Control molecular del ritmo circadiano en mamíferos

Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
Control molecular del ritmo circadiano en mamíferos
Introducción.Los relojes circadianos son mecanismos moleculares que permiten mantener una determinada
ritmicidad en una gran variedad de células en diversos organismos. El rol principal de estos
relojes es el de dirigir la expresión rítmica de genes involucrados en la fisiología, metabolismo y
comportamiento del individuo. La principal característica que presentan los relojes circadianos
es su habilidad para “sincronizarse” con elementos ambientales, o zeitgebers, como los ciclos
de luz/oscuridad o de temperatura, además de la capacidad para mantener un funcionamiento
rítmico en condiciones constantes.
En los mamíferos, el reloj central se encuentra localizado en el núcleo supraquiasmático (NSQ)
del hipotálamo anterior. El NSQ es regulado por los ciclos de luz/oscuridad por medio de
células ganglionares fotosensitivas de la retina que se proyectan hacia el NSQ a través del
tracto retinohipotalámico. Luego, el NSQ controla otras funciones corporales mediante la
secreción de ciertos factores (ej. TGFα, procineticina) que actúan de manera local sobre el
hipotálamo y también regulan otros osciladores circadianos en tejidos periféricos (ej. riñón e
hígado) por medio de señales humorales (ej. glucocorticoides). Estos osciladores periféricos
pueden, sin embargo, desacoplarse del NSQ si algunas necesidades específicas lo requieren,
como ocurre en el hígado, pulmón y músculo esquelético luego de la regulación por la comida.
El NSQ mantiene una ritmicidad persistente (>2 semanas) cuando es sometido a la regulación
por ciclos de luz / oscuridad in vivo y en cultivos celulares in vitro, mientras que los osciladores
periféricos pierden esta ritmicidad luego de 4-5 días bajo las mismas condiciones.
Genes involucrados en el control del ritmo circadiano.En 1984, el primer clock gene, period, fue aislado en Drosophila. Luego se descubriría en esta
misma especie que la transcripción del gen period es inducida cuando los niveles de su
producto, la proteína PERIOD se ven reducidos. De esta manera, Drosophila se convirtió en la
primera especie en la cual se descubrió un “feedback loop” autorregulatorio que causaba las
oscilaciones en la transcripción de estos clock genes.
En los siguientes años, se identificaron otros clock genes circadianos en Drosophila. Estos
genes incluyen a timeles (tim), clock (clk), cycle (cyc), double-time (dbt), cryptochrome (cry) y
vrille (vri). Las mutaciones en estos genes alteran la duración del período o llevan a una
pérdida de la ritmicidad circadiana. A nivel molecular, se piensa que la expresión de per está
1
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
dirigida por el heterodímero de CLK y CYC, el cual se une al E-box presente en el promotor de
per, activando así su transcripción. Los mRNAs transcritos salen del núcleo y son traducidos en
el citoplasma de la célula. Posteriormente, la proteína PER es fosforilada por una casein kinasa
I (CKI) codificada por el gen dbt. La fosforilación afecta la estabilidad de PPER y por lo tanto
influye sobre la cantidad de de PER que puede ser transportada al núcleo junto con TIM. En el
núcleo, los complejos PER/TIM bloquean la activación de la transcripción de per al interferir con
la actividad de los heterodímeros CLK/CYC. Es por este feedback negativo que se regula la
expresión de per en Drosophila.
En la actualidad ya se han conseguido encontrar los análogos en mamíferos para la mayoría
de los genes responsables del reloj circadiano en Drosophila (Tabla 1), manteniéndose un alto
grado de conservación a nivel de genes y de mecanismos involucrados (Fig.1). Los principales,
tres genes Period en mamíferos (mPer1, mPer2 y mPer3), dos genes Criptocromo (mCry1 y
mCry2), Clock, Bmal1 (análogo de cyc) y CKIε (análogo de dbt) ya han sido identificados.
Tabla 1 Principales genes reguladores del ritmo circadiano aislados en el ratón
Los genes mPer1, mPer2 y mPer3 contienen el dominio PAS (period, arnt y sim), importante
para las interacciones proteína-proteína, y el dominio CLD que ayuda a la localización de las
proteínas en el citoplasma. El clonamiento del gen clock reveló que codifica la proteína
CLOCK, que reconoce dominios PAS/bHLH (basis helix loop helix). CLOCK forma un
heterodímero, el cual es internalizado hacia el núcleo y se une al E-box de la región promotora
de mPer1. Hasta este punto se sugiere que el autofeedback negativo presente en Drosophila
se encuentra conservado en mamíferos (Fig. 1).
2
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
Fig. 1 Mecanismo común de la regulación del reloj circadiano. Los factores positivos estimulan la
transcripción de los clock genes, y los productos de su traducción regulan de manera negativa a
sus mismos genes.
En mamíferos, los clock genes son expresados principalmente en el NSQ, el cual es el
principal regulador del ritmo circadiano en todo el organismo. Muchos de estos genes son
expresados de manera oscilatoria a nivel transcripcional y traduccional (Tabla 2). Las
diferentes fases en la expresión oscilatoria de estos genes sugieren que estas diferencias son
funcionalmente importantes para el mantenimiento del reloj circadiano.
Tabla 2
Tiempos de máxima expresión de los clock genes de mamíferos en el núcleo
supraquiasmático de ratas y ratones.
Cabe mencionar que, de manera interesante, la expresión de estos clock genes no está
restringida únicamente al NSQ, sino que puede ser observada en la mayoría de los tejidos. La
expresión oscilatoria de estos genes puede ser mantenida en los órganos periféricos y hasta
en cultivos celulares. Esto indica que esta ritmicidad circadiana no es específica para cada tipo
de célula y no es una propiedad individual de éstas.
3
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
Mecanismo de control.Los ciclos de retroalimentación de los mecanismos moleculares que controlan el ritmo
circadiano pueden resumirse de la siguiente manera (Fig. 2): Dos osciladores principales,
mPer1 y mPer2, existen en la célula. La transcripción de estos genes es estimulada por la
unión de heterodímeros formados por proteínas bHLH-PAS (CLOCK y BMAL1) a los E-box de
los promotores de mPer1 y mPer2. La activación de la transcripción conlleva a la formación de
mRNAs de mPer1 y mPer2, que son traducidos en el citoplasma. Cuando la concentración de
éstas proteínas es lo suficientemente alta, pasan a formar parte de los factores negativos que
comprenden a mCRY1, mCRY2, mPER1, mPER2, mPER3 y mTIM y que suprimen la
transcripción de los genes de mPer1 y mPer2 al unirse a los factores positivos
(CLOCK/BMAL1). Junto con los factores negativos, mCRY1 y mCRY2 poseen un gran
potencial de inhibir la transcripción del gen mPer1 inducida por MBAL1/CLOCK por unión
directa a estas proteínas bHLH-PAS. Experimentos con ratones doble knock-out para
mCry1/mCry2 y knock-out para Bmal1 mostraron la pérdida inmediata del ritmo circadiano en
condiciones de completa oscuridad. Esto sugiere que mCry1/mCry2 y Bmal1 juegan un rol
clave dentro de este ciclo de regulación. En los últimos años se ha venido especulando que,
junto con este mecanismo de feedback negativo, existe también uno de feedback positivo
involucrado en la oscilación del reloj circadiano en varias especies.
Fig. 2 Modelo del ciclo de retroalimentación principal en el reloj circadiano mamífero.
4
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
Si la concentración de los factores negativos es lo que determina el momento en que se
detiene la transcripción, el siguiente paso sería conocer cuáles son los mecanismos que
determinan la concentración de estas proteínas “clock”. El primer es su fosforilación. Los
monómeros de mPER1 y mPER2 son fosforilados por la casein kinasa Iε (CKIε), y estos
monómeros fosforilados son rápidamente degradados. De esta forma, la proteína no se
acumula hasta que la transcripción de mPer1 y mPer2 alcanza niveles altos el número de
monómeros de las proteínas mPER1 y mPER2 es tan alto que supera la capacidad de
fosforilación de CKIε.
La importancia de la fosforilación para la generación y control del ritmo circadiano ha sido
mostrada en modelos humanos. El síndrome familiar de fase de sueño avanzada (ASPS, por
sus siglas en inglés), que provoca que el individuo se quede dormido en tempranas horas de la
noche, se basa en una mutación del gen mPer2, lo cual conlleva a un impedimento en la
fosforilación. De esta manera, esta mutación permitirá una acumulación más rápida de mPER2
en el citoplasma que podría llevar a un detenimiento más temprano de la transcripción.
Dentro del núcleo, las proteínas mCRY1, mCRY2 y mTIM se unen con mPER1, mPER2 y
PER3 para formar un complejo que tiene acción negativa sobre la transcripción de los genes
mPer (Fig. 2). Este complejo se une a los factores (COCK y BMAL1), evitando así su acción
estimulatoria sobre mPer1 y mPer2.
Efecto de las mutaciones sobre el reloj circadiano.Estudios de mutaciones de estos genes revelaron que gran parte de éstos poseen funciones
redundantes, pero diferenciadas en el tiempo. Si éstos fueran esenciales para la realización de
un ciclo del reloj, una mutación nula en uno de ellos probablemente llevaría a una pérdida
inmediata de la ritmicidad; y este no es el caso para la mayoría de este grupo particular de
genes.
La pérdida o mutación específica de los clock genes puede llevar a una alteración en la
duración del periodo (Cry1, Cry2, Per1, Per3, CKIε) o una pérdida progresiva (Clock, Per2) o
inmediata (Bmal1) en condiciones constantes (Tabla 3)
Los doble mutantes para Cry1/Cry2 y Per1/Per2 pierden la ritmicidad de manera inmediata
bajo condiciones constantes, demostrando así la importancia de éstos genes en el control del
ritmo circadiano. Sin embargo, Per3 parece no ser de tanta importancia, ya que el efecto de su
deleción sobre el ritmo es muy leve, y los mutantes Per1/Per3 y Per2/Per3 muestran el mismo
fenotipo que los mutantes Per1 y Per2, respectivamente.
5
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
El único gen no redundante de este reloj (hasta ahora) parece ser Bmal1. La deleción de este
gen lleva a una pérdida inmediata de la ritmicidad en condiciones de oscuridad constante. A
nivel molecular, no se puede apreciar la expresión de Per1 y Per2 en el NSQ, lo cual reafirma
el rol de Bmal1 sobre la expresión de los genes Per.
Tabla 3 Los genes del reloj circadiano mamífero y el efecto de sus mutaciones sobre la duración
del periodo en condiciones de oscuridad constante
Los ratones carentes de Cry1 y Cry2 son arrítmicos en su comportamiento y muestran una
expresión constitutiva de Per1 y Per2 en el NSQ y tejidos periféricos. Esto demuestra que los
genes Cry actúan como reguladores negativos sobre la expresión de los genes Per (Fig. 2 y 3).
Los ratones carentes de Cry1 o Cry2 presentan ritmicidad, pero con alteración en la duración
de los periodos. Ratones Cry1-/- muestran un periodo menor de 24 horas, mientras que el de
los ratones Cry2-/- es mayor de 24 horas (Tabla 3). En condiciones de oscuridad constante, los
relojes de estos ratones corren más rápido o más lento, respectivamente, sugiriendo la idea de
que se encuentran regulando a proteínas diferentes dentro de dos osciladores que poseen
acción opuesta (Fig. 3).
Los ratones con deleciones específicas en Per1 y Per2 pierden la ritmicidad de su ciclo, a
diferencia de los ratones Cry1/Cry2, lo cual demuestra la importancia de estos genes en el
mecanismo de control del ciclo. Una mutación en Per2 lleva a una pérdida gradual de la
actividad locomotora circadiana y a una expresión reducida de Per1 y Cry1, mientras que la
expresión de Per3 y Clock no se vieron afectadas. Estas observaciones sugieren un rol de
Per2 como regulador positivo del la expresión de genes circadianos. Los ratones que carecen
de Per1 no mostraron alteraciones en los niveles de mRNA de Per2, Cry1 y Bmal1; sin
6
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
embargo, en el núcleo de las células del NSQ se detecta una menor concentración de la
proteína PER2, lo cual sugeriría que PER1 podría regular a PER2 de manera posttranscripcional y también podría estar influyendo en su transporte hacia el núcleo. Una
reducción o pérdida de PER2 en el núcleo lleva a la variación en la transcripción de Bmal1 y
genera un desfase en la oscilación del reloj circadiano, lo cual lleva a una variación en la
duración del ciclo o eventualmente a una pérdida total de la ritmicidad en los mutantes de
Per1. Bajo condiciones de luz constante, la duración del periodo en mutantes en Per1 es
mayor de 24 horas, mientras que en mutantes en Per2 es menor y no se observa la misma
pérdida de la ritmicidad. Estas observaciones apoyan también la hipótesis de la acción de dos
osciladores de acción opuesta (Fig. 3).
Fig 3 Modelo de oscilación entre mañana (M) y noche (E) en una neurona del NSQ. En el núcleo,
la transcripción de los clock genes Per y Cry es inducida por el complejo CLOCK/BMAL1. Las
proteínas PER son fosforiladas por CKIε, interactúan con CRY1 (C1) o CRY2 (C2),
respectivamente, y son transportados nuevamente hacia el núcleo donde los complejos PER/CRY
interactúan con CLOCK/BMAL1 e inhibiendo el complejo, cerrando así el ciclo oscilatorio. Los
osciladores de M y E son sincronizados vía PER2 (P2), el cual regula la expresión del gen Bmal1.
El transporte de P2 a su vez es influenciado por la cantidad presente de PER1 (P1) en el
citoplasma. La luz actúa sobre los dos osciladores de manera diferencial. Dependiendo de la hora
del día, la luz provoca la liberación de ácido glutámico, el oscilador E es reiniciado (línea
discontinua) o se afecta al oscilador M (línea continua). Esto genera diferencias en la expresión de
los “clock-controlled genes” putativos (ccg), donde ccg1 son controlados principalmente por el
oscilador M y ccg 2 por el oscilador E.
7
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
Sincronización con el ambiente externo.El reloj circadiano realiza un periodo que dura alrededor de, pero no exactamente, 24 horas.
Por lo tanto, este reloj debe ser “reiniciado” periódicamente para asegurar la sincronización
entre la fisiología del organismo y los patrones de luz/oscuridad (Fig 4). La importancia que
tiene esta regulación por el medio externo radica en que el organismo es capaz de predecir los
cambios en el ciclo de luz/oscuridad, lo cual le permite estar preparado para ellos.
Recientemente se ha llegado a demostrar que el principal regulador en ambiente externo es la
luz nocturna. La información sobre la luz nocturna es transmitida en los mamíferos a través del
glutamato (Fig. 3), el cual es liberado a partir de proyecciones de la retina hacia el NAQ. La
activación de los receptores de glutamato provoca la entrada de iones Ca2+ hacia la célula, lo
cual termina llevando a una activación dirigida de ciertos genes. Dado que Per1 y Per2
muestran una gran respuesta (pero a la vez diferenciada) a la luz, podrían ser genes blanco de
estas vías de activación por luz.
Fig 4 Cómo la luz regula el reloj circadiano mamífero. La luz induce la expresión de Per1 y Per2,
pero con diferentes intensidades y a diferentes tiempos, por lo cual el efecto de la luz sobre los
componentes del reloj se ven muy influenciados por la hora del día.
La rápida activación de la síntesis de los mRNA de Per probablemente se debe a la
fosforilación del factor de transcripción CREB y la activación de MAP kinasas. Dado que la
activación de CREB y las MAP kinasas puede ser causada por varios eventos dentro de la
célula, la expresión de los genes Per también puede ser sincronizada por otros factores no
fóticos. Esta sincronización no fótica es particularmente en los relojes periféricos de
mamíferos, donde la luz no tiene un efecto directo sobre tejidos como el hígado o el riñón.
Estos relojes periféricos, por su parte, son activados por otros factores llevados por la sangre,
como los glucocorticoides, el ácido retinoico, IL-6, IFN-α, entre otros.
8
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
Fig 5 Regulación temporal de Per1, Per2, Per3, tim, Clock y Bmal1 en los relojes central y
periférico.
Genes blanco del reloj circadiano.Varios aspectos de la fisiología y el comportamiento son controlados por el reloj circadiano a
través de vías neurales y endocrinas. Esto permite una adaptación a las variaciones diarias y
estacionales en el ambiente externo. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la acción
de los relojes circadianos no se conocen muy bien. Recientemente se descubrió que el
complejo CLOCK/BMAL1 está involucrado en el control de la transcripción del gen de la
arginina-vasopresina (AVP, por sus siglas en inglés). Ratones mutantes en Per2 muestran una
inhibición el la expresión rítmica de AVP en el NSQ, demostrando el control circadiano de este
gen.
La proteína de unión al elemento D (DBP, por sus siglas en inglés) es un factor de
transcripción del hígado que se expresa con una periodicidad circadiana, y recientemente se
demostró que su transcripción también se encuentra regulada por el complejo CLOCK/BMAL1,
lo que demuestra que los clock genes son capaces de regular la transcripción periódica de sus
propios reguladores. A su vez, DBP es capaz de unirse al promotor del gen Per1, influenciando
de manera positiva su transcripción. Esto indica la capacidad del reloj de responder ante sus
propios genes blanco, característica esencial para controlar el estado del organismo en
cualquier momento determinado.
El análisis de la expresión de Per1 y Per2 en ratones mutantes ha demostrado que existen
diversas vías controladas por este reloj. Existen diversos tipos de genes controlados por este
reloj (“clock-controlled genes”, ccg): 1) genes que están bajo el control de Per1, 2) genes bajo
el control de Per2, y 3) genes que dependen de ambos. Uno de los ccg identificados es
CRBP1, un gen que codifica para una proteína involucrada en la homeostasis de vitamina A.
Como se menciona en la página anterior, el ácido retinoico, un precursor de la vitamina A, es
9
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
capaz de regular los relojes circadianos periféricos. Por lo tanto, parece que la disponibilidad
de vitamina A y la regulación del reloj circadiano se encuentran ligadas.
Dado que los genes Per pueden responder a vías de señalización comunes, es probable que
las vías controladas por el reloj circadiano puedan retroalimentar de manera directa o indirecta
al reloj, aunque estas vías aún no se conocen lo suficiente.
Nuevo modelo de la regulación del reloj circadiano.Diversos análisis de expresión de los genes involucrados junto con las observaciones descritas
en las secciones anteriores llevaron al modelo propuesto por Daan et al. (Fig. 3). Las proteínas
CLOCK y BMAL1 dimerizan y forman un complejo que se une a los E-boxes de los promotores
de los genes Per1 y Per2, activando su transcripción. Esto probablemente se da en asociación
con otros factores aún desconocidos. Las proteínas PER1 y PER2 luego son fosforiladas por
CKIε, lo cual influye sobre su estabilidad y capacidad para interactuar otras proteínas como
CRY1 y CRY2, respectivamente. Las mutaciones en Cry1 y Cry2 muestran que estos dos
genes tienen efectos opuestos sobre la duración del periodo. A partir de estas observaciones y
de los diferentes patrones de expresión de Per1 y Per2, incluyendo su respuesta a la luz, el
mecanismo de regulación puede ser visto como un oscilador que es estabilizado por dos vías
regulatorias distintas. Una de estas vías muestra un oscilador para la mañana (M) y otro para
la noche (E) (Fig. 3). Luego de su interacción, el complejo PER1/CRY1 sería transportado de
vuelta hacia el núcleo por medio de un mecanismo desconocido, interfiriendo con el complejo
el complejo CLOCL/BMAL1, inhibiendo así la transcripción de Per1 y (posiblemente) Cry1. De
manera similar, el complejo PER2/CRY2 regularía la transcripción de Per2 y Cry2.
PER1 también puede interactuar con PER2 de manera directa e influir sobre la cantidad de
PER2 que llega al núcleo. Por lo tanto una variación en la expresión máxima de Bmal1 debería
observarse en el mutante Per1 de manera similar a lo que se observa en mutantes Per2. Así
PER2 regula la expresión circadiana de Bmal1, y por lo tanto la interacción PER1/PER2
parece ser importante para la regulación entre los osciladores M y E. Esto también afectaría a
otros genes que son regulados por el complejo CLOCK/BMAL1. DE esta manera, los
osciladores M y E se encuentran acoplados a través de la dimerización entre PER1 y PER2.
Una pérdida de la función de uno de estos genes Per llevaría a una falla en la sincronización y
reiniciación del reloj con el ambiente, como se ha observado en diversos experimentos. En el
reiniciación mediado por luz, el glutamato juega un rol importante. Este es liberado por la
estimulación luminosa hacia el NSQ, activando diversas vías de señalización que influyen
sobre la expresión de Per1 y Per2.
10
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
Esta separación del mecanismo de control en dos osciladores M y E resulta atractiva porque
demuestra que Per1 y Per2 no son genes redundantes y que son capaces de activar a
diferentes ccg por vías separadas (ccg, ccg1 y ccg2), dependiendo del momento del día.
El modelo de la Fig. 3 muestra la presencia de dos osciladores en una sola célula del NSQ. Sin
embargo, también es posible que los osciladores M y E se encuentran separados en diferentes
células, dado que las células neuronales del NSQ varían entre sí en cuanto a su
ultraestructura, histoquímica y conexiones con otras células.
De manera general, este modelo enfatiza que los genes Per1 y Per2 no son redundantes y que
regulan diferentes genes blanco y respuestas fisiológicas. Las dos vías dirigidas por Per1 (M) y
Per2 (E) se encuentran interconectadas, regulándose mutuamente. Los genes Cry son
reguladores negativos de ambas vías y son responsables para el mantenimiento de la
oscilación. De esta manera, los genes Per podrían establecer la fase en la que se encuentra el
ciclo y los genes Cry establecerían la duración de éstas.
11
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
Idea de investigación.Mucho se ha mencionado acerca del rol del gen mPer3 en el control del ritmo circadiano en
mamíferos, y muchos autores han llegado a la conclusión de que no se trata de un gen
esencial para el correcto funcionamiento del reloj. Sin embargo, gran parte de estas
conclusiones se basan únicamente en la observación de modelos mutantes para mPer3 y el
efecto que tienen estas mutaciones sobre la duración del periodo (se da solo una leve
alteración de éste). Por otro lado, dado que los modelos planteados en las secciones
anteriores, como el de Daan et al. pueden ser sustentados sin la necesidad de incluir la acción
de mPER3, se suele considerar que esta proteína no tiene función relevante sobre la
regulación.
Sin embargo, si nos basamos en el hecho de que las proteínas mPER1 y mPER2 no son
redundantes, regulando diferentes fases dentro del ciclo, cabría la posibilidad que mPER3
pudiera estar ejerciendo alguna función regulatoria diferente a las ejercidas por mPER1 y
mPER2. Esta función sería llevada a cabo por interacción con otras proteínas del ciclo
regulatorio (ej. proteínas de la familia CRY) o proteínas desconocidas hasta ahora.
Para analizar nuevamente el efecto de la mutación/deleción sobre mPer3, primero se deben
generar los ratones knockout para mPer3 por medio de recombinación homóloga dirigida
contra la secuencia conocida de mPer3 (GenBank: AF050182). Los vectores que se construyan
deben ser linearizados e introducidos en células madre por medio de electroporación. Las
líneas recombinantes pueden ser identificadas por su resistencia a la neomicina; la
recombinación homóloga puede ser identificada por medio de electroforesis en gel de agarosa
utilizando enzimas de restricción que corten en las zonas que flanquean al gen, o puede ser
también identificada por su resistencia al ganciclovir (aquellos que hayan realizado
recombinación no homóloga serán sensibles). Los ratones recombinantes luego se aparean
entre sí hasta obtener homocigotes mPer3 -/-. La ausencia total de la proteína mPER3 puede
ser identificada utilizando la técnica de Western Blot con anticuerpos específicos anit-mPER3 a
partir de células provenientes del NSQ y otros tejidos donde se haya demostrado la presencia
de relojes circadianos periféricos (ej. hígado o riñón).
Una vez obtenidos estos ratones se analiza su comportamiento y la duración de su ciclo en
condiciones de oscuridad constante (para evitar la sincronización con la luz del medio externo).
Para analizar si esta mutación tiene algún efecto sobre la expresión de otras proteínas
involucradas en el control del ritmo se podría efectuar una prueba de Northern Blot para
determinar la variación en las concentraciones de los mRNAs de estas proteínas. Una variación
en las concentraciones con respecto a ratones control sugeriría un control a nivel
12
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
transcripcional. Por otro lado, una variación en la concentración de las proteínas (por medio de
Western Blot) sugeriría una regulación durante o después de la traducción.
Es también posible que esta proteína no influya tanto sobre la concentración total de los
reguladores del ciclo, sino sobre el patrón de expresión de éstos a lo largo del ciclo. Para
analizar esto se podrían utilizar genes reporteros como la luciferasa bajo el control de cada uno
de los promotores de estas proteínas. Bajo la estimulación de constante de la luciferina, los
patrones de expresión se verán reflejados en los patrones de luminiscencia observados. Esta
técnica incluso puede ser aplicada in vivo en ratones, como ya se ha demostrado con
anterioridad (Yamaguchi et al. 2001), en donde se insertó un polímero de fibra óptica justo
encima del NSQ de un ratón que expresaba uno de estos genes reporteros al cual se le
administraba constantemente luciferina en el ventrículo lateral. El otro extremo de esta fibra
óptica era conectado a un aparato de conteo de fotones.
Otra manera de analizar el efecto de la falta de expresión del gen mPer3 es por medio de la
técnica de RNA de interferencia (RNAi). Por medio de esta técnica, se introducen RNAs de
doble cadena a la célula, los cuales serán rápidamente digeridos por la enzima Dicer hasta
pequeños fragmentos de 20-25 nucleótidos de longitud (small interefering RNAs, siRNAs).
Estos RNAs se unirán al complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC, por sus siglas en
inglés) y cuando se unan al mRNA complementario (en este caso el mRNA transcrito a partir de
mPer3) provocarán su degradación a partir de el extremo 3’. De esta manera se consigue la
transcripción, mas no la traducción de mPer3. Esta técnica resulta muy útil ya que se
interrumpe la expresión del mPer3 solo en un momento deseado, y no permanentemente con
en el caso de los ratones knock-out. De esta manera, no se alterarían los efectos (en caso los
tuviera) que tiene la proteína mPER3 sobre el desarrollo del ratón y sólo se evaluaría el efecto
a nivel del control del ritmo circadiano. Una vez que se acaba el silenciamiento, es muy posible
que el ratón regrese a los patrones normales de regulación, facilitando la comparación entre las
fases de presencia y ausencia de mPER3.
La interacción con otras proteínas conocidas del ciclo regulatorio también puede ser
demostrada in vitro utilizando, por ejemplo, el sistema de doble híbrido en un modelo de
levaduras. También existe la posibilidad que mPER3 se una a otras proteínas no conocidas
para ejercer su supuesta acción regulatoria. Para este caso se podría realizar un ensayo de
coinmunoprecipitación utilizando anticuerpos anti-mPER3 unidos a cuentas de sepharosa y
analizar las proteínas con las que precipite mPER3 de manera conjunta. Estas posteriormente
pueden ser analizadas por SDS-PAGE y su rol puede ser evaluado por ensayos de análisis de
expresión.
13
Pablo Tsukayama
Expresión Genética / UPCH / 2003-I
Referencias bibliográficas.Asai M, Yamaguchi S, Isejima H, Jounouchi M, Moriya T, Shibata S, Kobayashi M, Okamura H (2001)
Visualization of mPer1 transcription in vitro by luciferase mediated bioluminescence: NMDA induces a rapid
phase-shift of mPer1 gene in cultured SCN. Current Biology 11: 1524 – 1527
Bae K, Jin X, Maywood E, Hastings M, Reppert S, Weaver R (2001) Differential functions of mPer1, mPer2 and
mPer3 in the SCN circadian clock. Neuron 30: 525 – 536
Balsalobre A (2002) Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Research 309: 193 – 199
Bartness TJ, Song CK, Demas GE (2001) SCN efferents to peripheral tissues: implications for biological rhythms.
Journal of Biological Rhythms 16: 196 – 204
Buijs RM, van Elden CG, Goncharuk VD, Kalsbeek A (2003) The biological clock tunes the organs of the body:
timing by hormones and the autonomic nervous system. Journal of endocrinology 177: 17 – 26
Daan S, Albrecht U, van der Horst GTJ, Ilnerová H, Roenneberg T, Wehr TA, Schwartz WJ (2001) Assembling a
clock for all seasons: are there M and E oscillators in the genes? Journal of Biological Rhythms 16: 105 – 116
Dunlap JC (1999) Molecular bases for circadian clocks. Cell 96: 271 – 290
Glossop NR, Hardin PE (2002) Central and peripheral circadian oscillator in flies and mammals. Journal of Cell
Science 115: 3369 – 3377
Hammond SM, Caudy AA, Hannon GJ (2001) Post-transcriptional Gene Silencing by Double-stranded RNA. Nature
Reviews Genetics 2: 110 – 119
Herzog ED, Schwartz WJ (2002) Invited review: A neural clock-work for encoding circadian time. Journal of Applied
Physiology 92: 401 – 408
Kalsbeek A, Buijs RM (2002) Output pathways of the mammalian suprachiasmatic nucleus. Coding circadian time by
transmitter selection and specific targeting. Cell and Tissue Research 309: 109 – 118
Lee C, Etchegaray JP, Cagampang F, Loudon S, Reppert S (2001) Posttranslational mechanisms regulate the
mammalian circadian clock. Cell 107: 855 – 867
Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J (2002) Biología Celular y Molecular. 4ta
Edición. Editorial Panamericana. España. pp. 284 – 289, 879 -882
Okamura H (2003) Integration of mammalian circadian clock signals: from molecule to behavior. Journal of
Endocrinology 177: 3 – 6
Okamura H, Yamagichi S, Yagita K (2002) Molecular machinery of the circadian clock in mammals. Cell and Tissue
Research 309: 47 – 56
Reppert SM, Weaver DR (2002) Coordination of circadian timing in mammals. Nature 418: 935 – 941
Ripperger JA, Schibler U (2001) Circadian regulation of gene expression in animals. Current Opinion in Cell Biology
13: 357 – 362
Schultz TF, Kay SA (2003) Circadian clocks in daily and seasonal control of development. Science 301: 326 - 328
Sharp PA (2001) RNA Interference-2001 Genes & Development 15: 485 - 490
Shuldiner AR (1996) Transgenic animals. The New England Journal of Medicine 334: 653 – 655
Stanewsky R (2003) Genetic Analysis of the Circadian System in Drosophila melanogaster and Mammals. Journal of
Neurobiology 54: 111 – 147
Yamaguchi S, Kobayashi M, Mitsui S, Ishida Y, van der Horst GTJ, Suzuki M, Shibata S, Okamura H (2001) Gene
expression – View of a mouse clock gene ticking. Nature 409: 684
14