RESUMEN Mediante disección, previa asepsia y antisepsia

RESUMEN
Mediante disección, previa asepsia y antisepsia con Dextrán, alcohol yodado, peroxido
de hidrógeno hipoclorito de sodio al 20% y cloruro de benzalconio; se realizó la
búsqueda de endosimbiontes en el tubo digestivo posterior de Meccus pallidipennis, se
obtuvo el contenido intestinal y se sembró en medios de caldo de Tioglicolatoy caldo
BHI. El caldo de Tioglicolato se sembró en Gelosa sangre Y AGAR Gelosa Levintal en
condiciones de anaerobiosis. El BHI se sembró en Gelosa sangre, Mac Conkey, Sal
manitol y SDA. Se aislaron Staphylococcus xylosus, S. warneri, Enterococcus faecalis,
Kocuria varians, Micrococcus luteus y Kocuria rosea.
Introducción
Debido a que la transmisión de Trypanosoma cruzi es estercoraria, la microbiota
presente en el tubo digestivo del insecto ha sido motivo de estudio desde varios puntos
de vista. Moraes et al. En 2001 estudiaron la microbiota de cinco especies de
triatominos del género Penicillium y Aspergillus sugiriendo que pueden tener
comportamiento patógeno para el hombre. Eichler et al. en 2002 estudiaron la variación
en los niveles de población de las bacterias intestinales antes y después de la
alimentación, identificando a Rhodococcus rhodnii y Nocardia sp. Sugiriendo que estas
pueden tener un efecto patógeno para el hospedero. Beard et al. En 2002 proponen el
uso de endosimbionte
para modificarlos genéticamente y que sean
capaces de producir sustancias antiprotozoarioas para evitar que los triatominos se
infecten y propagen la enfermedad. Dotson et al. Aislaron y transformaron a
Rhodococcus rhodnii, un endosimbionte de Rhodnius prolixus, con elementos
integrativos del micobacteriofago L1 con propósitos de control de los transmisores en
lugar de utilizar insecticidas. Azambuja et al. en 2004 estudiaron los efectos de las
bacterias residentes en intestino en ninfas de V estadio de Rhodnius prolixus en le
hemólisi y la infección de T. cruzi e identificaron a Serratia marcensces con actividad
tripanolítica.
MATERIAL Y METODOS
Se colectaron ejemplares de Meccus pallidipennis en la localidad de Villa de Álvarez en
el estado de Colima, se estableció la colonia en el laboratorio y se mantuvieron a 28 °C
y con humedad relativa de 60%, utilizando para la alimentación el método de Ryckman
modificado por Alejandre en 1993. Cuando se obtuvieron los adultos se realizó la
asepsia y antisepsia externa, para evitar posibles contaminantes externos, utilizando
Dextrán al 1%, Alcohol yodado, peróxido de hidrógeno 30V, Hipoclorito de Sodio y
Cloruro de benzalconio. Este procedimiento se realizó en condiciones de esterilidad y la
muestra obtenida se sembró en medio BHI. El sacrificio de los triatominos se realizó en
cámara letal con acetato de Etilo, donde se colocaron por 30 min. Se retiraron de la
cámara letal, se realizó la asepsia y antisepsia en un área estéril y con tijeras estériles se
cortaron los bordes del conexivo, se ralizó la separación de las partes dorsal y ventral,
quedó expuesto el intestino posterior, se introdujeron 200 µl de solución salina estéril y
se extrajo el contenido intestinal.
El contenido intestinal se sembró en tubos de Caldo de Tioglicolato para el crecimiento
de anaerobios estrictos, microaerofílicos y anaerobios facultativos y en tubos de caldo
BHI para el crecimiento de microorganismos aerobios, se incubaron a 27° C durante 72
horas. Se eligió esa temperatura por ser a la que se incuban los triatominos para su
reproducción.
Del crecimiento obtenido en los tubos con caldo de Tioglicolato y con caldo BHI, se
sembraron del caldo de Tioglicolato en cajas con Agar Gelosa sangre CDC y se
colocaron en jarras para anaerobiosis y se incubaron a 27 °C durante 72 horas
(aislamiento de anaerobios estrictos).
Se sembraron también cajas de Gelosa Levintal y se incubaron por el método de
extinción de vela a 27 °C durante 72 horas para la búsqueda de organismos.
Del caldo BHI se sembró en cajas de Agar Gelosa Sangre, Mac Conkey, Agar Sal
Manitol para la búsqueda de microorganismos aerobios y anaerobios facultativos
También se hizo siembra en cajas de SDA para la búsqueda de hongos y levaduras con
incubación a 27 °C durante 72 horas.
Las colonias crecidas en el primoaislamiento, se sembraron en cajas de Gelosa Sangre
para obtener colonias puras, después se sembraron en Ager Gelosa Nutritiva y se
procedió a realizar la identificación bioquímica de cada una de las cepas encontradas.
Se realizaron los criterios de Cowan y Steel para la identificación de grupo o género
bacteriano, las pruebas incluyeron 10 determinaciones para la primera etapa de
identificación las cuales consisten en: Forma (Tinción de Gram), äcido resistencia
(Tinción de Ziehl-Neelsen), Esporas (Shaeffer y Fulton), Movilidad (Medio SIM),
Crecimiento Aerobio y Anaerobio, Catalasa, Oxidasa, Producción de Ácido Glucosa
(Rojo de Fenol) y Vía metabólica de Carbohidratos (Medio de Hugh y Leifson sin sello
de aceite mineral y con sellos de aceite mineral).
Se realizaron las pruebas características para la identificación de género. Al confirmar el
género con las diferentes pruebas mencionadas anteriormente, las cepas se crecieron en
tubos de gelosa nutritiva por 24 horas y se colocaron en el sistema Vitek2, que es un
sistema automatizado de identificación bacteriana. La identificación se basa en la
inoculación de una suspensión de microorganismos en tarjetas con determinados
paneles de reacciones bioquímicas (Vargas-Jarda et al., 2005) se incuba 4 horas y la
tarjeta se lee cinéticamente cada 15 minutos para un tiempo óptimo de obtención del
resultado el cual se obtiene entre 6 y 8 horas.
Se aislaron Staphylococcus xylosus, S. warneri, Enterococcus faecalis, Kocuria varians,
Micrococcus luteus y Kocuria rosea.
Se cocultivaron las bacterias obtenidas con la cepa H8 de T. cruzi y se evaluó la
infectividad del protozoario inoculando ratones de la cepa Balb C, el cocultivo con
endosimbiontes modificó el comportamiento de la cepa retardando el tiempo de
aparición de la parasitemia y alargando el tiempo de infección.
CONCLUSIONES
La presencia de endosimbiontes modifica el comportamiento de la cepa de T. cruzi.
Es posible aislar, sin contaminaciones externas, los endosimbionetes de triatominos.
Se contribuyó al conocimiento de la flora intestinal existente en los triatominos ya que
se encontraron algunas especies no descritas en trabajos anteriores.