Protocolo Oncogén Basic

KIT ONCOGEN BASIC. KIT PARA LA OBTENCION DE AMPLICONES DE LOS GENES AKT, BRAF, KRAS, NRAS y PI3K Y SU ANÁLISIS MEDIANTE EL SISTEMA JUNIOR Y LA DETECCIÓN DE MUTACIONES DE ESTOS GENES EN MUESTRAS ONCOLOGICAS. 1.
ANTECEDENTES. En los últimos años se está investigando intensamente en las bases genéticas de diferentes tipos de tumores y en cómo las diferentes alteraciones genéticas afectan en la respuesta al tratamiento, la evolución y el pronóstico. Recientemente se han desarrollado diferentes fármacos anticancerígenos cuya eficacia aumenta o disminuye considerablemente en función dela presencia de determinadas mutaciones somáticas en diferentes tipos tumorales. La investigación en nuevos fármacos y la necesidad de saber si diferentes mutaciones afectan a los fármacos que ya se están utilizando ha hecho imprescindible el estudio de estas mutaciones. Para realizar estos estudios se debe trabajar a partir de ADN obtenido de tejido tumoral, normalmente incluido en parafina. La inclusión en parafina produce la alteración del ADN y su fragmentación en diferente grado, por lo que se necesitan técnicas específicas para trabajar con este material genético. Por otro lado, las mutaciones somáticas en los tumores pueden encontrarse en una baja proporción respecto a la secuencia normal en el ADN obtenido de una muestra tumoral debido a que parte de las células tumorales presentan la mutación o a una baja proporción de estas células en la muestra. Si bien normalmente supera el 10% el ADN mutado. Para poder detectar las mutaciones de interés en esta situación no sirven protocolos basados en secuenciación convencional dado el alto índice de falsos negativos que necesita que la mutación esté presente en más del 25 o el 30% para detectarla. Por lo que se han desarrollado nuevas técnicas que permiten detectarlas aunque la mutación solo esté presente en el 1-­‐5% del ADN obtenido de una muestra. Estos protocolos sirven solamente para detectar las mutaciones ya identificadas y requieren numerosos estudios individuales para detectar todas las mutaciones de interés. Estos métodos son útiles en algunos genes donde se producen una o unas pocas mutaciones, normalmente de ganancia de función; pero no son viables cuando se necesita estudiar varios genes y en genes que presentan numerosas mutaciones diferentes. El presente kit (OncoGen Basic) se ha diseñado para detectar las principales mutaciones descritas hasta el momento en los genes AKT1, BRAF, KRAS, NRAS y PI3K (Tabla 1) en solo dos reacciones de PCR y secuenciación mediante el sistema Junior (Roche). En varios de los genes se han identificado diferentes mutaciones en los mismos codones, si bien el presente protocolo permite detectar todas ellas. Por otro lado, el diseño realizado permite detectar otras mutaciones que puedan estar en las regiones estudiadas. 2.
CONTENIDO -­‐ TIRAS DE TUBOS A1 Y A7: tiras de 6 tubos cada una para realizar la amplificación de los fragmentos de interés (Tabla 1) en 10 muestras, un control positivoy un control negativo . -­‐ TIRAS DE TUBOS M1 Y M7: tiras de 6 tubos cada una para realizar la reamplificación de los fragmentos e incluir los MIDs (códigos de identificación de cada muestra) y los oligos necesarios para realizar la secuenciación mediante el sistema GS Junior (Roche). -­‐ 1 tubo con DNA: control positivo. Tabla 1: Regiones amplificadas, localización en la proteína de los codones o aminoácidos donde se han descrito las principales mutaciones somáticas en tumores y región analizada en cada fragmento. PRINCIPALES CODONES CODONES GEN EXON CON MUTACIONES* ANALIZADOS AKT1 3 17 16-­‐32 BRAF 15 600 581-­‐620 KRAS 2 12, 13 1-­‐37 KRAS 3 61 42-­‐75 NRAS 2 12, 13 1-­‐25 PI3K 2 110 107-­‐116 PI3K
10 542, 545 522-­‐547 PI3K
21 1025, 1047 1016-­‐1062 3.
EQUIPAMIENTO NECESARIO: -­‐ Termociclador de 96 o 48 pocillos con tapa térmica para tubos de 200 µl (el protocolo se ha realizado en diferentes termocicladores de AppliedBiosysems, actualmente LifeTech, y en Eppendorf) si bien se pueden utilizar otros equipos que presenten rampas de calentamiento y enfriamiento iguales o más rápidas. -­‐ Pipetas para volúmenes entre 2 y 100 µl (aconsejable una 0.5 a 10, otra de 2-­‐20 y otra de 10-­‐100 o hasta 200). -­‐ Centrífugaparaplacas, strips o tubos de 200 µl. -­‐ Sistema de electroforesis que permita identificar las bandas amplificadas, puede ser en gel de agarosa, Bioanalizador (Agilent Technologies), Qiaxcel (Qiagen), etc. -­‐ Fluorímetro. -­‐ Equipamiento necesario para la realización de los protocolos necesarios para la secuenciación con el sistema 454 GS Junior (Roche)a partir de amplicones. 4.
REACTIVOS NECESARIOS NO PROPORCIONADOS: -­‐ Agua para biología molecular (libre de DNA, DNsas y RNasas). -­‐ TE para biología molecular (libre de DNA, DNsas y RNasas). -­‐ Reactivos y material plástico para la cuantificación con PicoGreen de ADN. Se recomienda el kit Quant-­‐iT™ PicoGreen® dsAADNssay Kit, Ref. P7589 ( Invitrogen™) -­‐ Reactivos necesarios para la realización de la secuenciación de amplicones mediante el sistema 454 GS Junior (Roche) 5.
PROTOCOLO: Hemos diseñado un protocolo robusto y sencillo para preparar 8 amplicones para su secuenciación con el sistema Junior y que permita detectar las mutaciones presentes en las regiones de interés en numerosos tumores. El procedimiento admite ADN obtenido de diferentes formas y a partir de muestras diversas, requiriendo una peña cantidad de ADN. Debido a que en muchos casos el ADN se obtendrá a partir de muestras incluidas en parafina y que la calidad de este ADN suele ser muy baja, las concentraciones pueden variar mucho e incluso pueden contener impurezas que pueden inhibir parcialmente las PCRs, el protocolo ha sido desarrollado ytestado con estas muestras. El protocolo funciona correctamente con la inmensa mayoría de las muestras de parafina, si bien cuando la muestra de partida es muy escasa o está muy degradada, pueden no obtenerse los resultados ideales. Para mejorar más los resultados, hemos incluido en el procedimiento algunos comentarios para mejorar los resultados cuando se quieran analizar muestras que tengan una baja concentración y/o puedan tener problemas para la amplificación. Para muestras incluidas en parafina, hemos comprobado que se obtienen buenos resultados con los kits “cobas® DNA SamplePreparation Kit” (Roche), “High Pure FFPET DNA Isolation Kit” (Roche), “QIAamp DNA FFPE Tissue” (Qiagen), REALPURE DNA FFPE Tissue (Druviz).Se pueden utilizar otros siempre que se obtenga una buena calidad de ADN. Recomendamos la cuantificación del ADN de partida con PicoGreen para tener una cuantificación más fiable, aunque se pueden utilizar otros sistemas. Posteriormente al protocolo de nuestro kit se debe realizar la purificación de los productos de PCR y la reacción de secuenciación mediante el sistema Junior según las indicaciones de Roche.s con el kit pueden ser purificados con Ampure (AgencourtAMPure XP, Ref. A63881; BeckmanCoulter), Real Clean Spin Kit utilizando el protocolo para obtener fragmentos de 350-­‐10.000 bp (Ref. RBMCS01, Durviz), el sistema PippinPrep de SageScienceusando geles del 2%. RECOMENDACIONES GENERALES: -­‐ Antes de empezar cualquier experimento se debe: a) verificar que se dispone de todo lo necesario b) limpiar la zona de trabajo y todas las superficies del material presente en esta zona con productos para la eliminación de ADN -­‐ Todo el proceso se debe realizar con puntas de filtro para las pipetas. -­‐ Utilizar siempre guantes limpios en cada procedimiento de amplificación. -­‐ El procedimiento se explica para utilizar todo el kit en un solo experimento, pero puede subdividirse. Si bien hay que tener en cuenta que en cada experimento se deben incluir como mínimo un control negativo. -­‐ Centrifugar 1 minuto a máxima velocidad los STRIPS antes de abrirlos. -­‐ Para añadir el ADN al mix1 se debe utilizar una zona libre de productos de PCR. En esta zona no se debe trabajar con productos de PCR, debe ser de fácil limpieza para eliminar restos de ADN. Antes de empezar cualquier experimento se debe limpiar con productos para la eliminación de ADN. Es preferible abrir cada tubo en el momento de añadir su ADN y cerrarlo tras hacerlo. -­‐ Zona postPCR de fácil limpieza para eliminar ADN. Tras limpiar la zona y utilizando puntas con filtro se debe preparar la dilución del ADN obtenido en la primera PCR. Posteriormente, cambiarse de guantes y limpiar la zona o abrir antes de abrir los tubos del mix2, añadir con puntas de filtro el ADN diluido procedente de la reacción 1.Es preferible abrir cada tubo en el momento de añadir su ADN y cerrarlo tras hacerlo. -­‐ Es importante no tocar la cara interior de los tubos para evitar la contaminación entre las diferentes muestras. El protocolo para obtener los amplicones necesarios para la secuenciación de las regiones de interés se divide en dos partes: Ø REACCIÓN 1: amplificación de los fragmentos de interés: permite amplificar estas regiones en diferentes muestras; Ø REACCIÓN 2: preparación de las librerías, reamplifica estas regiones e incluye los MIDs necesarios para luego identificar cada muestra y los oligos necesarios para la secuenciación. 5.1: REACCIÓN 1: AMPLIFICACIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE INTERÉS. Se debe utilizar tiras de tubos A1 y A7: PROCEDIMIENTO (12 reacciones: 10 muestras, 1 control positivo, 1 control negativo): 5.1.1.
Identificar cada tubo delastiras de A1 (muestras 1 a 6) y A7 (muestras 7-­‐10, control positivo y control negativo) y anotar la muestra que se va a amplificar en cada uno de ellos (los pocillos 11 y 12 se deben utilizar para los controles positivo y negativo, respectivamente). 5.1.2.
Centrifugar 1 minuto a máxima velocidad las dos tiras de tubos, verificar que en todos los tubos hay el mismo volumen. 5.1.3.
Añadir 2 µl de ADN genómico (entre 10 y 200 ng en total) de cada tubo según el orden seleccionado en los tubos 1 al 10. Cerrar los tubos. 5.1.4.
Añadir 2 µl de ADN del tubo de controlpositivo (pocillo 11). Cerrar el tubo. 5.1.5.
Añadir 2 µl de agua en el control negativo (pocillo 12). Cerrar el tubo. 5.1.6.
Centrifugar5 segundos las tiras de tubos (verificar que todo el volumen está en el fondo y que no hay burbujas) y colocar en el termociclador. Las tiras deben colocarse centradas dentro de la placa del termociclador, de forma paralela, y separadas por 3-­‐4 pocillos; esta disposición garantiza que la tapa esté equilibrada y evite la evaporación en todos los tubos (Foto). 5.1.7.
Utilizar el siguiente programa: Temp (ºC) Tiempo (seg) 95 900 95 20 62 30 72 60 72 180 X 1 ciclo X 40ciclos X 1 ciclo 4 ∞ X 1 ciclo 5.1.8.
Una vez terminada la reacción de amplificación, visualizar el resultado de las muestras amplificadas y de los dos controles mediante un sistema de detección de DNA en electroforesis (por ejemplo un sistema Qiaxcel de Qiagen, cargar 2 µl según instrucciones del equipo)o en gel de agarosa de alta sensibilidad para ver fragmentos entre 80 y 400 bp (por ej. 2-­‐3% agarosa alta sensibilidad y 1% agarosa normal; cargar 5-­‐8 µl de cada muestra y un marcador de tamaños que comprenda los ya indicados). Figura 1. Resultados obtenidos en la REACCIÓN 1 en las muestras positivas (carreras del a-­‐h), el control positivo (carrera i) y el control negativo (C-­‐). En la parte superior se pueden ver en su apariencia tipo gel y en la inferior como se ve la intensidad de cada pico. Todos los ADNs utilizados como molde se han obtenido a partir de muestras parafinadas. COMENTARIOS: Si la calidad del ADN utilizado es buena, todos los picos deben tener una intensidad similar y no se observan bandas diferentes a las de los amplicones. Se deben ver entre 6 y 8 bandas (según la capacidad para discriminar los fragmentos amplificados) en cada muestra, todas deben tener un aspecto similar al control positivo o a los resultados mostrados enlas muestras a-­‐i en la Figura 1. En el control negativo no deben verse bandas entre 160 y 230 bp aunque pueden verse bandas de menor tamaño correspondientes a “primer-­‐dimer”, normalmente en torno a las 100-­‐150bp (ver C-­‐ en la figura 1). 5.1.9.
Realizar diluciones 1/10 de todas las muestras y los controles con agua(2µl producto de PCR + 18 de agua). Si en alguna muestra, la intensidad es muy inferior (4-­‐10 veces menos) se pueden utilizar diluciones de 1/2 o 1/5. REACCIÓN 2: PREPARACION DE LAS LIBRERÍAS. Se deben utilizar las tiras de tubos M1 y M7. PROCEDIMIENTO (12 reacciones: 10 muestras, 1 control positivo, 1 control negativo): 5.2.1.
Identificar cada tubo de las tiras de tubos y anotar la muestra que se va a amplificar en cada uno de ellos (es recomendable usar el mismo orden que en las tiras anteriores, incluyendo la utilización de los pocillos 11 y 12 para los controles positivo y negativo, respectivamente). Es importante conocer el orden dado que de este orden depende el orden de los identificadores o MIDs que llevará cada muestra). 5.2.2.
Añadir 1.5 µl del producto diluido de la primera PCR correspondiente a cada caso, al control positivo y al control negativo en su tubo correspondiente en el STRIP 2. 5.2.3.
Centrifugar unos segundos las tiras de tubos (verificar que todo el volumen está en el fondo y que no hay burbujas) y colocar en un termociclador. 5.2.4.
Introducir en el termociclador de igual forma que en la reacción 1 y repetir los mismos ciclos realizados en la reacción 1. 5.2.5.
Verificar el resultado de la PCR mediante la carga en condiciones similares a las descritas anteriormente (incluso se puede verificar con parte de la reacción anterior para verificar que los fragmentos han aumentado de tamaño). Verificar que los tamaños obtenidos corresponden a productos de mayor tamaño que los observados en la PCR anterior. El control positivo siempre debe salir como en la Figura 2 (carrera i, en las representaciones superiores y 2 en las inferiores). Las muestras deben presentar una intensidad de picos que aumentan con el tamaño, en general (similar a la representada en la figura 2). En las muestras no se debe ver ninguna banda diferente a las esperadas. Según la resolución del gel o del sistema utilizado algunas bandas pueden aparecer como un solo pico (en la segunda PCR esto es más fácil que suceda, como en la imagen que se presenta donde las bandas de mayor tamaño aparecen como una sola). Figura 2. Resultados obtenidos en la RREACCIÓN 2 en las muestras positivas (carreras a a h), control positivo (i) y control negativo(c-­‐). En la parte superior se pueden ver en su apariencia tipo gel y en la inferior como se ve la intensidad de cada pico. Todos los ADNs utilizados como molde se han obtenido a partir de muestras parafinadas. 6.
PREPARACIÓN MUESTRAS PARA EMPCR Y SECUENCIACIÓN: En este punto se debe proceder como cualquier otra reacción de secuenciación del Junior para amplicones, si bien hay que tener en cuenta que: Los productos obtenidos con el kit pueden ser purificados con Ampure (AgencourtAMPure XP, Ref. A63881; BeckmanCoulter), el sistema PippinPrep de sageScience (indicando que se recupere el ADN entre 200 y 400 bp.) usando geles del 2%, REALCLEAN PCR Clean-­‐up (Durviz), este último utilizando el protocolo para 300-­‐10.000 bps. Se pueden utilizar otros sistemas de purificación siempre que eliminen fragmentos de ADN inferiores a 150-­‐
200bp. Es importante poner la misma cantidad de cada muestra por lo que es importante cuantificar el producto purificado con picogreen según procedimientos estándar (ver protocolo de cuantificación en documento que hay en la web y Excel para cálculo). 6.1.
6.2.
6.3.
6.4.
6.5.
Cuantificar el producto purificado con picogreen según procedimientos estándar Ajustar la concentración a 5 ng/µl de cada muestra con TE. Añadir 5 µls de cada muestra en un tubo limpio (no incluir control negativo ni control positivo) Vortex durante 1 minuto para mezclar bien Esta librería se puede conservar congelada a -­‐20ºC para utilizar otro día en la emPCR. 6.6. Para poder poner la cantidad necesaria de moléculas para la emPCR se deben diluir las muestras como se indica a continuación: 6.7. Diluir 1/100: añadir 5 µl del mix de librerías a 495 µl de TE. 6.8. Mezclar bien con vortex durante 1 minuto. 6.9. Diluir otra vez 1/100: añadir 5 µl de la dilución 1/00 anterior a 495 µl de TE. 6.10. Mezclar bien con vortex durante 1 minuto. 6.11. Diluir 1/5: añadir 5 µl de la dilución anterior (1/10.000 del mix de librerías original) a 20 µl de TE. 6.12. Mezclar bien con vortex durante 1 minuto. 6.13. Utilizar 5 µl con las esferas A y otros 5 µl con las esferas B. Si la concentración de alguna de las muestras es inferior a 5ng/µl se pueden preparar todas las muestras a 1 ng/µl o una concentración inferior ymezclarlas según el protocolo anterior. Si bien, las diluciones se deben modificar para obtener la misma cantidad de ADN final. Por ej. Si se parte de 1 ng/µl se deberán hacer diluciones seriadas de 1/100 y 1/100 (en total 1/10.000), frente a la dilución final 1/50.000 si se parte de 5 ng/µl. 7. ANÁLISIS: Para el análisis de resultados se debe descargar el Script que proporcionamos en las web http://seqplexing.com
mediante la inclusión del código de lote de su kit (ver parte inferior de la tapa del kit). Utilizar siempre el código del kit que se va a utilizar para evitar problemas entre versiones de kits y protocolos. En esta misma descarga encontrará las instrucciones para la instalación, análisis y visualización de resultados. Mediante una sencilla instalación (ver documentación que acompaña al script) se obtiene un sistema en el cual se deben incluir la correspondencia de las muestras con los MIDs incluidos en el kit. Los MIDs están ordenados desde el 1 al 6 y desde el 7 al 12 en las tiras de tubos M1 y M7 (Tira M1, contiene los MIDs del 1 al 6, y la tira M7los MIDs 7-­‐10 para las muestras, el 11 y el 12 corresponderían al control positivo y al negativo, respectivamente). RECOMENDACIONES TRABAJO CON PCR: El sistema desarrollado es muy sensible por lo que puede detectar cualquier contaminación que haya entre las muestras o con reacciones anteriores. Por ello se debe evitar siempre cualquier fuente de contaminación y evitar que las muestras se contaminen entre ellas. a)
Es aconsejable habilitar una zona para preparar la primera PCR donde no se trabaje nunca con productos de PCR o productos derivados de estos para evitar contaminar las muestras con este material. Las pipetas solo se deben utilizar en esta área. b) Una vez se realiza la amplificación las muestras se deben verificar y diluir en una segunda zona de trabajo. Las pipetas deben ser específicas de esta zona y los guantes utilizados en esta área no deben usarse en otras zonas del laboratorio. c) Siempre se deben utilizar puntas de pipeta con filtro. d) Todo el material (pipetas, banco, campana, gradillas, etc.) se debe limpiar con productos que eliminen el ADN. e) Se debe evitar siempre tocar la parte interior de los tapones de las tiras de tubos, de las muestras, de las diluciones, etc. Principalmente se pueden contaminar las muestras tras haber realizado la Reacción 1 al realizar las diluciones y poner las muestras en la reacción 2, por lo que hay que ser especialmente cuidadoso en este paso. PROBLEMAS: 1)
2)
3)
4)
5)
No se amplifican bandas (en ningún caso): verificar que todos los pasos del protocolo se han realizado correctamente. El control positivo siempre debe salir. Solo se amplifica el control positivo: verificar que las muestras utilizadas contienen ADN, la pureza del ADN es elevada. Si hay suficiente ADN se pueden volver a purificar. La intensidad de los diferentes fragmentos no es homogénea en algunas muestras: la calidad del ADN no es buena en las muestras no homogéneas, debería realizarse una nueva extracción. Si se ven todas las bandas se podría continuar, pero en aquellos fragmentos en los que se obtengan menos lecturas la sensibilidad se verá reducida. Ver ejemplos en la Figura 3. El control negativo presenta varias bandas similares a las que están presentes en el control positivo: ha habido una contaminación en la reacción. Se debería proceder a descontaminar todo el material utilizado en la reacción de PCR y de las áreas de trabajo, verificar si el kit de multiplex está contaminado, etc. El control negativo sale similar al control positivo: existe una contaminación importante y se debería realizar una descontaminación a fondo de las áreas de trabajo y de todo el material utilizado. A
B
a b c d e f g h i j
a b c d e f g h i j
a
b
a
b
f
i
f
i
Figura 3. Resultados obtenidos en las reacciones 1 y 2 con muestras de diferente calidad y concentración (todos son ADNs obtenidos de parafina). Panel A, resultados de la primera PCR; Panel , resultados de la segunda PCR. Muestras a-­‐e con diferentes concentraciones y buena calidad del ADN. Muestras f, g y h tienen muy baja concentración (inferior a 1 ng/µl). Muestras i y j presentan mala calidad del ADN y posiblemente impurezas que inhiben la reacción. En un recuadro se indican bandas anómalas obtenidas en las muestras de peor calidad. Las escalas de intensidad no son homogéneas entre los geles y muestras.