizado
Descalcificación
EDTA, si es necesario
El fijador óptimo es el formaldehído tamponado al 10%; el fijador Prefer y el fijador de Bouin
impedirán la hibridación. Es casi seguro que los tejidos descalcificados con soluciones de ácido fuerte
no puedan hibridar. La descalcificación suave con EDTA o ácido fórmico en general no afecta sustancialmente el rendimiento de la prueba. La descalcificación es particularmente relevante cuando la
única muestra disponible para el análisis molecular es una lesión ósea metastásica; en tales casos,
el grado de descalcificación ósea puede deducirse a partir del tejido teñido con H&E, lo cual puede
ayudar a decidir si se pueden utilizar las muestras para la prueba FISH.
Otro factor relevante para la eficacia del ensayo es el tiempo y las condiciones de almacenamiento
de las secciones. El tejido seccionado en portaobjetos que se guarda durante un periodo prolongado
a temperatura ambiente no suele dar buenos resultados en ensayos FISH estándar, requiriendo
protocolos personalizados. Por lo tanto, el bloque de tejido incluido en parafina es el formato ideal
de almacenamiento. El tiempo de almacenamiento aceptable para los bloques de parafina varía en
función de las condiciones de almacenamiento (por ejemplo, la temperatura, la exposición a la luz,
al calor o a la humedad), y los materiales sometidos a condiciones que degradan el DNA pueden
fallar para hibridar.
Numerosas variables antes y después de la hibridación también pueden afectar a la prueba. El
proceso de prehibridación incluye una serie de pasos para facilitar la penetración de la sonda en el
núcleo de las células tumorales. La permeabilización del tejido se consigue con la digestión de las
19
CAPÍTULO 3: Hibridación in situ fluorescente
grandes estructuras de proteínas, pero no todas las muestras responden de forma idéntica a un determinado protocolo. Los tumores pobremente diferenciados son más sensibles a los procedimientos
de prehibridación, mientras que los tumores mucinosos y fibrosos son más resistentes. Los lavados
post-hibridación deben permitir la eliminación adecuada de la sonda no hibridada sin disminuir la
intensidad de la señal. Muchos protocolos alternativos pueden generar excelentes resultados, por
lo que los laboratorios pueden elegir cualquiera de estos protocolos mientras las condiciones se
ajusten adecuadamente a las características de la muestra.
Evaluación de la calidad de las muestras hibridadas y selección de
células valorables
Es esencial que la calidad de la morfología del tejido y la intensidad de la
señal sean evaluadas rigurosamente
antes de aceptar una muestra para el
análisis. Las muestras son óptimas para
el análisis cuando presentan una morfología excelente y una intensidad de
señal con muy baja tinción de fondo
(Figuras 2 y 3). Las muestras con una
digestión excesiva de la cromatina o
escasa penetración de la sonda no son
aceptables y deben ser analizadas de
nuevo cuando se hayan solucionado
los problemas técnicos. Por ejemplo, las
muestras no son aceptables cuando el
pre-tratamiento de los tejidos es insuficiente o excesivo (Figura 4) o cuando
la superposición de núcleos con señales
fusiformes, producto del artefacto en
los cortes, hace imposible valorar la
A
C
B
Figura 2. Campos microscópicos de los tumores de pulmón ALK negativo.
D
A
B
C
E
Figura 3. Campos microscópicos de los tumores de pulmón ALK positivos mostrando principalmente el patrón dividido
3'-5' (3A-3C) y el patrón aislado 3' (3D, 3E).
20
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
separación entre la señal roja y
la verde (Figura 5).
El reordenamiento de ALK
aparece homogéneamente distribuido en el tumor, lo que refleja
su papel oncogénico crítico
(Camidge 2010). Por lo tanto, no
es necesario seleccionar un área
del tumor específico basado en la
morfología o perfil inmunológico,
y en cambio se recomienda clasificar varias áreas tumorales
diferentes. La gradación de los
B
A
tumores se debe realizar en Figura 4. Muestras no aceptables para el análisis debido a la digestión excesiva
las células tumorales muy bien del tejido (4A) o la escasa digestión del tejido (4B).
conservadas que no se solapan
y que tienen por lo menos una
copia de cada una de las señales
de las regiones 5' y 3'. Debido a
que el cáncer de pulmón tiende
a asumir una amplia gama de
patrones de crecimiento, y
porque las células tumorales
pueden mezclarse estrechamente con los elementos de
tejido no tumoral (por ejemplo,
macrófagos alveolares y linfocitos), la identificación precisa de
A
B
las células tumorales puede ser
difícil en un campo oscuro. Es Figura 5. Muestras no aceptables para el análisis debido a altos niveles de
recomendable remitirse siempre tinción de fondo (5A) y señales fusiformes (5B).
a una serie de cortes histológicos de tejido teñido con H&E para el ajuste morfológico adecuado.
Clasificación celular: patrones de señal
Conceptualmente, las zonas genómicas homólogas a las sondas 5' y 3' están molecularmente muy
cercanas y estas señales se visualizan como fusionadas, próximas o adyacentes en las células normales. Por el contrario, cuando el gen de fusión EML4-ALK está presente, la señal verde de 5' ALK se
aleja bastante de la señal roja de 3' ALK (aproximadamente 12,5 Mb), y las señales se ven como si estuvieran divididas. En realidad, las señales 3' y 5' se pueden visualizar o muy alejadas o muy próximas
entre sí en las células huéspedes tumorales anormales debido a diversos grados de condensación
y reordenamientos tridimensionales de la cromatina. Del mismo modo, debido a la proximidad
de EML4 y ALK, la división puede ser tan estrecha que las señales pueden parecer fusionadas en el
reordenamiento ALK (Figura 6). Además, esta región genómica parece ser altamente inestable, y las
regiones homólogas a una de las sondas se pueden perder, y por consiguiente, la señal correspondiente también. Como resultado, cada célula tumoral puede mostrar una variedad de combinaciones
de señales de co-localización 5'-3' ALK o señales aisladas de 5' o 3' ALK.
21
CAPÍTULO 3: Hibridación in situ fluorescente
A pesar de esta diversidad
en el perfil de la señal, las células se pueden clasificar dentro
de cuatro patrones distintos
basados según el número de
la señal y su localización.
CLASIFICACIÓN DE LA SEÑAL
Patrones observados en patrón
Patrones observados en ALK nativo
dividido 3'-5' ALK
Rojo y verde
separado por
diámetros de
señal <2
Clasificado
como negativo
Rojo y verde
separado por
diámetros de
señal ≥2
Clasificado
como positivo
Rojo y verde
separado por
diámetros de
señal ≥2
Clasificado
como positivo
Rojo y verde
separado por
diámetros de
señal <2
Clasificado
como negativo
Patrón fusionado (normal)
(Figura 7A). Se considera que
una célula tiene un patrón
normal (ALK negativo) cuando
CLASIFICACIÓN DE LA MUESTRA
las señales 5' y 3' se fusionan
tumores con reordenamiento:
tumores sin reordenamiento:
(Figura 2). Cualquier separatasa de reordenamiento
tasa de reordenamiento
ción entre las señales 5'y 3'
positivo ≥15% de las células
positivo <15% de las células
por una distancia de menos Figura 6. Patrones de señal en los núcleos de tumores pulmonares hibridados con
de dos diámetros de señal la prueba FISH de ALK-break apart.
debe ser clasificada como
patrón fusionado. El número de señales fusionadas 5'-3' por núcleo tumoral no es relevante para
la clasificación según estos patrones.
Patrón dividido (positivo) (Figura 7B). Se
considera que una célula tiene un patrón
dividido (ALK positivo) cuando las señales 5'
y 3' están separadas, sin importar el número
de señales aisladas reales (Figura 3). La separación entre las señales de 5' y 3' debe ser
dos o más veces el diámetro de la señal más
grande (Camidge 2010). El número de señales
aisladas 5' y 3' no necesita ser el mismo, por
ejemplo, una célula con dos copias de la señal
aislada 5' y tres copias de la señal aislada 3' se
clasifica como patrón dividido. El número de
señales fusionadas 5'-3' acompañantes en la
célula no es relevante para la clasificación de
patrones. Patrón aislado 3' (positivo) (Figura
7C). Se considera que una célula tiene un
patrón aislado 3’ cuando sólo están presentes las señales aisladas 3' y no hay ninguna
señal 5' aislada. Cuando una célula tiene
tanto señales aisladas 3' como 5', con más
señales 3' que 5', la clasificación correcta es
la de patrón dividido, y no la de patrón
aislado 3'. El número de señales fusionadas
acompañantes no es relevante para la clasificación de patrones.
Patterns
Examples
A.
Fused
B.
Split
C.
Isolated
3' ALK
D.
Isolated
5' ALK
Figura 7. Clasificación de células tumorales basada en el patrón
de señal ALK en la prueba FISH.
22
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Patrón aislado 5' (negativo) (Figura 7D). Se considera que una célula tiene un patrón aislado 5'
cuando sólo están presentes señales aisladas 5' y no hay señales aisladas 3'. Cuando una célula tiene
tanto señales aisladas de 3' como 5', con más señales de 5' que de 3', la clasificación correcta es la
de patrón dividido, y no de patrón aislado 5'. El número de señales fusionadas acompañantes no es
relevante para la clasificación de patrones.
Nota: Los criterios para el patrón dividido se basan principalmente en las pruebas efectuadas de
las secciones del tumor FFPE con el Vysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit, y los criterios deben
ser validados cuando se utiliza un reactivo analítico diferente o un espécimen biológico. El tamaño
de la sonda puede diferir entre los diseños de sonda, y una sonda más grande da como resultado
tanto un tamaño de la señal más grande como una distancia más corta necesaria para la definición
de patrón dividido.
Célula
Gradación de tumores
Se necesita un mínimo de 50 células tumorales
cuando hay un marcador y un mínimo de 100
células tumorales cuando hay dos marcadores (ver más información en la sección “Valor
de Corte”). Las muestras con menos células
evalua­bles no son adecuadas para el análisis
FISH (Camidge 2010). El patrón de señal de cada
célula tumoral se debe anotar en una hoja de
registro (Figura 8). Es probable que la gradación
de tumores sea más exacta cuando se visualiza el tejido bajo un microscopio con filtros de
interferencia individuales (rojo y verde) y dual.
La gradación de tumores basada en imágenes
capturadas tiene limitaciones y la imagen debe
representar toda la profundidad de la sección
con el fin de evitar una falsa
interpretación de las señales
aisladas (Figura 9).
El aumento de copias del
gen ALK nativo es común en
CPCNP (Figura 10) y no existe
ningún indicio de que esté
asociado con la sobreexpresión de la proteína. Hoy por
hoy, no se recomienda que
el número de copias de ALK
se incluya de forma rutinaria
como parte de la gradación.
A
Nota: El tamaño de la señal
en las imágenes capturadas
tiende a ser ligeramente más
señal
señal
fusionada
5'
señal
3'
Pattern
Célula 1
2
0
0
Fusionada
Célula 2
2
1
1
Dividida
Célula 3
2
0
1
Aislada 3'
Célula 4
1
1
0
Aislada 5'
Célula 5
0
1
2
Dividida
Célula 6
1
0
0
Fusionada
Célula 50
2
0
0
Fusionada
Resumen de gradación de células:
Número total de células contadas: 50
Número total de células con patrón fusionado: 19
Número total de células con patrón dividido: 22
Número total de células con patrón aislado 3': 5
Número total de células con patrón aislado 5': 4
Número total de células con patrón de reordenamiento positivo: 22+5=27
Tasa de células de reordenamiento positivo: 27÷50 x100=54%
Figura 8. Un ejemplo de una hoja de registro de gradación
de células.
No z-stacking
B
16 planes at 0.4 µm=
6.4 µm z-stacking
Figura 9. El análisis basado en imágenes capturadas es difícil si la sobreposición
z (consolidación de múltiples niveles de enfoque en un plano) no representa toda
la profundidad de la sección.
23
CAPÍTULO 3: Hibridación in situ fluorescente
D
A
B
C
E
Figure 10. El aumento de número de copias de las señales de ALK nativas aumenta comúnmente en muestras de cáncer de
pulmón, con niveles que van desde bajo (10A) a muy alto (10C). Un grupo de numerosas copias sugiere la amplificación del
gen (10D, 10E). El aumento de número de copias no debe ser interpretado como un resultado positivo.
grande que la que se observa en el examen real bajo microscopía de fluorescencia. Cuando la gradación se realiza en las imágenes capturadas, la distancia entre las señales puede subestimarse, lo
que puede comprometer los resultados del análisis.
Otro riesgo en la utilización de imágenes capturadas para la gradación de tumores es que la
captura de imágenes a menudo consolida múltiples niveles de enfoque en un plano, y, como resultado, una señal dividida verticalmente a lo largo del eje z del plano de tejido puede no distinguirse
de una señal fusionada.
Clasificación de la muestra: tasa de células de reordenamiento positivo
La tasa de reordenamiento positivo se define como:
Tasa de reordenamiento de células positivas (%) = [(número de células con patrón dividido + número
de células con patrón aislado 3’) / Número total de células evaluadas] × 100
Nota: Debido a que el dominio cinasa de la tirosina cinasa del ALK se codifica en la región 3' del gen,
la señal 3' no apareada es la que indica el gen de fusión oncológicamente relevante, mientras que
la señal no apareada 5' representa probablemente un producto de fusión recíproco no funcional.
Por lo tanto, las células con un patrón aislado 3’ se clasifican como células de reordenamiento positivo junto con las que tienen un patrón dividido. Las células con un patrón aislado 5' no deben ser
interpretadas como células de reordenamiento positivo. Si no tenemos en cuenta el patrón aislado
3' y nos limitamos a la definición de reordenación para el patrón dividido, se reduce la sensibilidad
del ensayo de FISH de ALK en un 60% ó 70% (Yoshida 2011a, Paik 2011).
Valor de corte
Debido a que el gen de fusión EML4-ALK se crea normalmente por una pequeña inversión intracromosomal que afecta a dos genes localizados en las proximidades, la distancia entre las señales
de división que supone un reordenamiento de ALK es normalmente estrecha cuando se utiliza la
prueba FISH break-apart. Debido al grado de condensación de la cromatina en las células o su distribución física, las divisiones estrechas son a veces técnicamente no distinguibles de las señales
fusionadas (Figura 6), lo cual puede causar que la tasa de células con reordenamiento positivo en
ALK en CPCNP sea baja (40 % al 70 %)(Perner 2008, Camidge 2010, Camidge 2012b). Además, CPCNP
sin reordenamiento de ALK puede tener patrones de reordenamiento positivo (es decir, patrón
dividido o patrón aislado 3') en una fracción de células (Perner 2008, Camidge 2010, Yoshida 2011a),
24
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
probablemente debido a un artefacto de rotura o tal vez a una alteración genómica estocástica que
no indica un gen de fusión específico (Figura 6). Como resultado, la distribución de las tasas de células
con reordenamiento positivo en CPCNP es continua, y la diferencia entre CPCNP ALK-reordenado
y de tipo nativo es una cuestión estadística. Por lo tanto, se debería efectuar obligatoriamente una
cuidadosa evaluación cuantitativa para el resultado óptimo de la prueba. Se ha determinado un
valor de corte del 15% para separar mejor entre CPCNP ALK reordenado (ALK positivo) y CPCNP ALK
de tipo nativo (ALK negativo) (Camidge 2010, Kwak 2010, Yoshida 2011a).
Para minimizar el sesgo técnico, se recomienda una estrategia de evaluación en dos etapas con
dos marcadores independientes (Figura 11). El primer marcador clasifica 50 células tumorales. Una
tasa de células de reordenamiento positivo de menos de 10% (es decir, de reordenamiento en menos
de cinco de las 50 células) se considera negativa; una tasa mayor del 50% (es decir, más de 25 de las 50
células) se considera positiva, y una tasa
de 10% a 50% (es decir, de 5 a 25 de las
Primer marcador–50 células tumorales
50 células) se considera equívoca y por
tanto se debe hacer una clasificación
<10% positiva
>50% positiva
10%-50% positiva
adicional. En ese caso, un segundo
marcador independiente clasificaría
Equívoca
50 células tumorales adicionales, y una
Segundo marcador–50 células tumorales
tasa final de células de reordenamiento
Primer y segundo marcador-50 células tumorales
positivo se calcularía sobre la suma de la
primera y la segunda. Si la tasa final es
<15% positiva
≥15% positiva
de 15% o más, la muestra se interpreta
como positiva para el reordenamiento
Muestra considerada
Muestra considerada
del gen ALK, y si la tasa es menor que
negativa para el
positiva para el
reordenamiento
reordenamiento
15%, la muestra se interpreta como
del gen ALK
del gen ALK
negativa para el reordenamiento del
Figura 11. Algoritmo de clasificación recomendado para FISH de ALK.
gen ALK.
Nota: El punto de corte del 15% se basa principalmente en pruebas con el Vysis LSI ALK Break Apart
FISH Probe Kit (Abbott Molecular) y se debe confirmar cuando se utilice un reactivo diferente.
Validación del laboratorio
La prueba FISH de ALK debe estar debidamente validada en el laboratorio antes de ofrecer la prueba
en un entorno clínico (Halling 2012, Saxe 2012). La exactitud de los resultados- es decir, el grado en
que el ensayo discrimina entre normal (ALK negativo) y anormal (ALK positivo) - debe compararse
cuidadosamente en otro laboratorio donde el ensayo validado se está realizando correctamente
y/o en comparación con un método previamente validado en el mismo laboratorio que ofrezca la
misma precisión. La precisión o reproducibilidad de los resultados debe ser verificado teniendo en
cuenta el grado de acuerdo entre las mediciones realizadas sobre la misma muestra por diferentes
técnicos y/o en diferentes momentos, y todo el proceso de análisis debe ser corroborado y repetido
periódicamente. Por otra parte, la sensibilidad analítica y especificidad de la prueba deben ser confirmadas en las muestras con genotipo conocido. El CPCNP con ALK de tipo nativo y el tejido benigno
deben ser evaluados para determinar la distancia en una señal dividida como verdaderos positivos
(una distancia de al menos dos veces el diámetro de la señal). Estas tareas son más sencillas cuando
se utilizan reactivos comerciales y requieren un mayor nivel de detalle cuando se utilizan reactivos
desarrollados por el laboratorio.
25
CAPÍTULO 3: Hibridación in situ fluorescente
Desafíos
El procedimiento FISH de ALK break-apart se ha asociado a cuatro retos principales: resultados
falsos negativos y falsos positivos, perfiles de señales FISH atípicos, las tasas marginales de células
de reordenamiento positivas y la necesidad de repetir la prueba.
Los resultados falsos negativos y falsos positivos
Aunque la sonda FISH break-apart se ha utilizado como norma general para el diagnóstico de cáncer
de pulmón ALK-positivo, sigue siendo difícil evaluar la verdadera sensibilidad y especificidad de la
prueba. La mayor discordancia entre FISH y otras modalidades surge debido a razones técnicas. Sin
embargo, FISH puede generar verdaderos resultados falsos positivos o falsos negativos, que pueden
tener un impacto significativo en el manejo de la enfermedad. Los resultados falsos positivos son
especialmente difíciles de demostrar, principalmente debido a la limitada sensibilidad bien conocida
de la RT-PCR y la IHC. Sin embargo, hay algunos indicios clínicos de que un diagnóstico basado en
resultados de FISH predice la respuesta al tratamiento con un inhibidor de ALK con menos exactitud que una combinación de FISH, IHC y RT-PCR, y los casos clínicamente discordantes raramente
incluyen verdaderos falsos positivos con los resultados de FISH (Chihara 2011).
Las nuevas tecnologías, como la secuenciación masiva en paralelo en todo el genoma, pueden
ayudar a demostrar la existencia de resultados falsos positivos de FISH. Por el contrario, algunos casos
de resultados falsos negativos de FISH están bien documentados en la literatura (Yoshida 2011a,
Murakami 2012, Peled 2012). En tales casos, los patrones de señales FISH atípicos pueden o no ser
vistos. Los mecanismos genómicos subyacentes a los resultados falsos negativos de FISH no han
quedado completamente claros, pero cabe la posibilidad de que los complejos reordenamientos
genéticos e inserciones crípticas puedan contribuir a ello.
Perfil de señal atípico
Hay casos aislados aproximadamente el 6% de los casos, (Camidge 2013) en que FISH produce perfiles
de señal atípicos que son tanto recurrentes como suficientemente distintos para ser reconocibles.
Al menos algunos de dichos patrones son conocidos por estar asociados con resultados falsos
negativos. Un ejemplo de ello es cuando la mayoría de las células tumorales albergan un patrón
aislado predominantemente de
5', con sólo unas pocas células
que tienen un patrón dividido
o un patrón aislado 3' (“patrón
predominante 5'”, Figura 12). Por
regla de enumeración convencional, el patrón aislado 5' debe
ser clasificado como ALK negativo y estos casos tienden a ser
pasados por alto como negativo
para el reordenamiento de ALK.
Sin embargo, se han descrito
casos con este patrón de señal
que conllevan un transcrito de
A
B
fusión EML4-ALK cuando los
Figura 12. Un patrón atípico en el cáncer de pulmón con la prueba FISH breakresultados se confirmaron por apart es el patrón aislado predominantemente 5'. Las flechas indican las señales
verdes individuales (5' ALK).
la RT-PCR (Yoshida 2011a).
26
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Otra señal de FISH atípica es el denominado patrón de doble señal roja, en el que un par de
señales de 3' se fusiona con una señal 5' (Figura 13A) (Peled 2012). El CPCNP ALK-positivo con un
patrón de doble señal roja puede ser mal interpretado como negativo para el reordenamiento de ALK
porque dicho grupo de señales puede simular una señal fusionada convencional. A veces, tres o más
copias de señales 3' pueden agruparse y fusionarse con una señal 5' (que se refiere como un patrón
de triple señal roja) y así sucesivamente, según el número de copias (Figura 13B, 13C). En otros casos
más raros, la mayoría de las células tumorales en CPCNP de ALK positivo pueden mostrar sólo señales
3' aisladas sin copias normales de ALK (Figura 13D). Las células con dicho patrón son consideradas
como no evaluables por las reglas de gradación convencionales debido a la posibilidad de un fallo
de la hibridación de la
sonda 5', y el cáncer ALKpositivo con un patrón
de este tipo puede
ser pasado por alto.
B
Aunque todavía no está
completamente claro
cómo tales patrones
de señales anormales
predicen el estado de
fusión sistemáticaA
C
D
mente, estos patrones Figura 13. Patrones atípicos observados en los tumores de pulmón con la sonda FISH
deberían al menos break-apart. 13 A: 3'-5-3' (patrón de doble señal roja) 13B y 13C: 3'-3'-5'-3' (patrón de triple
plantear un alto índice señal roja); 13D: Señales 3’ aisladas, en su mayoría sin señales normales ALK. Las flechas
de sospecha e incitar a indican un reordenamiento en ALK.
la realización de pruebas con otras modalidades de diagnóstico (por ejemplo, la RT-PCR o la IHC).
Serán necesarios futuros estudios para identificar otros perfiles de señal atípicos que están asociados
con resultados falsos negativos de la prueba FISH.
Tasas borderline de células con reordenamiento positivas
En aproximadamente el 8% de los casos de CPCNP, la tasa de células con reordenamiento positivo
está en un rango del 10 % al 20 % (Camidge 2013). Aunque el punto de corte aceptado actualmente
del 15% clasifica técnicamente tales casos, ya sea como positivo o negativo para el reordenamiento
de ALK, nuestra experiencia es limitada en cuanto a si dicha prevalencia borderline de señales
de reordenamiento por la prueba FISH representa con precisión la presencia del gen de fusión.
Recomendamos que las células sean cuidadosamente contadas otra vez en este tipo de muestras
prestando especial atención a la diferenciación morfológica entre células tumorales y no tumorales. El
hecho de incluir las células no tumorales en el recuento diluye la tasa de células con reordenamiento
positivo. Estos errores técnicos se deberían minimizar mediante el algoritmo de clasificación de
dos pasos recomendado. Se debe prestar atención también a las señales divididas verticalmente a
lo largo del eje z del plano de tejido, el cual podría ser confundido con una señal fusionada. Este
último inconveniente es particularmente relevante en laboratorios en los que la evaluación se realiza
en imágenes digitales capturadas que consolidan múltiples niveles de enfoque para producir una
imagen (sobreposición z).
Estos casos borderline también pueden albergar perfiles de señal atípicos, como se ha descrito
anteriormente. En concreto, un patrón de doble señal roja puede destacar inicialmente como una
tasa borderline de células con reordenamiento positivo. Usar un filtro de un solo color en el análisis
27
CAPÍTULO 3: Hibridación in situ fluorescente
puede facilitar la identificación de señales estrechamente yuxtapuestas que pueden ser pasadas
por alto con un filtro de dos colores (rojo y verde) o de tres colores (azul, rojo y verde). Si después
de una cuidadosa re-evaluación, la tasa de células con reordenamiento positivas sigue siendo borderline, la interpretación final puede ser tanto positiva como negativa utilizando el punto de corte
del 15% y se debería añadir una nota de advertencia recomendando que se tomen en cuenta otras
modalidades de diagnóstico, como la IHC o la RT-PCR, para su posterior estudio diagnóstico.
Necesidad de repetir la prueba
Los resultados de algunas investigaciones sugieren que el estado de ALK, incluyendo el aumento
de número de copias de ALK en el curso clínico, puede cambiar, sobre todo después del tratamiento
con un inhibidor de ALK (Doebele 2012). Aunque la incidencia exacta y el mecanismo de dicho
cambio aún no están claros, se recomienda repetir la prueba cuando el tumor muestra resistencia
adquirida tras el tratamiento con un inhibidor de ALK, y seleccionar un nuevo régimen terapéutico.
Sin embargo, los datos son todavía preliminares, y se necesitan más investigaciones y validación.
Hibridación In Situ Cromogénica (CISH)
La prueba FISH no está exenta de limitaciones, entre las que están la necesidad de un equipo altamente especializado, un inevitable desvanecimiento de la señal después de un almacenamiento
de tejidos a largo plazo y el examen de campo oscuro que puede dificultar la visualización de la
arquitectura del tejido y la citomorfología. Este último factor puede ser especialmente problemático
porque el cáncer de pulmón a menudo muestra patrones de crecimiento complejos íntimamente
mezclados con células no tumorales y diferenciar las células tumorales de elementos no tumorales
puede ser difícil sin información arquitectónica o citomorfológica. La prueba CISH se ha desarrollado
para superar estas desventajas de la prueba FISH. Con la prueba CISH, cada sonda de hibridación
se visualiza por cromógenos en lugar de fluorocromos (Figura 14). CISH permite la detección de
alteraciones genéticas específicas, preservando al mismo tiempo la arquitectura del tumor y citomorfología bajo el microscopio de trabajo de rutina de campo claro. Se ha puesto a prueba la utilidad
Substrato
Reacción
cromogénica
Enzima
Anticuerpo
primario
Anticuerpo
secundario
Sonda
DNA diana
Figura 14. Principios de la prueba CISH; izquierda. Sondas individuales marcadas con diferentes haptenos que se visualizan
por reacciones de anticuerpos similares a los de la IHC. La sonda CISH de ALK break- apart se aplica a los tumores ALK-positivos
(derecha). Los puntos negros representan el gen normal ALK, y los genes con reordenamiento en ALK se muestran como
señales separadas en color rojo o azul.
28
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
de la técnica CISH de ALK-break-apart para el diagnóstico del cáncer de pulmón y todos los estudios
han demostrado una excelente concordancia con los resultados de la prueba FISH y/o la RT -PCR
(Kim 2011, Yoshida 2011a, Nitta 2013, Schildhaus 2013). La prueba CISH aún tiene que ser validada
para su uso en la detección de reordenamiento de ALK en el cáncer de pulmón, y se han utilizado
diferentes puntos de corte (15% y 20%) y criterios de gradación (1 vs 2 diámetros de diferencia) en
los pocos estudios realizados.
Conclusión
La prueba FISH break-apart es una técnica fiable para el diagnóstico de CPCNPs con reordenamiento
en ALK y ha sido aceptada como el criterio estándar para seleccionar pacientes para el tratamiento
con un inhibidor de ALK. Sin embargo, la prueba FISH depende en gran medida de una cuidadosa
preparación e interpretación que siga un estricto cumplimiento de las recomendaciones. Además, la
prueba FISH rara vez puede producir resultados equívocos o incluso erróneos. Como cualquier otra
prueba clínica, la sonda FISH de ALK-break apart tiene sus puntos fuertes y sus limitaciones y debe
ser utilizada dentro de un contexto de diagnóstico adecuado.También es muy recomendable que
cada laboratorio realice estudios de validación interna donde se utilicen controles conocidos antes
de usar este método como prueba habitual. Además, los laboratorios deben participar en programas
periódicos de intercambio de cortes con otros laboratorios clínicos acreditados o en encuestas de
ensayos de aptitud proporcionados por los distribuidores autorizados.
CAPÍTULO 4
La Inmunohistoquímica (IHC)
Por Erik Thunnissen, Sylvie Lantuéjoul, Jin-Haeng Chung, Keith Kerr,
Fred R. Hirsch, Ming Sound Tsao y Yasushi Yatabe
La IHC de ALK como herramienta de detección
La terapia dirigida molecularmente depende fundamentalmente de una prueba validada para
detectar la alteración molecular correspondiente, especialmente cuando la alteración molecular
está presente en un pequeño subgrupo de pacientes. La IHC de ALK es un método prometedor de
cribaje rápido y relativamente económico que utiliza el examen de campo claro, el cual es el preferido
por la mayoría de los patólogos, sobre todo porque permite la evaluación de la arquitectura de los
tejidos y la histología de las células tumorales. Posiblemente, la IHC se puede interpretar con un
menor número de células malignas de las necesarias para la prueba FISH. La IHC da buenos resultados en una variedad de muestras de tumor diferentes. Se pueden analizar los bloques de tejido
FFPE, fluidos y citología de bloques celulares por aspiración con aguja fina (PAAF) o frotis, siempre
y cuando al menos un par de grupos de células tumorales viables estén presentes en la muestra.
Además, en enfermedades de baja prevalencia, tales como CPCNP con reordenamientos en ALK, hay
una necesidad creciente de un método de cribado económico (Soda 2007, Koivunen 2008, Perner
2008, Takeuchi 2008, Palmer 2009).
El desafío de la IHC de ALK
Es importante estandarizar el ensayo
de la IHC de ALK como método de
cribado y establecer los criterios
de evaluación. Las células tumorales en el cáncer de pulmón ALK
- positivo normalmente expresan las
proteínas de los genes quiméricos
del ALK (Figuras 1 y 2). La proteína
de fusión del dominio de tirosina
cinasa intracelular de ALK con varias
(N-terminal) porciones truncadas del
gen acompañante es responsable
de aumentar constitutivamente la
actividad de la cinasa ALK (Morris
1994, Allouche 2007). Sin embargo, la
proteína de fusión de ALK en CPCNP
puede ser más difícil de detectar con
el anticuerpo ALK1, el cual se utiliza
A
B
C
D
Figura 1. Un adenocarcinoma que es fuertemente ALK positivo. A y B:
secciones teñidas con H&E, a pequeño aumento (A) y con un aumento de
x10 (B). El recuadro en B es a un aumento de x40. No se observan células en
anillo de sello. C y D: La IHC de ALK con el anticuerpo 5A4 muestra intensa
tinción citoplasmática de producto del gen ALK (aumento), C: x20, D: x40.
30
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
B
A
Figura 2. Un adenocarcinoma que es fuertemente ALK positivo. A: sección teñida con H&E. B: La IHC de ALK con
el anticuerpo D5F3 y amplificación de tiramida muestra una intensa tinción citoplasmática del producto del gen
ALK (aumento, x40).
para diagnosticar el linfoma anaplásico de célula grande (LACG), ya que la expresión de la proteína
es generalmente menor en el CPCNP (Mino-Kenudson 2010). Para superar este problema, se han
introducido varios pasos técnicos incluyendo la recuperación de antígeno, el uso de un anticuerpo
primario con mayor afinidad y en una concentración suficientemente alta, medidas para amplificar
la fuerza de la señal (por ejemplo, con una cascada tiramida y la intercalación de un anticuerpopolímero mejorado), y el desarrollo de nuevos anticuerpos (Tabla 1).
Tabla 1. Anticuerpos disponibles en el mercado para la IHC para detectar la expresión de la proteína ALK.
Clon
Tipo de Clon
Isotipo
Immunogeno
ALK1
Monoclonal de ratón
IgG3, kappa
Los aminoácidos 1359–1460 de la proteína ALK humana
de longitud completa, correspondientes a los aminoácidos
419–520 de la proteína de NPM-ALK quimérica
5A4
Monoclonal de ratón
IgG1
C-terminal del transcrito NPM-ALK (419-520 aminoácidos)
D5F3
Monoclonal de conejo
No disponible
Anti-ALK
Monoclonal de conejo
IgG
Carboxilo terminal (C-terminal) de ALK humano
La proteína recombinante que representa los aminoácidos 426
a 528 de ALK humano
Otro aspecto importante de las pruebas IHC de ALK en muestras de cáncer de pulmón es la falta
de un control positivo interno para la inmunotinción, lo que hace difícil juzgar si un resultado de
IHC negativo es realmente negativo para la expresión de la proteína de fusión de ALK. Sin embargo,
debido a que el tejido pulmonar normal no expresa ALK, la expresión difusa de la proteína ALK en
células de cáncer de pulmón se asocia siempre con la expresión de la proteína aberrante de fusión
ALK (Takamochi 2013, Takeuchi 2013). Los bloques celulares obtenidos a partir de líneas celulares
con reordenamientos en ALK (H3122-variante 1 y H2228 de la variante 3) se pueden usar como
controles para el estado óptimo de tinción, pero se deben tener en cuenta las diferencias entre las
secciones de tejido y los bloques celulares obtenidos de líneas celulares, especialmente con una
concentración menor de epítopo de la IHC de ALK (Figura 3).
Fijación y seccionamiento
Los pasos preanalíticos para la IHC de ALK son los mismos que los otros procedimientos de la IHC.
31
CAPÍTULO 4: La inmunohistoquímica
Intensidad (U.A.)
Independientemente de su origen,
20
las biopsias diagnósticas o piezas
quirúrgicas deben fijarse de inmediato en una cantidad adecuada
(relación de 10 veces más que el
volumen de la muestra) de for10
maldehído tamponado al 10% y
embebidos en parafina (FFPE). La
fijación debe hacerse tan pronto
como sea posible para evitar los
0
1
10
80
efectos de isquemia fría. No se
recomiendan tiempos de fijación
Concentración de epítopo
de menos de 6 horas porque la tinción convencional, así como la IHC, Figura 3. El efecto de un sistema de mejora de la señal en la IHC: baja (círpuede verse afectada negativa- culos azules) y alta (triángulos rojos). Nótese que una baja concentración de
epítopo puede llegar a ser positiva con un sistema de alta señal de mejora,
mente. La preservación antigénica (flecha delgada), pero negativa con un sistema de mejora de señal baja.
para la IHC es epítopo depen­diente, Además, se llegó a una meseta de mayor intensidad; una vez positiva, una
concentración de epítopo no dará lugar a manchas oscuras. Con la
y algunos epítopos no pueden mayor
IHC de ALK, la concentración del epítopo es mayor (flecha gruesa) en los
verse obstaculizados por tiempos linfomas que en CPCNP (flecha delgada), y un sistema de mejora de la señal
de fijación de hasta 120 horas. Para baja puede ser suficiente. En CPCNP es necesario un anticuerpo de alta
afinidad con alta concentración y alta mejora. La concentración de epítofines prácticos, se recomienda un pos tiene una escala logarítmica y una escala lineal de la intensidad (UA =
intervalo de fijación de 6 a 48 horas unidades arbitrarias). Adaptado de Prinsen CF, Klaassen CH, Thunnissen FB.
para todas las muestras. Después de Microarray como modelo para la química de la visualización cuantitativa.
Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2003;11:168-173
su inclusión en parafina, el tejido
tumoral es estable y se conserva contra daños oxidativos u otros efectos degenerativos. Sin embargo,
una vez las secciones de 3 a 4-μm de grosor se cortan a partir del bloque de FFPE, el tiempo de
almacenamiento de estas secciones montadas en portaobjetos de vidrio a temperatura ambiente
se limita a un máximo de 6 semanas. Si se almacena a temperaturas más frías, las secciones siguen
siendo adecuadas durante un período de tiempo más largo. Sin embargo, los cortes de las secciones
de tejido que se prepararon con más de 6 semanas de antelación se deben interpretar con mucho
cuidado, ya que pueden presentar resultados falsos negativos.
La inmunotinción
Para el procedimiento analítico, es decir, la prueba de IHC de ALK en sí, se tienen que controlar y
optimizar varias cuestiones: la recuperación del epítopo, tipo y concentración del anticuerpo, tiempo
de incubación, temperatura de incubación y la amplificación.
No se ha evaluado o comparado una sola técnica uniforme en los estudios sobre IHC de ALK
en CPCNP. En cambio, el tipo o la fuente de anticuerpos, el proceso de recuperación de antígeno
y detección de anticuerpos, y las técnicas de amplificación han variado sustancialmente (Tabla 2).
Cuando se compararon directamente los diferentes anticuerpos, D5F3 (Cell Signaling Technology) y
5A4 (Novocastra) con el sistema ADVANCE (Dako) parecían ser ambos más sensibles y más específicos
que el anticuerpo ALK1 (Dako) (Figura 4) (Conklin 2013). (Veáse el Capítulo 6 para una discusión de
varias plataformas de ensayo). Actualmente se están desarrollando y validando kits comerciales de
IHC de ALK.
La sensibilidad para detectar la proteína de fusión ALK se ha mejorado mediante el uso de
varias etapas de amplificación de la señal (Figura 5) (Rodig 2009, Sakairi 2010, McLeer-Florin 2012).
32
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Tabla 2. Las Condiciones de la inmunotinción utilizando anticuerpos alk comercialmente disponibles en los estudios
publicados seleccionados en los que los kits comercialmente disponibles no se utilizaron
Estudio
Anticuerpo Recuperación Antigénica
Yi et al., 2011
ALK1
Mino-Kenudson
et al., 2010
ALK1
D5F3
EDTA, pH 8,0,
30 min en PT Link
EDTA, pH 8,0, en olla
de presión
Dilución
Incubación
Sistema de detección
1:100
30 min a temperatura ambiente
ADVANCE
Durante la noche
EnVision+
1:2
1:100
Minca et al., 2013a
D5F3
Calor mediante
BenchMark XT
1:100
Sin especificar
OptiView
Martinez et al., 2013
D5F3
Estándar en
BenchMark XT
1:50
16 min a 37ºC
ultraView
Paik et al., 2011
5A4
Solución CC1, 100ºC,
20 min
1:30
2 hr a 42°C
iVIEW
Hofman et al., 2011
5A4
Objetivo de recuperación
de soluciones, pH 9,0,
97°C, 40 min
1:50
30 min a
temperatura
ambiente
EnVision FLEX
McLeer-Florin et al.,
2012
5A4
Solución CC1 con EDTA,
pH 8,4, 1 hr
1:50
2 hr a 37°C
Amplification Kit
Kim et al., 2011
5A4
Solución CC1, 100°C,
20 min
1:30
2 hr a 42°C
iVIEW
Sholl et al., 2013
5A4
Tampón citrato, pH 6,0,
en olla de presión, 122ºC,
30-45 min
1:50
40 min a
temperatura
ambiente
EnVision FLEX+
Wong et al., 2009
Anti-ALK
Tampón citrato, pH 6,0, en
microondas, 95ºC, 30 min
1:1000
Durante la noche
a 4°C
Estreptavidina biotina
peroxidasa de rábano
picante complejo
Chen et al., 2012
Anti-ALK
Solución CC1, 95ºC, 30 min
1:500
Durante la noche
a temperatura
ambiente
ultraView
Anticuerpos: ALK1 es un producto de Dako; D5F3 es un producto de Cell Signaling Technology; 5A4 es un producto de Novocastra en los estudios
de Paik et al, Kim et al, y Sholl et al. y es un producto de Abcam en los estudios de Hofman et al. y McLeer-Florin et al, y anti-ALK es un producto de
Invitrogen, Life Technologies Corporation. Recuperación antigénica: PT Link y Target Retrieval Solution son productos de Dako y BenchMark XT es un
producto de Ventana Medical Systems, Inc. Sistemas de Detección: ADVANCE, EnVision FLEX + son productos de Dako; OptiView (Kit DAB), ultraView
(Kit DAB), iVIEW (Kit DAB), y Amplification Kitson son productos de Ventana Medical Systems, Inc
Clone ALK1
Clone D5F3
Figura 4. La IHC de ALK con anticuerpos ALK1 y D5F3 muestran
significativamente diferentes
intensidades positivas en cortes
de tejido idénticos.
33
CAPÍTULO 4: La inmunohistoquímica
La estandarización también se
Método del polímero regular
Método del polímero enlazador
puede obtener con la automatización de la IHC usando un
kit de IHC disponible comercialmente. La estandarización
con tinción automatizada
puede llevar a una tinción más
consistente, ocasionalmente a
expensas de una mayor concentración del anticuerpo primario.
Recientemente, ha sido desarrollado un método de detecPolímero con
anticuerpo primario
anticuerpos secundarios
ción altamente sensible que
!"#$%"&'%()*+,&'
Antígenos
combina un novedoso hapteno
enlazador
(3-hidroxi-2-quinoxalina; HQ)
con amplificación de tiramida Figura 5. Esquemas de métodos de polímero regular y de polímero enlazador.
(Nitta 2013). Con este sistema
de detección de la IHC con HQ-tiramida, todas las células tumorales fueron positivas a pesar de
las variaciones de intensidad, lo que sugiere que la tinción heterogénea con algunos métodos es
una cuestión de detección del umbral. Además, la hipótesis fue confirmada mediante el ensayo de
la proteína del gen que combinaba la IHC altamente sensible con una prueba ISH break apart de
campo claro.
Evaluación de la tinción
La fase postanalítica comienza con la evaluación microscópica de la muestra teñida. En CPCNP, la
tinción ALK es citoplasmática; puede tener un carácter granular y, en algunos casos, puede haber
un refuerzo de la membrana. La evaluación de la intensidad de la tinción es subjetiva, pero el uso
de objetivos de varios aumentos es una ayuda física en el establecimiento del nivel de intensidad,
tal y como fue aplicado a pruebas de HER2 (Ruschoff 2012). El uso de este enfoque puede conllevar
a una mayor uniformidad en la gradación de la intensidad. La tinción fuerte (3+) es claramente
visible con el uso de un microscopio con un objetivo de x2 o x4; la tinción moderada (2+) requiere
un objetivo x10 o x20 para ser vista claramente, y la tinción débil (1+) se puede ver solamente con
un objetivo x40. La clasificación H clásica se obtiene multiplicando el porcentaje de tumores que
se tiñen positivamente por la intensidad (0, 1, 2, ó 3) dentro de un rango de 0 a 300. Este enfoque
tiene más en cuenta la heterogeneidad de la tinción.
Se han aplicado diferentes criterios para los resultados de ALK-positivos y ALK- negativos en la
IHC en diferentes estudios. Algunos autores han clasificado la intensidad de 1+ a 3+ (Figura 6), con
un umbral ambiguo alrededor de 1+ o 2+. Este enfoque de clasificación parece estar principalmente
relacionado con el sistema de amplificación utilizado y con la tinción de fondo observada con algunos anticuerpos (Mino-Kenudson 2010, Conklin 2013). Otros han aplicado una evaluación sencilla
de la positividad, definiendo la expresión de ALK-positiva cuando se observa más del 10 % de células tumorales positivas, independientemente de la intensidad (Rodig 2009, Mino-Kenudson 2010,
McLeer-Florin 2012, Martínez 2013, Sholl 2013). Más recientemente, sin embargo, Takeuchi encontró
que casi todas las células cancerosas se tiñeron en más de 300 tipos de cáncer de pulmón con reordenamiento en ALK que fueron probados por la IHC con el anticuerpo 5A4 y el método del polímero de
anticuerpos mejorado intercalado (iAEP) (Takeuchi 2013). Esta homogeneidad en la tinción sugiere
34
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
que, en el cáncer de pulmón con
reordenamiento en ALK, todas
las células tumorales albergan
el reordenamiento del gen ALK.
Hasta que se disponga de más
datos acerca de los resultados
falsos positivos de la IHC para el
3+
2+
cribaje de alto rendimiento con
IHC de ALK, cosa que se propone
en la actualidad en la mayoría de
las publicaciones, los patólogos
deben confirmar cualquier señal
positiva por la técnica de referencia: la prueba FISH fluorescente.
0
Sin embargo, un número cre1+
ciente de pacientes que tienen
Figura 6. Un ejemplo de la clasificación de la IHC de ALK que oscila de 0 a 3+.
tumores que son positivos con la
IHC y negativos con FISH (de acuerdo a criterios estrictamente definidos) han tenido una buena
respuesta a la terapia con tocrizotinib (Peled 2012).
Otro aspecto a tener en cuenta es la reproducibilidad de los resultados de la IHC de ALK entre
diferentes laboratorios y patólogos. Hasta el momento, dos protocolos de IHC parecen haber sido
validados. En un estudio, siete patólogos internacionales evaluaron la reproducibilidad utilizando
el kit Ventana IHC ALK (Ventana Medical Systems, Inc.). En una clasificación binaria utilizando el
procedimiento definido de funcionamiento estándar Ventana, la reproducibilidad entre los observadores fue del 95% y el 97% tanto para los resultados positivos como negativos (Hirsch 2013). El
otro estudio es el protocolo de la Plataforma Europea de Oncología Torácica (ETOP) en el que se
utilizó el anticuerpo 5A4 (Novocastra) (Thunnissen 2012c), y en el que 12 laboratorios tiñeron, ya sea
manualmente o con el uso de un procedimiento automatizado, los mismos tumores de una manera
consistente. (Consulte el Capítulo 9 para obtener información más detallada sobre la estandarización).
Puesta en práctica de la IHC de ALK
Los patólogos deben estar familiarizados con varios artefactos que pueden llevar a la tinción de falsos
positivos: el punteado citoplasmático claro en los macrófagos alveolares (Figura 7), células de origen
neural (células nerviosas y ganglionares), la tinción del epitelio glandular, la mucina extracelular y
las áreas tumorales necróticas. Raramente se observa tinción de fondo en parénquima pulmonar
normal, pero se han observado varios problemas de tinción. (Tabla 3).
La expresión de la proteína ALK puede estar aumentada en algunas situaciones sin reordenamiento de ALK, y los resultados de la IHC pueden ser positivos con un patrón negativo (o atípico)
en la prueba FISH de ALK (Figura 8) (véase también el capítulo 3). Además, se ha descrito en la literatura
médica la falta de la expresión de la proteína de ALK a pesar de la amplificación del gen (Pelosi 2012,
Salido 2011). Por ejemplo, Pelosi et al. describieron un subconjunto de carcinoma sarcomatoide que
presentaba la amplificación del gen ALK, pero la expresión de la proteína ALK no se detectó usando
dos anticuerpos diferentes. Las implicaciones clínicas del aumento de número de copias del gen
asociada con la expresión de la proteína requiere más investigación (Salido 2011, Kim 2013).
Histológicamente, las células que contienen mucina, como las células en anillo de sello, requieren una cuidadosa interpretación de la inmunorreactividad del ALK. El patrón positivo fino de
35
CAPÍTULO 4: La inmunohistoquímica
A
B
C
D
Figura 7. Tinción inespecífica con la IHC con el
anticuerpo D5F3. A: Los macrófagos alveolares
en el margen de un tumor ALK negativo. B:
Citología de bloque celular por punción aspiración con aguja de un nódulo pulmonar,
mostrando CPCNP. El punteado citoplasmático
claro en los macrófagos alveolares puede
dar lugar a una interpretación falsa positiva.
Bloque celular (C) y una biopsia (D) de adenocarcinoma con punteado que fue negativo
para el reordenamiento ALK en la prueba FISH.
Tabla 3. Posibles errores de interpretación de los resultados de la IHC
Células productoras de mucina
El citoplasma está enmascarado por la mucina intracelular con ausencia de la proteína
ALK, y conlleva a la tinción negativa o tinción tipo marginal membranosa y a una
interpretación de falsos negativos.
Tinción de membrana
Ocasionalmente se vé tinción de membrana no específica, particularmente
prominente en la parte apical. Este hallazgo no es específico para células tumorales y
también se observa en los neumocitos normales.
Células neuroendocrinas
Algunos carcinomas escamosos, carcinomas neuroendocrinos de célula grande y
células ganglionares normales muestran reacciones positivas.
Tinción no específica de la mucina
Dependiendo del sistema de amplificación utilizado, se puede observar alguna tinción
de fondo de la mucina extracelular y en el citoplasma de los macrófagos alveolares y
las células bronquiales.
membrana con la IHC de ALK puede
estar enmascarado por la vacuola
mucinosa intracelular (Figura 9), y el
patrón positivo puede entonces ser
difícil de detectar en las células en
anillo de sello (Rodig 2009, Yoshida
2011b, Popat 2012).
Algunos investigadores han
observado tinción membraB
A
nosa, particularmente en la parte
apical, en el cáncer FISH-negativo Figura 8. Un ejemplo de expresión de la proteína ALK (izquierda) con patrón
(Murakami 2012, Mino-Kenudson atípico de la prueba FISH (señales verdes difusas individuales: derecha)
[comunicación personal]). Este hallazgo no es específico para las células cancerígenas y también fue observado en algunas células
no tumorales como los neumocitos tipo II reactivos. Además, algunos carcinomas neuroendocrinos
también se han relacionado con reacciones positivas (Murakami 2012, Nakamura 2013).
La tinción puede parecer heterogénea en algunos tumores, particularmente en muestras quirúrgicas (Figura 10), sin embargo, si se controlan las condiciones preanalíticas, la gran mayoría de las
células tumorales se tiñen de igual manera que en la distribución homogénea del reordenamiento
36
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
del gen ALK en el análisis FISH. La heterogeneidad está probablemente relacionada con la heterogeneidad de la fijación y no parece estar relacionada con la presencia de un patrón histológico
diferente. La sensibilidad de la proteína ALK con un tiempo de fijación mayor no es un problema
para las muestras de biopsia, pero puede ser un problema cuando se utilizan microarrays de tejidos
para el cribaje de ALK en muestras archivadas. Puede que se requieran estudios adicionales sobre el
patrón de punteado paranuclear descrito como característico en la reordenación KIF5B-ALK (Figura
11) (Takeuchi 2009).
A
B
C
D
Figura 9. Un tumor con variación en la morfología y la tinción. La tinción H&E muestra (A) un
área con muchas células en anillo de sello, y (B) un área con un patrón sólido con pocas células en
anillo de sello. La inmunohistoquímica ALK 5A4 muestra (C) un pequeño refuerzo citoplasmático
con tinción débil (+1) y (D) intensidades de tinción altas (+2/+3) (ampliación, x40).
Figura 10. Un ejemplo de tinción positiva heterogénea en un tumor ALK-positivo. Los cuadros en la tabla de la izquierda
corresponden a las imágenes de la derecha. El componente de carcinoma de células en anillo de sello es un problema
potencial para la tinción negativa.
37
CAPÍTULO 4: La inmunohistoquímica
A
B
C
D
Figura 11. Reacciones positivas inusuales en la IHC de un adenocarcinoma KIF5B-ALK-positivo,
mostrando un patrón con una fuerte tinción del área del aparato de Golgi (A: tinción H&E,
B: tinción ALK) y un patrón de halo perinuclear (C: tinción H&E, D: tinción de ALK). Las barras=100
μm. Fuente: Takeuchi K, et al. KIF5B-ALK, una oncocinasa nueva de fusión identificada por un
sistema de diagnóstico basado en la IHC para el cáncer de pulmón ALK-positivo. Clin Cancer Res.
2009; 15:3143-3149.
Conclusión
Los ensayos de IHC de ALK están siendo validados y estandarizados actualmente y parecen ser
una herramienta clínica prometedora para un cribado rentable para detectar la presencia del reordenamiento del gen ALK en el CPCNP. Este procedimiento ya está siendo recomendado por las
organizaciones en Europa, Japón y Asia. En los Estados Unidos, donde el tratamiento de CPCNP con
un inhibidor de ALK actualmente depende de los resultados positivos en FISH de ALK, los resultados
positivos en la IHC de ALK aún requieren verificación por FISH de ALK para poder beneficiarse de la
terapia con el inhibidor de ALK. Sin embargo, en un futuro próximo, el test de IHC podría ser aprobado por la FDA de los EE.UU., y los pacientes con resultados positivos en la IHC de ALK también
podrían ser candidatos para el tratamiento con un inhibidor de ALK. En Europa, el cáncer de pulmón
ALK-positivo no se limita a las pruebas por FISH de ALK.
CAPÍTULO 5
Retrotranscriptasa-reacción en Cadena de la
Polimerasa (RT-PCR por sus siglas en inglés) y
varios ensayos genéticos
Por Yasushi Yatabe, Kengo Takeuchi y Ignacio Wistuba
La PCR es clínicamente factible, ya que esta técnica se utiliza en la mayoría de ensayos para detectar
mutaciones de EGFR en CPCNP. Sin embargo, los ensayos con retrotranscriptasa [(RT)-PCR] se utilizan
principalmente para neoplasias malignas hematológicas, ya que requiere RNA de alta calidad, el cual
es difícil de obtener en la práctica clínica. De hecho, en la guía CAP/IASLC/AMP, no se recomienda la
RT-PCR en las pruebas de selección de los pacientes para la terapia con inhibidor de ALK en el cáncer
de pulmón debido al riesgo de resultados falsos negativos y una alta tasa de error para los ensayos
basados en RNA en muestras FFPE. Sin embargo, la RT-PCR proporciona información más sólida y
detallada acerca de los patrones de fusión de ALK. Además, algunas de las técnicas recientemente
desarrolladas se pueden aplicar a muestras clínicas con una elevada tasa de éxito.
RT-PCR
El EML4-ALK muestra muchas variantes de fusión. El punto de rotura del ALK se encuentra siempre
antes del extremo 5' del exón 20 (ENST00000389048) donde comienza el dominio de la cinasa, y
esta alteración se observa en otros tipos de cáncer con la translocación de ALK, tales como linfoma y
sarcoma. En cambio, el punto de rotura de EML4 puede abarcar varios exones. Tras el descubrimiento
de las dos primeras variantes de fusión (Soda 2007), se han encontrado más de 13 variantes y tres
parejas de fusión (Figura 1). En las seis variantes EML4-ALK más comunes, los exones del EML4 y
ALK se fusionan directamente en marco de lectura sin necesidad de inserción o deleción. Las tres
variantes principales (v1: E13; A20, v2: E20; A20, y v3: E6; A20) representan más del 90% del cáncer
de pulmón asociados con EML4-ALK. Entre las variantes menores, E2; A20 (v5’) y E18; A20 (v5’) se
encuentran entre 1% y 2% del cáncer de pulmón con EML4-ALK (Takeuchi 2008, Wong 2009). El E21;
A20 ha sido identificado en el cáncer colorrectal (Lin 2009), pero todavía no en el cáncer de pulmón.
La RT-PCR en muestras tumorales frescas o congeladas instantáneamente puede ser más sensible que otros métodos en relación al número de células tumorales requeridas. Sin embargo, la alta
sensibilidad se consigue sólo cuando el patrón de fusión está dentro de un rango detectable por los
pares de cebadores. Para detectar todas las variantes posibles de reordenamiento EML4-ALK, se deben
diseñar de manera correcta los conjuntos de cebadores (Tabla 1), pero incluso un diseño meticuloso
de los cebadores puede no detectar algunas variantes con deleciones en el sitio de anilamiento.
Además, los sistemas de RT- PCR diseñados para detectar EML4 -ALK no pueden detectar fusiones
de ALK con otros conjuntos asociados, como por ejemplo los miembros de la familia cinesia 5B
(KIF5B) y cadena ligera cinesia 1 (KLC1) (Takeuchi 2009, Togashi 2012). Para superar esta limitación,
se han diseñado cebadores para otras parejas de fusión, lo que permite que se detecte simultáneamente EML4-ALK, KIF5B-ALK (Figura 2), y fusiones con el proto-oncogén ret (RET) en un mismo tubo
de RT–PCR (Takeuchi 2012). A pesar de estos esfuerzos, las fusiones con parejas desconocidas han
39
CAPÍTULO 5: Retrotranscriptasa-reacción en cadena de la polimerasa y varios ensayos genéticos
ALK
e20
e14
EML4-ALK (E14;del49A20), v4
EML4-ALK (E18;A20), v5'
KIF5B-ALK (K24;A20)
KIF5B-ALK (K15;A20)
del49e20
e2
EML4-ALK (E2;A20), v5
EML4-ALK (E15del19;del20A20), v4'
e20
e6
EML4-ALK (E6;A20), v3
EML4-ALK (E14;del14A20), v7
e20
e20
EML4-ALK (E20;A20), v2
EML4-ALK (E13;ins69A20), v6
e20
e13
EML4-ALK (E13;A20), v1
e20
e13
ins69e20
e14
e15del19
del14e20
e18 del20e20
e20
e24
e15
e17
e20
e20
KIF5B-ALK (K17;A20)
KLC1-ALK (K9;A20)
e20
e9
e20
Figura 1. ALK de tipo nativo y varios tipos de fusiones ALK en el cáncer de pulmón: cinco variantes
regulares (v1, v2, v3, v5, y v5') y cuatro variantes irregulares (v4, v6, v7, y v4') de EML4-ALK, tres variantes
de KIF5B-ALK, y KLC1-ALK. Las regiones más oscuras en los genes asociados de fusión (EML4, KIF5B y
KLC1) representan dominios “coiled-coil”, y los de ALK representan el dominio transmembrana (naranja)
y el dominio cinasa (rojo).
permanecido indetectables. Por lo tanto, la RT-PCR no se recomienda para el cribado de pacientes
para el tratamiento con un inhibidor de ALK. Desde otra perspectiva, la eficacia terapéutica con inhibidores de ALK puede variar de acuerdo a las parejas de fusión y/o variantes de fusión, como se ha
sugerido en algunos estudios que muestran que el punto de mutación L858R y la deleción del exón
19 de EGFR afecta a la actividad de transformación in vitro y la eficacia clínica del tratamiento con
EGFR TKIs. La RT-PCR puede ser beneficiosa si tales diferencias resultan ser clínicamente relevantes
en el cáncer de pulmón ALK–positivo.
La técnica de RT-PCR permite y es más adecuada para el estudio de muestras que no son aptas
para bloques de tejido, como líquido de lavado bronquial, esputo, sangre, efusión en cavidad corporal y otros fluidos corporales (Soda 2012). Para los pacientes con un diagnóstico confirmado de
reordenamiento en ALK, la RT-PCR que utiliza RNA aislado o células tumorales circulantes en muestras
de líquido es una herramienta poderosa y mínimamente invasiva para controlar la progresión de
la enfermedad. Sin embargo, la presencia de células tumorales (o RNA procedente del tumor) en
muestras de fluido es a menudo difícil de confirmar, lo que aumenta el riesgo de que los especímenes
sin células tumorales se diagnostiquen erróneamente como negativos para el reordenamiento de
ALK. En principio, si se utilizan las muestras de fluidos para el cribado primario, sólo las muestras
confirmadas como positivas para células malignas deben ser examinadas, pero entonces la alta
sensibilidad de la RT-PCR ya no es ventajosa.
40
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Tabla 1. Configuración de la RT-PCR para el cribaje de EML4-ALK
Estudio
Utilización de las Variantes Regulares de EML4-ALK
Variantes Principales*
Tipo de
Muestras
No. of Cebadores
Variantes Menores*
E13;A20
E20;A20
E6;A20
E2;A20
E18;A20
E21;A20
Soda et al., 2007
Si
Si
No
No
Si
Si
Congelada
2
Inamura et al.,
2008
Si
Si
No
No
Si
Si
Congelada
2
Shinmura et al.,
2008
Si
Si
No
No
Si
Si
Congelada
3
Takeuchi et al.,
2008
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Congelada
3
Martelli et al.,
2009
Si
Si
Si
No
Si
Si
Congelada
3
Takeuchi et al.,
2009
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Congelada
(incluyendo 2
cebadores para KIF5B-ALK)
Wong et al., 2009
Si
Si
Si
No
Si
Si
Congelada
4
Takahashi et al.,
2010
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Congelada
3
Sun Y et al., 2010
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Congelada
4
Sanders et al.,
2011
Si
Si
Si
Si
Si
Si
FFPE
23
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Congelada
Shaozhang et al.,
2012
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Congelada
4
Soda et al., 2012
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Congelada
(incluyendo 4
cebadores para KIF5B-ALK)
Takeuchi et al.,
2012
5
6
(incluyendo 3 cebadores
para fusiones
KIF5B-ALK y RET )
9
*Las variantes principales se encuentran en más del 90% de cáncer de pulmón con EML4-ALK; las variantes menores se encuentran entre 1% y 2%
de cáncer de pulmón con EML4-ALK.
Comparativa RT-PCR cuantitativa
La IHC se puede usar para detectar reordenamientos en ALK porque el gen ALK no se expresa en los
tejidos pulmonares normales y, como tal, una reacción positiva de ALK en la IHC siempre sugiere
una expresión aberrante del gen ALK que frecuentemente es por reordenamiento en el cáncer de
pulmón. Este principio se puede aplicar a la expresión del transcrito de ALK. El punto de rotura en ALK
se produce antes del dominio oncogénico de cinasa (exón 20) que el transcrito quimérico mantiene
consistentemente. Por lo tanto, cuando el gen ALK se fusiona con el EML4 u otros interactores, las
regiones 3’ y 5’ del transcrito de ALK se expresan de manera diferente (Figura 3).
Basándose en este principio, el array de exones se ha utilizado para detectar el gen de fusión
identificando nuevas variantes de EML4-ALK además de los patrones de fusión común (Lin 2009).
También se ha utilizado PCR en tiempo real (Wang R 2012a, Wang R 2012b). El ensayo NanoString
(NanoString Technologies) fue introducido recientemente para detectar genes de fusión ALK (Lira
2013), así como ROS1 y RET (Suehara 2012).
41
CAPÍTULO 5: Retrotranscriptasa-reacción en cadena de la polimerasa y varios ensayos genéticos
EML4 72F; 5'-GTCAGCTCTTGAGTCACGAGTT-3' (exón 2 EML4, forward)
!"#$(2-H,(3 %DBC&DCBCBBD&DBC&CD&DBB%+
()!"#$(;EF>(-0(KFGLMG:/(
Fusion-RT-S;
5'-GTGCAGTGTTTAGCATTCTTGGGG-3' (exón 13 EML4,
forward)
HI?=F>%AB%J,(3%DBDC&DBDBBB&DC&BBCBBDDDD%+
()!"#$(;EF>(*+0(KFGLMG:/0((
&#'(+.26AA0(3
%&BCC&DBBCDBCCBDBBC&D&DC%+
()&#'(;EF>(-.0(G;1;G?;/(
ALK 3078RR, 5'-ATCCAGTTCGTCCTGTTCAGAGC-3' (exón 20 EML4,
reverse)
EML4 72F/
!"#$(2-HN(
&#'(+.26AA(
ALK 3078RR
Fusion RT-S/
HI?=F>(AB%JN(
&#'(+.26AA(
ALK 3078RR
!"#$%&#'()!*+,&-./0(1*
EML4-ALK
(E13;A20), v1
(1,735bp)
()*02+345/
(($+-45(432bp
EML4-ALK
(E20;A20), v2
!"#$%&#'()!-.,&-./0(1-
(2,488bp)
()-0$6645/
1,185bp
(*0*6345(
EML4-ALK
(E6;A20), v3
!"#$%&#'()!7,&-./0(1+
913bp*, 946bp*
(8*+4590(8$7459(
EML4-ALK
(E14;del49A20), v4
!"#$%&#'()!*$,:;<$8&-./0(1$
(1,849bp)
()*06$845/
EML4-ALK
(E2;A20), v5
!"#$%&#'()!-,&-./0(13
($3$45(454bp
EML4-ALK
(E13;ins69A20), v6
!"#$%&#'()!*+,=>?78&-./0(17
(1,804bp)
()*06.$45/
!"#$%&#'()!*$,:;<*$&-./0(12
EML4-ALK
(E14;del14A20), v7
(3$745(546bp
(3.*45(501bp
()*062+45/
(1,873bp)
(32.45(570bp
!"#$%&#'()!*3:;<*8,:;<-.&-./0(1$@(
EML4-ALK
(E15del19;del20A20), ()+02+-45/
v4' (3,732bp)
(32845(579bp
!"#$%&#'()!*6,&-./0(13@
EML4-ALK
(E18;A20), v5'
()-0+.-45/
(2,302bp)
(88845(999bp
KIF5B867F 5'-ATTAGGTGGCAACTGTAGAACC-3' (exon 10)
'OH3P672H(3@%&BB&DDBDDC&&CBDB&D&&CC%+@(();EF>(*./(
KIF5B2533F'OH3P-3++H((3@%DBDC&C&&&C&DBBDDB&CDBD%+@()!EF>(-+%-$(4FI>:MGQ/(
5'-GTGCACAAACAGTTGGTACGTG-3' (exon 23-24 boundary)
KIF5B867F/
'OH3P672HN(
ALK 3078RR
&#'(+.26AA(
KIF5B2533F/
'OH3P-3++HN(
ALK 3078RR
&#'(+.26AA(
'OH3P%&#'()'-$,&-./
KIF5B-ALK
(K24;A20)
(3$745546bp
()+07.+45/((
(3,603bp)
'OH3P%&#'()'*3,&-./
KIF5B-ALK
(K15;A20)
(
(*0*2745((
1,176bp
'OH3P%&#'()'*2,&-./
KIF5B-ALK
(K17;A20)
(
(*0$6+45(
1,483bp
se señala con un asterisco (*) los productos de la variante 3A y B respectivamente
Figura 2. Sitios de los cebadores y las longitudes de productos previstos de la RT-PCR múltiple. Debido a que el dominio de
la cinasa del gen ALK se fusiona con varios exones del EML4 y otros genes asociados, tales como KIF5B, se necesitan varias
series de cebadores para la detección eficaz de fusión de ALK.
El mayor beneficio de
estos arrays basados en
RNAm comparando 3' y
5' es que pueden detectar simultáneamente y de
forma independiente varias
parejas de fusión de ALK.
Aunque FISH break-apart
ofrece un beneficio similar, la
medición comparativa de las
regiones 3' y 5' del transcrito
permite un análisis de alto
rendimiento, lo que significa
que todas las alteraciones
de tipo fusión, incluyendo a
ALK, ROS1 y RET, se pueden
detectar usando los métodos en una sola muestra
de RNA. Por otra parte, los
recientes avances en las técnicas de extracción de RNA
de muestras FFPE permite la
aplicación de este método a
+ cells
ALK
ALK+
cells
células
ALK
+
Normal
cells
células
normales
Normal
cells
ALK DNA
DNA
ALK
DNA
ALK
mRNA
mRNA
RNAm
Kinase
dominio
domain
cinasa
EML4dominio
Coiled
EML4
coil domain
“coiled-coil”
domain
Comparación
de las
regiones
!"#$%&'(")*+,-.,,)*/0*%)1*20*
Comparison
between
5' and
3'
5’ y 3’ofdeALK
ALKtranscript
transcrito
regions
&,3'")(*"4*567*-&%)(8&'$-*
RNAm
mRNA
mRNA
ALK
ALK
ALK
Kinase
dominio
domain
cinasa
5'
región
5’ region
region5'
10
8>9*
6 =*
4 <*
2 ;*
0 :*
9*
región
5'
5'
region
5' region
3'región
region3'
3' region
ALKdominio
Kinase
ALK
domain
cinasa
3'
3’ region
region3'
región
10
8
6
4
2
0
>9*
=*
<*
;*
:*
9*
región
5'
5' region
5' region
región
3'
3' region
3' region
Figura 3. En las células pulmonares normales, el ALK se expresa en un nivel muy
bajo o indetectable de RNAm, mientras que las células tumorales de ALK-positivo
producen abundante ALK quimérico transcrito. Cuando se analizan por separado las
regiones 3' y 5' de ALK, un alto nivel de transcrito de la región 5' de ALK se detecta
exclusivamente en células ALK-positivo. Este método no se vé afectado por las células
normales mezcladas y es independiente de las parejas de fusión.
ALK DNA
DNA
ALK
DNA
ALK
Kinase
dominio
domain
cinasa
EML4dominio
Coiled
EML4
coil domain
“coiled-coil”
ALKdominio
Kinase
ALK
domain
cinasa
42
mRNA
mRNA
RNAm
domain
Atlas de la IASLC de Pruebas
de ALK en Cáncer de Pulmón
RNAm
mRNA
mRNA
la práctica clínica, ya que la RT-PCR cuantitativa generalmente requiere productos de corta longitud
(aproximadamente 150 pb), que se obtienen por lo general, incluso en muestras FFPE (Figura 4).
ALK
ALK
ALK
Comparación
de las
regiones
!"#$%&'(")*+,-.,,)*/0*%)1*20*
Comparison
between
5' and
3'
5’
y
3’
de
ALK
transcrito
regions of ALK transcript
&,3'")(*"4*567*-&%)(8&'$-*
Kinase
dominio
domain
cinasa
5'
región
5’ region
region5'
9*
800
región
5'
5'
region
fluorescencia
10
8>9*
6 =*
4 <*
2 ;*
0 :*
600
400
3'región
region3'
200
34.83
B
productos 3'
>9*
=*
<*
;*
:*
3'0 region
-200
exón 20 ALK
10
8
6
4
2
0
9*
50.0
5' region
A
comparativa de
productos 5’-3’
3'
3’ region
region3'
región
región
5'
5' region
productos 5'
5' region
20
10
30
40
50
región
3'
3' region
3' region
60
ciclos
exón 13 EML4
C
D
Figura 4. Un ejemplo de adenocarcinoma de pulmón ALK-positivo (A), usando PCR en tiempo real cualitativo en un RNA
en una muestra FFPE. Se extrajo RNA de la FFPE y se analizó el nivel de expresión de las regiones 3' y 5' de ALK (B). En este
tumor, la diferencia entre las dos regiones era sustancial, lo que sugiere un reordenamiento de ALK. La fusión fue confirmada
con secuenciación directa con la RT-PCR (C) y FISH Break-Apart (D).
Ensayos de múltiples genes
Existe una creciente necesidad en el cáncer de pulmón de desarrollar ensayos clínicamente aplicables
que puedan simultáneamente determinar la mutación, reordenamiento, y el estado de expresión
de muchos genes, incluyendo el ALK. Estas metodologías múltiples son importantes para maximizar
el uso de pequeñas muestras de tejido tumoral de pulmón y muestras de citología. Aunque varios
ensayos múltiples genómicos se pueden utilizar para determinar las fusiones de ALK en los niveles
de DNA y RNA, la literatura publicada es limitada (Li T 2013). El rápido desarrollo de las tecnologías
para la secuenciación a gran escala (secuenciación de nueva generación [NGS]) ha facilitado el
análisis molecular de alto rendimiento que ofrece varias ventajas con respecto a la secuenciación
tradicional, incluyendo la capacidad de secuenciar plenamente un gran número de genes en una
sola prueba y, simultáneamente, detectar deleciones, inserciones, alteraciones del número de copias,
reordenamientos y sustituciones de bases en todo el exoma (incluyendo mutaciones conocidas hotspot) en los genes conocidos relacionados con el cáncer (Ross 2011). Actualmente, las plataformas
NGS, que incluyen todo el genoma, todo el exoma, y la secuenciación de genes dirigida, representan
metodologías de diagnóstico emergentes para la detección de fusiones y mutaciones de oncogenes
43
CAPÍTULO 5: Retrotranscriptasa-reacción en cadena de la polimerasa y varios ensayos genéticos
en muestras de tejido tumoral, incluyendo muestras FFPE (Lipson 2012, Takeuchi 2012). En un estudio
con NGS de DNA genómico, donde estaban involucrados puntos de rotura en al menos cinco loci
diferentes del genoma, detectaron un complejo reordenamiento de ALK en una muestra que fue
ALK-negativo utilizando FISH break-apart (Peled 2012). La experiencia se limita a la determinación
de mutaciones de ALK y la variación del número de copias del gen en muestras clínicas de tejidos
tumorales. Con el uso de DNA extraído de muestras de FFPE de tejidos tumorales de pulmón, un
ensayo de NGS múltiple detectó mutaciones del gen ALK asociadas con la resistencia al tratamiento
con crizotinib en tres de 13 pacientes con cáncer de pulmón (Huang 2013).
Conclusión
La RT-PCR para detectar EML4-ALK debe ser diseñada de la forma más completa posible, con los
objetivos restringidos a las tres variantes principales que representan más del 90% del cáncer de
pulmón con EML4-ALK. La RT-PCR puede ser una herramienta útil para confirmar los resultados de
IHC y análisis FISH, pero es menos apropiada para el cribado primario de reordenamiento de ALK,
especialmente cuando la cantidad de muestra de tejido es adecuada. Los ensayos de genómica
múltiples nuevos, en especial NGS, representan metodologías prometedoras clínicamente aplicables
para la detección de fusiones de ALK, así como otras anomalías de genes, incluyendo mutaciones,
ganancias de número de copia y la expresión génica. Sin embargo, los datos publicados sobre estos
ensayos son limitados.
CAPÍTULO 6
Comparación de diferentes plataformas
de ensayo para pruebas ALK
Por Sylvie Lantuéjoul, Marileila Varella-Garcia, Erik Thunnissen y Yasushi Yatabe
Como se señaló anteriormente, FISH ha sido universalmente aceptado como un estándar de referencia en la evaluación de reordenamiento de ALK, y ha sido clínicamente validado y aprobado para
las pruebas de selección de los pacientes para el tratamiento con un inhibidor de ALK (crizotinib).
FISH puede detectar reordenamiento en ALK independientemente de la pareja de genes y la variante y se puede realizar en muestras de FFPE archivadas. Sin embargo, FISH requiere un mínimo
de 50 células tumorales, y este requisito puede ser la razón por la cual FISH no se puede utilizar en el
20% de las biopsias de cáncer de pulmón (Camidge 2010, McLeer-Florin 2012). La prueba FISH tiene
muchas otras limitaciones: requiere mucho tiempo, tiene un alto coste, requiere de un microscopio de fluorescencia y exige una formación especializada para la interpretación de los resultados.
Debido a sus limitaciones, FISH no está disponible en todos los laboratorios de rutina de patología,
y por tanto, otras plataformas de ensayo han sido evaluadas por su utilidad en la detección de ALK
en CPCNP. Los estudios se han centrado en la comparación de la prueba FISH con IHC con el uso de
diversos anticuerpos, la RT-PCR cuantitativa y múltiple y CISH.
La IHC puede, en teoría, detectar todas las proteínas de fusión de ALK, pero algunas variantes
y parejas de fusión pueden generar bajos niveles de proteína que pueden ser difíciles de detectar.
Por lo tanto, muchos ensayos de IHC incluyen ahora un proceso de amplificación para mejorar la
señal de la proteína. La IHC sigue siendo la plataforma más popular y rentable, ya que:
• Se utiliza en los laboratorios de patología en todo el mundo
• Se puede usar en muestras FFPE preparadas rutinariamente
• Es relativamente barato
• Requiere un equipo limitado
• Ofrece una rápida formación y optimización
• Por lo general, requiere un pequeño número de células tumorales para detectar la presencia de
la proteína de fusión
Aunque la correlación de los resultados de la IHC para ALK y FISH para ALK es excelente, la IHC
no se ha validado en grandes cohortes de pacientes como marcador predictivo de respuesta a la
terapia con inhibidores de ALK. La IHC tampoco muestra directamente el reordenamiento de ALK, y
se ha descrito en la literatura algunos resultados falsos negativos y falsos positivos (en comparación
con los resultados de FISH). En algunas muestras que habían resultado positivas para ALK con IHC
y negativas con FISH, se observó una buena respuesta al crizotinib (Peled 2012).
Actualmente está en curso la estandarización del ensayo de IHC para las pruebas de ALK. Sin
embargo, muchas directrices, como las desarrolladas en Europa y Japón, ya recomiendan la IHC
para ALK en las pruebas de cribado y posterior comprobación de los resultados positivos con FISH
45
CAPÍTULO 6: Comparación de diferentes plataformas de ensayo para pruebas ALK
para optar a la terapia con crizotinib. Además, las directrices estadounidenses señalan que si la IHC
para ALK se valida cuidadosamente puede tenerse en cuenta para la detección de pacientes con
adenocarcinoma de pulmón (Lindeman 2013).
La RT-PCR es una técnica altamente específica y fiable, ya que permite la identificación precisa de
las parejas 5’ y variantes de punto de rotura. Pero las variantes ALK atípicas o parejas de fusión (por
ejemplo, una variante irregular con inserción o deleción) pueden pasar inadvertidas. La RT-PCR de
EML4-ALK es muy sensible ya que los cebadores no amplificarán un producto en las células normales,
pero el RNAm intacto se conserva mal en una muestra guardada de FFPE. Aún se está valorando el
coste de la RT-PCR y dependerá del laboratorio y la prueba utilizada.
CISH es un nuevo método para la detección de reordenamiento de ALK, con el fin de superar
algunas de las desventajas de FISH (Kim 2011). CISH es un ensayo de ISH totalmente automatizado
que proporciona una tinción estable y permite la detección del reordenamiento del gen ALK usando
microscopía óptica de campo claro convencional.
IHC versus FISH
Varios estudios han comparado la IHC con FISH. Se han utilizado una variedad de anticuerpos para la
IHC, incluyendo dos clones de anticuerpos monoclonales de ratón, ALK1 (Dako) y 5A4 (Novocastra);
un clon de anticuerpo monoclonal de conejo D5F3 (Cell Signaling Technology), y un anticuerpo
policlonal de conejo (Invitrogen, Life Technologies). En la mayoría de los estudios, la prueba FISH
se ha realizado con un kit de sonda de reordenamiento ALK-break-apart (Abbott Molecular), la cual
está aprobada por la FDA de EE.UU. como prueba complementaria de diagnóstico para las pruebas
de ALK para determinar la selección de los pacientes para el tratamiento con crizotinib.
La IHC de ALK1 versus FISH
Inicialmente utilizado para el diagnóstico de linfoma de célula grande anaplásico, el anticuerpo
ALK1 también se ha evaluado para la detección de reordenamiento de ALK en CPCNP. Se comparó
ALK1 con IHC y FISH en tres grandes series de adenocarcinoma de pulmón o CPCNP (Tabla 1) (Rodig
2009, Mino-Kenudson 2010, Yi 2011). En comparación con FISH, ALK1 con IHC parece menos sensible
para detectar el reordenamiento de ALK en cáncer de pulmón que para detectarlo en el linfoma de
célula grande anaplásico, posiblemente debido a que la proteína de fusión ALK se expresa en niveles
bajos en CPCNP. ALK1 ofrece una buena especificidad, pero la sensibilidad oscila entre 67 % y 100 %.
Algunas muestras han dado positivo para ALK en FISH pero negativo para ALK en IHC, pero no hay
Tabla 1. Características de tinción de la IHC con el anticuerpo ALK1
Estudio
No. de Dilución Recuperación
Muestras ALK1
Antigénica
Sistema de
Detección y
Amplificación
Gradación
Umbral
IHC
Positivo
Sensibilidad Especificidad
IHC
IHC
(vs. FISH)
(vs. FISH)
Rodig et
al., 2009
358
1:2
EDTA (pH 8,0)
en olla de
presión
Amplificación
de la tiramida
y EnVision
0 vs. +
>10%
células
tumorales
positivas
80% con
amplificación
(40% sin)
100%
MinoKenudson
et al., 2010
153
1:2
EDTA (pH 8,0)
en olla de
presión
EnVision
0, 1+, 2+, ó
3+ y % de
células
tumorales
teñidas
>10%
células
tumorales
positivas
67%
97%
Yi et al.,
2011
101
1:100
EDTA (pH 8,0)
en PT Link
ADVANCE
0, 1+, 2+,
ó 3+
>0
90%
97,8%
PT Link, EnVision y ADVANCE son productos de Dako.
46
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
muestras que hayan dado positivo en la IHC y negativo en FISH (Rodig 2009, Mino-Kenudson 2010).
En un estudio, resultados de 1+ y 3+ de IHC determinaron ALK negativo y ALK positivo, respectivamente, considerando 2+ como un resultado equívoco (Yi 2011). Esta clasificación es similar a la de
las pruebas de HER2 en cáncer de mama. El uso de la amplificación de la tiramida se recomienda
para aumentar la sensibilidad de detección, pero se ha descrito una tinción no específica tanto en
células tumorales como en células no tumorales con una alta concentración del anticuerpo ALK1
(Mino-Kenudson 2010).
La IHC con D5F3 versus FISH
Se ha comparado la IHC con el clon D5F3 y FISH en tres estudios (Tabla 2) (Mino-Kenudson 2010,
Martínez 2013, Minca 2013). La sensibilidad fue del 83% al 100%, y la especificidad del 99% y del
100%. De entre seis muestras que fueron ALK positivo por FISH en un estudio, una muestra fue
ALK negativo por IHC, pero ninguna de las muestras que fueron ALK negativo por FISH, fueron ALK
positivos por IHC (Martínez 2013). Además de estos estudios, un panel internacional de patólogos
evaluó la IHC con D5F3 en una serie de adenocarcinomas de pulmón con genotipo ALK conocido.
En general, la sensibilidad fue del 90% y la especificidad del 95% para IHC comparado con FISH, y
la concordancia entre observadores en la puntuación fue alta (Hirsch 2013).
Tabla 2. Las características de tinción de la IHC con el anticuerpo D5F3
Estudio
No. de Dilución Recuperación
Muestras D5F3
Antigénica
Sistema de
Detección y
Amplificación
Gradación
Umbral
IHC
Positivo
Sensibilidad Especificidad
IHC
IHC
(vs. FISH)
(vs. FISH)
MinoKenudson
et al., 2010
153
1:100
EDTA (pH 8,0)
en olla de
presión
EnVision+
0, 1+, 2+,
ó 3+ y %
de células
tumorales
>10% células
tumorales
positivas
100%
99%
Martinez
et al., 2013
79
1:50
Estándar en
BenchMark XT
ultraView
0 vs. +
≥10% células
tumorales
positivas
83%
100%
Minca et al.,
2013a
231
1:100
Calor con
BenchMark XT
OptiView
0 vs. +
Positivo
94%**
100%
Hirsch et al.,
2013b*
98
Prediluído
Estándar en
BenchMark XT
OptiView y
OptiView
Amplification
0 vs. +
Cualquier
tinción
citoplásmica
fuerte
90%
95%
a
Dos resultados falsos negativos en las pruebas de IHC de muestras FFPE fueron posteriormente corregidas con un procesador ThinPrep (resultados positivos).
b
Los casos seleccionados para el estudio incluyeron 43 muestras que fueron ALK positivo por FISH y 55 que fueron ALK negativo por FISH.
BenchMark XT, ultraView (Universal DAB Detection Kit), OptiView (DAB IHC Detection Kit),y OptiView Amplification Kit son productos de Ventana
Medical Systems, Inc. EnVision+ es un producto de Dako.
La IHC con el clon 5A4 versus FISH
Al menos seis estudios han comparado la IHC con el clon 5A4 y FISH en una amplia serie (Tabla 3)
(Jokoji 2010, Kim 2011, Paik 2011, Lopes 2012, McLeer-Florin 2012, Sholl 2013). En todos los estudios,
la sensibilidad y la especificidad varió de 93% a 100% y 96% a 100%, respectivamente. Sin embargo,
en un estudio, se describieron resultados falsos positivos o falsos negativos. En un caso, las células
malignas se perdieron en FISH, y el resultado fue ALK positivo por IHC, y en otro caso, las señales
de división asimétrica con señales de sonda verdes débiles fueron mal interpretados como ALK
positivo en FISH (Sholl 2013). En general, en ese estudio, la especificidad de FISH en comparación
con IHC fue de 98,5%.
47
CAPÍTULO 6: Comparación de diferentes plataformas de ensayo para pruebas ALK
Tabla 3. Características de la tinción de IHC con el anticuerpo 5A4
Estudio
Sistema de
No. de Dilucióna Recuperación Detección y
Muestras
5A4
Antigénica
Amplificación
1:100
Target Retrieval
EnVision
Solution,
FLEX+ y iAEP
pH alto
Umbral
IHC
Positivo
Gradación
0 vs. +
Ninguna
gradación
Sensibilidad Especificidad
IHC
IHC
(vs. FISH)
(vs. FISH)
100%
100%
Jokoji et al.,
2010
254
Paik et al.
2011
640
1:30
Solución CC1
i-VIEW
0, 1+, 2+,
ó 3+
0, ó 1+:
negativo
2+: equívoco
3+: positivo
100%
96%
Kim et al.,
2011
465
1:30
Solución CC1
i-VIEW
0, 1+, 2+,
ó 3+
0, ó 1+:
negativo
2+: equívoco
3+: positivo
100%
cuando 2+
se considera
positivo
98%
McLeerFlorin et al.,
2012
441
1:50
Solución CC1
ultraView
0, 1+, 2+, ó
3+ y % de
células tumorales positivas
>10% de
células
tumorales
positivas
95%
100%
Lopes et al.,
2012
62
1:200
Microondas
Novolink
Ninguna
>10% de
células
tumorales
positivas
100%
100%
Sholl et al.,
2013
186
1:50
Tampón de
citrato,
(pH 6) en olla
de presión
EnVision
FLEX+
0, 1+, ó 2+
1+, 2+
93%
100%
(FISH sólo en
muestras IHC+)
a
Los anticuerpos 5A4 usados en los estudios de McLeer-Florin et al., Jokoji et al., y Lopes et al. eran de Abcam ; el anticuerpo usado en los otros
estudios era de Novocastra.
iView (DAB Detection Kit) y OptiView (DAB IHC Detection Kit) son productos de Ventana Medical Systems. Novolink (Polymer Detection System) es
un producto de Leica Biosystems.
Anticuerpos policlonales de conejo para IHC versus la RT-PCR
Al menos dos estudios han incluido el uso de IHC con anticuerpos policlonales de conejo (Tabla
4) (Wong 2009, Chen 2012). En un estudio, los resultados se compararon con los obtenidos por
RT-PCR de EML4-ALK y la concordancia fue alta (Chen 2012). En el otro estudio, 11 adenocarcinomas
y un carcinoma adenoescamoso que eran ALK positivo en RT-PCR también fueron positivos en IHC
(Wong et al 2009).
Tabla 4. Características de tinción de IHC con anticuerpo ALK policlonal de conejo
Estudio
No. de
Sistema de
muestras Dilución Recuperación Detección y
(% de ALK+) ALK1
Antigénica
Amplificación Gradación
Umbral
IHC
Positivo
Sensibilidad Especificidad
IHC
IHC
(vs. RT-PCR) (vs. RT-PCR)
Wong et
al., 2009
266 (4,9%)
1:1000
Tampón de
citrato (pH 6,0)
en microondas
HRP
complex
Ninguna
No
especificado
100%
No
especificado
Chen et al.,
2012
64 (4,7%)
1:500
Solución CC1
ultraView
0, 1+, 2+,
ó 3+
≥2+
100%
90%
CC1 (Tris/borate/ EDTA) es un producto de Roche (Basel, Suiza). UltraView (Universal DAB Detection Kit) es un producto de Ventana Medical
Systems, Inc. y el complejo HRP (peroxidasa de rábano picante) es un producto de Dako.
Comparación de clones de anticuerpos
Algunos autores han abordado directamente la concordancia entre los clones de anticuerpos usando
las mismas muestras, y se ha demostrado que la concordancia depende de los anticuerpos (Tabla
5) (Rodig 2009, Takeuchi 2009, Mino-Kenudson 2010, Murakami 2011, Conklin 2013, Selinger 2013).
48
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Tabla 5. Comparación de los clones de anticuerpos usados con IHC
No. de
Muestras
Estudio
Takeuchi
et al., 2009
Clon de
(% de ALK+) Anticuerpo
21 (52%)
5A4
Recuperación
Antigénica
Target Retrieval
Solution (pH 9,0)
(para todos)
239 (4%)
37 (59%)
0 vs. +
(para
todos)
RT-PCR
361a (5%)
Selinger
et al., 2013
377 (3%)
594 (11%)
100%
27%
iAEP
100%
100%
ALK1
EnVision+
9%
100%
SP8
iAEP
20%
100%
ALK1
EnVision+
EDTA en olla de
presión
(para ambos)
ALK1
100%
18%
40%
100%
80%
100%
67%
97%
100%
99%
81%
100%
EnVision
FLEX+
100%
100%
EnVision
FLEX+
100%
99,7%
100%
62,5%
EnVision+
0 vs. +
(para
ambos)
FISH
Amplificación
de la tiramida
EDTA en olla de
presión
(para ambos)
ALK1
Target Retrieval
Solution (pH 9,0)
(para todos)
5A4
Conklin
et al., 2013
100%
EnVision+
EnVision+
(para ambos)
Un marcaje
>2,7 en el
análisis por
imagen es
positivo
FISH
D5F3
Murakami
et al., 2011
100%
5A4
ALK1
MinoKenudson
et al., 2010
iAEP
ALK1
SP8
Rodig
et al., 2009
Sistema de
Sensibilidad Especificidad
Detección y
IHC
IHC
Amplificación Gradación Estándar (vs. estándar) (vs. estándar)
5A4
Según instrucciones del fabricante
(para todos)
ABC (sin
amplificación)
iAEP
0 vs. +
(para
todos)
0, 1+, 2+,
ó 3+ (para
todos)
RT-PCR/
FISH
FISH
ALK1
EnVision FLEX
66%
100%
ALK1
ADVANCE
66%
87,5%
5A4
ADVANCE
100%
87,5%
D5F3
ADVANCE
100%
75%
100%
99%
ALK1
Buffer (pH 9,0) en
olla de presión
EnVision
FLEX+
0, 1+, 2+,
ó 3+ (para
todos)
FISH
5A4
Según
instrucciones del
fabricante
ultraView y
ultraView
Amplification
100%
98%
D5F3
Según
instrucciones del
fabricante
OptiView y
OptiView
Amplification
100%
99%
a
Se analizaron un total de 356 muestras con el anticuerpo D5F3.
SP8 es un producto de Abcam. Target Retrieval Solution, buffer, EnVision, EnVision FLEX+, y ADVANCE son productos de Dako. UltraView
(Universal DAB Detection Kit), OptiView (DAB IHC Detection Kit), y ultraView y OptiView Amplification kits son productos de Ventana Medical
Systems, Inc. ABC=complejo avidina biotina.
49
CAPÍTULO 6: Comparación de diferentes plataformas de ensayo para pruebas ALK
Takeuchi et al. describieron resultados comparables con los anticuerpos ALK1 y 5A4 usando un
método de polímero intercalado de anticuerpos mejorado (iAEP) para amplificar señales (Takeuchi
2009). Sin embargo, se han encontrado discordancias con otros estudios. Por ejemplo, Murakami
et al. describieron un caso discordante entre las 12 muestras con reordenamiento de ALK cuyo
resultado fue negativo con IHC con 5A4 pero positivo con IHC con D5F3 (Murakami 2012). Conklin
et al. compararon cinco combinaciones de clones de anticuerpos y los sistemas de detección, y la
concordancia fue mayor con 5A4 y D5F3 con el sistema ADVANCE (Dako), pero se detectó una reacción heterogénea positiva en una muestra que era ALK negativo en FISH (Conklin 2013).
RT-PCR cuantitativa o múltiple en comparación con FISH (con o sin IHC)
Además de encontrarse transcritos de EML4-ALK en las células tumorales de nueve CPCNP, también se
encontraron en un único estudio en un pulmón normal (Martelli 2008). Dicha presencia en el tejido
pulmonar normal no ha sido confirmada por otros, lo que ha llevado a cuestionarse esos datos (Mano
2010, Sasaki 2010). La RT-PCR es un método altamente sensible asociado con una alta especificidad y
sin resultados falsos positivos. Sin embargo, hay un riesgo de resultados falsos negativos debido a la
dificultad en la obtención de RNA de alta calidad a partir de muestras FFPE. Aunque la tasa de falsos
negativos de la RT-PCR no se ha abordado en detalle, se ha descrito la detección de los transcritos
de ALK de forma prospectiva (Soda 2012). En ese estudio, 108 (12 %) de las 916 muestras fueron
excluidas porque el RNA era de mala calidad. Se detectaron los transcritos EML4-ALK en 36 muestras,
15 de las cuales estaban disponibles para IHC; y todas las muestras fueron ALK positivas por IHC.
En general, la sensibilidad y especificidad de la RT-PCR para la detección de los transcritos de
ALK, en comparación con IHC y FISH, son buenas, y van desde 94% al 100% (Tabla 6) (Takeuchi 2008,
Inamura 2008, Takeuchi 2009, Soda 2013).
Tabla 6. Comparación de los resultados de la RT-PCR con los resultados de otros métodos de pruebas de ALK
Sensibilidad de la
RT-PCR
(vs. FISH y/o la IHC)
Especificidad de la
RT-PCR
(vs. FISH y/o la IHC)
Tipo de
RT-PCR
Anticuerpo
IHC
FISH
Inamura et al.,
2008
RT- PCR múltiple
ALK1
Ninguno
100% (vs. IHC)
100% (vs. IHC)
Takeuchi et al.,
2008
RT- PCR múltiple
–
Ensayo de fusión basado
en FISH
100% (vs. FISH)
100% (vs. FISH)
Takeuchi et al.,
2009
RT-PCR inversa
y múltiple
5A4
ALK1
Ensayo de fusión
EML4 y KIF5B
100% (vs. IHC)
100% (vs. IHC)
RT- PCR múltiple
5A4
ALK break-apart
probe kit
100% (vs. IHC)
94% (vs. FISH)
100% (vs. IHC)
100% (vs. FISH)
Estudio
Soda et al.,
2012
En los estudios de Inamura et al. y Takeuchi et al. (2009), el anticuerpo ALK1 es un producto de Dako. El anticuerpo 5A4 en el estudio de Takeuchi
et al. (2009) es un producto de Abcam y, en el estudio de Soda et al. es un producto de Nichirei Biosciences, Inc. En el estudio de Soda et al., el kit de
sonda break-apart es un producto de Abbott Molecular.
CISH versus otros métodos
CISH tiene algunas ventajas sobre FISH, y los estudios han demostrado que los resultados de CISH
son comparables con los de otros métodos de detección de reordenamiento de ALK (Tabla 7) (Kim
2011, Yoshida 2011a, Schildhaus 2013). En un estudio, los criterios de ALK-positivo para CISH eran los
mismos que FISH, pero en otro estudio, los investigadores encontraron que un valor de corte diferente para CISH llevó a una mejor separación de los tumores ALK-positivo y ALK-negativo (Schildhaus
2013, Yoshida 2011a). Se ha desarrollado una nueva tecnología dual en la que el número de copias
50
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
de ALK y la expresión de la proteína ALK se evalúan en las mismas células (Ventana Medical Systems,
Inc.) (Nitta 2013), y dicho método ha demostrado una mayor sensibilidad que la IHC convencional,
proporcionando una evaluación más precisa del estado de ALK. Sin embargo, el ensayo es técnicamente difícil, por lo que se están realizando controles de validación continuos de esta tecnología.
Tabla 7. Comparación de CISH con otros métodos de prueba ALK
CISH
Kit de
Prueba
Estudio
FISH
IHC
RT-PCR
No. de
Muestras Criterio de
(% de ALK+) Positividad Sensibilidad Especificidad Sensibilidad Especificidad Sensibilidad Especificidad
Kim et al.,
2011
ALK dual-color
break-apart
CISH
431 (4%)
No se
menciona
94%
100%
66,7%
100%
ND
ND
Yoshida
et al.,
2011a
ALK dual-color
break-apart
CISH
45 (31%)
≥20%
células con
señales
divididas
100%
100%
93%
100%
93%
100%
ZytoDot 2C
SPEC ALK
break-apart
probe
100 (16%)
≥15% de
células con
señales
divididas
100%
100%
ND
ND
ND
ND
Schildhaus
et al., 2013
El kit de prueba usado en los estudios de Kim et al. y Yoshida et al. es un producto de Ventana Medical Systems, Inc. El kit usado en el estudio
de Schildhaus et al. es un producto de ZytoVision GmbH.
ND = no disponible.
Ejemplos de algoritmos diagnósticos para la prueba de ALK
Basándose en las ventajas y características de cada método para la detección de ALK, varios grupos
de investigadores han propuesto algoritmos de diagnóstico para la realización de las pruebas de
ALK (Figuras 1-6) (Sociedad de Cáncer de Pulmón Japonesa 2011, Kim 2011, Paik 2011, Thunnissen
2012b, Conklin 2013, Marchetti 2013).
muestras de
cáncer de
pulmón
muestras de citología,
congeladas
RT-PCR
IHC
negativo
negativo
positivo
positivo
FISH
negativo
positivo
(raro)
inhibidor de ALK
Figura 1. Algoritmo propuesto por la
Sociedad Japonesa de Cáncer de Pulmón,
con el cribaje por IHC y confirmación por
FISH. La RT-PCR se utiliza para muestras
de citología. Las líneas de puntos representan un posible análisis duplicado de
acuerdo con las características clínicopatológicas. Modificado con autorización
del Comité de biomarcadores, Sociedad
Japonesa de cáncer de pulmón. “Guidance
for ALK Gene Testing in Lung Cancer
Patients” (Orientaciones para las Pruebas
Genéticas de ALK en pacientes con cáncer
de pulmón). Versión 1.0 (1 agosto, 2011).
Disponible en http://www. haigan.gr.jp/
uploads/photos/641.pdf
51
CAPÍTULO 6: Comparación de diferentes plataformas de ensayo para pruebas ALK
IHC
negativo
0/1+
equívoco
2+
negativo
3+
presentadas
como ALK
negativo
CISH/FISH
presentadas
como ALK
positivo
IHC
negativo
0/1+
equívoco
2+
negativo
3+
presentadas
como ALK
negativo
FISH
presentadas
como ALK
positivo
Figura 3. Algoritmo diagnóstico utilizando
IHC de ALK y FISH en CPCNP. Modificado con
autorización de Paik J, Choe G, Kim H, et al.
“Screening of anaplastic lymphoma kinase
rearrangement by immunohistochemistry in
non-small cell lung cancer: correlation with
fluorescence in situ hybridization” (Cribaje
del linfoma anaplásico con reordenamiento
de cinasa por inmunohistoquímica en el
cáncer de pulmón de células no pequeñas:
correlación con hibridación in situ fluorescente). J Thorac Oncol. 2011;6(3):466-472.
Figura 4. Algoritmo propuesto para las
pruebas de ALK en CPCNP si la IHC para ALK
está completamente validada. Modificado
con autorización de Thunnissen E, Bubendorf
L, Dietel M, et al. “EML4-ALK testing in nonsmall cell carcinomas of the lung: a review
with recommendations” (Las pruebas EML4ALK en carcinomas de células de pulmón
no pequeñas: revisión y recomendaciones).
Virchows Arch. 2012;461(3):245-257.
CPCNP
pruebas de
ALK
IHC
positivo
1+, 2+, 3+
negativo
FISH
negativo
sin reordenamiento de ALK
Figura 2. Algoritmo para predecir el reordenamiento del gen ALK mediante IHC y
CISH o FISH. Modificado con autorización
de Kim H, Yoo S-B, Choe J-Y, et al. “Detection
of ALK gene rearrangement in non-small
cell lung cancer”. (La detección de reordenamiento del gen ALK en el cáncer de
pulmón de células no pequeñas). J Thorac
Oncol. 2011;6(8):1359-1366.
positivo
con reordenamiento de ALK
52
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
ALK IHC
(5A4 por Novocastra o DSF3 por Cell
Signaling con detección ADVANCE)
negativo
positivo
(sin expresión ALK)
(cualquier expresión ALK)
FISH
ALK positivo
ALK negativo
CPCNP
(adenocarcinoma, carcinoma de células grandes,
diferentes tumores con adenocarcinoma, NOS)
ALK IHC
1-2 días laborables
negativo
positivo
prueba FISH 2-3 días laborables
negativo
sin reordenamiento ALK
positivo
con reordenamiento ALK
Figura 5. Algoritmo para el diagnóstico de
detección para la prueba de ALK con IHC y
posterior confirmación con FISH. Modificado
con autorización de Conklin C, Craddock KJ,
Have C, et al. “Immunohistochemistry is a
reliable screening tool for identification of
ALK rearrangement in non-small-cell lung
carcinoma and is antibody dependent”.(La
inmunohistoquímica es una herramienta
de detección fiable para la identificación de
reordenamiento de ALK en el carcinoma de
pulmón de células no pequeñas y es dependiente de los anticuerpos) J Thorac Oncol.
2013;8(1):45-51.
Figura 6. Posibles algoritmos de pruebas
ALK en CPCNP propuestos por la Asociación
Italiana de Oncología Médica y la Sociedad
Italiana de Patología y Citopatología. Los recuadros y líneas punteadas corresponden a
formas hipotéticas de selección de tumores
para la prueba FISH después del cribado
con IHC. Se describe también la duración
del tiempo necesario para las pruebas y
la interpretación de los resultados de IHC
y FISH. NOS=no especificado. Modificado
con autorización de Marchetti A, Ardizzoni
A, Papotti M et al. “Recommendations for
the analysis of ALK gene rearrangements in
non-small-cell lung cancer: a consensus of
the Italian Association of Medical Oncology
and the Italian Society of Pathology and
Cytopathology” (Recomendaciones para el
análisis de los reordenamientos del gen ALK
en el cáncer de pulmón de células no pequeñas: un consenso de la Asociación Italiana
de Oncología Médica y la Sociedad Italiana
de Patología y Citopatología) J Thorac Oncol.
2013;8(3):352-358.
Conclusión
La detección de ALK con IHC es ampliamente recomendada debido a su relación coste-eficacia para
el cribaje masivo y posterior verificación de los resultados ALK-positivos por FISH. Sin embargo, la
IHC necesita una mayor validación clínica que muestre una fuerte correlación con la respuesta a los
inhibidores de tirosina cinasa de ALK. Además, FISH debe continuar siendo evaluado para determinar
la importancia clínica de los resultados que se interpretan actualmente como atípicos o borderline.
Se han propuesto varios algoritmos de diagnóstico para las pruebas de ALK.
CAPÍTULO 7
Análisis de ALK en citología
Por Lukas Bubendorf
El papel de la citología en CPCNP
Las pruebas FISH para la detección del reordenamiento de ALK como marcador predictivo en CPCNP
se emplearon en un principio para el análisis de biopsias (Kwak 2010). El material de biopsia se
prefiere a menudo para los estudios traslacionales en los ensayos clínicos ya que los bloques de
parafina se procesan de forma rutinaria en los laboratorios de patología y estos bloques proporcionan
múltiples secciones para distintos análisis. Sin embargo, hasta el 40% de todo el CPCPN avanzado se
diagnostica sólo mediante una evaluación citológica, sin correlación con una biopsia. Por lo tanto,
depender de la histología como la única fuente para las pruebas de ALK requeriría repetir la biopsia
en una gran proporción de los pacientes, haciendo hincapié en la necesidad de ampliar el análisis
de ALK a las muestras citológicas.
El análisis FISH de muestras citológicas cuenta con una larga tradición. La tecnología FISH se
utilizó para evaluar las líneas celulares o núcleos intactos aislados a partir de muestras de tumores
histológicos antes de que fuera aplicable a las secciones de tejido. La prueba FISH también es el
método establecido en varios campos de diagnóstico de la citología. Desde un punto de vista
analítico, no hay ningún argumento en contra de la aplicación de FISH de ALK en muestras citológicas.
De hecho, las muestras citológicas tienen varias ventajas; por ejemplo, comparado con las secciones
histológicas, los núcleos en frotis de citología están íntegros, lo que permite la detección del número
real de las señales de FISH en un núcleo.
La citología es un método interesante y mínimamente invasivo para recoger el material tumoral
para repetir el análisis de biomarcadores en la enfermedad recurrente o metastásica. El diagnóstico
citológico de CPCNP se basa habitualmente en muestras obtenidas por EBUS-PAAF, PAAF transtorácica, secreciones o cepillados bronquiales, lavados broncoalveolares y efusiones pleurales o
PAAF de otros sitios metastásicos. El procesamiento de dichas muestras para los bloques celulares en
FFPE se ha convertido en el método más utilizado de muchos laboratorios ya que los bloques celulares pueden ser manejados
de la misma manera que las
muestras histológicas, y se
pueden aplicar los mismos
protocolos para el análisis
de biomarcadores (Figura
1) (Alici 2013, Kalhor 2013).
50 µm
50 µm
Aparte de la capacidad de
A
B
generar más material me- Figura 1. Derrame pleural de un adenocarcinoma pulmonar. 1A: Frotis teñido con
diante cortes seriados, los Papanicolaou convencional. 1B: sección teñida con H&E de un bloque celular (x 400).
54
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
bloques celulares también tienen la ventaja de la conservación a largo plazo de la proteína o de la
calidad del DNA. Además de los productos comerciales, están también disponibles los protocolos
publicados para la realización de bloques celulares, y tres de los más comúnmente utilizados son
los denominados método del botón celular, el método del alginato sódico y el método de plasmatrombina (Cuadro 1) (Orell 2011, Kalhor 2013, Noda 2010, Jing 2013).
Análisis de FISH de ALK en
citología pulmonar
Cuadro 1. Protocolos para la preparación de bloques
celulares citológicos
MÉTODO 3
MÉTODO 2
MÉTODO 1
Método del Botón Celular (Orell 2011, Kalhor 2013)
FISH es una tecnología sólida que se
a. Dejar caer suavemente una gota de material aspirado o puede aplicar a casi todos los tipos y
citocentrifugado en un portaobjetos de vidrio sin difundirlo formatos de muestras citológicas. Los
o extenderlo.
protocolos y criterios para el análisis
b. Después de unos pocos segundos para que se adhiera, sumergir cuidadosamente el portaobjetos en etanol para su de FISH de ALK son idénticos a los
fijación.
usados en histología. Sin embargo,
c. Separar con cuidado la gota fijada (como un botón) con una
un grupo significativo de bloques
hoja de bisturí y procesarla de la misma manera que una
pequeña muestra de la biopsia.
celulares contienen muy escasas o
ninguna célula cancerígena para el
Método del Alginato Sódico (Noda 2010)
análisis molecular (Knoepp 2013),
a. Suspender el material correctamente centrifugado y fijarlo y la diferenciación de las células
en formaldehído tamponado al 10% durante 2-3 horas.
tumorales de las células reactivas
b. Recoger el precipitado con las células fijadas por centrifugación, decantar el formaldehído sobrenadante y
adyacentes es más difícil que en la
lavar con agua destilada.
citología convencional, especialc. Centrifugar y resuspender el precipitado con 0,5ml de
mente durante el análisis de FISH.
alginato sódico al 1%.
d. Añadir sodio-calcio (1M) a la solución y dejar que coagule.
Por lo tanto, el análisis de ALK en
e.
Recoger el material coagulado con forceps y procesar de la
muestras citológicas es otra opción
misma manera que una pequeña muestra de biopsia.
válida usada por algunos laboratorios (Figura 2) (Betz 2013, Savic
Método de Plasma-Trombina (protocolo usado en los
2013). Una ventaja importante de
Hospitales Universitarios de Basilea y Zurich, Suiza)
a. Centrifugar el material citológico durante 10 minutos a
la citología convencional es la capa 2500 rpm.
cidad de seleccionar la extensión
b. Eliminar el sobrenadante.
citológica óptima entre todas las
c. Pipetear dos gotas del sedimento en un tubo cónico.
d. Añadir 200 μl de plasma y agitar brevemente la muestra.
extensiones previamente teñidas
e. Añadir 50 μl de trombina y agitar brevemente la muestra.
para el análisis de FISH, sin necesi f . Incubar la muestra durante 5 minutos.
dad de usar extensiones no teñidas
g. Poner el cóagulo en un casete de inclusión (entre dos
adicionales. Además de la falta de
almohadillas de filtro), y cerrar el casete.
h. Fijar el material en formaldehído tamponado al 10%.
rotura nuclear y artefactos relaciona i . Sacar el material fijado y procesarlo de la misma manera que
dos, la calidad del DNA en muestras
una pequeña muestra de biopsia.
citológicas fijadas en alcohol o secadas al aire es mejor que la que hay
después de la fijación en formaldehído, la cual conlleva al cruzamiento y la modificación química
de los nucleótidos. Esto explica una tasa de éxito de hasta un 100 % para el análisis de FISH de ALK
en la citología convencional y una tasa de fracaso de hasta el 19 % para las muestras histológicas
(McLeer-Florin 2011, Savic 2013).
La técnica FISH es aplicable a casi todos los tipos de muestras citológicas, incluyendo frotis convencionales, muestras citocentrifugadas, o preparaciones de base líquida (por ejemplo, ThinPrep,
Hologic, o SurePath, BD Diagnostics), independientemente del tipo de fijación (secado al aire y
55
CAPÍTULO 7: Análisis de ALK en Citología
A
B
C
D
Figura 2. Hallazgos representativos sobre ensayos de FISH de ALK en extensiones citológicas convencionales o muestras previamente teñidas con Papanicolaou (imágenes comprimidas superpuestas z que
muestran la proyección de todas las señales de FISH en el núcleo intacto de las células). 2A y 2B: Dos tipos
de cáncer ALK-negativo con tres señales normales (fusionadas) de ALK (2A), y con un mayor número de
señales normales de ALK por núcleo de la célula tumoral (2B). 2C y 2D: Dos tipos de cáncer ALK-positivos
con una o dos señales break-apart (una distancia entre las señales verde y roja de al menos dos veces
el diámetro de la señal) (2C) o una sola señal roja con ninguna señal verde correspondiente además de
varias señales normales por núcleo de célula tumoral (2D).
fijadores a base de alcohol). Se recomienda el uso de portaobjetos recubiertos de adhesivo o con
carga positiva en la citología de pulmón, ya que estos portaobjetos tratados mejoran la adherencia
de las células y les impiden flotar durante la realización de la técnica FISH. La prueba FISH funciona
igual de bien en muestras no teñidas, así como las procesadas con Papanicolaou, hematoxilina,
o la tinción de Giemsa modificada, y generalmente no se requiere un procedimiento separado,
excepto cuando se utiliza la tinción de Giemsa modificada y se recomienda usar una solución de
desteñido con un alcohol ácido antes del análisis FISH (Betz 2013). Cabe destacar que FISH también
funciona bien con las muestras inmunocitoquímicamente teñidas si se utiliza 3-amino-9-etilcarbazol
(AEC) como cromógeno. El uso de 3,3’diaminobencidina (DAB) puede interferir con las señales de
FISH debido a la autofluorescencia. Se ha publicado un protocolo para la prueba FISH en muestras
citológicas teñidas (Thunnissen 2012b). Es posible que existan reticencias sobre el uso de extensiones citológicas diagnósticas para el análisis FISH ya que legalmente los laboratorios de citología
archivan las extensiones de diagnóstico durante varios años y cabe la necesidad de revisar estas
56
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
extensiones relacionadas con casos raros incluso años después del diagnóstico. Una posible solución
a este problema pasaría por capturar las imágenes representativas o escanear toda la muestra antes
del análisis. También es posible teñir otra vez los cortes después del análisis FISH (Betz 2013).
El umbral para un resultado positivo de FISH de ALK se estableció sobre la base del análisis de
las muestras histológicas (un patrón de señal típica de reordenamiento de ALK en al menos el 15%
de las células cancerosas), pero cada laboratorio debe determinar su propio umbral en muestras
citológicas ALK negativo hasta que estén disponibles las recomendaciones consensuadas. (Véase
la sección Hibridación in Situ Fluorescente para más información sobre los valores de corte). Se deben
seleccionar las células tumorales no superpuestas para la prueba de FISH de ALK, aunque los grupos
tridimensionales son susceptibles de análisis de ALK, ya que la detección de señales de reordenamiento no se ve obstaculizada por la tridimensionalidad. El uso de una fase automatizada guiada
por un software apropiado para las muestras con baja proporción de células tumorales aumenta la
precisión del análisis y facilita la revisión del resultado de la prueba FISH.
La IHC de ALK en citología
La inmunohistoquímica para detectar la sobreexpresión de la proteína ALK se ha convertido
recientemente en un método muy útil para el cribado de CPCNP para el análisis FISH posterior y
para la posterior evaluación de los resultados de FISH inciertos (tal y como se describe en detalle en la
sección de Inmunohistoquímica ). Al igual que con las muestras histológicas, la prueba de IHC de ALK
es igualmente prometedora con muestras citológicas, incluyendo bloques celulares y preparaciones
citológicas convencionales o de base líquida (Moreira 2012, Martínez 2013, Savic 2013, Tanaka 2013).
La precisión de la prueba de IHC de ALK en extensiones citológicas teñidas con Papanicolaou ha sido
alta, con una sensibilidad y especificidad de casi el 100 % comparado con FISH de ALK (Savic 2013,
Tanaka 2013). Esta precisión se logró con el anticuerpo 5A4 (Novocastra, véase la sección Diferentes
Plataformas de Ensayo para las Pruebas de ALK) y un inmunoteñidor automatizado (Bond-Max;
Leica Biosystems) (Figuras 3 y 4). Serán necesarios más estudios para validar este anticuerpo en
otras plataformas y para probar el rendimiento de un nuevo ensayo estandarizado de IHC de ALK
utilizando el anticuerpo D5F3 (Ventana Medical Systems, Inc.) en citología.
A
B
C
D
Figura 3. La IHC en extensiones citológicas convencionales
a partir de derrames pleurales
malignos de adenocarcinoma
pulmonar (x 200), mostrando
ALK-negativo (3A) y tumores
ALK-positivos (3B, 3C), con una
línea celular H2228 con reordenamiento de ALK utilizado
como control positivo (3D).
Se utilizó el anticuerpo 5A4
(Novocastra) y un inmunoteñidor automatizado (Bond-Max;
Leica Biosystems) y todos los
resultados fueron confirmados
por FISH.
57
CAPÍTULO 7: Análisis de ALK en Citología
A
Debido a que el uso de la IHC está ampliamente
generalizado, el número de laboratorios de patología
que la utilizan como un primer medio de prueba de
ALK puede aumentar y limitar el análisis de FISH sólo a
los hallazgos equívocos o positivos en la IHC, siempre y
cuando se compruebe que los ensayos estandarizados
y programas adecuados de control de calidad externos
sean satisfactorios tanto para las muestras histológicas
como citológicas.
RT-PCR
La RT-PCR puede ser utilizada para analizar muestras
citológicas (Betz 2013, Mitiushkina 2013). Como se
expuso en la sección Diferentes Plataformas de Ensayo
para las Pruebas de ALK, la RT-PCR puede ser apropiada
para la confirmación de los resultados de la prueba de
IHC de ALK o de FISH, pero es menos apropiada para el
cribado primario para el reordenamiento de ALK.
B
Conclusión
Las preparaciones citológicas, incluyendo las extensiones
convencionales y bloques celulares pueden constituir
una solución alternativa a las muestras de biopsia para
el análisis predictivo de ALK.
C
Figura 4. La IHC de ALK de un adenocarcinoma
pulmonar ALK-positivo (x 200), con las pruebas
realizadas con el anticuerpo 5A4 (Novocastra) en
una extensión citológica previamente teñida con
Papanicolaou (4A) y las correspondientes secciones del bloque celular teñidas con el anticuerpo
5A4 (4B) y el anticuerpo D5F3 (Ventana Medical
Systems, Inc.) (4C)
CAPÍTULO 8
Presentación de informes de la prueba ALK
Por Elisabeth Brambilla, Erik Thunnissen, Marileila Varella-Garcia y Yasushi Yatabe
De acuerdo con el sistema habitual de diagnóstico patológico molecular de los tumores, los informes
de ensayo de ALK deben incluir cuatro secciones: preanalítica, analítica, resultados e interpretación/
conclusión, independientemente del método diagnóstico utilizado: FISH, IHC, o RT-PCR.
Sección preanalítica
Además de la identificación del paciente, esta sección del informe habitual debe incluir un resumen
del tipo de muestra y del diagnóstico si el diagnóstico molecular no se ha emitido conjuntamente
con el informe anatomopatológico. Se deben añadir los siguientes datos.
Características de la muestra
• Tamaño de la muestra y tipo: resección quirúrgica (lobectomía, neumonectomía, segmentectomía, cuña), biopsia (bronquial/biopsia transbronquial, biopsia con aguja gruesa), citología
PAAF, fluido (pleural, líquido cefalorraquídeo)
• Conservación del tejido: congelado instantáneamente (temperatura de almacenamiento) o FFPE
• La fijación del tejido: el tiempo de fijación, la duración y el fijador utilizado (se recomienda sólo
formaldehído tamponado para FFPE). Si el tejido ha sido procesado con una solución descalcificadora, ésta debe ser documentada, así como el reactivo utilizado.
Diagnóstico histológico del tumor
Para el adenocarcinoma, el tipo y subtipo deben seguir la clasificación del 2011 de adenocarcinoma
de pulmón de la IASLC/American Thoracic Society/European Respiratory Society (Travis 2011). Los
tumores que sean de más de un tipo deben ser descritos como tales: carcinoma adenoescamoso,
cáncer de pulmón de células pequeñas combinado con adenocarcinoma y carcinoma neuroendocrino de células grandes (puro o combinado con adenocarcinoma). Si en el mismo tumor hay más
de un patrón o tipo histológico, se deberá indicar el tipo histológico predominante en la muestra
de la prueba, y si no es así, se debe documentar el tipo analizado.
Evaluación del tumor
• Estimación de la celularidad tumoral (porcentaje de núcleos de células tumorales en comparación con todos los núcleos presentes en el corte) de toda la muestra, para saber si la muestra
contiene suficientes células tumorales para las pruebas IHC, FISH y/ o RT-PCR
• Porcentaje de células tumorales en el corte/bloque inicial y, opcionalmente, después de la
selección de células tumorales por macrodisección para así reflejar la celularidad del tumor de
la parte de la muestra utilizada para aislar el DNA/RNA
59
CAPÍTULO 8: Presentación de informes de la prueba ALK
• Presencia de necrosis, infiltrados de células inflamatorias, antracosis y artefactos tisulares
• Resultados de la prueba de marcadores inmunohistoquímicos de diagnóstico adicionales, tales
como factor de transcripción tiroideo 1 (TTF-1), p63/p40, y tinciones de mucina, si existieran
(Thunnissen 2012a)
Idoneidad general de la muestra
• Documentada como “adecuada para las pruebas de” (en relación con los resultados recogidos
aquí, así como para las pruebas de ALK) o como “no apta” (anotando la razón o razones)
Otra información
• Tratamiento farmacológico previo, si existiera (opcional)
Sección analítica
Esta sección debe incluir la metodología básica para cada ensayo utilizado junto con la sensibilidad
del ensayo y el umbral. Debe incluir la suficiente información para que cualquier otro laboratorio
pueda entender lo que se hizo, en caso de discrepancia entre los laboratorios, o si se pidiera que
repitiese la prueba.
• FISH de ALK: set de sondas (fabricante, tipo) y el umbral utilizado para definir resultados positivos
• IHC de ALK: tipo de anticuerpo (fuente), la concentración de anticuerpos, el tiempo de incubación
y la temperatura, y el sistema de intensificación de la señal secundaria
• RT-PCR de ALK: método utilizado, cebadores, sondas y sus referencias, y la sensibilidad del ensayo
Sección de resultados
En esta sección se debe informar de los resultados de la prueba, incluyendo los hallazgos incidentales
y variantes de significado incierto. Los resultados no concluyentes se deben describir claramente
como tales. Los resultados se deben especificar como positivos o negativos para el reordenamiento
de ALK para que los oncólogos y patólogos no especialistas puedan comprender fácilmente los
resultados. Además, se deben añadir los elementos específicos de acuerdo con el método de prueba
utilizado.
FISH de ALK: el número de células analizadas y el número y porcentaje de células que muestran
patrones positivos. En el caso de que hubiera un patrón atípico, éste debe anotarse (por ejemplo, “negativo para reordenamiento de ALK, ver Interpretación”). Si se utilizaran los Sistemas
Internacionales de Nomenclatura para la Citogenética Humana (ISCN, por sus siglas en inglés),
ésta debe ir acompañada de un resultado específico de fácil comprensión.
IHC de ALK: El resultado debe ser descrito como positivo, negativo o indeterminado. Cuando el
resultado es indeterminado, se debe proporcionar una explicación (por ejemplo, agotamiento
del tejido del tumor o número insuficiente de células tumorales). Entre otros resultados opcionales están la gradación-H modificada (el porcentaje de núcleos teñidos, la intensidad y el patrón
de la tinción [citoplásmica y/o de membrana]) y la homogeneidad de la tinción. Para garantizar la
validez de la técnica, se requiere un control positivo externo para todas las pruebas. Este control
positivo puede ser un bloque celular obtenido de una línea celular con reordenamiento en ALK
o una muestra de un tumor ALK-positivo.
RT-PCR de ALK: los nombres de todas las mutaciones clínicamente significativas que se han
identificado. Se ha utilizado el patrón de fusión como la “variante 1,” pero se recomienda describir
60
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
las variantes (Soda 2012) como “EML4-ALK (E13; A20)” para la variante 1 y “EML4-ALK (E14; A20
E14; ins11del49A20)” para la variante 4. (Para más información ver http://atlasgeneticsoncology.
org/Tumors/inv2p21p23NSCCLungID5667.html.)
Sección de interpretación/conclusión
Esta sección debe incluir lo siguiente:
• Tipo de muestra y diagnóstico (primario o después del tratamiento con un inhibidor de ALK)
• Interpretación clínica fácilmente comprensible, incluyendo los resultados de la prueba molecular
y una apreciación general de la probabilidad de que el cáncer responda o sea resistente a la
terapia con inhibidores de ALK (teniendo en cuenta también la evidencia clínica)
• Explicación (lo más clara posible) para los resultados no concluyentes o resultados discrepantes
con múltiples pruebas, ya sea debido a un fallo del ensayo, una muestra insuficiente, u otra
razón (por ejemplo, los patrones atípicos de la prueba FISH) y sugerencias para la obtención
de mejores resultados en el ensayo de próximas muestras
Conclusión
Los informes sobre los resultados de las pruebas de ALK deben incluir detalles suficientes para que
tanto los médicos como los profesionales sanitarios de laboratorio puedan entender el origen y las
características de la muestra analizada, la naturaleza de la prueba realizada, así como la precisión y
la posible utilidad clínica de los resultados.
CAPÍTULO 9
Líneas de actuación y estudios de estandarizació
Por Yasushi Yatabe, Sylvie Lantuéjoul, Erik Thunnissen, Keith Kerr y Ming Sound Tsao
Con el desarrollo de la terapia dirigida contra ALK para CPCNP, varias organizaciones de oncología
y patología de todo el mundo han definido recomendaciones para las pruebas de ALK, ya sea
como documentos independientes o como parte de unas directrices generales sobre las pruebas
moleculares. Además, se han realizado varios estudios multicéntricos locales o internacionales para
estandarizar los protocolos de la prueba de ALK en los diferentes laboratorios.
Líneas de actuación
Las directrices para las pruebas moleculares en muestras de cáncer de pulmón pueden incluir
recomendaciones clínicas y metodológicas. En el 2011, la Sociedad Europea de Oncología Médica
(ESMO), señaló que, en ese momento, no se podían recomendar las pruebas de rutina de ALK, pero
reconoció que los datos emergentes podrían dar lugar a indicaciones clínicas para dicha prueba
en un futuro (Felip 2011). Desde entonces, varios grupos de expertos han publicado un criterio
general consensuado y recomendaciones para las pruebas moleculares en el cáncer de pulmón,
incluyendo la prueba de reordenamiento del gen ALK (Tabla 1). La guía más completa es el resultado
de un esfuerzo conjunto de expertos en representación de la CAP, IASLC y AMP que se basó en una
revisión sistemática de los estudios publicados hasta febrero del 2012. (Véase el Apéndice 2 para un
resumen de las recomendaciones de esta guía). La guía recomienda que todos los pacientes con CPCNP
avanzado se hagan las pruebas de reordenamiento del gen ALK si el tumor es de subtipo adenocarcinoma o tiene un componente de adenocarcinoma. También se deben realizar las pruebas para la
determinación del reordenamiento del gen ALK si la muestra es pequeña y no se puede excluir el
componente de adenocarcinoma (Lindeman 2013). Al igual que para las pruebas para la mutación
de EGFR, es necesario que un patólogo seleccione las muestras de tejido para determinar si son
adecuadas o no. La metodología elegida actualmente es el ensayo FISH ALK break-apart (Vysis LSI
Break Apart FISH Probe Kit, Abbott Molecular), que es, hoy por hoy, la única prueba aprobada por
la FDA de EE.UU. para seleccionar los pacientes tributarios al tratamiento con un inhibidor de ALK.
Sin embargo, la normativa establece que la prueba de IHC de ALK también se puede utilizar para el
cribaje de ALK si se utiliza un ensayo de IHC validado.
Estudios de estandarización
En los Estados Unidos, el uso de crizotinib, tal y como lo indica en el prospecto, está supeditado
a la realización de las pruebas de ALK con un ensayo aprobado por la FDA de los EE.UU. En la
actualidad, la prueba de FISH de ALK break-apart (Abbott Molecular) es el único ensayo de FISH de
ALK aprobado. En otras partes del mundo, las agencias reguladoras no exigen el uso de un método
específico, pero sí requieren el uso de un ensayo validado. En estos países, otros métodos o ensayos
62
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Tabla 1. Directrices o recomendaciones publicadas por varios grupos de expertos sobre el ensayo de ALK en el cáncer
de pulmón
Técnica
Autor, Año Organización Analizada
Algoritmo de Diagnóstico
Pruebas en
Muestras de
Citología
Inmunohistoquímica
(IHC)
Mitsudomi
et al., 2011
JLCS
FISH, IHC, Cribado con IHC y posterior
y RT-PCR confirmación con FISH
Adecuadas. Se
recomienda hacer
un bloque celular
para FISH y IHC
Recomendaciones para
enviar muestras a los
laboratorios comerciales
validados donde se utilizan
clones y sistemas de
detección adecuados
Garrido
et al., 2012
SEOM y
SEAP
FISH
No discutido
No discutido
Thunnissen Expertos en FISH, IHC, Cribado con IHC y posterior
et al.,
Europa
y RT-PCR confirmación con FISH
2012b
Las muestras
histológicas y
citológicas son
potencialmente
adecuadas
Tiene un gran potencial
como herramienta de
detección
Yi et al.,
2012
Expertos
FISH y IHC Cribado con IHC y posterior
confirmación con FISH
No discutido
Puede ser una herramienta
de cribaje práctica y segura
Marchetti
et al., 2013
AIOM y
SIAPEC-IAP
FISH es válida,
FISH, IHC, FISH para una selección de
y RT-PCR pacientes con estadio IIIB y IV incluso en frotis
de CPCNP
(tejido
Lindeman
et al., 2013
CAP-IASLCAMP
FISH
FISH en el momento de
diagnóstico en pacientes con
adenocarcinoma de pulmón
avanzado (o CPCNP con componente de adenocarcinoma).
Se recomienda la prueba a los
pacientes en estadio I-III CPCNP bajo criterio del equipo
multidisciplinario local
Adecuadas.
Preferentemente
en bloques
celulares y no
en frotis
Técnica correctamente
validada. Puede ser una
herramienta de cribaje para
seleccionar muestras para
la prueba FISH de ALK. La
prueba FISH no es necesaria
si los resultados con la IHC
optimizada son negativos
Ettinger
et al., 2013
NCCN
FISH
FISH es estándar; puede
ser detectado con la IHC y
confirmados los resultados
positivos con FISH. La PCR
está siendo evaluada.
No discutido
Puede ser usada como una
herramienta de cribaje.
Los ensayos de la IHC para
linfomas no son aptos para la
detección de muchos CPCNP
con reordenamiento en ALK.
Pruebas de FISH para
pacientes con tumores EGFRnegativos
congelado)
Puede ser usada para el
cribaje, pero no hay datos
suficientes para establecer
conclusiones
ESMO=Sociedad Europea de Oncología Médica, SEOM=Sociedad Española de Oncología Médica, SEAP: Sociedad Española de Patología,
AIOM=Asociación Italiana de Oncología Médica, SIAPEC-IAP=Sociedad Italiana de Anatomía Patológica y Diagnóstico CitopatológicoAcademia Internacional de Patología, NCCN=Red Nacional de Centros Oncológicos Integrales, ALCL=Linfoma de Célula Grande Anaplásico.
pueden ser utilizados si han sido estandarizados para detectar el reordenamiento del gen ALK. El
criterio general de los expertos reflejado en la normativa del CAP/IASLC/AMP es que la validación
de las pruebas de ALK debe seguir las mismas directrices y políticas similares de control y garantía
de calidad que las otras pruebas de diagnóstico molecular. Se han realizado varios estudios multicéntricos en diferentes países o regiones del mundo con el fin de implementar una política de
estandarización entre laboratorios (Tabla 2).
Europa
El proyecto ETOP Lungscape se diseñó para ocuparse de la investigación de biomarcadores en el
cáncer de pulmón. El primer protocolo fue un estudio de cohorte retrospectivo de reordenamiento
del gen ALK para tratar la prevalencia de la positividad del ALK en el adenocarcinoma de pulmón
63
CAPÍTULO 9: Líneas de Actuación y estudios de estandarización
Tabla 2. Estudios de estandarización multicéntricos para los métodos de prueba de ALK
País
Métodos
Evaluados
Participantes
No. de Muestras
Tipo de Estudio
Europa
(ETOP)
IHC y FISH
15 laboratorios
1099 (69 ALK-positivas)
Prueba interlaboratorios; Análisis
retrospectivo
Canadá
IHC y FISH
12 laboratorios
de patología
canadienses
28 (22 ALK- positivas)
Pruebas según protocolo individual de
cada laboratorio, seguido de un ajuste
de protocolo después de una reunión
de consenso y validación adicional al
repetir la prueba.
Japón
IHC, FISH, y
RT-PCR
cuantitativo
Pruebas de
detección a nivel
nacional durante
3 meses
2884 213 ALK- positivas)
Cribaje prospectivo
Francia
IHC, FISH,
y RT-PCR
15 departamentos
de patología
torácica franceses
459 (85 ALK- positivas)
Tratar la concordancia como método
de ensayo en los laboratorios
centrales
Alemania
IHC y FISH
Expertos de 8
institutos de
patología alemanes
10 (5 ALK- positivas)
Pruebas interlaboratorios con el
estado de ALK conocido previamente
Europa
(Sociedad
Europea de
Patología)
IHC, FISH,
e imágenes
digitales de
FISH
80 y 150 laboratorios
respectivamente
para la primera y
segunda serie de
pruebas
6 muestras extirpadas (2
ALK-positivas), 6 líneas
celulares (2 ALK positivas) y
4 imágenes digitales (2 ALK
positivas)
Pruebas interlaboratorios con el
estado de ALK conocido previamente
resecado en el estadio I-III en Europa, utilizando IHC con posterior confirmación con FISH (Blackhall
2012). Un protocolo de IHC de ALK fue validado en una prueba interlaboratorios en la que participaron 15 laboratorios. Aunque el clon de anticuerpo utilizado fue 5A4 junto con el sistema de
detección Novolink (Leica Biosystems), algunos laboratorios utilizaron la plataforma de tinción
automática Bond-Max (Leica Biosystems) y otros realizaron la tinción manualmente. Un análisis preliminar demostró que la IHC de ALK fue positiva en 69 (6,3%) de 1099 muestras de adenocarcinoma.
La gradación fue de 3+ en 23 muestras (33,3%), 2+ en ocho muestras (11%) y 1+ en 38 muestras (55%).
Para verificar la concordancia, se evaluó una prueba de IHC de ALK positiva/negativa 1:2 de cohorte
equiparable (n=207) con la prueba FISH. Los resultados de la prueba FISH fueron concordantes en
22 (37%) de los 60 tumores IHC ALK-positivos y en 137 (99%) de los 138 tumores IHC ALK-negativos
(Figura 1). Este estudio demuestra la importancia de una definición clara de positividad de la IHC y
qué nivel de positividad IHC puede predecir el reordenamiento del gen ALK. Si se usan estas condiciones aplicadas al anticuerpo 5A4, las muestras con una puntuación de 1+ o 2+ tienen una baja
probabilidad de reordenamiento de ALK. Del mismo modo, una prueba IHC negativa conlleva una
alta probabilidad de no reordenamiento de ALK.
Canadá
El estudio canadiense del linfoma anaplásico cinasa (CALK) fue un estudio multicéntrico llevado a
cabo en todo el país para optimizar y estandarizar la prueba de IHC de ALK y de FISH, con tumores
confirmados por FISH (22 tumores ALK-positivos y seis tumores ALK-negativos) (Tsao 2013). Las
muestras de ALK-positivos se obtuvieron a partir de muestras que habían sido seleccionadas tanto
con la IHC como con la prueba FISH en microarrays de tejidos construidos a partir de cerca de 2000
adenocarcinomas pulmonares resecados. Se enviaron réplicas anónimas de secciones a los laboratorios participantes para la IHC y la prueba FISH utilizando la prueba FISH ALK break-apart (Abbott
64
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
pacientes de adenocarcinoma con información de la IHC de ALK disponible
N=1099
100
ALK IHC–
N=1030
Estudio de cohorte pareado de la IHC de ALK 1:2
N=207
factores coincidentes en orden de importancia: estadio,
sexo/tabaquismo, centro/año de realización de la
intervención quirúrgica/edad
ALK IHC+
N=69*
38
FISH–
22
FISH+
*9, prueba FISH no realizada
ALK IHC–
N=138
1
FISH+
137
FISH–
99,3%
93,5%
87,5%
9,5%
90,5%
80
porcentaje
ALK IHC+
N=69
60
40
20
0
12,5%
6,5%
IHC resultado IHC resultado IHC resultado IHC resultado
0+
1+
2+
3+
FISH ALK
FISH negativo
FISH positivo
Figura 1. Los resultados del proyecto ETOP Lungscape. Entre 1099 adenocarcinomas de pulmón, 69 se identificaron como
ALK positivo en la IHC. La concordancia entre la IHC y la prueba FISH se analizó en un cohorte emparejado.
Molecular) por FISH: los anticuerpos ALK1 (Dako, un centro), clon 5A4 (Novocastra; 12 centros), el clon
D5F3 (Cell Signaling Technology, un centro); y el sistema de tinción automática existente localmente
disponibles (Dako, Leica Biosystems, o Ventana Medical Systems, Inc.). Se recogieron y analizaron
los resultados propios de la IHC de 12 centros que evaluaron el anticuerpo 5A4 y los resultados
de FISH en 11. El coeficiente de correlación intraclase (CCI) entre centros para IHC era 0,84. Tras el
análisis inicial de los resultados de la IHC y una reunión de los patólogos participantes para revisar
los cortes, cada laboratorio implementó los ajustes de protocolo pertinentes. Un segundo estudio
se llevó a cabo con el mismo conjunto de muestras, y el CCI mejoró significativamente (0,94). El CCI
para FISH fue de 0,68, y la sensibilidad y especificidad de los resultados de FISH entre centros fue
del 88 % al 100 % y 100%, respectivamente. Los autores de este estudio concluyeron que se puede
lograr la estandarización en los múltiples centros para las pruebas de ALK por la técnica de IHC y de
FISH. Se detectaron todos los tumores que eran ALK-positivo por IHC y FISH, a excepción de un caso
discrepante con resultados de la prueba FISH atípicos con una mutación desconocida e implicación
clínica también desconocida. Sin embargo, los resultados también sugieren la posible aparición de
resultados falsos negativos ocasionales en FISH.
Japón
Crizotinib fue aprobado por la Agencia de Productos Farmacéuticos y Sanitarios en Japón el 30
de marzo del 2012, pero este agente no se pudo utilizar en la práctica clínica hasta que fue incluido en la Lista de Precios de Medicamentos del Seguro de Salud Nacional. Tres meses antes de
que se incluyera esta medicación, Pfizer Japón llevó a cabo un programa de pre-reembolso por
razones éticas, en el que la compañía farmacéutica proporcionaba crizotinib a un instituto certificado cuando se determinaba que un tumor era ALK positivo. En el programa, se examinaron
muestras FFPE simultáneamente con la prueba FISH (Vysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit, Abbott
Molecular) y la IHC (el anticuerpo clon 5A4 junto con el sistema EnVision FLEX + [ Dako ] y un kit de
65
CAPÍTULO 9: Líneas de Actuación y estudios de estandarización
detección de iAEP [Nichirei Biosystems]), y la RT-PCR se utilizó en muestras de citología, tales como el
derrame pleural. Se realizaron un total de 5514 pruebas: 2630 con FISH, 2631 con IHC y 253 con
RT-PCR. El éxito de las pruebas fue del 93%, 96%, y 94%, respectivamente. Aunque la concordancia
entre la técnica de FISH y la IHC fue del 98%, la sensibilidad de la IHC de ALK se limitó al 86%. Los
resultados fueron positivos tanto en la prueba FISH como en la IHC para 213 muestras; 36 muestras
fueron positivas en la prueba FISH, pero negativas en la IHC, y 12 muestras fueron negativas en FISH,
pero positivas en la IHC. Los resultados fueron negativos tanto en FISH como en la IHC para 2076
especímenes. Basándose en estos resultados, la Sociedad Japonesa del Cáncer de Pulmón añadió
una nota especial en su guía de pruebas de ALK 2011 que indica que, incluso cuando se considera
a un paciente un buen candidato para el tratamiento con un inhibidor de ALK basándose en los
resultados de ambas pruebas de IHC y FISH, puede haber discrepancia entre los resultados de las
dos pruebas, y el tratamiento debe ser cuidadosamente determinado teniendo en cuenta la relación
beneficio-riesgo (Mitsudomi 2011).
Francia
El programa del Instituto Nacional del Cáncer (INCA) francés, que se inició en 2007, se dedica a la
detección prospectiva de biomarcadores emergentes en el cáncer de pulmón, cáncer colorrectal
y melanoma en 28 plataformas de genética molecular en los hospitales para cáncer. Como parte
de este programa, se está realizando un estudio multicéntrico francés de validación del ALK que
compara la IHC, utilizando los anticuerpos 5A4 y D5F3 (Novocastra y Cell Signaling Technology,
respectivamente), con la técnica FISH y la RT-PCR cuantitativa en una serie de 500 especímenes
quirúrgicos FFPE (Lantuéjoul 2013). Entre los 459 especímenes incluidos hasta la fecha, 340 eran
ALK negativo tanto en la prueba FISH como en la IHC y 85 fueron ALK positivos también en ambas.
Entre los casos discordantes, 15 fueron negativos en la prueba FISH y positivos en la IHC (pero con
gradación baja de tinción); 12 fueron positivos en la prueba FISH y negativos en la IHC. Siete especímenes no se pudieron interpretar con la prueba FISH, pero cinco de ellos fueron ALK positivo en
la IHC. En general, la sensibilidad de la IHC versus la técnica FISH fue del 87% y la especificidad del
96%. En cuanto a la RT-PCR cuantitativa, casi el 50% de las muestras ALK positivas tenían la variante
1, el 30% tenían variante 3a/b, menos del 5% tenían la variante 2 ó 7, y 20% fueron negativas o no se
pudieron interpretar. Los autores concluyeron que la IHC con 5A4 es una técnica fiable y fácil para el
diagnóstico de rutina de anormalidades de ALK, mientras que la técnica FISH y la RT-PCR cuantitativa
aún dependen de las condiciones preanalíticas y los conocimientos técnicos. Sin embargo, ningún
método es absolutamente preciso, y cuando el cuadro clínico sugiere la presencia de la positividad
de ALK, a pesar de un resultado negativo, conviene repetir la prueba con otro método.
Alemania
La Sociedad Alemana de Patología (Deutsche Gesellschaft für Pathologie; DGP) y la Asociación
Profesional de Patólogos Alemanes (Berufsverband Deutscher Pathologie; BDP) están llevando a
cabo pruebas interlaboratorios para la detección de la fusión del gen ALK para garantizar la técnica en cada uno de los institutos. En la fase preliminar del estudio, expertos de ocho institutos de
patología evaluaron las muestras de 10 casos de cáncer de pulmón para confirmar el estado del
ALK mediante la técnica FISH y la técnica de IHC (V Laffert 2013). Posteriormente, las muestras de
cáncer de pulmón confirmadas se distribuyeron como una sección de microarrays de tejidos. Los
institutos participantes utilizaron diferentes sondas FISH (ya sea de Abbott Molecular o ZytoVision
GmbH), diferentes clones de anticuerpos (ALK1, 5A4 y D5F3), diferentes diluciones (de 1:20 a 1:200),
y varios sistemas de detección (tinción manual o automatizado de Ventana Medical Systems, Leica
66
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Biosystems o Dako). Los tumores ALK negativos fueron diagnosticados correctamente con cualquiera
de los métodos (FISH y la IHC), mientras que se encontraron resultados dispares para los tumores
ALK positivos, especialmente con la IHC. El estudio demostró claramente que es crucial establecer
protocolos estandarizados para detectar el gen de fusión ALK.
Europa
Se ha publicado recientemente una guía sobre los requisitos de los programas de evaluación externa
de la calidad de la patología molecular (Van Krieken 2013). La Sociedad Europea de Patología lleva a
cabo un programa europeo de evaluación externa de la calidad para determinar las mutaciones de
los biomarcadores en CPCNP y así asegurar la máxima precisión y perfeccionamiento en las pruebas.
El programa cuenta con dos series de evaluación externa de calidad de las pruebas de ALK en las
que participaron 80 y 150 laboratorios respectivamente. Se proporcionaron cortes de microarray
tisular con núcleos a partir de material FFPE e imágenes digitales de FISH. Los datos de las dos series
estarán disponibles a finales de 2013.
Estudio internacional de reproducibilidad del kit Ventana IHC de ALK
Siete observadores internacionales estudiaron 100 casos evaluables para analizar la correlación
entre las pruebas de IHC y de FISH así como la reproducibilidad de la técnica de IHC de ALK Ventana
con el anticuerpo D5F3 (Ventana Medical Systems, Inc). Cuando los resultados de la IHC de ALK se
correlacionaron con los de la prueba FISH de ALK, la sensibilidad fue del 90% y la especificidad del
95%, con una precisión del 93% respecto a la prueba FISH. Los siete observadores coincidieron en
la interpretación de la IHC en el 95% de los casos, y seis de los siete observadores coincidieron en
el 97% de los casos (Hirsch 2013). Los autores llegaron a la conclusión de que había una excelente
concordacia intraobservador e interobservador con el Kit IHC de Ventana, así como una excelente
correlación con las pruebas FISH de ALK.
Conclusión
Aunque las pruebas para el reordenamiento del gen ALK mediante sondas FISH ALK break-apart
es generalmente reconocida como el criterio diagnóstico estándar para la terapia con TKI ALK, el
algoritmo de cribado para la detección de cáncer de pulmón con reordenamiento en ALK está aún en
fase de investigación. Se están llevando a cabo estudios en varios grupos para desarrollar directrices
nacionales o regionales en todas partes del mundo. La mayoría de estos estudios se centran en la
estandarización tanto de las pruebas IHC como las pruebas FISH, así como en la evaluación de la
sensibilidad y la especificidad de la IHC como herramienta de detección. A medida que se publiquen
los resultados de estos estudios, es probable que se pueda llegar a un consenso mundial sobre el
algoritmo de detección del gen ALK en los próximos años.
CAPÍTULO 10
Resumen y perspectivas futuras
Por Fred R. Hirsch, Yasushi Yatabe y Ming Sound Tsao
Los resultados del tratamiento para los pacientes con CPCNP en estado avanzado y reordenamiento
del gen ALK siguen siendo alentadores, y el diagnóstico de estos reordenamientos sigue siendo un
reto. Hoy en día es bien sabido que las pruebas moleculares para el reordenamiento del gen ALK son
cruciales para elegir la mejor terapia para los pacientes con CPCNP avanzado, en particular para los
tumores de tipo adenocarcinoma o que tienen un componente de adenocarcinoma. Sin embargo,
aún quedan algunas cuestiones sin resolver:
1.¿Qué pacientes deben ser examinados para el reordenamiento del gen ALK ?
2.¿Cuál es el método de cribado más efectivo a nivel de coste-beneficio?
3.¿Cuál es el mejor modelo de cribado para seleccionar los pacientes que serán tributarios
del tratamiento con inhibidores de ALK con el fin de elegir todos los pacientes que pueden
beneficiarse potencialmente de esta terapia?
4.¿Cuál es el modelo de tratamiento más eficaz basado en la evidencia clínica actual?
Aunque la última pregunta está más allá del alcance de este Atlas, las tres primeras preguntas
han sido abordadas en esta publicación.
¿Qué pacientes deben ser examinados para el reordenamiento del gen ALK?
Parece haber consenso en que, como mínimo, la detección de reordenamiento del gen ALK se debe
hacer para todos los pacientes con CPCNP avanzado que sea un adenocarcinoma o que tenga
un componente de adenocarcinoma. En función de los recursos y el interés académico, se debe
considerar la detección de los pacientes con CPCNP avanzado con otras histologías, sobre todo los
pacientes con una o más de estas características: pacientes más jóvenes de la media, sin antecedentes
de tabaquismo (o fumadores esporádicos), o resultados negativos en las pruebas en el gen EGFR y
en el gen KRAS. De vez en cuando, el reordenamiento del gen ALK se encuentra en los tumores con
un diagnóstico histológico sin adenocarcinoma, aunque esto no es muy común. Si la muestra de
diagnóstico es pequeña y el componente de adenocarcinoma no se puede excluir, se recomienda
realizar las pruebas de ALK.
A pesar de que el tratamiento con un inhibidor de ALK no se recomienda para los pacientes con
CPCNP en estadio temprano (I-IIIA), se recomiendan las pruebas moleculares, incluyendo las pruebas
de ALK, en las piezas quirúrgicas con el fin de proporcionar información si se produjese una recaída
de la enfermedad o un avance en la misma.
¿Cuál es el método de cribado más efectivo a nivel de coste-beneficio?
En los Estados Unidos, el criterio de inclusión para la terapia con crizotinib requiere el diagnóstico del
68
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
reordenamiento del gen ALK mediante un ensayo de ALK que esté aprobado por la FDA de los EE.UU.
Actualmente, sólo hay uno que esté aprobado por dicha organización: el ensayo FISH ALK breakapart (Abbott Molecular). Sin embargo, no se ha estipulado ningún requisito para determinar una
prueba específica para la detección del ALK. Muchos estudios han confirmado una alta especificidad
y sensibilidad diagnóstica para la IHC de ALK comparada con la FISH de ALK, y muchas directrices
ya incluyen recomendaciones para el uso de la IHC de ALK para detectar el reordenamiento del gen
ALK en grandes poblaciones de personas afectadas de CPCNP y la verificación de los resultados
positivos en la IHC con la prueba de FISH de ALK para la selección de tratamiento. Hoy por hoy, la
RT-PCR no se recomienda para el cribado de ALK.
¿Cuál es el mejor modelo de cribado para el tratamiento con un inhibidor
de ALK?
Aunque el cribado con IHC de ALK ha sido adoptado en muchos países, no está claro cuales resultados deben ser verificados con la prueba de FISH de ALK. Algunas guías recomiendan que todos
los tumores que son positivos en IHC de ALK deben ser analizados por la técnica de FISH de ALK,
mientras que otros sugieren que la prueba de FISH se use para verificar los resultados de la IHC de 1+
y 2+. Se requieren un mayor número de asociaciones clínico-diagnósticas más detalladas en cuanto
a la respuesta y los resultados relacionados con la terapia con inhibidores de ALK para determinar el
paradigma óptimo de cribado de diagnóstico. Hasta que estos resultados adicionales detallados del
análisis correlativo estén disponibles, los autores recomiendan que todos los tumores IHC positivos
se verifiquen con FISH de ALK. Sin embargo, hay un número creciente de pacientes con tumores
que son FISH ALK negativos pero positivos con la IHC que tienen una buena respuesta a la terapia
con crizotinib. En tales casos, estos resultados negativos en la prueba de FISH de ALK pueden ser
resultados tanto verdadero-negativo como falso-negativo debido a un patrón FISH borderline o
atípico. En este momento se están realizando análisis más exhaustivos de estos casos que ayudará
a obtener más información al respecto.
¿Cuáles son los pasos a seguir en el futuro?
Desde un punto de vista terapéutico, actualmente se encuentran en desarrollo clínico varios inhibidores de ALK de segunda generación, como los inhibidores duales ALK/EGFR, con resultados
muy alentadores. Sólo podremos decidir qué ensayo de diagnóstico dará los mejores resultados
clínicos realizando más estudios. La prueba de FISH de ALK es hoy en día el criterio estándar para la
inclusión en el tratamiento con crizotinib, y también se está utilizando en los ensayos clínicos con
inhibidores de ALK de nueva generación. Sin embargo, la correlación del tratamiento con otros
ensayos, tales como la IHC y la PCR, es aún objeto de investigación y el paradigma de diagnóstico
de cribado puede cambiar en el futuro. Además, la introducción de nuevos ensayos múltiples, en
particular las tecnologías NGS, deben ser validadas tanto para el cribado como para la selección de
tratamiento de los pacientes con CPCNP para la terapia ALK dirigida.
Conclusión
Como se ilustra en este Atlas, el diagnóstico del reordenamiento del gen ALK todavía se está
estudiando. En un par de años, el esquema de diagnóstico puede cambiar, y la aparición de
nuevos fármacos dirigidos puede facilitar esa transición. Sin embargo, estamos seguros de que
ahora podemos tratar adecuadamente a los pocos pacientes que tienen CPCNP con esta alteración
genética. Todos los profesionales de este campo deben asegurarse que los pacientes que
potencialmente puedan beneficiarse de la terapia de ALK-dirigida reciban un tratamiento óptimo.
69
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China (HK)
Japón
Japón
España
China
Japón
Jokoji et al., 2010
Sakairi et al., 2010
Salido et al., 2010
Sun Y et al., 2010
Takahashi et al.,
2010
IHC/FISH
Corea
EEUU
Paik et al., 2011
Yi et al., 2011
FISH/IHC
RACE/ RT-PCR
Zhang X et al., 2010 China
RT-PCR/Direct Seq
RT-PCR
FISH/IHC
IHC/FISH & RT-PCR
IHC
RT-PCR
101
735
103
313
52
107
109
254
266
130
141
Wong et al., 2009
IHC/RT-PCR & FISH
FISH
IHC/FISH
Japón
335
IHC/FISH/RT-PCR
Takeuchi et al.,
2009
EEUU
Boland et al., 2009
340
RT-PCR/FISH/
Gen Seq
EEUU
Japón
Takeuchi et al.,
2008
77
603
RT-PCR/Gen Seq
FISH/RT-PCR
Shaw et al., 2009
Japón
Shinmura et al.,
2008
305
358
EEUU/Suiza
Perner et al., 2008
RT-PCR
75
103
120
EEUU/Corea
Koivunen et al.,
2008
RT-PCR
RT-PCR
EEUU
Japón
Soda et al., 2007
Rodig et al., 2009
China
Rikova et al., 2007
No. de
CPCNP*
Martelli et al., 2009 Italia/España RT-PCR/FISH/IHC
País
Estudio
Plataforma de
Pruebas
10 (9,9%)
28 (3,8%)
12 (11,7%)
5 (1,6%)
3 (5,8%)
3 (2,8%)
7 (6,4%)
8 (3,1%)
13 (4,9%)
4 (3,1%)
19 (13,5%)
20 (5,6%)
9 (7,5%)
6 (1,8%)
11 (3,2%)
2 (2,6%)
16 (2,7%)
8 (2,6%)
5 (6,7%)
4 (4%)
No. (%)
ALK+
-
20 (5,6%)
3 (4,8%)
5 (2,7%)
11 (4,3%)
2 (4,0%)
-
8 (3,8%)
2 (10,0%)
101
395
62
211
52
69
82
254
209
130
10 (9,9%)
27 (6,8%)
10 (16,1%)
5 (2,4%)
3 (5,8%)
3 (4,3%)
7 (8,5%)
8 (3,1%)
11 (5,3%)
4 (3,1%)
130 18 (12,8%)
358
63
185
253
50
-
208
20
-
0
292
29
75
0
30
18
0
34
0
2
0
48
150
71
20
-
88
11
-
0
0
2 (6,9%)
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4 (8,3%)
1 (0,7%)
0
0
-
0
1 (9,1%)
-
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
0
2
0
7
3
-
9
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1 (25%)
0
2 (100%)
0
0
0
-
0
0
-
No.
No. de No. (%) No. de No. (%) ADSC/ No (%)
ADC
ALK+
CCE
ALK+
ASC
ALK+
0
48
12
27
0
8
9
0
23
0
5
0
7
0
9
4
-
0
42
-
No.
CPCNP,
Otros
0
1 (2,1%)
0
0
0
0
0
0
2 (8,7%)
0
0
0
0
0
0
0
-
0
0
-
No. (%)
ALK+
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
24
0
-
0
0
-
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
-
0
0
-
No fumadores con
adenocarcinoma
No fumadores
No fumadores/
fumador ocasional,
asiáticos, mujeres
NE Ca incluye
CPCP + CNECG
No. No (%) Selección de
NE Ca ALK+ Pacientes
Resumen de estudios publicados sobre las pruebas de reordenamiento del gen ALK en cáncer de pulmón
Anexo 1
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
74
China (HK)
China
China
To et al., 2013
Zhang Y-G et al.,
2013
Zhou et al., 2013
ARMS RT-PCR
RT-PCR/IHC/FISH
IHC/FISH/RT-PCR
IHC/FISH
IHC/FISH
FISH/IHC
239
15 (6,3%)
28 (5,7%)
20 (4,2%)
22 (5,9%)
12 (6,5%)
32 (12,8%)
7 (7,1%)
7 (3,4%)
75 (4,4%)
15 (4,3%)
34 (11,3%)
39 (34%)
11 (9,7%)
8(7,8%)
25 (9,7%)
31 (3,8%)
29 (6,6%)
10 (6,0%)
49 (3,7%)
39 (34%)
10 (10,5%)
5 (6,2%)
17 (9,3%)
30 (4,2%)
29 (6,6%)
9 (7,4%)
-
10 (7,7%)
349
341
373
186
-
79
95
-
349
25 (7,2%)
19 (2,6%)
22 (5,9%)
12 (6,5%)
-
5 (6,3%)
6 (6,3%)
-
15 (4,3%)
300 34 (11,3%)
116
95
73
182
713
441
121
-
130
101
112
0
-
7
96
-
0
0
0
18
14
0
52
0
46
-
97
2 (2,0%)
0
0
-
0
0
-
0
0
0
1 (5,6%)
1 (7,1%)
0
1 (1,9%)
0
1 (0,2%)
-
4 (4,1%)
12665 662 (5,2%) 6775 444 (6,6%) 1411 18 (1,3%)
488
469
373
186
249
99
208
1683
349
300
116
113
102
258
811
441
167
1387
-
78
18
4
0
-
0
7
-
0
0
0
0
14
0
8
0
0
-
-
7 (9,0%)
1 (5,6%)
0
0
-
0
1 (14,3%)
-
0
0
0
0
2 (14,3%)
0
0
0
0
-
376
20
12
0
-
13
10
-
0
0
0
0
1
76
38
0
0
-
12
17 (4,5%)
0
1 (8,3%)
0
-
2 (15,4%)
0
-
0
0
0
0
0
8 (10,5%)
0
0
0
-
1 (8,3%)
28
0
0
0
-
0
0
-
0
0
0
0
0
4
0
0
0
-
0
0
0
0
0
-
0
0
-
0
0
0
0
0
0
0
0
0
-
0
Mujeres no
fumadoras
No fumadores
EGFR de tipo nativo,
derrame pleural
Mujeres,no fumadoras/fumador
ocasional, y/o
adeno-carcinoma
EGFR de tipo nativo
o falta de respuesta
a TKI para EGFR
anterior
* Excluye cáncer neuroendocrino (NE Ca); CPCNP= carcinoma de pulmón de células no pequeñas, ADC= adenocarcinoma, CCE=carcinoma de células escamosas, ADS=mezcla adenocarcinoma/ carcinoma de
células escamosas, CPCP=carcinoma de pulmón de células pequeñas CNECG=carcinoma neuroendocrino de células grandes, EGFR=receptor del factor de crecimiento epidérmico, TIK= inhibidores de la tirosina
cinasa, RT-PCR = reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, FISH= fluorescencia de hibridación in situ, Gen seq=secuenciación genética, IHC=inmunohistoquímica, RACE= amplificación
rápida de los extremos de cDNA, y ARMS= amplificación refractaria de sistemas de mutaciones.
Total
EEUU
EEUU
Minca et al., 2013
Sholl et al., 2013
España
Martinez et al.,
2013
RT-PCR/IHC
FISH
EEUU
China
Gainor et al., 2013
RACE-PCR
Zhang Y et al., 2012 China
Li Y et al., 2013
IHC/FISH
EEUU
RT-PCR
Yang et al., 2012
China
Shaozhang et al.,
2012
IHC/FISH
RT-PCR/FISH
Corea
Park et al., 2012
RT-PCR/IHC/FISH
Taiwan
Japón
Murakami et al.,
2012
IHC/FISH
RT-PCR
Wu et al., 2012
Francia
McLeer-Florin et
al., 2012
FISH/IHC
Corea
Jin et al., 2012
RACE-PCR
FISH
Wang Z et al., 2012 China
China
EEUU
An et al., 2012
Dai et al., 2012
ANEXO 1
75
76
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
Anexo 2
Guía de pruebas moleculares propuestas por CAP/IASLC/AMP para la selección
de pacientes con cáncer de pulmón elegibles para el tratamiento con
inhibidores de la yirosina cinasa para EGFR y ALK
Resumen de las recomendaciones
Sección I. ¿Cuándo se deben realizar las pruebas Mmoleculares de cáncer de pulmón?
Pregunta 1. ¿En qué pacientes se deberían realizar las pruebas de mutaciones del EGFR y
reordenamiento del Gen ALK?
1.1a: Recomendación: La prueba molecular de EGFR se debe utilizar para seleccionar a los pacientes para la terapia dirigida con inhibidores de la tirosina cinasa del EGFR, y los pacientes con adenocarcinoma de pulmón no deben ser excluidos de la prueba debido a las características clínicas.
1.1b: Recomendación: La prueba molecular de ALK se debe utilizar para seleccionar a los pacientes para la terapia dirigida con inhibidores de la tirosina cinasa del ALK, y los pacientes con adenocarcinoma de pulmón no deben ser excluidos de la prueba debido a las características clínicas.
1.2: Recomendación: En el caso de muestras de cáncer de pulmón resecado, se recomiendan las pruebas EGFR y ALK para los adenocarcinomas y cánceres de pulmón mixtos con un componente de adenocarcinoma, sin importar el grado histológico. En el caso de muestras de cáncer de pulmón
totalmente extirpadas, no se recomiendan las pruebas de EGFR y de ALK en cáncer de pulmón que
carece de cualquier componente de adenocarcinoma, como por ejemplo el carcinoma “puro” de
células escamosas, el carcinoma de células pequeñas “puro”, o carcinoma de células grandes
carentes de evidencia inmunohistoquímica (IHC) de diferenciación de adenocarcinoma.
1.3: Recomendación: En el caso de las muestras de cáncer de pulmón más limitadas (biopsias, citologías), donde un componente de adenocarcinoma no puede excluirse totalmente, las pruebas EGFR y ALK se pueden realizar en casos que muestran una histología escamosa o de células
pequeñas, pero los criterios clínicos (por ejemplo, edad jóven, ausencia de historial de tabaquismo) pueden ser útiles en la selección de un subgrupo de estas muestras para la prueba.
1.4: Recomendación: Los tumores primarios o lesiones metastásicas son igualmente adecuados para determinar el estado de EGFR y ALK para la selección del tratamiento inicial. 1.5: Opinión consensuada de los expertos: Para los pacientes con múltiples, aparentemente separados, adenocarcinomas de pulmón primarios, cada tumor puede ser examinado pero no es necesario examinar múltiples zonas diferentes dentro de un mismo tumor.
Pregunta 2. ¿Cuándo se debe examinar la mutación EGFR o el reordenamiento ALK en una
muestra de un paciente?
2.1a: Recomendación: Las pruebas de mutación del EGFR se deben pedir en el momento del diagnóstico en los pacientes que presentan un estadio avanzado de la enfermedad (estadio IV de acuerdo con
la séptima edición del sistema de estadificación TNM) y que son aptos para la terapia o en el
momento de la recidiva o progresión en los pacientes que originalmente tuvieron la enfermedad en
estadios bajos, pero que no fueron examinados previamente.
2.1b: Sugerencia: La prueba de reordenamiento del ALK debe solicitarse en el momento del diagnóstico en los pacientes que presentan enfermedad en estadio avanzado (estadio IV de acuerdo con la séptima edición del sistema de estadificación TNM) y que son aptos para la terapia o en el momento
de la recidiva o progresión en los pacientes que originalmente tuvieron la enfermedad en estadios
bajos, pero que no fueron examinados previamente.
77
ANEXO 2
2.2a:
2.2b:
2.3:
Opinión consensuada de los expertos: se recomienda realizar las pruebas de EGFR en los tumores
en el momento del diagnóstico en pacientes con estadio I, II o III, pero la decisión de hacerlo debe
tomarse localmente por cada laboratorio, en colaboración con su equipo de oncología. Opinión consensuada de los expertos: se recomienda realizar las pruebas de ALK en los tumores al momento de diagnóstico en pacientes con estadio I, II o III, pero la decisión de hacerlo debe tomarse localmente por cada laboratorio, en colaboración con su equipo de oncología.
Recomendación: Debe priorizarse el tejido para las pruebas EGFR y ALK.
Pregunta 3. ¿Cuán rápido deberían estar disponibles los resultados de las pruebas?
3.1: Opinión consensuada de los expertos: Los resultados de las pruebas EGFR y ALK deberían estar
disponibles en 2 semanas (10 días laborables) desde la recepción de la muestra en el laboratorio
de pruebas.
3.2: Opinión consensuada de los expertos: Los laboratorios con tiempos medios de respuesta de más de 2 semanas tienen que poner a disposición una prueba más rápida—ya sea interna o a través de un laboratorio de referencia—en casos de urgencia clínica.
3.3: Opinión consensuada de los expertos: los departamentos de laboratorio deben establecer procesos para asegurarse que los especímenes que tienen un diagnóstico histopatológico definitivo se envíen a laboratorios externos de patología molecular dentro de los 3 días hábiles siguientes a la recepción de solicitudes y a laboratorios de patología molecular internos en 24 horas.
Sección II. ¿Cómo se deben realizar las pruebas de EGFR?
Pregunta 4. ¿Cómo se deben procesar las muestras para las pruebas de mutación EGFR?
4.1: Opinión consensuada de los expertos: los patólogos deben utilizar, muestras fijadas en formol e
incluidas en parafina (FFPE) o especímenes frescos, congelados, o fijados en alcohol para pruebas de mutaciones EGFR basados en la PCR. Se deben evitar otros tratamientos de tejidos (por ejemplo
fijadores ácidos o de metales pesados o soluciones descalcificantes) en las muestras destinadas a las
pruebas de EGFR.
4.2: Opinión consensuada de los expertos: las muestras citológicas también son adecuados para las pruebas EGFR y ALK. Los bloques celulares son preferibles a las preparaciones de frotis.
Pregunta 5. ¿Qué requisitos deben cumplir las muestras para las pruebas de EGFR?
5.1: Opinión consensuada de los expertos: Los patólogos deben determinar la idoneidad de las muestras para las pruebas de EGFR mediante la evaluación del contenido de células cancerígenas y la
cantidad y calidad del DNA.
5.2: Opinión consensuada de los expertos: Cada laboratorio debe establecer el porcentaje y el número de células cancerígenas mínimas necesarias para la detección de mutaciones durante la validación. 5.3: Opinión consensuada de los expertos: Un patólogo debe evaluar el contenido del tumor de cada espécimen y, o bien, realizar microdisecciones para enriquecer la muestra en células tumorales (según sea necesario) o supervisar a un técnico capacitado para que las realice.
Pregunta 6. ¿Cómo se debe realizar la prueba EGFR?
6.1: Recomendación: Los laboratorios pueden usar cualquier método validado de análisis EGFR con características de rendimiento suficientes.
6.2: Opinión consensuada de los expertos: Los laboratorios deben utilizar métodos de prueba de EGFR capaces de detectar mutaciones en las muestras con al menos un 50% de contenido de células
cancerígenas, aunque se recomienda encarecidamente a los laboratorios utilizar (o tener a su
disposición en un laboratorio de referencia externa) pruebas más sensibles capaces de detectar
mutaciones en muestras con sólo 10% de células cancerígenas.
78
Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón
6.3: Opinión consensuada de los expertos: las pruebas clínicas de mutación EGFR deben ser capaces de detectar todas las mutaciones individuales que se han descrito con una frecuencia de al menos el 1% de los adenocarcinomas de pulmón con una mutación en el gen EGFR. 6.4: Recomendación: No se recomienda la inmunohistoquímica del EGFR total para la selección de la terapia con TKI para EGFR.
6.5: Recomendación: No se recomienda el análisis del número de copias del gen EGFR (es decir, FISH o CISH) para la selección de la terapia con TKI para EGFR.
Pregunta 7. ¿Cuál es la función del análisis del gen KRAS en la selección de pacientes para la terapia
dirigida con TKI para EGFR? 7.1: Recomendación: las pruebas de mutación KRAS no se recomiendan como un único factor
determinante de la terapia TKI para EGFR.
Pregunta 8. Qué otras consideraciones importantes hay que Ttener en cuenta en caso de encontrar
resistencia secundaria o adquirida a los TKI para EGFR? 8.1: Recomendación: Si un laboratorio realiza pruebas en muestras de pacientes con resistencia adquirida a los inhibidores de cinasa del EGFR, dichas pruebas deben ser capaces de detectar la mutación secundaria EGFR T790M en tan sólo 5% de las células.
Sección III. ¿Cómo se debe realizar la prueba de ALK?
Pregunta 9. ¿Qué métodos deben utilizarse para las pruebas de ALK?
9.1: Recomendación: Los laboratorios deben utilizar el ensayo FISH de ALK utilizando sondas break-
apart doblemente marcadas para la selección de pacientes para terapia con TKI para ALK. Si se valida cuidadosamente la inmunohistoquímica del ALK, ésta puede ser considerada como una metodología de cribaje para seleccionar muestras para las pruebas FISH de ALK.
9.2: Recomendación: La RT -PCR no se recomienda como una alternativa a la prueba FISH para la
selección de pacientes para la terapia de inhibidores de ALK.
9.3: Opinión consensuada de los expertos: Un patólogo debería participar en la selección de cortes para la prueba FISH de ALK evaluando la arquitectura del tumor, la citología y la calidad de la muestra.
9.4: Opinión consensuada de los expertos: Un patólogo debería participar en la interpretación de las
imágenes de la prueba FISH de ALK, ya sea mediante la realización de análisis directamente o mediante la revisión de las interpretaciones de citogenetistas o técnicos con capacitación
especializada en el análisis FISH de los tumores sólidos.
9.5: Opinión consensuada de los expertos: Hoy en día no se requieren pruebas para mutaciones secundarias en ALK asociado con resistencia adquirida a los inhibidores de ALK para la gestión clínica.
Sección IV. ¿Se deben examinar rutinariamente otros genes en el adenocarcinoma
de pulmón?
Pregunta 10. ¿Existen otros marcadores moleculares adecuados para el análisis en el cáncer
de pulmón? 10.1a: Recomendación: Las pruebas de EGFR deben ser prioritarias sobre otros marcadores moleculares en el adenocarcinoma de pulmón.
10.1b: Sugerencia: Después de las pruebas de EGFR, las pruebas de ALK deben tener prioridad sobre otros marcadores moleculares propuestos en el adenocarcinoma de pulmón, ya que en el momento presente, la evidencia publicada es insuficiente para respaldar el desarrollo de guías para su análisis.
79
ANEXO 2
Sección V. ¿Cómo se deben implementar y poner en marcha los análisis moleculares en
el adenocarcinoma de pulmón?
Pregunta 11. ¿Se tienen que analizar todos los adenocarcinomas tanto con la prueba del EGFR como
con la de ALK? 11.1: Opinión consensuada de los expertos: Los laboratorios pueden implementar algoritmos de pruebas para mejorar la eficacia de las pruebas moleculares de los adenocarcinomas de pulmón, siempre que se cumplan los requisitos generales de tiempo de respuesta.
Pregunta 12. ¿Cómo se deben describir los resultados de EGFR y ALK?
12.1: Opinión consensuada de los expertos: los informes de los análisis de mutación del gen EGFR y FISH de ALK deben incluir una sección de resultados y de interpretación que sea de fácil comprensión para los oncólogos y patólogos no especializados.
Pregunta 13. ¿Cómo se deben validar los análisis de EGFR y ALK?
13.1: Opinión consensuada de los expertos: La validación de los análisis de EGFR y ALK debe seguir las mismas pautas que los otros diagnósticos moleculares y pruebas de FISH.
Pregunta 14. ¿Cómo se mantendrá la garantía de calidad? 14.1: Opinión consensuada de los expertos: Los laboratorios deben seguir un control similar de calidad, así como de garantía de calidad y procedimientos para las pruebas EGFR y ALK en cáncer de pulmón
al igual que para otros ensayos de laboratorio clínico. En particular, los laboratorios que
realizan pruebas de EGFR y ALK para la terapia con TKI deben contar con pruebas de capacitación, si están disponibles.
Abreviaturas: CISH, hibridación in situ cromogénica; EGFR, receptor del factor de crecimiento epidérmico; FISH, hibridación in situ fluorescente;
PCR, reacción en cadena de la polimerasa; RT-PCR, retrotranscriptasa- reacción en cadena de la polimerasa; TKI, inhibidor de la tirosina cinasa;
TNM, tumor, nódulo y metástasis. .
Reproducido, con permiso de, Lindeman NI, Cagle PT, Beasley MB, et al. “Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients
for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors” (Guía de pruebas moleculares para la selección de pacientes con cáncer de pulmón para los
inhibidores de la tirosina cinasa de EGFR y ALK: Guía del CAP, IASLC y AMP. J Thorac Oncol 2013;8:823-859.
IASLC acknowledges the generous funding and support provided
by Pfizer Oncology for this ALK Atlas project.
www.iaslc.org