informe final

MODELAMIENTO DEL EFECTO DEL CLORURO DE SODIO SOBRE EL
CRECIMIENTO Y LA PRODUCCIÓN DE NISINA DE Lactococcus lactis.
RESUMEN
Lactococcus lactis es una bacteria ácida láctica que generalmente se encuentra en la leche y
productos lácteos. Se caracteriza por producir nisina el cual tiene efecto antimicrobiano. Su
aislamiento permitirá utilizarlo en la conservación de alimentos que tienen compromiso
con bacterias patógenas responsables de las ETAs. El bjetivo del presente estudio fue
estimar la bondad de ajuste de la curva de crecimiento de L. lactis mediante el uso de
modelo de Gompertz modificado y obtener parámetros cin icos para ser utilizados en
modelos secundarios que estimaron el efecto del cloruro de sodio en concentraciones de 2,
4 y 6% sobre su biocinética de l crecimiento celular y la producción de bacteriocinas. Se
investigaron, en condiciones in vitro, fermentaciones usando el caldo MRS con glucosa 20
g/L. Se midieron el consumo de glucosa, producción de ácido láctico, p
cción de
biomasa y nisina, bajo el efecto de las concentraciones creciente de sal. Los resultados
demostraron que el modelo de Gompertz modificado explica el crecimient de L. lactis
obteniendo una velocidad de crecimiento específico de .30 Log UFC/mL/h. Así mismo, el
crecimiento celular y la actividad de bacteriocinas se vieron afectados por los cambios en
la concentración de sal. La concentración de NaCl al 2% no afecta sustancialmen e el
crecimiento y la actividad de la nisina. El efecto neg
vo de concentraciones mayores a
2% se traduce en una disminución de la producción específica de nisina (k B) y en
consecuencia en la actividad de la bacteriocina.El efecto inhibitorio del NaCl se debió
principalmente a su papel como agente reductor de a w.
1
I. INTRODUCCION
Actualmente existe una gran variedad de productos quím cos que son utilizados por la
industria en la conservación de los alimentos, pero los esfuerzos por proteger además, sus
propiedades alimenticias y gustativas aumentaron consi erablemente en los últimos años.
Si bien la conservación por adición de sustancias quím cas presenta muchas ventajas, parte
de la población rechaza fuertemente su uso por temor a sus posibles efectos tóxicos. Esto
llevó a las industrias elaboradoras de alimentos a la
squeda de alternativas que permitan
suprimir la adición de tales sustancias o reducir las
is para satisfacer las exigencias de
los consumidores, con el riesgo de que se puedan afect
la estabilidad microbiológica del
producto
En algunos alimentos la adición de ácido acético entre 0,5% y 1,2% es una alternativa para
controlar células vegetativas de microorganismos patógenos. Aunque estas condiciones son
generalmente de carácter bactericida, un limitado grup de microorganismos acidófilos es
capaz de crecer bajo estas condiciones lo que se evidencia por la generación de dióxido de
carbono y aroma indeseable.
Por otro lado, se ha demostrado que los sorbatos retar an el crecimiento de numerosos
microorganismos, este es el antimicrobiano más utilizado en jugos, salsas y aderezos;
siendo su acción inhibitoria generalmente más pronunciada contra hongos y levaduras que
contra bacterias; Así mismo, el antimicrobiano nisina resulta efectivo contra un gran grupo
2
de bacterias Gram (+), por lo que el uso nisina-sorbato podría ser una alternativa para la
reducción de la concentración del preservador químico.
La nisina es ampliamente usada desde 1953, recientemen e recibió la calificación de
GRAS (“Generally Recognized As Safe”, sustancia recono ida generalmente como segura)
por parte de la US FDA (Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos)
para su utilización en alimentos con acidez alta y baj . Debido a las características de que
muchos alimentos procesados por la industria alimentaria, el uso de nisina en los mismos
se vería favorecido.
De todas las sustancias antimicrobianas producidas por las bacterias lácticas, las
bacteriocinas, dentro de las cuales se encuentra la ni ina, aparecen como las más adecuadas
desde un punto de vista tecnológico para ser utilizadas como conservantes de rado
alimentario. En principio, su naturaleza peptídica permite la degradación por los enzimas
digestivos, resultando así presuntivamente inocuas para el consumidor y su microbiota
intestinal de ocupación y, en algunos casos, su espectro de acción incluye a los potenciales
patógenos y alterantes asociados a los alimentos (B. cereus, S. aureus, L. monocytogenes,
Clostridium spp., etc.). Por último, sus propiedades físico-químicas las hacen resistentes a
los tratamientos térmicos y cambios de pH que sufren l
alimentos durante su fabricación
y almacenamiento y, además, su pequeño tamaño permite
difusión en sistemas
semisólidos, propios de la mayoría de los productos al mentarios.
Adicionalmente, las bacterias lácticas ofrecen la posibilidad de producir as bacteriocinas
in situ durante el proceso de fabricación. De hecho, se ha demostrado que muchos de los
cultivos iniciadores utilizados en sistemas alimentarios producen bacteriocina. Por lo tanto,
3
se podría evitar la adición directa de una preparación pura de la bacteriocina, que
implicaría un mayor gasto económico. La inclusión de c pas bacteriocinogénicas en los
cultivos iniciadores puede realizarse siguiendo dos estrategias diferentes. La primera es
utilizar la cepa productora como cultivo iniciador puro y segundo, como cultivo iniciador
mixto, combinando la cepa productora con una segunda e pecie microbiana resistente a la
bacteriocina y responsable, al menos en parte, de la fermentación.
Actualmente es un problema el no tener una claridad en la medición y estimación de los
valores que expresan los efectos de distintos factores físico-químicos sobre la actividad de
una bacteriocina por lo que no permite inferir su posible aplicación industrial, ya que las
altas temperaturas y las amplias variaciones de pH son, entre otras, algunas de las
condiciones que debe resistir una bacteriocina para se útil como potencial agente inhibidor
de microorganismos no deseados en procesos alimenticio
(fermentaciones de leche,
maduración de quesos, curado de encurtidos, etc.).
La producción de bacteriocinas está influenciada por
ersos factores, entre los que se
incluyen las fuentes de carbono y nitrógeno, las condi iones de fermentación (pH,
temperatura, agitación, concentración de Cloruro de sodio o actividad de ag
etc) y en
general, cualquier variable que afecte el crecimiento bacteriano.
La nisina es una sustancia polipeptídica producida por Lactococcus lactis a partir de una
fermentación en medio lácteo modificado. La molécula exhibe su mayor estabilidad bajo
condiciones ácidas en la que también es más soluble. Sin embargo, la velocidad en que
puede metabolizar mono o disacáridos permitirá la formación de ácidos y de esta manera
generar la producción de nisina, permitiéndole manifestar la propiedad bactericida. Esta
4
correlación metabólica debe ser explorada debido a que son muy variadas las respuestas de
Lactococcus cuando utiliza sustratos diversos en los diferentes alimentos a que puede
llegar, sobre todo cuando se trabaja con cepas nativas aisladas de nuestr s alimentos.
Existen diversos modelos matemáticos que intentan describir el crecimiento de las
bacterias lácticas. Un ejemplo son las ecuaciones logísticas y las de Gompertz que pueden
ser útiles a la hora de predecir el efecto de un único factor ambient l sobre la producción
de bacteriocina y otros parámetros biológicos relevant
(biomasa, evolución del pH del
medio de cultivo, etc). La principal desventaja del uso de estas ecuaciones es que han sido
diseñadas para una cepa en concreto, de manera que su xtrapolación a otras cepas, con un
crecimiento muy diferente, da resultados muy imprecisos, por esta razón es necesario
hallar sus parámetros de crecimiento y poder utilizar estos valores cuando se trata de
medir su potencial tecnológico para producir nisina en forma masiva.
Por último, cabe señalar que, aunque la producción de
cteriocina sea un proceso
concomitante con el crecimiento, las condiciones óptimas para este último no implican
necesariamente un máximo en la producción de bacteriocina. Por
se ha
encontrado una relación bastante lineal entre la veloc dad de bacteriocina y la velocidad de
crecimiento celular para algunas bacteriocinas, pero esta relación no se ha encontrado para
la nisina, cuya biosíntesis es muy compleja y podría depender de factores de cultivo
intrínsecos o metabolitos que se forman en el cultivo
pueden alterar dicha
correspondencia entre los parámetros de crecimiento y producción de bacteriocina.
Muchos de los modelos matemáticos han sido estructurad
para describir la cinética del
crecimiento celular y la producción de ácido láctico en fermentaciones acidolácticas, sin
5
embargo existen pocos modelos los cuales describen la
roducción de bacteriocinas y
especialmente la nisina.
Se hace necesario establecer los parámetros de crecimiento para Lactococcus lactis cuando
es cultivado a temperatura óptima y en sustratos fermentables como la lactosa, la cual
establecería condiciones ideales para que la nisina formada se mantenga estable y con
propiedades antimicrobianas. Este comportamiento del crecimiento (Log UFC/mL) debe
ser ajustado mediante un modelo matemático apropiado como el de Gompertz, para que así
se puedan calcular los parámetros cinéticos del crecimiento en el medio de cultivo de caldo
MRS con glucosa y determinar el comportamiento de los
fermentativos en presencia de cantidades variables de
arámetros en procesos
uro de sodio.
El objetivo del presente estudio es el modelamiento de datos experimentales del
crecimiento de Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa usando el modelo primario de
Gompertz modificado para cuatro variables y medir el e ecto del cloruro de sodio sobre
dichos parámetros de crecimiento y
la producción de nisina, utilizando modelos
secundarios.
1.1. ALCANCES DE LA INVESTIGACION
Las cepas de Lactococcus lactis generalmente son aisladas de productos lácteos o de la
leche, sin embargo no todas las cepas son apropiadas p ra su uso tecnológico, e tal forma
que primero tiene que demostrar su crecimiento en sustratos natural s o medios de cultivo
sintéticos. Su adaptación y crecimiento requiere de mu
compuestos químicos que
deben existir en los sustratos o se deben incorporar.
6
Por otro lado las condiciones de cultivo intrínsecas también son inconvenientes que se
deben subsanar para que de esta manera su manejo o uso tecnológico en la industria láctea
pueda ser efectiva. Por lo tanto encontrar constantes de su crecimiento bajo los efectos de
dos variables como es la concentración de su fuente limitante de su crecimiento y del
factor osmolaridad (Cloruro de sodio) permitirá que esta bacteria pueda ser accesible por
cualquier productor artesanal y aprovechar sus propied
s como conservador natural pro
la producción de la nisina.
El modelo permitirá obtener una curva de crecimiento que servirá de base para que la
industria láctica artesanal, quienes no tienen acceso a controles microbiológicos por sus
costo elevados, puedan servirse de una herramienta que controlando la el pH o acidez y
midiendo la concentración de cloruro de sodio puedan inferir los niveles de UFC/mL que
pueden contener sus productos y de ésta forma predecir la vida útil, garantizando la
inocuidad del alimento.
1.2 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION
Tecnológicamente, el presente estudio, favorecería a la industria láctea y frutos
fermentables debido a que las bacterias lácticas ofrecen la posibilidad de producir las
bacteriocinas in situ durante el proceso de fabricación. De hecho, se ha demostrado que
muchos de los cultivos iniciadores utilizados en sistemas alimentarios producen
bacteriocinas. Por lo tanto, se podría evitar la adición directa de una preparación pura de la
bacteriocina, que implicaría un mayor gasto económico.
7
Así mismo, la inclusión de cepas bacteriocinogénicas en los alimentos podría realizarse
siguiendo la estrategias de utilizar la cepa productor como cultivo iniciador puro o bien
como cultivo iniciador mixto, combinando la cepa produ ora con una segunda especie
microbiana resistente a la bacteriocina y responsable, a menos en parte, de la
fermentación.
Los modelos matemáticos estiman las acciones de los microorganismos como una
respuesta a las condiciones ambientales, incluyendo aquellas presentes durante las
operaciones de producción y procesamiento de alimentos. Desarrollar un modelo
matemáticos para estimar el comportamiento de las bacterias benéficas en los alimentos
permitirá conocer las actividades de Lactococcus lactis en fases de su crecimiento
mediante el método logístico. Los resultados permitirán tener una base para el monitoreo
de la conservación de los productos lácteos, quienes no recurrirán a la incorporación de
antibióticos o inhibidores químicos por poseer en su composición sustancias antibióticas
naturales producidas por Lactococcus lactis.
El estudio se justifica porque tecnológicamente el uso de esta bacteria se haría m s simple
manejando variables como pH, temperatura o medición de la concentración de cloruro de
sodio y se podría predecir como es el comportamiento del crecimiento y de esta mane a
estar seguro que Lactococcus lactis estaría produciendo nisina otorgándole al alimento
propiedades de inocuidad. Esta situación es benéfica t
o para el productor como para el
consumidor.
8
Así mismo los resultados de éste estudio permitirán evitar o bajar la dosis de aditivos
químicos usados como conservadores de alimentos, y de sta manera no producir daños a
la salud por los efectos secundarios por su consumo diario.
Económicamente será mucho más rentable adicionar una b cteria productora de nisina que
los aditivos químicos, más aun cuando los efectos cola erales de los aditivos químico son a
largo plazo y de manera irreversible, consecuentemente las atenciones de salud serán más
costosas.
Actualmente no se aplica la Microbiología Predictiva a nivel industrial, debido a ue se
entiende que el uso de los modelos matemáticos es complicado y de manejo difícil para el
personal común; sin embargo, la experiencia indica que cuando los resultados en el
proceso de producción se incrementan y aseguran el man jo de los Programas de Buenas
Prácticas de Manufactura y Análisis de peligros y Punt
críticos de control, las empresas
comienzan a implementar sus áreas de producción con personal profesional matemático
que esté involucrado con el tema de microbiología o la biomatemática.
El cuidado de reportar predictivamente la cantidad de bacterias productoras de antibióticos
disminuirá los riesgos de consumir un alimento que está alterándose por bacterias no
exigidas en su control por las normas, evitará que los cuadros de enfermedades gastrointestinales aumenten, sobre todo en tiempos en que la temperatura del ambiente se eleve.
Finalmente, el presente proyecto tiene la finalidad de aportar información científica para
cepas naturales que mantienen un genoma adaptado a una ecología microbiana muy típica
9
de nuestros alimentos, para las cuales falta aporte de datos científicos para su mejor
aprovechamiento.
II. MARCO TEÓRICO
Las bacterias lácticas se encuentran en ambientes muy variados, pero generalmente están
asociadas con sustratos ricos en nutrientes. Esto ha d erminado que en su evolución hayan
perdido muchas capacidades biosintéticas, así como la
acidad de esporulación,
innecesarias en sustratos como los alimentos o el tracto gastrointestinal (Makarova y
Koonin, 2007; Pfeiler y Klaenhammer, 2007). En relación con los alimentos, forman parte
de la microbiota natural de las superficies de vegetales, aparecen con frecuencia en leche y
derivados, en productos cárnicos y en otros alimentos. En estos sustratos la acidificación y
otros cambios que acompañan el crecimiento de las bact
s lácticas, como por ejemplo la
producción de compuestos antimicrobianos, exopolisacár dos y diversas enzimas,
contribuyen al aroma, textura, conservación y valor nu ritivo de una gran variedad de
productos fermentados (Kleerebezem y Hugenholtz, 2003; Wood, 1997). En general, las
bacterias lácticas toleran bien concentraciones relativamente altas de ácidos y valores de
pH más bajos que el resto de las bacterias por lo que
elen llegar a predominar en los
hábitats que colonizan. Gracias a las bacterias láctic
la vida útil y la calidad
microbiológica y organoléptica de los productos finale aumentan notablemente con
respecto a la materia prima original. Sin embargo, el nterés industrial de estas bacterias no
se limita a la obtención de alimentos fermentados, sin que también abarca la producción
de diversos compuestos químicos y biológicos como etanol, ácido láctico, bacteriocinas,
biopolímeros o enzimas (Leroy y De Vuyst, 2004).
10
El hecho de que las bacterias lácticas y los productos de su metabolismo hayan sido
consumidos por el hombre durante tantos siglos sin ocasionar problemas, salvo en muy
contadas excepciones, ha determinado se consideren como bacterias reconocidas
generalmente como seguras (GRAS, acrónimo de Generally Recognized As Safe). Para
hacernos una idea de su inocuidad baste considerar que n europeo ingiere unos 22 kg de
leche fermentada al año, lo que equivaldría a un consumo global, tan sólo en Europa, de
8,5 × 1020 bacterias lácticas (o 3.400 toneladas) cada año, sin que se les haya asociada con
ningún problema sanitario grave (Chamba y Jamet, 2007).
Los productos fermentados suponen alrededor de un tercio de los alimentos que
consumimos habitualmente. La importancia económica de las fermentaciones a gran escala
en la industria alimentaria ha desterrado la práctica radicional de confiar en las
fermentaciones espontáneas o de utilizar como inóculo una pequeña porción de una
fermentación previa (back -slopping). Estos métodos han quedado relegados en la
actualidad a la obtención de productos fermentados en aíses en vías de desarrollo o para
la elaboración de productos fermentados artesanos, así como en ciertos casos en los que no
se conoce con precisión la sucesión de los microorganismos implicados, en países
desarrollados (Harris, 1998). En los países occidentales la práctica habitual para la
producción a gran escala de alimentos fermentados es el empleo de cultivos in iciadores. En
este caso lo que se añade es un microorganismo, o una
ezcla, seleccionado previamente
por sus características fisiológicas y metabólicas. Así, se logra un estrecho control del
proceso de la fermentación y de las características del producto fin
evitándose las
grandes pérdidas económicas derivadas de fermentaciones fallidas o anómalas. Un grave
inconveniente asociado a esta práctica es que con frecuencia los productos fermentados
industriales carecen de las propiedades organolépticas que caracterizan a los productos
11
artesanos elaborados sin empleo de cultivos iniciadores y que son tan apreciadas por los
consumidores (Caplice y Fitzgerald, 1999).
Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos activos frente a otras bacterias
generalmente próximas filogenéticamente a la cepa productora. Debido a su naturaleza
peptídica las bacteriocinas pueden ser degradadas por
nzimas digestivas, resultando
inocuas para el hombre y su microbiota intestinal. Además, sus propiedades fisicoquímicas
confieren a estos compuestos resistencia a los tratamientos térmicos y gracias a su pequeño
tamaño pueden difundir con relativa facilidad en los a imentos. Las bacteriocinas de las
bacterias lácticas presentan un gran interés para su uso en quesería como bioconservantes.
La nisina, producida por algunas cepas de lactococos,
la más estudiada y se emplea
actualmente como conservante en más de 40 países (Rodríguez, 1996).
Existen numerosas bacteriocinas producidas por bacterias lácticas y cada una de ellas
exhibe un espectro de inhibición particular. Algunas inhiben únicamente el crecimiento de
cepas relacionadas taxonómicamente con la cepa product
como las lactococinas A, B y
M, activas solamente frente a Lactococcus (Ross et al., 1999). Otras bacteriocinas, en
cambio, inhiben a un amplio rango de bacterias, si bien es cierto que la acción inhibitoria
de las bacteriocinas producidas por bacterias Gramposi vas suele restringirse a otras
bacterias Gram-positivas. Con respecto a las bacterias Gram-negativas, los mohos y las
levaduras, las bacteriocinas de las bacterias lácticas tienen difícil el acceso a su lugar de
acción, la membrana plasmática. Existen algunas excepciones a este comportamiento
general. Así, la nisina A es activa frente a diversas bacterias Gram-negativas de
importancia médica, como Campylobacter , Haemophilus, Helicobacter o Neisseria (MotaMeira et al., 2000). Además, la congelación, el calent miento suave, la exposición al ácido
12
láctico y/o EDTA o la presión hidrostática facilita la actuación de las bacteriocinas sobre
otras bacterias Gram-negativas (Kalchayanand et al., 1992; Stevens et al.,
92;
Kalchayanand et al.,1998; Arqués et al., 2005).
La producción de bacteriocinas es una característica m y extendida y conservada entre las
bacterias. Esto indica que es un rasgo ventajoso para
bacteria productora, ya que le
permite adquirir una posición dominante en un determinado nicho ecológico al e liminar a
otras bacterias competidoras (Deegan et al., 2006). A
ferencia de las bacteriocinas de la
clase I, que tienen un espectro de acción bastante amplio, en la clase II suele ser más
limitado. Una de las posibles razones quizá sea la necesidad de un receptor en la bacteria
sensible. Es preciso aclarar que la sensibilidad depen
de la especie e incluso de la cepa.
Merece la pena destacar que las mismas concentraciones de esta bacteriocina no tienen
ningún efecto en diversas especies que frecuentemente forman parte de cultivos
iniciadores, como las del género Lactococcus (Eijsink et al., 1998; Guyonnet et al.,2000).
Con respecto a las bacterias Gram-negativas, sus cubiertas celulares impiden el acceso de
las bacteriocinas a la membrana plasmática. Sin embargo, es suficiente alterar la
permeabilidad de sus membranas externas para permitir
bacteriocinas. Uno de los ejemplos más clásicos es el
acción antibacteriana de las
l quelante EDTA, que une
iones magnesio del lipopolisacárido y altera la membrana externa de las bacterias
Gramnegativas, permitiendo el paso de las bacteriocinas (Stevens et al., 1991). Este modo
de acción también explica que las bacterias Gram-negativas sean sensibles a las
bacteriocinas después de haber sido sometidas a algunos nuevos métodos de conservación
que debilitan o forman poros en sus cubiertas celulare
como las altas presiones
hidrostáticas (Kalchayanand et al.,1998).
13
Es muy difícil comparar la actividad de unas bacteriocinas con otras porque, aunque se han
realizado muchos ensayos, las condiciones empleadas son difícilmente comparables. Por
otra parte, a pesar de la homología entre las secuencias de las bacteriocinas de la familia de
la pediocina, existe variabilidad tanto en la especificidad de las bacterias sensibles como en
la intensidad de su actividad (Eijsink et al., 1998; F mland et al., 1996; Richard et al.,
2006). Este hecho se ha relacionado con las diferencia que existen en las secuencias de
estas bacteriocinas (Johnsen et al., 2005).
Combinar el empleo de bacteriocinas con otros métodos de conservaci
(control de pH,
temperatura, sal, altas presiones hidrostáticas, pulsos eléctricos o condiciones de
almacenamiento) si se considera como una opción muy prometedora (Deegan et al., 2006;
Muriana, 1996; Stiles, 1996). Esta estrategia, conocida como “siste a de barreras
múltiples” o “teoría de los obstáculos”, podría compatibilizar la obtención de alimentos
más seguros con una reducción considerable de las cantidades de aditivos químicos y/o de
la intensidad de los tratamientos tecnológicos (Leistner, 1992). De este modo, podríamos
disponer de alimentos que conservan mejor sus propiedades nutritivas y organolépticas, al
tiempo que tienen una excelente calidad higiénica que les permite tener una larga vida útil.
Cabe destacar que se ha comprobado, mediante experimentos realizados in vitro, que
cuando L. monocytogenes se somete a estrés osmótico (6,5% NaCl, w/v) se hace i sensible
a la acción de la bacteriocina. Igualmente la bacterio
bacterias sometidas previamente a estrés térmico con t
a era mucho menos activa sobre
eraturas de refrigeración (5ºC)
(Jydegaard et al., 2000). Se desconoce si estos efectos son debidos a cambios en la
14
conformación de la bacteriocina, a la dificultad de la interacción electrostática entre la
bacteriocina y la membrana bacteriana o a cambios en l cubierta celular de las bacterias.
Sería interesante comprobar si esos resultados son ext polables en la práctica a los
alimentos, dado que es muy común en la industria alimentaria aplicar refrigeración y
adicionar sal en muchos productos. Es posible que la limitada acción antibacteriana que
generalmente se observa durante la aplicación de bacte iocina en productos alimenticios
concretos se deba, al menos en parte, a que casi siempre se hace en combinación con el
empleo de refrigeración.
Ya en la primera aplicación de la bacteriocina a sustratos alimentarios se indicó que el
ácido láctico, que se encontraba de forma natural en los productos lácteos que se estaban
ensayando, tenía un efecto sinérgico con la bacteriocina (Pucci et al., 1988). Los ácidos
orgánicos y sus sales, sobre todo cuando el pH del ali
to es ácido, son muy efectivos
potenciando la actividad de las bacteriocinas. En un m
cido aumenta la solubilidad de
las bacteriocinas, y por tanto su capacidad para difundir, y se podría facilitar su
translocación a través de la pared celular al aumentar la carga neta de la molécula (Gálvez
et al., 2007). La acción sinérgica de las bacteriocinas y diversos ácidos orgánicos se ha
puesto de manifiesto en varios alimentos, como por ejemplo productos cárnicos, queso y
hortalizas (Barakat y Harris 1999; Bari et al.2005; Uhart et al.2004).
En este contexto de barreras múltiples, también se han empleado conjuntamente varias
bacteriocinas, con la idea de reducir la cantidad de cada una de las bacteriocinas y, al
mismo tiempo, impedir la aparición de bacterias resist tes (aunque esto último sea
dudoso). De las distintas combinaciones ensayadas cabe destacar que la pediocina PA-1
15
sue le tener un efecto sinérgico con bacteriocinas de otras clases (nisina, lactacina 481,
lactacina F y lactacina B), por lo que sería factible
plear como bioconservante una
mezcla de distintas bacteriocinas (Mulet-Powell et al.,1998). El mismo efecto se ha
comprobado no sólo in vitro, sino también en un sustrato alimenticio, carne, con na
mezcla de una bacteriocina de la clase IIa (enterocina CRL35) y otras pertenecientes a
otras clases: nisina y lactocina 707. El empleo conjunto de estas tres bacteriocinas impidió
la aparición de células resistentes en L. monocytogenes y L. innocua (Vignolo et al., 2000).
Los alimentos conservados mediante la aplicación de tr tamientos térmicos también se
podrían beneficiar de la actividad de las bacteriocinas desde el punto de vista de los
sistemas de barreras múltiples. Las bacterias que han
sometidas a un tratamiento
térmico son más sensibles a la acción de las bacteriocinas, como se ha demostrado para la
nisina (Kalchayanand et al., 1992). Y, al contrario, la acción de algunas bacteriocinas
reduce la resistencia térmica de las bacterias (Boziaris et al.1998). Es decir, el empleo
conjunto de bacteriocina y un tratamiento térmico perm iría reducir la intensidad de este
último, lo que se traduciría en una mínima modificación de las propiedades sensoriales del
alimento al tiempo que se logra una calidad microbiológica adecuada. Las bacteriocinas
también podrían ofrecer una protección adicional frent
a la proliferación de las
endosporas que sobreviven al tratamiento térmico (Galvez et al., 2007).
El empleo de las bacteriocinas como una barrera adicional con métodos de conservación
no térmicos (aplicación de altas presiones hidrostátic s y los pulsos eléctricos de alta
intensidad) permitiría disminuir la intensidad de dichos tratamientos y/o contrarrestar el
efecto protector del alimento. Además, como uno de sus puntos clave de actuación es la
membrana celular, cuya integridad dañan, se potencia l
eficacia bactericida de las
16
bacteriocinas, que llegan a destruir incluso bacterias Gram-negativas como, por ejemplo,
E. coli, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhymuri m y Serratia liquefaciens
(Kalchayanand et al., 1994). Por otra parte, estos inv tigadores han comprobado que el
efecto sinérgico de la combinación de pediocina PA-1 y nisina se potencia en gran medida
cuando se emplean con altas presiones, siendo efectivo in vitro incluso frente las esporas
de Clostridium que han germinado por las altas presiones (Kalchayanan et al., 1998;
2004).
A pesar de los resultados satisfactorios que se obtienen al añadir la bacteri cina más o
menos purificada a los alimentos, tanto desde el punto de vista legal como desde el
económico, una opción más interesante es la adición de un cultivo productor de la
bacteriocina, bien como cultivo iniciador o como adyuvante. Así tendríamos un
ucto
dotado de su propio sistema de conservación, como si f era una fábrica “viva”, y sin
necesidad de aprobación legal. De hecho, ésta es la aplicación que ha aglutinado una gran
parte de la investigación realizada en los últimos años (Drider et al., 006). Por supuesto,
se ha de escoger el cultivo adecuado para cada aplicac ón, teniendo en cuenta las
peculiaridades de cada producto y, además, controlar q
su metabolismo no modifique
indeseablemente las características del producto final.
En los productos cárnicos fermentados una opción relativamente sencilla sería emplear un
cultivo iniciador que posea la capacidad de producir b
eriocina. La fermentación y el
descenso del pH (pH < 4,9), y el secado en el caso de los productos curados, controla en
cierta forma el crecimiento de L. monocytogenes . La bacteriocina producida in situ por el
cultivo iniciador a lo largo de la fermentación contribuiría adicionalmente a obtener un
producto seguro, especialmente en aquellos casos en los que no se llegasen a alcanzar esas
17
condiciones (Baccus-Taylor et al., 1993; Berry et al., 1990; Foegeding et
., 1992). Sin
embargo, muchas de las bacterias que producen bacteriocinas de la clase IIa no son
adecuadas para llevar a cabo las fermentaciones tradicionales porque n
tienen la
capacidad de producir ácido láctico con rapidez (Drider et al., 2006).
Se debe resaltar que el empleo de las bacteriocinas casi siempre se ha enfocado desde el
punto de vista de la seguridad microbiológica, pero no se debe olvidar el posible p el que
pueden jugar para controlar el crecimiento de bacterias alterantes o incluso mejorar sus
propiedades sensoriales. Como ejemplo de esto último,
comercializa un cultivo
liofilizado de P. acidilactici (Choozit™ Lyo. Flav 43), recomendado como cultivo adju o
en la elaboración de queso Cheddar y otros tipos semid os, para acelerar y potenciar los
rasgos aromáticos gracias a la producción de bacteriocinas (Deegan y col, 2006).
Aunque las bacteriocinas producidas por las bacterias ácticas son muy interesantes para la
bioconservación de los alimentos, su eficacia y/o la de las cepas productoras puede verse
seriamente comprometida por diversos factores. Entre ellos se incluye el que su espectro de
acción en algunas ocasiones puede ser bastante reducido, la incapacidad de obtener buenos
protocolos de purificación que permitan unos rendimien os aceptables, la aceptabilidad de
la cepa productora como microorganismo QPS, la adaptab lidad de la cepa
bacteriocinogénica a diferentes sustratos alimentarios o la posibilidad de aparición de
bacterias resistentes (Rodríguez et al., 2002b).
Algunas bacterias lácticas, como L. lactis, son muy versátiles y su potencial ha aumentado
notablemente en los últimos años como resultado de los recientes a ances en la
estabilización de genes heterólogos y en el control de su expresión, así como con la
18
secuenciación completa de su genoma (Le Loir et al., 2005). De hecho, ya se ha descrito la
producción heteróloga a escala industrial de una proteína (la lisos afina, con actividad
antibacteriana) en L. lactis, comprobándose que el escalado, la producción y el posterior
procesado del producto eran simples y permitían obtener una proteína muy purificada y
con actividad biológica (Mierau et al., 2005).
La producción de nisina y el crecimiento de L. lactis está determinado por las condiciones
de cultivo en periodos de tiempo de 24 horas, temperat
22 °C, pH entre 5.8 – 8.2 y
concentraciones de NaCl 0-6% p/v. Se demostró que la actividad antimicrobial de 50
I.U./ml de Nisina disminuyó con la presencia de NaCl, con un mínimo efecto inhibitorio
entre 2 y 4% de NaCl. La actividad antimicrobiana sobre Listeria monocytoge es se
caracteriza por la modificación de los parámetros de crecimiento como la
crecimiento de y el tiempo lag, que fueron estimados m
Gompertz
tasa de
iante el modelo matemático de
(Lebois, et. al, 2004). En relación a bacterias esporuladas como Bacillus
licheniformis se observó que su crecimiento en leche a 37 °C es favorable, sin embargo
concentraciones subletales de nisina (30 IU/ml) actúa
totalmente la germinación
de las esporas y células vegetativas a pH 6.0, sin posibilidad de remontar el crecimiento
después de 7 días a 37 °C. (Mansour, 1999). Cuando se refiere a patógenos como
Staphylococcus aureus presente en quesos experimentales con pH 5 y acidez 0.53%.
la
nisina inhibió el crecimiento de la bacteria, mientras que en el queso control el crecimiento
fue de cinco ciclos logarítmicos (100.000UFC/g) a los siete días de almacenamiento
(Maldonado, 2007). En otro estudio se vuelve a reiterar el efecto inhibidor de la nisina
sobre el mismo patógeno cuando interactúa la la bacteriocina con un quelante EDTA y la
concentración de ácido láctico 2 mg%. (Marquez, 2007).
19
Así mismo los componentes de los sustratos que se encu ntran incorporado en los medios
de cultivo también pueden afectar la producción de nisina. Comparativamente los
compuestos proteicos solubles presentes en el medio de MRS permitieron obtener menor
cantidad de nisina comparado con el medio de TYT (Triptona, extracto de levadura y
tween 80), (Parente, 1992).
Existiendo una variedad de factores que intervienen en el crecimiento de Lactococus lactis
y que estos factores repercuten en la producción de la nisina. Muchos
ores proponen
diversos modelos matemáticos para explicar y obtener p rámetros constantes del
crecimiento de dicha bacteria, sin embargo las respuestas que se obtiene no siempre tiene
sentido biológico sino matemático. El mayor atributo de un modelo es p
ecir el evento
biológico con una elevada correlación con la realidad. En este aspecto existen
modelamientos del incremento de la biomasa de acuerdo
una ecuación logística, el
consumo de sustrato asociado al mantenimiento del metabolismo (no crecimiento) y
cinética del metabolito primario para la producción de bacteriocina. Lejeune (1998)
estableció un modelo empírico simple que examina el cr
ento y la producción de
bacteriocina en diferentes condiciones. Los parámetros estimados fueron obtenidos a artir
de una fermentación con 20 g.l-1 (p/v) que podría ser usado para predecir la evolución de la
masa celular seca, concentración de glucosa y concentraciones de ácido láctico de
fermentaciones estructuradas con 5, 30, 40 y 60 g l-1 de glucosa inicial, operando a
temperaturas de a 30, 37 and 45 °C. El modelo ajustó
datos experimentales y se pudo
establecer que la tasa específica de la producción de
ina es a 30 °C y las mejores
predicciones se realizan entre el rango de 30 a 37 °C. Wenhua (2002) varió el uso de
sustrato con la sacarosa y propuso un modelo matemático que pueda describir el proceso
de fermentación utilizando 6, 7, 8 y 10 g l– 1 h–1 , de sacarosa por Lactococcus lactis subsp.
20
Lactis y su producción de nisina, determinando que existe un incremento del 58% de la
producción de nisina cuando se alimenta el bach con 7 g l–1 h–1 La biosíntesis de nisina se
vio afectada por la sacarosa residual. Finalmente, el modelo matemático fue desarrollado
para simular el crecimiento celular, el consumo de sac
a, la producción de ácido láctico
y la producción nisina. El modelo fue capaz de describir el proceso de fermentación en
todos los casos.
El modelo primario de Gompertz viene siendo utilizado como preferente par simular el
crecimiento bacteriano y producción de metabolitos pri
ios y secundarios. El modelo de
Gompertz fue utilizado para evaluar el crecimiento de bacterias lácticas y producción de
bacteriocinas bajo la influencia del pH, temperatura y medio de cultivo. Los resultados
indican que el medio de cultivo y la temperatura tuvie on un dramático efecto sobre la
producción de bacteriocinas y las condiciones óptimas de ésta producción fueron diferent s
a las condiciones óptimas del crecimiento. Se demostró que el descenso del pH del medio
de cultivo fue paralelo al crecimiento. Las condiciones óptimas de la producción de nisina
en caldo MRS es pH inicial 6 y temperatura de 37 °C y en el medio de LAPTg después de
6 horas de cultivo a 37 °C, pH inicial de 6.8. (Juarez. 2002).
Poschet (2005) propuso un nuevo modelo para estimar el crecimiento bacteriano, en
contraste con los modelos logísticos comúnmente utilizados porque incorpora a su modelo
los efectos que inducen al establecimiento de la fase stacionaria que le atribuye a la
inhibición del crecimiento por la formación de product
tóxicos y el modelo lo describe
como una función de la evolución del pH y además por un agotamiento del sustrato. El
modelo es llamado P-Model es aplicado de manera eficiente al crecimiento de Listeria
21
inocua en cocultivo con Lactococcus lactis mediatizados por la producción de ácido
láctico.
III. MATERIALES Y METODOS
El universo y la muestra se caracterizan por ser de la misma dimensión y ambas están
determinado por todas las células de Lactococcus lactis contenidas en un cepario.
3.1.1. MATERIALES
3.1.1.1 EQUIPOS
Refrigeradora congeladora, 15 pies 3
Baño de agua, 15 l capacidad
Estufa Incubadora, Temperatura máxima 65 ºC sensibilidad 1 ºC
Estufa Esterilizadora, Temperatura máxima 250 ºC, sens bilidad 1 ºC
Potenciómetro, rango de pH 1 – 14
Contador de colonia, Amplitud 15X
Centrifugadora 5,00 g
3.1.1.2 MATERIAL DE VIDRIO
Frascos de cultivo microbiológico de 2 L capacidad
Placas petri 15 cm diámetro
Tubos de ensayo 20x200 c/tapa rosca
22
Tubos de ensayo 15 x 100
Tubos de centrífuga cónico graduados 1/10 con tapa
Pipetas de 10 mL div. 1:10
Pipeta 1 mL, div 1: 10
3.1.1.3 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
Caldo MRS (Oxoid)
Agar MRS (Oxoid)
Agar BHI (Oxoid)
Agar Agar (Merck)
3.1.1.4 MATERIAL BIOLOGICO
Cepa experimental: Lactococcus lactis
Cepa sensible a bacteriocina: Lactobacilus innocua
3.1.2. METODOS
Microorganismo y medios de cultivo
Se ha considerado como cepa experimental a La ct o coc cu s la ct is subsp. la ct is la cual
posee la capacidad de sintetizar nisina. Para efectos de medir la actividad biológica de la
nisina se utilizó como organismo Indicador sensible a nisina a Lactobacilo innocua cuya
respuesta de su crecimiento sirvió para cuantificar los niveles de
actividad de la
bacteriocina .
A partir de las cepas que se encontraban conservadas en congelación a -20 °C en Agar
MRS y
Agar BHI (Meck) y ambas conteniendo 25% (vol/vol) de glicerol como un
23
crioprotector, sirvieron para obtener cultivos frescos. Para el uso experimental las cepas
fueron reactivadas por dos veces 30 °C por 12 horas en caldo MRS, antes de su uso en los
experimentos.
Para la cuantificación de las células se utilizó caldo MRS (MerK) que se modificó a agar
MRS añadiéndole 1.5% (p/v) de agar (Oxoid).
Para la valoración de títulos de bacteriocina se utilizaron sobrecapas de agar que se
prepararon usando 0.7 % de agar. (p/v).
Para establecer las condiciones de esterilidad de los
edios de cultivo y otras soluciones
requeridas todos ellos fueron esterilizados a 121°C por 20 minutos.
Las fermentaciones se realizaron en Frasco de 2000 mL estériles con un volumen de
trabajo de 1000 mL de caldo MRS estéril.
Se realizaron una serie de fermentaciones in vitro usando caldo MRS con 20 g de glucosa
por litro, complementado con concentraciones diferente de NaCl (0, 2, 4, y el 6 % [p/v])
para investigar sus efectos tanto sobre el crecimiento como sobre la producción de
bacteriocina de L. lactis. Todas las fermentaciones se realizaron por triplicado para mostrar
la reproductibilidad de los experimentos.
Preparación del inóculo
El inóculo fue preparado utilizando un cultivo fresco de L. lactis en caldo MRS obtenido
en fase logarítmica que corresponde a un tiempo de 8 horas de cultivo a 30 ºC. Bajo estas
24
condiciones, 10 ml de caldo MRS fueron inoculados con 0.5 ml de L. lactis, obtenido de
un cultivo reciente y luego fue incubado a 30°C por 12 h para alcanzar su máximo
crecimiento. Luego, 5 mL de este precultivo es añadidos a 100 ml de caldo MRS. Después
de 12 horas de crecimiento a 30°C, este cultivo fue usado como inóculo primario.
El inóculo definitivo consistió en tomar volúmenes suficientes hasta alcanzar una
equivalencia del nivel 0.5 de la escala McFarland. (1,5x109 u.f.c/mL). De esta solución se
tomaron volúmenes necesarios diluidos con suero fisiológico estéril para obtener
finalmente el inóculo experimental correspondiente a 103 ufc/mL aproximadamente, el
cual fue inoculado en los frascos de fermentación.
De las fermentaciones
Se utilizaron 12 frascos de 2000 mL de capacidad en condiciones de esterilidad a los
cuales se les adicionó 1000 mL de caldo MRS estéril con 20 g de glucosa. Los frascos se
dividen en 4 grupos o Tratamientos, con 3 unidades de
etición, caracterizados de la
siguiente manera:
Grupo 01: Caldo MRS glucosado sin adición de NaCl.
Grupo 02: Caldo MRS glucosado + 2 % NaCl [p/v]
Grupo 03: Caldo MRS glucosado + 4 % NaCl [p/v]
Grupo 04: Caldo MRS glucosado + 6 % NaCl [p/v]
A cada uno de los frascos de cultivo el grupo 01 se les inoculará 1 mL del inóculo
experimental en la cual se estima un aproximado de Log UFC/mL iniciales de 103.
Inmediatamente después de la inoculación los frascos se agitarán de manera suave asta
25
lograr una homogenización completa de las células en el medio de cultivo. Los frascos se
dejarán incubando a 30 ºC por un periodo de 24 horas.
Antes de llevar los frascos a incubación a 30 ºC se obtendrá de cada uno de ellos y en
forma aséptica una muestra de 10 mL, considerándose a ésta como tiempo cero (t=0).
Luego los frascos son trasladados a incubación y a int
alos de 2 horas, de cada frasco de
fermentación se retiraron 10 mL. De esta muestra se utilizó 0.1 mL para determinar las
Unidades Formadoras de Colonias (UFC/mL) estimado por iembra por inmersión en
placa.
La biomasa o masa seca celular (CDM) se determinó por gravimetría después de filtrar 5
ml del cultivo por membranas de acetato ? 22µ.
Los niveles de actividad de la bacteriocina soluble en una suspensión libre de células
(CFS) se determinaron por el método de dilución crítica usando como cepa indicadora a
Lactobacillus innocua. Se utilizaron 2 mL del medio de cultivo fermentado que se
homogenizaron con 1 volumen de HCl 0.04 N y luego fue calentado a 98ºC durante 5 min.
Las muestras se centrifugaron a temperatura ambiente para luego recoger los
sobrenadantes. Una vez neutralizados, se analizarán mediante el test d difusión en agar.
Las concentraciones de ácido láctico se medirá, neutralizando 9 ml del cultivo con NaOH
0.1 N en presencia de una solución alcohólica de fenolftaleína al 1% como indicador; los
resultados se expresarán como porcentaje de ácido láctico producido.
Las concentraciones residuales de glucosa serán cuanti icadas por métodos de
determinación enzimática para glucosa (Kit MercK).
Del mismo modo que se opera con el Grupo 01, se procederá con el resto de grupos.
26
Para determinar el efecto de factor de inducción añadido (IF), dos fermentaciones
adicionales se ejecutarán una de ellas será usando caldo 1000 mL de caldo MRS con 6 %
(p/v) de NaCl estéril a una temperatura controlada de
°C y pH constante de 5.5 y otra
fermentación se realizará en las mismas condiciones de sustratos a una temperatura
controlada de 22°C y un pH constante de 5.4. Después de 24 horas de crecimiento, las
células serán retiradas por centrifugación (2,500 g y
C durante 30 minutos). 50 mL del
supernadante libre de células (CFS), que se asumirán una actividad de 1,600 Unidades
arbitrarias [AU] ml-1 de bacteriocina, serán usadas como una fuente de FI para la primera
fermentación que contiene 1000 mL de caldo MRS. Esta fermentación que usará el CFS
también será ejecutada por triplicado, y sus desviacio es estándar serán calculadas.
Como una fuente alternativa del IF, un precipitado de acteriocina y asumiendo que éste es
un factor de inducción, se preparará de la manera siguiente. El pH del CFS fue ajustado a
6.5, luego se añadirá 300 g de sulfato de amonio por litro (saturación del 48 %). La
suspensión se agitará mecánicamente a 4 ºC por 12 horas. Luego se centrifugará a 20,500 g
y 4°C durante 30 minutos, el sedimento será cosechado y disuelto en buffer fosfato de
sodio 50 mM a pH 6.5 (5 ml por litro de CFS). La segunda fermentación se realizará
añadiendo 1.5 ml de la solución de proteína (represent do por el precipitado de sulfato de
amonio; biocina con una actividad de 153,600 AU ml-1) al fermentador (1.0 litro de caldo
MRS).
Del Modelado primario y secundario
El modelado primario del crecimiento celular, consumo e glucosa, producción de ácido
láctico, y la producción de bacteriocina se realizarán ajustando los datos según la ecuación
27
propuesta para el crecimiento celular y de esta manera determinar los valores de los
parámetros biocineticos del crecimiento y producción d bacteriocina. El modelo primerio
corresponde a la ecuación de Gompertz modificado: Y=a+c*exp(-exp(-b*(x-d))).
Donde:
Log N es logaritmo decimal del número de microorganismo
tiempo t,
A es el valor asintótico cuando el tiempo decrece indefinidamente (aproximadamente
equivalente al logaritmo decimal del número inicial de microorganismos),
C representa el incremento en el logaritmo del número e microorganismos cuando el
tiempo se incrementa indefinidamente (número de ciclos de crecimiento),
B es la velocidad de crecimiento máxima relativa al ti mpo M
M es el tiempo requerido para alcanzar la máxima velocidad de crecimiento.
Las abreviaturas para parámetros biocinéticos represen ativos del crecimiento y la
producción de la nisina y las ecuaciones utilizadas qu se detallan en párrafo siguiente,
según los reporta Messens et al (2002), excepto que la ecuación pa a la producción de
bacteriocina fue elaborada dependiendo de XB , definido como la mínima concentración de
biomasa requerida para el inicio de la producción de b
eriocina debido a la inducción.
Las fermentaciones se realizarán por triplicado, se calcularán las desviaciones estándar
para todos los parámetros biocinéticos estimados vía el modelo primario.
Las ecuaciones serán integradas usando el Programa Curve expert v. 1.4.
Mediante el empleo de modelado secundario, todos los p rámetros biocineticos (µ max,
Xmax, n, YX /S , ms, YL/S , el kB , y k inact), extraídos del modelo primario, serán expresados
28
como funciones de la concentración de sal. Por esta razón, se emplearan los modelos
empíricos. Las Desviaciones estándar serán calculadas
donde se requiera necesario
hacerlo.
Ecuaciones usadas para el desarrollo de los modelos primarios:
Modelo
Ecuación
Crecimiento celular
dX/dt = {µ max [1 - (X/X max)]n - a } X
Cuando t >?
Modelo secundario para el Consumo
dS/dt= - [(1/YX/S )(dX/dt)] - mSX
de Glucosa
Modelo secundario para la
dL/dt= - (YL/S)(dS/dt)
Producción de ácido láctico
Modelo secundario para la
dB/dt = [( k B)( dX/dt)] - [(k inact)( XB )]
Producción de Bacteriocinas
Cuando X > XB
Abreviaturas:
X
Concentración de biomasa (en gramos [CDM] por litro)
t
Tiempo (en horas)
?
Duración de la fase lag (en horas)
µ max
Tasa máxima específica del crecimiento (en h-1)
X max
Concentración de biomasa máxima alcanzable (en gramos CDM] por litro)
n
Inhibición exponencial
a
Índice de mortalidad específica (en h-1)
S
Concentración residual de glucosa (en gramos de glucosa por litro);
29
YX/S
Coeficiente de producción celular (en gramos [CDM] por gramo de glucosa);
ms
Coeficiente de mantenimiento (en gramos de glucosa por gramo de CDM por
hora)
L
Producción de ácido láctico (en gramos de acido láctico por litro);
YL/S
Coeficiente de producción para la conversión de glucosa en ácido láctico (en
gramos de ácido láctico por gramo de glucosa)
B
Actividad de bacteriocina soluble (en AU por litro)
kB
Producción específica de bacteriocina (en AU por gramo de CDM);
k inact
Tasa aparente de inactivación de bacteriocina (en litros por gramo de CDM por
hora)
X B’
Concentración mínima de biomasa para el inicio de pro ucción de bacteriocina
(en gramos [CDM] por litro).
3.1.3 ANÁLISIS EXPERIMENTAL
La bondad de ajuste de los modelos se evaluar on mediante los valores del coeficiente de
determinación (R2 ) de cada ajuste. Cuánto más cercano a 1 es el valor de R2 y más bajo el
valor de RMSE, mejor ajusta el modelo.
El efecto de las concentraciones de cloruro de sodio y producción de nisina se utilizaó el
diseño de Análisis de varianza con tres repeticiones y un nivel de confianza de 95%.
30
IV. RESULTADOS
1. Se obtuvo la curva de crecimiento de Lactococcus lactis sub sp. lactis en cultivo en
caldo MRS glucosa 20% en un periodo de tiempo de 24 ho as, a una temperatura de
30 ºC por un periodo de 24 horas, utilizando 13 iteraciones de tiempo. Los valores
de Log UFC/mL de la curva de crecimiento se ajustaron aplicando el modelo de
Gompertz
modificado
cuya
expresión
es:
a+c*exp(-exp(-b*(x-d))),
Y=
obteniéndose los parámetros de crecimiento que se mues an en la tabla Nº 1. La
bondad de ajuste permite decidir que el ajuste de la curva al modelo de Gompertz
modificado es suficiente el cual está representado por un coeficiente de
determinación de 99.8%.
2. La figura Nº 2 representa el crecimiento celular expresado por la Biomasa /X=g/L)
obtenida en caldo MRS glucosa durante el periodo de 24 horas. Se destaca que la
ecimiento específico (µ max)
Xmax alcanza un valor de 2.88 g/L cuando alcanza una tasa
de 0.30 Log UFC/mL/h, según el modelo primario. El modelo de Gompertz adapta con
elevada bondad de ajuste los datos experimentales obtenidos con el 99% de validez
estadística. Tabla Nº 2.
3. El consumo de Glucosa durante los ensayos experimentales de fermentación se
observa en la Figura Nº 3, reportando un consumo prome
de 18. 99 ± 0.46 g/L,
que relacionado a la concentración de biomasa se deter ina el Coeficiente del
rendimiento celular (Y(X/s) = g/L) que alcanza un valor de 0.15 g X/g S/L. Así
mismo el coeficiente de mantenimiento (ms) y el coeficiente del rendimiento celular
(YX/S) alcanzan valores de 0.27 g Glu/gXmax /h
y
0.11 g Xmax/gGlu;
respectivamente. Tabla Nº 3
31
4. La producción de ácido láctico a partir de la glucosa
orporada al medio de
cultivo se encuentra graficada en la figura Nº 4, en la cual se observa que la
concentración final de produccíon de ácido láctico es
e 16,05 g/L, con un
coeficiente de conversión de 0.84.Tabla Nº 4.
5. La Figura Nº 5 grafica el modelamiento de la producción de la nisina destacando
que la máxima concentración es de 2.12 UA/L en un periodo de 14 horas, con una
producción específica de 0.74 AU/gXmax, requiriéndose de una concentración mínima de
biomasa de 0.0015 gXmax/L para iniciar la producción de nisina. Tabla Nº 5.
6. La adición de cloruro de sodio al 2% (p/v) no afectó el valor de µmax. Comparando
éste parámetro de crecimiento con el del control no existe diferencia
estadísticamente
significativa
Fc (n:3;a :0.0 5):3.22>Ft:3.47.
Figura
Nº
6.
Concentraciones de sal por encima del 2% afecta la tasa de crecimiento específica
(b ó µ max) disminuyéndola en forma lineal, (Fc (n:3 ;a :0.05) :6.44>Ft: 3.47). Del mismo
modo, el tiempo que se tarda en alcanzar la máxima tasa de crecimiento (M) para
valores de cloruro de sodio menores del 2% es de 5.14 oras y el control 4.91 horas
y a concentraciones mayores del 2% el incremento es mayor.
7. El modelamiento de la actividad de la bacteriocina pre ente en el sobrenadante libre
de células frente a varias concentraciones de cloruro e sodio está representado en
la figura Nº 7. La actividad de la Nisina con adición del 2% de sal no se modifica
sustancialmente sus parámetros cuando se compara con el cultivo que no contiene
sal.
(Fc (n:3 ;a :0.05):4.36>Ft:3.47).
Concentraciones
mayores
al
2%
afectan
32
drásticamente la actividad de la biocina, demostrándose que la adición de 6% de sal
determina que el Bmax alcance un valor de 0.38 AU/L y consecuentemente disminuye
el valor de producción específica de nisina (KB ) a 0.14 AU/gX max. Tabla N 7,
Cuando se adiciona 2% de sal, la cantidad mínima de bi
a que se requiere para
iniciar la producción de nisina es de 0.42 g/L. El uso de mayores concentraciones
de sal como 6% obliga a utilizar concentraciones de biomasa equivalente a 1.12 g/L
8. Los datos derivados de los experimentos de fermentación fueron analizados a fin de
caracterizar cinéticamente el proceso y proponer estra egias para mejorar su
desempeño empleando modelos primarios como el de Gompertz modificado que se
ocupa de la descripción de los cambios del número microbiano en función del
tiempo. Por otro lado se propusieron modelos secundarios con la finalidad de
permitir evaluar cómo dos o más factores interactúan so
el crecimiento
microbiano. Dichos parámetros biocinéticos derivados de los modelos primarios
están en la tabla Nº 8. Los datos representan las relaciones entre los parámetros
biocinéticos y el efecto del cloruro de sodio.
Los resultados expuestos son elementos que permiten aceptar la hipótesis de que el modelo
primario de Gompertz modificado tiene una elevada bondad de ajuste para
atos
experimentales del crecimiento de Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa. Así mismo,
los modelos secundarios permiten estimar el efecto negativo de las concentraciones de
cloruro de sodio mayores del 2% sobre el crecimiento de Lactococus lactis y la producción
de nisina.
33
V. DISCUSIÓN
Las investigaciones en alimentación plantean nuevos retos en seguridad alimentaria. Estos
desafíos deben ir más allá de la vigilancia y el control de la calidad, en respuesta
básicamente a los nuevos métodos de producción agrícola y de novedades alimenticias,
como los denominados alimentos funcionales. Buena part de la labor se centra ahora en
identificar los principales riesgos alimentarios que emergen de los cambios en el sector de
la alimentación. El tema de la presencia de bacterias patógenas en lo alimentos cobra
importancia cuando se trata de su calidad en condiciones naturales o procesados, por tal
motivo se requiere buscar alternativas para el control, inhibición o eliminación de dichos
microorganismos.
La Nisina es efectiva en una gran variedad de productos alimenticios, a través de un amplio
rango de niveles de pH (3.5 - 6.0), como es el caso de la variedad de quesos,; productos de
crema tales como: saborizada, batida, espesa, ácida, etc.; lechería y postres elaborados con
grasa, yogurt y leches saborizadas; preparaciones de frutas y vegetales que incluyen la
pulpa, jugos de fruta pasteurizados, postres y bebidas elaborados con proteína vegetal y
leche de coco; bocadillos (snacks); productos de huevo líquido pasteurizado; salsas de bajo
pH, incluyendo mayonesa y salsas y aderezos salados; sopas y salsas pasteurizadas;
alimentos enlatados; carnes procesadas; procesos de fe
entación y productos de
fermentación tales como la cerveza y alimentos de alto contenido de humedad / reducidos
en grasas.
34
La nisina es un grupo de polipéptidos compuestos por 3 aminoácidos, estrechamente
relacionados, y es producida por ciertas cepas de la bacteria Lactococcus (Streptococcus)
lacticas ssp. La nisina tiene un doble modo de acción antimicrobiana: se une a los
fosfolípidos II con la subsiguiente inhibición de la síntesis de pared celular y también
forma poro en la membrana citoplasmática. La nisina sólo se utiliza como conservante
alimentario y actualmente no tiene ningún uso terapéutico.
Sin embargo, la producción de nisina en condiciones de laboratorio no necesariamente
significa que es efectiva, suficiente y biodisponible en el ecosistema de los alimentos
debido a que en éstos se incluyen factores limitantes, por ejemplo, la disponibilidad de
nutrientes restringida para las células productoras de bacteriocina, la adsorción de las
bacteriocinas sobre las partículas de carne, grasas y
roteínas, y / o la presencia de
proteasas endógenas degradantes de la bacteriocina. Además, la tecnología de
procesamiento de alimentos puede interferir con la capacidad de producción de
bacteriocinas de cultivos iniciadores o cocultivos utilizados como es el caso de embutidos
o salsas.
El crecimiento de Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa fue ajustado mediante el uso
del modelo de Gompertz modificado el cual incorpora cuatro variables obtenidas del
crecimiento en un periodo de 24 horas, siendo ésta la variable independiente. La velocidad
de crecimiento específicao (µ max ) de 0.27 UFC/mL/h indica que el medio de cultivo aporta
nutrientes suficientes para ,mantener el crecimiento en condiciones logarítmicas por
espacio de 6 a 8 horas. El declive de la tasa de crecimiento es debido a la falta de nutrientes
o factores de crecimiento como el extracto de levadura o riqueza de bioelementos; sin
embargo la velocidad de crecimiento hallada esta en concordancia con lo reportado por
35
Valbuena 2005 cuya µ max = 0.31LogUFC/mL/h en cultivos con leche fresca. Del mismo
modo Castro, 2008 ; reporta un valor de 0.29 LogUFC/mL/h en leche. Estos resultados
confirman que los datos experimentales de este estudio fueron bien obtenidos facilitando
su ajuste por el modelo primario de Gompertz.
Se realizaron fermentaciones en caldo MRS glucosa con la adición de cloruro de sodio en
los niveles de 2, 4, y 6%, observándose que la sal afecta el crecimiento de Lactococcus
lactis y del mismo modo la producción de bacteriocinas. En el caso de L. lactis , una baja
concentración de NaCl (2%, peso / volumen) no mostró ningún efecto sobre el crecimiento
bacteriano, mientras que la inhibición del crecimiento aumenta linealmente cuando se
utiliza mayores niveles de concentraciones de sal. El efecto negativo de concentraciones
elevadas de sal en el crecimiento de bacterias ácido lácticas (LAB) ha sido reportado por
Dew Vuyst (1996); Rozés (1996), Uguen(1999); así mismo se reporta que bajas
concentraciones de sal (1a2%, en peso/vol) muchas veces puede favorecer el crecimiento
bacteriano, como es el caso de las fermentaciones de vegetales o salsas reportados por
Ganzle (1998), Korkeala (1992), Vignolo ( 1995).
Si bien la sal tiene como propiedad ionizarse en el sistema agua proteínas del medio de
cultivo y que ésta condición que puede afectar el crecimiento, se observa que un nivel del
2% de sal no modifica sustancialmente la tasa máxima de crecimiento específico (µmax) y
concentración máxima de biomasa (X max) de L. lactis. Concentraciones más elevadas si
modifican dichos parámetros debido a que la concentración de solutos en el medio de
cultivo se incrementa generando condiciones de a w menores a las requeridas para la
fisiología del lactobacilo. La disminución de la actividad de agua demanda al lactobacilo
un mayor gasto energético para su mantenimiento; sin embargo la actividad enzimática no
36
se desarrolla en dichos niveles de actividad de agua que establecen las concentraciones de
4 y 6% de sal. Esta situación es poco diferente con el caso de ciertas BAL que resisten
altas concentraciones de sal en procesos fermentativos de carne y hortalizas. Herman
(2009), informa que concentraciones del 2% de sal no modifican la tasa máxima de
crecimiento, siendo ésta de 0.27 UFC/mL/h, compatibles para éste estudio.
Sin embargo, Lactococcus lactis es sensible a la concentración de sal y muestra una
tendencia decreciente de la X max con el aumento de las concentraciones de NaCl debido a
que esta sal interfiere con la eficiencia de la conversión de sustrato en biomasa. Semejante
situación encontró Leroy (1999) en donde el cloruro de sodio afecta el crecimiento y la
producción de nisina de las BAL cuando la fermentación de las salsas se eleva al 6%.
La presencia de ácido láctico y su consecuente modific ción de su pH del medio de cultivo
no afecto los parámetros del crecimiento de Lactococcus lactis porque su producción está
en íntima correlación con el consumo de glucosa y el d senso de la población bacteriana o
muerte celular es pequeña. Serna (2009) encuentra seme antes respuesta con este estudio
fermentando 20 g/L de glucosa y obtiene 13.7 g/L de ácido láctico, explicando que la cepa
Lactococcus lactis ssp. lactis se adapta a ambientes con altas concentraciones de sacarosa y
además es capaz de sobrevivir y replicarse en más altos niveles de estrés, en comparación
con otras cepas productoras de ácido láctico. Además el microorganismo tiene un sistema
enzimático que hidroliza el disacárido y metaboliza la glucosa mediante la vía glucolítica
en ambientes con baja disponibilidad de agua.
Por otro lado, se observó que si bien una concentración de 2% de sal no afecto el
crecimiento de bacterias, si afectó la máxima activida d de la bacteriocina (Bmax ) y se
37
redujo en 10% en relación al cultivo que no tenía sal. Esto se explica por la disminución de
la producción de bacteriocina espec ífica (KB ), aún cuando los valores de X max son
comparables. A mayores concentraciones de NaCl, k B disminuyó aún más. Leal-Sanchez
(2002) reporta que la plantaricina S por L. plantarum, la mayor producción se observa a
una concentración de cloruro de sodio de 2,5% (p/vol). Por otra parte, la producción de
sakacin K por L. sakei CTC 494 se ve afectada negativamente por el agregado de NaCl,
Leroy (1999). Aunque los enterococos son más resistentes a la sal, la producción de las
enterocinas A y B de Enterococcus faecium CTC 492 también se inhibe en presencia de
NaCl (Aymerich, 2000, 2002). Sin embargo, la producción de enterocina se puede
aumentar en la matriz de la carne mediante la adición de una pequeña cantidad de la
bacteriocina, que actúa como un inductor .
Tratando de explicar los efectos de la sal sobre la producción de bacteriocinas es que L.
lactis posee la capacidad de expulsar un péptido denominado Factor de Inducción (IF) y
cuando ésta alcanza una concentración crítica, facilita su unión a su receptor y pronto se
inicia la producción de bacteriocinas. El Cloruro de sodio interfiere al IF para su unión con
su receptor (Nilsen, 1998).
Nilson (2002) atribuye el rol del acetato como factor de inducción para la síntesis de
carnobacteriocina por C. piscicola A9b, la cual se ve afectada negativamente por la adición
de NaCl. Incluso en NaCl concentraciones que no afectan el crecimiento, la inducción de la
bacteriocina disminuye la producción, lo que indica que el aumento de las concentraciones
del inductor son necesarias para mantener la producción de bacteriocinas Nilsen ( 1998).
Glaster 1998, considera que es probable que la adición de sal a l medio de cultivo interfiera
38
con el crecimiento desestabilizando la unión del Factor de Inducción a su receptor
generando el síndrome de fatiga bacteriana y de forma irreversible.
Muchos alimentos se encuentran contaminados con bacterias patógenas que no siempre se
multiplican por la falta de algún factor nutricional determinante. Sin embrago, la naturaleza
del alimento puede servir de vehículo. En otros casos el alimento ofrece todas las
condiciones para su multiplicación. Debido a estas circunstancias se requiere utilizar un
sistema de barrera para evitar el crecimiento bacteriano y es así que se apunta al uso de
bacterias productoras de nisina, como es el caso de Lactococcus lactis , pero para la cual los
parámetros biocinéticos en sustratos complejos no está claramente establecidos, más aún
cuando los factores del entorno no son considerados de manera eficiente. Es allí donde los
modelos matemáticos primarios debidamente elegidos logran un nivel de ajuste de la curva
de crecimiento, como es el caso del modelo de Gompertz modificado, que aportarán
diferentes parámetros biocinéticos para utilizar los modelos matemáticos secundarios
utilizados en este estudio, que estiman valores de crecimiento o productividad de nisina
interaccionando dos o más variables al mismo tiempo sobre el microorganismo. Los datos
obtenidos en este estudio tienden a establecer criterios biocinéticos de Lactococcus lactis
para obtener a escala piloto concentraciones elevadas de nisina y de esta manera lograr su
aplicación masiva en muchos alimentos que se deterioran fácilmente.
Se ha conocido que las condiciones de fermentación y producción de nisina se afectan por
la presencia de cloruro de sodio en concentraciones mayores al 2%. Esta característica
servirá de modelo para predecir los eventos fermentativos en productos elaborados a base
de vegetales y carne.
39
Es esencial comprender los efectos de diferentes factores ambientales relacionados con los
alimentos en la inducción de nisina con el fin de comprender mejor el potencial de
aplicación de esta cepa en la producción de embutidos fermentados. El potencial de esta
cepa puede ser ampliado considerablemente si se logra manipular el Factor de Inducción
(IF) para alcanzar un nivel más alto de la producción de bacteriocina en condiciones
desfavorables. Se recomienda investigar el uso de licor de diversos procesos fermentativos
en donde se puede encontrar el factor de Inducción y de esta menra obtener mejores
resultados
40
VI. REFERENCIALES
1. Abee T., Krockel L. y Hill C. (1995) Bacteriocins: modes of action and potentials
in food preservation and control of food poisoning. Int. J. Food Microbiol., 28:
169-185.
2. Arqués, L., Rodríguez, E., Gaya, P., Medina, M., Nuñez, M. 2005. Effect of
combinations of high pressure treatments and bacteriocin-producing lactic acid
bacteria on the survival of Listeria monocytogenes in raw milk cheese. Int.Dairy J.
15: 893-900.
3. Aymerich, M. T., M. G. Artigas, M. Garriga, J. M. Monfort, and M. Hugas. 2000.
Effect of sausage ingredients and additives on the production f enterocins A and
B by Enterococcus faecium CTC 492. Optimization of in vitro production and antilisterial effect in dry fermented sausages. J. Appl. Microbiol.88:686–694.
4. Baccus-Taylor, G., Glass, K.A., Luchansky, J.B., Maurer, A.J. 1993. Fate of
Listeria monocytogenes and pediococcal starter culture during the manufacture of
chicken summer sausage. Poultry Sci. 72: 1772-1778.
5. Barakat, R.K., Harris, L.J. 1999. Growth of Listeria monocytogenes and Yersinia
enterocolitica on cooked modifiedatmosphere-packaged poultry in the presence and
absence of a naturally occurring microbiota. Appl. Environ.Microbiol. 65: 342-345.
41
6. Bari, M.L., Kawasaki, T., Inatsu, Y., Ukuku, D.O., Iss iki, K., Kawamoto, S. 2005.
Combined action of nisin and pediocin with sodium lact e, citric acid, phytic acid
and potassium sorbate and EDTA in reducing Listeria mo
ytogenes population
of inoculated fresh-cut produce. J. Food Prot.68: 1381-1387
7. Berry, E.D., Liewen, M.B., Mandigo, R.W., Hutkins, R.W. 1990. Inhibition of
Listeria monocytogenes by bacteriocin producing Pediococcus during the
manufacture of fermented semidry sausage. J. Food Prot.53: 194-199
8. Berry, E.D., Liewen, M.B., Mandigo, R.W., Hutkins, R.W. 1990. Inhibition of
Listeria monocytogenes by bacteriocin producing Pediococcus during the
manufacture of fermented semidry sausage. J. Food Prot. 53: 194-199.
9. Boziaris, I.S., Humpheson, L., Adams, M.R. 1998. Effec of nisin on heat injury
and inactivation of Salmonella enteritidis PT4. Int. J. Food Microbiol. 43: 7-13.
10. Caplice, E., Fitzgerald, G.F. 1999. Food fermentations role of microorganisms in
food production and preservation. Int. J. Food Microbiol. 50: 131-149.
11. Chandler, R. E., and T. A. McMeekin. 1989. Modelling g
response of
Staphylococcus xylosus to changes in temperature and glycerol concentration/water
activity. J. Appl. Bacteriol. 66:543–548.
42
12. Chamba, J.F., Jamet, E. 2007. Contribution to the safety assessment of
technological microflora found in fermented dairy prod
s. Int. J. Food
Microbiol.12:45-54
13. Deegan, L.H., Cotter, P.D., Hill, C., Ross, P. 2006. B cteriocins: Biological tools
for biopreservation and shelf-life extension. Int.Dairy J. 16: 1058-1071.
14. De Vuyst, L., R. Callewaert, and K. Crabbe´. 1996. Primary metabolite kinetics of
bacteriocin biosynthesis by Lactobacillus amylovorus and evidence for stimulation
of bacteriocin production under unfavourable growth co
ons. Microbiology
142:817–827.
15. Drider, D., Fimland, G., Hechard, Y., McMullen, L.M.,
revost, H. 2006. The
continuing story of class IIa bacteriocins. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70: 564-582
16. Eijsink, V.G.H., Skeie, M., Middelhoven, P.H., Brurberg, M.B., Nes, I.F. 1998.
Comparative studies of class IIa bacteriocins of lactic acid ba
ria. Appl. Environ.
Microbiol. 64: 3275-3281.
17. Fimland, G., Blingsmo, O.R., Sletten, K., Jung, G., Nes, I.F., Nissen-Meyer, J.
1996. New biologically active hybrid bacteriocins cons ructed by combining
regions from various pediocin-like bacteriocins: the C-terminal region is important
for determining specificity. Appl. Environ. Microbiol. 62: 3313-3318.
43
18. Gálvez, A., Abriouel, H., López, R.L., Ben Omar, N. 2007. Bacteriocin -based
strategies for food biopreservation. Int. J.Food Microbiol. 120: 51-70.
19. Gänzle, M. G., M. Ehmann, and W. P. Hammes. 1998. Modeling of growth of
Lactobacillus sanfranciscensis and Candida milleri in response to process
parameters of sourdough fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 64:2616–2623.
20. Glaasker, Erwin, Tjan, Frans S. B., Ter Steeg, Pieter F., Konings, Wil N., Poolman,
Bert
Physiological Response of Lactobacillus plantarum to Salt and Nonelectrolyte
Stress. J. Bacteriol. 1998 180: 4718-4723
21. Guyonnet, D., Fremaux, C., Cenatiempo, Y., Berjeaud, J.M. 2000. Method for rapid
purification of class IIa bacteriocins and comparison
their activities. Appl.
Environ. Microbiol. 66: 1744–1748.
22. Harris, L.J. 1998. The microbiology of vegetable fermentations. En: Microbiology
of Fermented Foods, Vol. 1, Wood, B.J.B. (Ed.). Blackie, Londres, pp. 45-72.
23. Herman C., Maguna F.,. Garro O. and. Castro E. Effect of temperature, pH and
NaCl on nisin activity against lactobacillus fructivorans The Journal of the
Argentine Chemical Society Vol. 97 N° 2, 11-18 (2009)
24. Johnsen, L., Fimland, G., Nissen-Meyer, J. 2005. The C-terminal domain of
pediocinlike antimicrobial peptides (Class IIa bacteriocins) is involved in specific
44
recognition of the C-terminal part of cognate immunity proteins and in determining
the antimicrobial spectrum. J. Biol. Chem. 280: 9243-50.
25. Juarez Toma M.S., Bru E., Wiese B., de Ruiz Holgado A., Nader-Macías M.E.
Influence of pH, temperature and culture media on the
and bacteriocin
production by vaginal Lactobacillus salivarius CRL 1328 Journal of Applied
Microbiology, Volume 93, Number 4, October 2002 , pp. 714- 724(11)
26. Jydegaard, A.-M., Gravesen, A., Knøchel, S. 2000. Growth condition-related
response of Listeria monocytogenes 412 to bacteriocina inactivation. Lett. Appl.
Microbiol. 31: 68 -72
27. Korkeala, H., T. Alanko, and T. Tiusanen. 1992. Effect of sodium nitrite and
sodium chloride on growth of lactic acid bacteria. Acta Vet. Scand. 33:27–32.
28. Kleerebezem, M., Hugenholtz, J. 2003. Metabolic pathway engineering in lactic
acid bacteria. Curr. Opin. Biotechnol. 14:232–237.
29. Kunji, E.R.S., Chan, K.W., Slotboom, D.J., Floyd, S.,
R., Monné, M.
2005. Eukaryotic membrane protein overproduction in La tococcus lactis.
Curr.Opin. Biotechnol. 16: 546-551.
30. Leal-Sa´nchez, M. V., R. Jime´nez-Diaz, A. Maldonado -Barraga´n, A. GarridoFerna´ndez, and J. L. Ruiz-Barba. 2002. Optimization of bacteriocin production by
45
batch fermentation of Lactobacillus plantarum LPCO10. Appl. Environ. Microbiol.
68 :4465–4471.
31. Lebois M., Connil N., Onno B., Pre´vost H. and Dousset X. Effects of divercin
V41 combined to NaCl content, phenol (liquid smoke) concentration and pH on
Listeria monocytogenes ScottA growth in BHI broth by an experimental design
approach. Journal of Applied Microbiology 2004, 96, 931–937
32. Leistner, L. 1992. Food preservation by combined methods. Food Res. Int. 25: 151158.
33. Lejeune R., Callewaert R., Crabbe´ K. De Vuyst L. Mod lling the growth and
bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471 in batch cultivation.
Journal of Applied Microbiology 1998, 84 , 159 –168
34. Leroy, F., De Vuyst, L. 2004. Lactic acid bacteria as functional starter cultures for
the food fermentation industry. Trends Food Sci. Technol. 15: 67-78.
35. Leroy, F., and L. De Vuyst. 1999. The presence of salt and curing agent reduces
bacteriocin production by Lactobacillus sakei CTC 494, a potential starter culture
for sausage fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 65:5350–5356.
36. Leroy, F., and L. De Vuyst. 1999. Temperature and pH conditions that prevail
during fermentation of sausages are optimal for produc on of the antilisterial
bacteriocin sakacin K. Appl. Environ. Microbiol. 65:974–981.
46
37. Makarova, K.S., Koonin, E.V. 2007. Evolutionary genomics of lactic acid bacteria.
J. Bacteriol. 189:1199-208.
38. Maldonado R.
Llanca L. Efecto de la incorporación de
supervivencia del Staphylococcus aureus en queso de ma
sobre la
Rev. Fac. Agron.
(Maracay) 33:147- 163. 2007
39. Mansour M., Amri D., Bouttefroy A., Linder M., Milliere J.B. Inhibition of
Bacillus licheniformis spore growth in milk by nisin,
laurin, and pH
combinations. Journal of Applied Microbiology1999, 86, 311–324
40. Marquez, J. García R. Efecto de la nisina sobre la microflora patógena del queso
blanco artesanal tipo"telita" elaborado en una quesera de Upata, Estado Bolívar,
Venezuela. Rev. Soc. Ven. Microbiol., 2007, vol.27, no.2, p.108-111.
41. Mierau, I., Leij, P., van Swam, I., Blommestein, B., F oris, E., Mond, J., Smid, E.J.
2005. Industrial-scale production and purification of a heterologous pr ein in
Lactococcus lactis using the nisin- controlled gene expression system NICE: The
case of lysostaphin. Microb. Cell Fact. 4: 15
42. Mota-Meira, M., Lapointe, G., Lacroix, C., Lavoie, M.C. 2000. MICs of Mutacin
BNy266, Nisin A, Vancomycin, and Oxacillin against Bacterial Pathogens.
Antimicrob. Agents Chemother. 44: 24-29.
47
43. Mulet-Powell, N., Lacoste-Armynot, A.M., Viñas, M., De Buochberg, M.S. 1998.
Interactions between pairs of bacteriocins from lactic acid bacteria. J. Food Prot.
61:1210-1212.
44. Muriana, P.M. 1996. Bacteriocins for control of Listeria spp. in food. J. Food Prot.
suppl. 1996: 54-63.
45. Nilsen, T., I. F. Nes, and H. Holo. 1998. An exported inducer peptide regulates
bacteriocin production in Enterococcus faecium CTC 492. J. Bacteriol. 180:1848–
1854.
46. Nilsson, L., M. K. Nielsen, Y. Ng, and L. Gram. 2002. Role of acetate in
production of an autoinducible class IIa bacteriocin in Carnobacterium piscicola
A9b. Appl. Environ. Microbiol. 68:2251–2260.
47. Parente E. Hill C. 1992. A comparison of factors affec ng the production of two
bacteriocins from lactic acid bacteria. Journal of Applied Bacteriology. 73: 290298
48. Pfeiler, E.A., Klaenhammer, T.R. 2007. The genomics of lactic acid bacteria.
Trends Microbiol. 15: 546- 553.
49. Poschet F.; Vereecken K.; Geeraerd A.; Noicolai. M. ; an Impe F. Analysis of a
novel class of predictive microbial growth models and pplication to coculture
48
growth. International Journal of Food Microbiology Volume 100, Issues 1-3, 15
April 2005, Pages 107-124.
50. Pucci, M.J., Vedamuthu, R.E.R., Kunka, B.S., Vandenber
P.A. 1988. Inhibition
of Listeria monocytogenes by using bacteriocin PA-1 produced by Pediococcus
acidilactici PAC1.0. Appl. Environ. Microbiol. 54: 2349- 2353.
51. Rodríguez, J.M. 1996. Espectro antimicrobiano, estructura, propiedades y modo de
acción de la nisina, una bacteriocina producida por La tococcus lactis. Food Sci.
Tech. Int. 2: 61-68.
52. Rodriguez, J.M., Martínez, M.I., Horn, N., Dodd, H.M.
2b. Heterologous
production of bacteriocins by lactic acid bacteria. I . J. Food Microbiol. 80: 101116.
53. Ross, R.P., Galvin, M., Mc Auliffe, O., Morgan, S.M.,
n, M.P., Twomey, D.P.,
Meaney, W.J., Hill, C. 1999. Developing applications for lactococcal bacteriocins.
Antonie Van Leeuwenhoek 76:337–346.
54. Roze´s, N., and C. Peres. 1996. Effect of oleuropein and sodium chloride on
viability and metabolism of Lactobacillus plantarum. Appl. Microbiol. Biotechnol.
45 :839–843.
49
55. Serna L. Lactic acid production by a strain of Lactococcus lactis subs lactis isolated
from sugar cane plants. Electronic Journal of Biotechnology Vol.9 No.1, Issue of
January 15, 2006
56. Stevens, K.A., Sheldon, B.W., Klapes, N.A., Klaenhamme , T.R. 1991. Nisin
treatment for inactivation of Salmonella species and other gram-negative bacteria.
Appl. Environ. Microbiol. 57: 3613-3615.
57. Stiles, M.E. 1996. Biopreservation by lactic acid bact ria. Antonie van
Leeuwenhoek Int.J. Gen. Mol. Microbiol. 70: 331-345.
58. Uguen, P., J. Hamelin, J. P. Le Pennec, and C. Blanco. 1999. Influence of
osmolarity and the presence of an osmoprotectant on Lactococcus lactis growth and
bacteriocin production. Appl. Environ. Microbiol. 65:291–293.
59. Uhart, M., Ravishankar, S., Maks, N.D. 2004. Control of Listeria monocytogenes
with combined antimicrobials on beef franks stored at
C. J. Food Prot. 67 :2296-
2301
60. Valbuena E. Modelos cinéticos aplicados al crecimiento de Lactococcus lactis en
leche..Revista científica . Vol. 15 , Nº 5, 464 – 475, 2005.
61. Vignolo, G., Palacios, J., Farías, M.E., Sesma, F., Schillinger, U., Ho lzapfel, W,
Oliver. G. 2000. Combined effect of bacteriocins on the survival of various Listeria
species in broth and meat system. Curr. Microbiol. 41: 410-416.
50
62. Wenhua Lv, Xiaoyan Zhang and Wei Cong. Modelling the p oduction of nisin by
Lactococcus lactis in fed-batch culture. Applied Microbiology and Biotechnology.
Volume 68, Number 3 / agosto de 2005
51
VII. APÉNDICE
52
Tabla Nº 1
Parámetros de crecimiento de Lactococcus lactis en caldo
MRs glucosa, según modelo primario de Gompertz
a
b
c
d
Desv. Estand
R2
3.03
0.27
5.17
4.98
0.188
0.998
a= población inicial UFC/mL
b= Tasa máxima de crecimiento UFC/mL/h
c= Máxima población obtenida UFC
M= Tiempo tasa máxima crecimiento
Edgar Zárate S.
53
Tabla Nº 2
Parámetros de crecimiento de Lactococcus lactis en caldo
MRs glucosa, en función de la biomasa, según modelo
primario de Gompertz
a
b
c
d
Desv. Estand
R2
0.02
0.30
2.93
7.72
0.064
0.99
a= población inicial UFC/mL
b= Tasa máxima de crecimiento UFC/mL/h
c= Máxima población obtenida UFC
M= Tiempo tasa máxima crecimiento
Edgar Zárate S.
54
Tabla Nº 3
Parámetros del consumo de Glucosa por la biomasa de
Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa
Concentración Glucosa inicial (g/L)
Consumo de Glucosa (g/L)
Concentración Glucosa residual (gL)
Máxima concentración Biomasa (Xmax=g/L)
Coeficiente del rendimiento celular (Y X/s= g/L)
Coeficiente mantenimiento (ms= g
Glu/gXmax/h)
Coeficiente rendimiento celular (Y X/S=g
X max/gGlu)
20.00
18.99
1.01
2.88
0.15
0.27
0.11
Edgar Zárate S.
55
Tabla Nº 4
Parámetros de la producción de Ácido láctico por
Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa
Ácido láctico producido (L= g/L)
Conversión Glu/Ac. Lact (Y L/S = g Ac. Lac./g Gluc)
16.05
0.84
Edgar Zárate S.
56
Tabla Nº 5
Parámetros de la producción de Nisina por Lactococcus lactis en caldo
MRS glucosa
Actividad de la Nisina (B= AU/L)
2.12
Producción especifica de nisina(KB= AU/gXmax)
0.74
Tasa aparente de inactivación nisina (Kinact = gX max/L/h)
0.052
Conc. Minima Biomasa para el inicio prod. Nisina (KB'=gX max/L)
0.0015
Edgar Zárate S.
57
Tabla Nº 6
Efecto del cloruro de sodio sobre los parámetros de crecimiento de
Lactococcus lactis en caldo MRS según modelo de Gomper z
Parámetros
crecimiento
a
b
c
M
Desv. Estand
R2
0% NaCl
2% NaCl
4% NaCl
6% NaCl
3.11
0.27
5.19
4.91
0.188
0.998
3.19
0.24
4.69
5.14
0.118
0.999
3.09
0.21
2.48
6.03
0.11
0.997
2.89
0.17
2.01
7.59
0.02
0.989
a= población inicial UFC/mL
b= Tasa máxima de crecimiento UFC/mL/h
c= Máxima población obtenida
M= Tiempo tasa máxima crecimiento
58
Edgar Zárate S.
Tabla Nº 7
Parámetros de la producción de nisina por Lactococcus lactis en caldo MRS glucosa
Cloruro de sodio
Parámetros
0%
2%
4%
6%
2.12
1.39
1.22
0.38
0.82
0.53
0.47
0.14
0.052
0.072
0.129
0.268
0.25
0.42
0.76
1.12
Actividad de la Nisina (B= AU/L)
Producción especifica de nisina(KB=
AU/gXmax)
Tasa aparente de inactivación nisina (K inac =
gX max/L/h)
Conc. Minima Biomasa para el inicio prod.
Nisina (XB'=gXmax/L)
Edgar Zárate S.
59
Tabla Nº 8
Valores de los parámetros biocinéticos de Lactococcus lactis y su relación
con las concentraciones de NaCl y producción de nisina según modelos
primarios y secundarios
Parámetros
biocinéticos
Modelo primario
Ecuaciones modelo empírico
Modelo secundario
µ max
0.27 ± 0.18
0.30 ± 0.22
Xmax
0.30 ± 0.06
2.92 ± 0.18
?
0.51 ± 0.01
0.49 ± 0.04
YX/S
0.15 ± 0.03
0.14 ± 0.02
mS
0.27 ± 0.02
0.29 ± 0.03
kB
0.74 ± 0.01
0.76 ± 0.02
0.052 ± 0.002
0.0054 ± 0.005
Kinact.
Edgar Zárate S.
60