POLIPEPTIDO BIOADHESIVO SINTETICO.(ES2147727)

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
2 147 727
kInt. Cl. : C12N 15/11, C07K 7/08
11 Número de publicación:
7
51
ESPAÑA
C07K 14/00, A61K 38/04
A61K 38/16, C12N 1/21
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 92901606.1
kFecha de presentación : 10.12.1991
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 563 172
kFecha de publicación de la solicitud: 06.10.1993
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Polipéptido bioadhesivo sintético.
k
73 Titular/es: CREATIVE BIOMOLECULES, INC.
k
72 Inventor/es: Pang, Roy, H. L.;
k
74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto
30 Prioridad: 14.12.1990 US 627323
35 South Street
Hopkinton, MA 01748, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.10.2000
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 147 727 T3
01.10.2000
Aviso:
k
k
Cohen, Charles M. y
Keck, Peter C.
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 147 727 T3
DESCRIPCION
Polipéptido bioadhesivo sintético.
5
Fundamentos de la invención
Esta invención se refiere a composiciones sintéticas para su uso como adhesivos en medios acuosos.
Más particularmente, la invención se refiere a composiciones adhesivas biocompatibles.
10
15
20
25
Los adhesivos funcionales en medios acuosos han sido largamente deseados en la técnica. La gran
mayorı́a de los adhesivos conocidos en la técnica se unen a las superficies secas más fuertemente que a
las mismas superficies cuando están húmedas. El agua, además de competir con el adhesivo para ocupar
el área de la superficie a la que éste se ha de unir, puede hidrolizar o plastificar muchos adhesivos. De
particular interés son los adhesivos biocompatibles que funcionan en medios acuosos, los ası́ llamados
“bioadhesivos”. Se contempla que los bioadhesivos tengan mucha utilidad en aplicaciones biomédicas,
particularmente en las áreas de reparación de tejidos, suministro de fármacos, cirugı́a, y cultivo de células
in vitro, ası́ como en otras áreas que implican medios acuosos, tales como la cromatografı́a y las aplicaciones marinas.
Los bioadhesivos de la técnica se derivan generalmente del material adhesivo que existe en la naturaleza, encontrado en animales marinos tales como los mejillones, percebes y ostras. La mayor parte del
trabajo se ha concentrado en la proteı́na polifenólica del mejillón marino Mytilus edulis. Esta proteı́na
bioadhesiva se cree que se dispersa como un material esponjoso desde el pie del mejillón (Waite, J.H. et al.
(1985), Biochem. 24, 5010-14), y a continuación se endurece para formar un material adhesivo, cohesivo,
suficientemente fuerte para unir el mejillón a las superficies húmedas. La proteı́na se caracteriza por una
unidad decapeptı́dica repetida 75 a 85 veces en la molécula nativa, y que tiene la siguiente secuencia de
aminoácidos (Listado de Secuencia ID N◦ 1):
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Xaa1 -Xaa1 -Thr-Xaa2 -Lys
30
35
40
45
50
55
donde Xaa1 es hidroxiprolina y Xaa2 es 3,4-dihidroxilfenil-alanina (dopa). Estos residuos se incorporan
probablemente a la cadena polipeptı́dica como prolina y tirosina, respectivamente, y se modifican después
de la traducción, por hidroxilación enzimática, con conversión de la tirosina en dopa, que tiene lugar por
la acción de una catecol oxidasa (una enzima “tirosinasa”), presente en el mechón de filamentos del mejillón (Waite, J.H. (1986), Comp. Physiol. B 156, 491).
La proteı́na tiene aparentemente una configuración predominantemente abierta, con poca o ninguna
estructura secundaria, tal como se determina por estudios fı́sicos recientes sobre las caracterı́sticas en
solución de la proteı́na (Trumbore, M.W. et al., Biophys. J. 55, 532a (1989) y Williams, T. et al., Arch.
Biochem. Biophys. 269, 415-22, 1989), y por aplicación de los algoritmos de Chou y Fasman a la secuencia de aminoácidos, que predicen una ausencia de α-hélices o β-láminas (Williams, ut supra). Las altas
concentraciones de grupos imino (prolina, hidroxiprolina) pueden impedir la formación de una estructura
secundaria sustancial dentro de la proteı́na.
Las solicitudes de Patente europea Nos. de Serie EPO 243.818 (publicada el 4 de noviembre de
1987) y EPO 244.688 (publicada el 11 de noviembre de 1987) describen bioadhesivos que comprenden la
proteı́na polifenólica que se encuentra en la naturaleza, aislada de M. edulis. Las patentes de los EE.UU.
Nos. 4.808.702 (Waite, J.H., expedida el 28 de febrero de 1989) y 4.687.740 (Waite, J.H., expedida el 18
de agosto de 1987) describen el aislamiento de decapéptidos de estas proteı́nas, ası́ como métodos para
combinar los péptidos, para formar materiales bioadhesivos útiles. El documento AU 8.824.972 (publicado el 23 de marzo de 1989) describe adhesivos impermeables al agua, que comprenden estas unidades
decapeptı́dicas pólifenólicas repetitivas (10 a 400) y un agente reticulante bifuncional.
El documento EPO 242.656 (publicado el 28 de octubre de 1987); Marumo et al. (1986) Biochem.
Biophys. Acta 872, 98-103; y Swerdloff, M.D. et al. (1989), Int. J. Peptide Protein Res. 33, 313, describen métodos para una nueva forma de sı́ntesis del decapéptido de M. edulis.
La solicitud de patente internacional PCT WO 88/03953 (publicada el 2 de junio de 1988) describe el
aislamiento de la secuencia genética codificadora de la proteı́na precursora bioadhesiva de Mytilus edulis.
60
Un objetivo de esta invención es diseñar un bioadhesivo que simplifique la secuencia de aminoácidos
necesaria para la cohesión y adhesión, y que no esté basada en la unidad decapeptı́dica repetitiva. Otro
objetivo de la invención es proporcionar una composición adhesiva cuya fuerza adhesiva pueda modularse
2
ES 2 147 727 T3
5
y que pueda, por tanto, ser útil en una amplia gama de aplicaciones biomédicas. Es también un objetivo
de esta invención diseñar una cadena polipeptı́dica, capaz de formar una arquitectura especı́fica que es
cohesiva, y alrededor de la cual pueda diseñarse una reticulación. Estos y otros objetivos y caracterı́sticas
de la invención se pondrán de manifiesto a partir de la descripción, figuras y reivindicaciones que aparecen
a continuación.
Sumario de la invención
10
Esta invención concierne a una composición sintética para su uso como adhesivo en medios acuosos. La
composición comprende una pluralidad de cadenas polipeptı́dicas que tienen una estructura α-helicoidal
en medios acuosos y que son capaces de establecer interacciones cohesivas y adhesivas. Tal como se usa en
la presente invención, el término “cohesivo” se entiende que significa que dos o más cadenas polipeptı́dicas
helicoidales de esta invención son capaces de agregarse en una estructura superhelicoidal, tal como una
espiral enrollada.
15
20
25
30
35
40
45
La secuencia de aminoácidos de cada cadena polipeptı́dica comprende residuos apolares y polares,
estando los residuos apolares y polares dispuestos para definir bandas longitudinales (verticales), en espiral, apolares y polares, sobre la superficie de la hélice. Al menos dos bandas apolares juntas definen
una superficie hidrófoba sobre la hélice, suficiente para interaccionar con la correspondiente superficie
hidrófoba de, al menos, otra cadena polipeptı́dica, para agregar las cadenas en una estructura superhelicoidal. Esta “formación de haz” superhelicoidal o “espiral enrollada”, es similar a la interacción entre
moléculas de queratina, miosina o tropomiosina. Los residuos de aminoácidos apolares que definen la
superficie hidrófoba sobre la hélice pueden ser residuos apolares cualesquiera, que se sepa que son buenos
formadores de hélices y que no interfieran estéricamente con la formación de la hélice o del haz. Los
aminoácidos apolares útiles incluyen alanina, valina, leucina e isoleucina, de los cuales son actualmente
preferidos los residuos de alanina.
Las bandas polares sobre las cadenas polipeptı́dicas helicoidales de esta invención se interponen entre
bandas apolares y comprenden aminoácidos adaptados para formar reticulaciones intercadenas dentro de
las estructuras superhelicoidales y entre ellas. La composición reticulada forma ası́ una matriz cohesiva,
insoluble. Además, estos residuos reticulables pueden también establecer interacciones con la superficie
a la que ha de unirse la composición adhesiva de esta invención, en un medio acuoso. Las bandas polares
están definidas preferiblemente por una disposición alternante, repetitiva, de dos residuos polares reticulables diferentes. En una realización de esta invención de máxima preferencia, las cadenas polipeptı́dicas
comprenden, al menos, tres bandas polares, distribuidas en forma de circunferencia alrededor de la superficie de la hélice.
La tirosina y la lisina son los aminoácidos polares reticulables actualmente preferidos, adaptados para
formar reticulaciones intercadenas. Los residuos de tirosina pueden modificarse para formar dopa y Oquinonas, que pueden reticularse con grupos amino, tales como los que hay en los residuos de lisina.
(Alternativamente, reticulaciones intercadenas entre estos u otros residuos apropiados, pueden formarse
utilizando un agente reticulante). Asimismo, los residuos de dopa son capaces de formar quelatos con
cationes metálicos unidos a la superficie, desplazando ası́ al agua de las superficies acuosas y permitiendo
que la matriz establezca múltiples interacciones no covalentes con la superficie. La suma de estas interacciones no covalentes es suficiente para adherir la matriz a una superficie en un medio acuoso. Ası́, la
composición sintética de esta invención proporciona una matriz cohesiva, adhesiva.
Una secuencia de aminoácidos preferida de las cadenas polipeptı́dicas cohesivas de esta invención,
comprende una o más copias de (Listado de Secuencia ID N◦ 2):
50
55
(Xaa1 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa2 -Xaa3 -Xaa2 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa3 -Xaa2 -Xaa3 -Xaa1 )b
donde Xaa1 es cualquier aminoácido apolar que forma hélice; Xaa2 y Xaa3 son aminoácidos reticulables,
adheribles a la superficie; y b es un número de 1 a 100. En general, cuanto mayor es el número b, más
cohesiva será la matriz. Los aminoácidos apolares útiles que forman hélices (Xaa1 ) incluyen, por ejemplo,
alanina, valina, leucina e isoleucina. Los aminoácidos reticulables útiles, adheribles a la superficie (Xaa2 ,
Xaa3 ) incluyen tirosina y lisina.
En una realización de esta invención de máxima preferencia, la secuencia de aminoácidos comprende
una o más copias de (Listado de Secuencia ID N◦ 3):
60
(Ala-Ala-Ala-Lys-Tyr-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Tyr-Lys-Tyr-Ala)b
donde b es un número de 1 a 100.
3
ES 2 147 727 T3
5
10
15
Como se indicó anteriormente, las cadenas polipeptı́dicas de esta invención pueden reticularse por
medio de un agente reticulante bifuncional (o multifuncional), tal como un dialdehı́do. Un agente reticulante actualmente preferido es el aldehı́do glutárico. Alternativamente, las cadenas polipeptı́dicas que
contienen tirosina y lisina pueden reticularse enzimáticamente por tratamiento con una enzima tirosinasa.
Los bioadhesivos de esta invención son particularmente útiles para unir compuestos biológicamente
activos tales como superficies celulares, y proteı́nas. La matriz adhesiva, cohesiva, de esta invención es
también útil como sistema de suministro para compuestos terapéuticos; por ejemplo, para mantener un
compuesto terapéutico en un sitio de aplicación in vivo. El método general comprende las etapas de
combinar el compuesto terapéutico con la composición de esta invención y un agente reticulante, de tal
modo que el agente terapéutico quede disperso dentro de la matriz adhesiva, cohesiva, y luego aplicar la
combinación al sitio de aplicación. Análogamente, la matriz adhesiva de esta invención puede utilizarse
para mantener células de reposición en un sitio de aplicación, para su uso como método de reparación
de tejidos, tal como, por ejemplo, células de reposición de los fibroblastos del ligamento periodontal,
sobre la superficie del ligamento periodontal. Se puede también combinar un factor de crecimiento con
la combinación de la matriz, para estimular el crecimiento celular. Alternativamente, la matriz puede
contener simplemente un factor de crecimiento, a fin de estimular el crecimiento celular en la superficie
de un tejido. Los factores de crecimiento útiles incluyen EGF, PDGF, TGF-β, TGF-α, FGF e IGF.
20
Los compuestos adhesivos de esta invención son también útiles como parte de un método de sellado
de incisiones quirúrgicas. El método incluye: la inducción de una reticulación entre las moléculas de esta
invención de modo que se forme una matriz adhesiva, cohesiva, insoluble; la aplicación de esta matriz a
una o más superficies en la incisión quirúrgica; y la puesta en contacto de las superficies.
25
30
La fuerza adhesiva y cohesiva de la composición de esta invención puede modularse variando la longitud de las cadenas polipeptı́dicas y variando el grado de reticulación intercadenas. La alteración de
la fuerza cohesiva y adhesiva de la composición puede alterar la velocidad de resorción de la matriz in
vivo, ası́ como la velocidad de liberación de los compuestos terapéuticos desde la matriz en el sitio de
aplicación in vivo.
Se contempla también que la composición de esta invención proporcione matrices adhesivas, cohesivas,
útiles en aplicaciones no biológicas, tales como las aplicaciones marinas.
35
Las cadenas polipeptı́dicas de esta invención pueden sintetizarse por medios quı́micos en un sintetizador de péptidos, o por tecnologı́a de ADN recombinante y expresión en un sistema hospedante eucariótico
o procariótico adecuado. Un hospedante actualmente preferido es Escherichia coli.
Breve descripción de los dibujos
40
La Figura 1 (A-C) muestra diversas representaciones esquemáticas de cadenas polipeptı́dicas αhelicoidales y espirales enrolladas;
45
la Figura 2 (A-B) muestra diversas representaciones esquemáticas de las cadenas polipeptı́dicas cohesivas/adhesivas de esta invención;
la Figura 3 es una reproducción fotográfica de geles SDS-PAGE, que ilustran diversas propiedades de
las hélices cohesivas de esta invención;
50
55
las Figuras 4 (A-B) y 5 (A-B) representan cromatografı́as HPLC de un péptido de control positivo
(P95, Fig. 4) y de un péptido de control negativo (P4, Fig. 5), antes (A) y después (B) de un tratamiento
con tirosinasa de hongos; y
las Figuras 6-8 ilustran diseños de genes útiles para la producción recombinante de las cadenas polipeptı́dicas de esta invención.
Descripción detallada
60
Los principios del plegamiento de proteı́nas están suficientemente bien comprendidos ahora que los
expertos en la técnica pueden predecir, con confianza, secuencias de péptidos que son capaces de formar α-hélices en solución. De hecho, esta capacidad predictiva ha permitido a la técnica buscar una
nueva forma de diseño de proteı́nas complejas. (Véase, por ejemplo, Cohen et al. (1990), Proteins 7,
4
ES 2 147 727 T3
5
10
15
20
25
30
1-15; ó DeGrado, W.F. et al. (1988), Science 241, 976-78). Entre las reglas o algoritmos empleados
más comúnmente para predecir la estructura secundaria de cadenas polipeptı́dicas en solución, están los
catálogos de Chou-Fasman y Garnier-Robson de las predisposiciones α-helicoidales de los aminoácidos
(Chou, P.Y. et al., Adv. Enzym., 1978, 47, 45; Garnier, J. et al. (1978), J. Mol. Biol. 120, 87).
Una descripción de las “reglas” o parámetros de configuración que gobiernan la formación de hélices, se
presenta, en profundidad, en numerosos textos conocidos por las personas con experiencia normal en la
técnica (véanse, por ejemplo, los capı́tulos 5 y 6 de “Principles of Protein Structure”, G.E. Schulz et al.,
Springer-Verlag, New York, 1979).
Se ha diseñado ahora una composición adhesiva para su uso en medios acuosos, que comprende cadenas polipeptı́dicas capaces de formar α-hélices cohesivas. Las cadenas polipeptı́dicas helicoidales de esta
invención son capaces de interaccionar para formar estructuras superhelicoidales (por ejemplo, espirales
enrolladas). Además, las cadenas polipeptı́dicas de esta invención contienen aminoácidos polares dispuestos adecuadamente, que se adaptan para formar reticulaciones intercadenas dentro de las estructuras
superhelicoidales y entre ellas (para formar una matriz reticulada insoluble), y que son también capaces
de interaccionar con las superficies que han de unirse en un medio acuoso.
El diseño de las α-hélices cohesivas, adhesivas, de esta invención, se basa, en parte, en la conocida
configuración estructural de las espirales enrolladas en hélice, tales como las encontradas en la queratina,
miosina o tropomiosina. Una descripción detallada de espirales enrolladas de dos y de tres hebras, puede
encontrarse en Cohen et al. (1990), Proteins 7, 1-15; Crick, F.H. (1953), Acta Cristallogr. 6, 689-97;
Schultz, G.E., “Principles of Protein Structure”, Springer-Verlag, New York, 1979; y Dickerson, R.E.
y Geis, I., “The Structure and Action of Proteins”, W.A. Benjamin Co., Inc., Menlo Park, 1969. En
términos breves, y como se ilustra en las Fig. 1A y 1B, las espirales enrolladas en hélice, de tres y de dos
hebras, comprenden α-hélices a derechas 10, que interaccionan como hebras de un cordón alrededor del
eje central de una “superhélice” 12. Cada una de las hélices está ligeramente distorsionada (aproximadamente 10◦ ) respecto al eje central, y la superhélice global 14 tiene una torsión a izquierdas. La geometrı́a
de cada hebra de la hélice en una configuración en espiral, es una septena repetitiva, representada en
la Fig. 1B por los números 1 a 7 y 1’ a 7’. (La representación esquemática de la Fig. 1B mira hacia
abajo el eje de la superhélice de una espiral de dos hebras). El resultado es que cada séptimo residuo
de la secuencia de aminoácidos de una hélice dada, en una configuración en espiral, está en una posición
estructuralmente equivalente, como se muestra en la Fig. 1C, formando una “banda” en espiral vertical
(longitudinal) 16 sobre la superficie de la hélice.
45
Para que las α-hélices interaccionen para formar una estructura superhelicoidal, una porción, al menos, de cada superficie de la hélice debe ser compatible para la interacción. Esto se consigue, del modo
más fácil, por interacciones hidrófobas entre las hélices. Tal como se usa en la presente invención, la
expresión “superficie hidrófoba” se entiende que describe una región de la superficie de la hélice suficiente
para permitir la interacción hidrófoba entre las hélices. La superficie hidrófoba sobre estas hélices se
define por dos bandas longitudinales adyacentes, que comprenden aminoácidos apolares (por ejemplo,
bandas definidas por residuos espaciados con una separación de cuatro aminoácidos en la secuencia repetitiva de la septena: 1 a 4 y 1’ a 4’ en la Fig. 1B, estando representadas las superficies hidrófobas
que interaccionan por el área punteada 20). Aminoácidos apolares útiles pueden ser cualesquiera de los
aminoácidos apolares, tales como la alanina, valina, leucina e isoleucina, que son buenos formadores de
hélices, y que no interfieren estéricamente con la estructura cohesiva de la hélice.
50
Las estructuras de espiral enrollada de la técnica también pueden estabilizarse por medio de interacciones no covalentes, tales como puentes salinos entre residuos apropiados dentro de las correspondientes
bandas que flanquean las superficies hidrófobas que interaccionan (por ejemplo, bandas definidas por los
residuos 5, 7’ y 7, 5’ de la Fig. 1B, estando la interacción representada por las lı́neas de trazos 22).
35
40
55
60
Las cadenas polipeptı́dicas de esta invención se diseñan para que formen una matriz reticulada cohesiva, insoluble, que es estable en medios acuosos, y que puede usarse como composición adhesiva en
estos medios. El diseño aprovecha la estructura de α-hélices cohesivas para crear una arquitectura especı́fica, alrededor de la cual puede crearse una matriz reticulada, adhesiva. Las cadenas polipeptı́dicas
α-helicoidales se diseñan para permitir una reticulación intercadenas dentro de las espirales enrolladas y
entre ellas. Por consiguiente, las bandas definidas por los residuos 5, 6 y 7 comprenden aminoácidos polares reticulables. La estabilización intercadenas dentro de una espiral puede tener lugar por reticulación
entre las correspondientes bandas (por ejemplo, 5, 7’ y 7, 5’). La reticulación intercadenas entre espirales
enrolladas puede llevarse a cabo por medio de residuos en las correspondientes bandas definidas por el
residuo 6, de modo que se forme una matriz reticulada cohesiva, insoluble, de estructuras superhelicoidales pegadas (véase, por ejemplo, la Fig. 2A, donde las lı́neas de trazo continuo 18 indican reticulaciones
5
ES 2 147 727 T3
entre estructuras superhelicoidales).
5
10
15
Las cadenas polipeptı́dicas de esta invención también deben ser capaces de adherirse a la superficie o
superficies que han de ser unidas por el adhesivo en un medio acuoso. En una realización preferida de
esta invención, los residuos polares reticulables son, ellos mismos, los residuos responsables de la adhesión
a estas superficies. Estos residuos se dice que son “adheribles a la superficie” o “adherentes a la superficie”. En una realización de máxima preferencia, las bandas polares están definidas por una disposición
alternante repetitiva de dos residuos reticulables, que son también capaces de interaccionar con la superficie que ha de unirse en un medio acuoso. Alternando la disposición de los residuos reticulables dentro
de las bandas polares, puede conseguirse el número máximo de interacciones entre las correspondientes
bandas sobre diferentes cadenas. La ubicación de compañeros de reticulación adecuados entre dos bandas
correspondientes, requiere sólo un desplazamiento pequeño, hacia arriba o hacia abajo, por una de las
cadenas.
La realización preferida del diseño de la cadena polipeptı́dica de esta invención puede describirse por
la secuencia genérica de catorce aminoácidos (14-mero), mostrada a continuación, que se repite una o
más veces en una cadena polipeptı́dica de esta invención (Listado de Secuencia ID N◦ 2):
(Xaa1 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa2 -Xaa3 -Xaa2 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa3 -Xaa2 -Xaa3 -Xaa1 )b
20
en la que Xaa1 es cualquier aminoácido apolar que forma hélice; Xaa2 y Xaa3 son aminoácidos reticulables, adheribles a la superficie; y b es un número de 1 a 100.
Una realización que actualmente tiene la máxima preferencia, comprende una o más copias de la
siguiente secuencia de aminoácidos (Listado de Secuencia ID N◦ 3):
25
30
35
40
45
50
55
60
(Ala-Ala-Ala-Lys-Tyr-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Tyr-Lys-Tyr-Ala)b
donde b es un número de 1 a 100; y Ala, Lys y Tyr son residuos de alanina, lisina y tirosina, respectivamente. La lisina y la tirosina son ambos residuos polares que pueden establecer interacciones no
covalentes con la superficie que ha de unirse, y la tirosina puede modificarse para formar dopa, que puede
desplazar al agua de las superficies acuosas, por quelación de cationes metálicos.
La Fig. 2B es una representación helicoidal de esta secuencia de aminoácidos preferida, donde b=1,5.
Las lı́neas se dibujan a través de las tres bandas polares longitudinales, definidas por los residuos de
tirosina y de lisina en esta secuencia.
Haciendo que la unidad repetitiva mı́nima sea una secuencia de catorce aminoácidos, los residuos reticulables alternarán en secuencia, dentro de las tres bandas polares respectivas. Colocando aminoácidos
apolares en los dos extremos de la unidad repetitiva, las α-hélices y las estructuras superhelicoidales
pueden prolongarse como cadenas adicionales, adecuadamente configuradas para añadirse a los extremos
de estas estructuras.
Además de estas consideraciones generales para la formación de las α-hélices de esta invención, se
puede también promover la formación de hélices y la estabilidad de las composiciones de esta invención
incluyendo uno o varios grupos cargados negativamente en el extremo N-terminal (+), y uno o varios
grupos cargados positivamente en el extremo C-terminal de la hélice. El efecto de estos grupos cargados
es aumentar el momento dipolar a través de los enlaces peptı́dicos a lo largo de la hélice, promoviendo
ası́ la estabilidad de la hélice (Shoemaker et al. (1987), Nature 236, 563-67).
La matriz adhesiva de esta invención está particularmente adaptada para permitir que los compuestos
terapéuticos y/o las células de reposición se dispersen dentro de ella, de modo que la matriz puede actuar
como vehı́culo de suministro, capaz de mantener compuestos en un sitio de aplicación in vivo. Puesto
que las estructuras de las cadenas polipeptı́dicas de esta invención se diseñan para formar α-hélices que
se peguen en solución, la matriz tendrá carácter adhesivo y cohesivo, incluso en ausencia de reticulación
intercadenas. Ası́, la fuerza de la matriz cohesiva puede modularse alterando la longitud de los péptidos
y el grado de reticulación entre las cadenas. Esto permite que la matriz sea útil para una variedad de
aplicaciones médicas diferentes.
De particular interés es el uso de la matriz para mantener lı́neas celulares primarias, especialmente
las capaces de secretar los componentes que forman el tendón, ligamento y cartı́lago, en un sitio de aplicación in vivo. Por ejemplo, durante la periodontitis, hay una pérdida especı́fica de matriz extracelular
del ligamento que mantiene los dientes en posición. Hay también perdida de los fibroblastos del ligamento
periodontal que sintetiza la matriz extracelular. La capacidad de suministrar células de reposición y/o
6
ES 2 147 727 T3
de factores que promueven el crecimiento celular (por ejemplo, factores de crecimiento tales como EGF,
PDGF, TGF-β, TGF-α, FGF e IGF) al sitio de pérdida de tejido, y la capacidad de hacer que esas células
y los compuestos terapéuticos estén en el sitio de aplicación, pueden tener un impacto significativo en el
tratamiento de la periodontitis y otras enfermedades que estén caracterizadas por la pérdida de tejido.
5
10
15
La matriz también puede emplearse para cerrar incisiones quirúrgicas. La fuerza adhesiva de la matriz puede modularse para que se corresponda con el perı́odo de tiempo necesario para que sanen las
superficies del tejido. Un tejido que sana rápidamente, tal como el de la piel o el hı́gado, puede requerir
matrices mı́nimamente reticuladas, mientras que los adhesivos utilizados en el protocolo de sustitución
de la córnea, que puede tardar hasta cuatro meses en cicatrizar, pueden requerir segmentos repetitivos
más largos y una reticulación aumentada.
Las cadenas polipeptı́dicas de esta invención pueden sintetizarse por medios quı́micos, en un sintetizador de péptidos en fase sólida, o por tecnologı́a de ADN recombinante, empleando procedimientos bien
conocidos por las personas con experiencia normal en la técnica.
Ejemplo 1
Sı́ntesis en fase sólida
20
25
30
La sı́ntesis de péptidos en fase sólida, descrita a continuación, sigue protocolos bien conocidos por las
personas con experiencia normal en la técnica, y por ello, no se describe aquı́ con detalle. Los péptidos
de esta invención se sintetizan utilizando un protocolo general descrito en la solicitud de patente de los
EE.UU. N◦ de serie 028.500 (presentada el 20 de marzo de 1987), cuya descripción se incorpora aquı́ por
su referencia. En términos breves, los péptidos se sintetizan en un sintetizador de péptidos en fase sólida
de Biosearch, utilizando procedimientos de operación estándar. Las cadenas completadas se desprotegen
luego y se purifican por HPLC (cromatografı́a de lı́quidos de alta eficiencia).
Varios péptidos diferentes, descritos con detalle a continuación, se sintetizan por este método, incluyendo péptidos de control positivo y negativo, para los ensayos de adhesión y cohesión:
P150 Un polipéptido de 21 aminoácidos, que tiene una secuencia de aminoácidos preferida de esta invención (Listado de Secuencia ID N◦ 4):
35
40
Ala-Ala-Ala-Lys-Tyr-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Tyr-Lys-Tyr-Ala-Ala-Ala-Ala-Lys-Tyr-Lys-Ala
El péptido se diseña de tal modo que tres bandas polares definidas por una disposición alternante
de residuos de lisina y tirosina, se distribuyan en forma de circunferencia alrededor de la superficie de
la hélice. Se eligen alaninas como residuos apolares, para favorecer la adopción de una estructura αhelicoidal en solución. Los algoritmos de Chou-Fasman y Garnier-Robson para la estructura secundaria
predicha indican un contenido de α-hélice entre 67 % y 100 %.
P95 Un control positivo, modelado según la unidad repetitiva de 10 aminoácidos de la proteı́na de la
goma de mejillón (Listado de Secuencia ID N◦ 5):
45
Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Xaa1 -Xaa1 -Thr-Tyr-Lys
donde Xaa1 es hidroxiprolina.
50
P96 Un control positivo, modelado también según el decapéptido de la proteı́na de la goma de mejillón.
P96 difiere de P95 en que tiene tres de las unidades repetitivas del decapéptido de P95:
[P95]3
55
P68 Un control negativo, que contiene lisinas, y una secuencia de aminoácidos con un carácter α-helicoidal
sustancial predicho (entre 56 y 100 %), pero que no tiene residuos de tirosina (Listado de Secuencia ID
N◦ 6):
Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Asn-Leu-Glu-Asp-Ala-Gly.
60
7
ES 2 147 727 T3
Ejemplo 2
Evaluación biológica
5
10
Péptidos P150 y controles apropiados se evalúan para determinar sus capacidades adhesivas y cohesivas, utilizando los ensayos descritos a continuación.
La ligación de células de pulmón de visón a un plástico se emplea para evaluar la capacidad de los
péptidos bioadhesivos para promover la adhesión celular. Se deja que los péptidos se adsorban sobre la
superficie de una placa de titulación de 96 pocillos, desde un tampón de bicarbonato. La superficie se lava
con agua, y las células de pulmón de visón (en un medio libre de suero) se aplican luego a la superficie.
En las condiciones del ensayo, las células de pulmón de visón no se adhieren a la superficie de la placa,
a menos que la proteı́na o péptido que reviste la placa presente propiedades de adherencia celular. La
adhesión celular se sigue por examen visual en un microscopio.
15
En este y en los siguientes ejemplos, se utilizaron P95, P96 y la proteı́na bioadhesiva del mejillón
(“Cell Tak”), adquiridos en Collaborative Research, como controles positivos. Los controles negativos
son P68 y seroalbúmiba bovina (BSA).
20
25
La Tabla 1 muestra la capacidad relativa de las proteı́nas y los péptidos no modificados, para promover
la adherencia celular. Como se esperaba, cuando no hay proteı́na en la placa, o las placas están revestidas
con BSA ó P68, no hay ligación de células. Sin embargo, en presencia de un bioadhesivo conocido (proteı́na
de la goma de mejillón), o de péptidos modelados según el decapéptido bioadhesivo del mejillón (P95 y
P96), hay una adhesión celular significativa. Análogamente, el nuevo péptido P150 también presenta la
misma magnitud de ligación celular.
TABLA 1
Adhesión celular con péptidos sintéticos
30
35
40
Proteı́na/péptido
Adhesión celular
Ninguno
Albúmina (BSA)
Proteı́na bioadhesiva del
mejillón (“Cell Tak”)
P68
P95
P96
P150
+
+
+
+
Ejemplo 3
45
50
55
60
El ensayo de reticulación (cohesión)
Los péptidos se reticulan quı́micamente, con aldehı́do glutárico, siguiendo el método de Waite, J.H.,
descrito en el documento US 4.808.702, presentado el 1 de junio de 1987, o enzimáticamente con una
enzima tirosinasa. La reticulación de proteı́nas y péptidos puede seguirse visualmente (para detectar la
aparición de un precipitado), ası́ como por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS
(PAGE), o por HPLC.
La reticulación enzimática se realiza esencialmente siguiendo el protocolo de Marumo et al., 1986,
Biochem. Biophys. Acta 872, 98. Una muestra, con una relación en peso de aproximadamente 10:1 de
péptido a enzima, se incuba durante, al menos, dos horas en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5. En estos experimentos, se emplea enzima tirosinasa bruta de hongos (de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Para
promover la reticulación, pueden también emplearse otras enzimas, tales como la catecol 2,3-dioxigenasa.
La Fig. 3 es un gel ilustrativo (SDS PAGE) de este experimento, realizado sobre diversas muestras de
péptidos. Los péptidos P150 y P96 no tratados (pistas 2 y 3, respectivamente) migran al fondo del gel.
Los mismos péptidos forman especies de orden superior (visualizadas como una mancha sobre el gel)
después del tratamiento con tirosinasa (P150 + tirosinasa, pistas 5 y 9; P96 + tirosinasa, pistas 6 y 11).
Las restantes pistas sobre el gel son estándares de peso molecular (pistas 1, 14), la muestra de enzima
8
ES 2 147 727 T3
tirosinasa bruta sola (pistas 7, 13) o son blancos (pistas 4, 8, 12).
5
10
15
Por el contrario, los péptidos de control negativo que no incluyen un aminoácido tirosina no se afectan
por el tratamiento con enzima tirosinasa, como se ilustra en las Figuras 4 y 5. Las Figuras 4 y 5 representan cromatografı́as HPLC de dos muestras de péptido diferentes, antes (panel A) y después (panel B)
del tratamiento con enzima tirosinasa. Las proteı́nas se eluyen empleando un gradiente de acetonitrilo.
La Fig. 4 muestra el efecto del tratamiento con enzima tirosinasa sobre un control positivo (P95). La
reticulación con enzima tirosinasa da como resultado un cambio sustancial en el pico de absorbancia a
los 15 min, como se muestra en la Fig. 4B. La Fig. 5 muestra el efecto del tratamiento con enzima
tirosinasa sobre un péptido de control negativo (P4, un pequeño péptido de control negativo, que no
contiene residuos de tirosina). En este caso, el tratamiento con enzima tirosinasa no tiene efecto sobre el
pico de absorbancia a los 15 min, como se muestra en la Fig. 5B.
A fin de determinar si las propiedades de ligación celular que presentan los péptidos, se mantienen
durante la reticulación, diversos péptidos de ensayo (ası́ como BSA y la proteı́na de la goma de mejillón)
se reticulan quı́micamente, usando aldehı́do glutárico al 50 % antes de su adsorción sobre la superficie
de la placa de titulación. Todos los péptidos forman agregados de orden superior y precipitan después
del tratamiento con aldehı́do glutárico, como se indica por la formación de precipitado y visualización de
agregados de alto peso molecular sobre geles de poliacrilamida, en presencia de SDS.
20
Como puede verse en la Tabla 2, la reticulación quı́mica no promueve la ligación celular en los controles
negativos (BSA y P68), y no interfiere con las propiedades de adhesión celular de la proteı́na de la goma
de mejillón ó de los péptidos P95 y P150. Además, las propiedades adhesivas de P150, cuando se usa
solo, mejoran significativamente por reticulación.
25
TABLA 2
Adhesión celular en presencia de reticulación
30
35
40
Proteı́na/péptido
Adhesión celular
Ninguno
Albúmina (BSA)
y aldehı́do glutárico
Proteı́na bioadhesiva del
mejillón y aldehı́do glutárico
P95 y tirosinasa y
aldehı́do glutárico
P150 y tirosinasa
y aldehı́do glutárico
+
+/++
Ejemplo 4
45
50
55
60
Preparación de genes recombinantes para P150
Las composiciones de esta invención también pueden sintetizarse por tecnologı́a de ADN recombinante,
utilizando procedimientos bien conocidos por las personas con experiencia normal en la técnica. Los procedimientos para manipular, amplificar y recombinar el ADN que codifica secuencias de aminoácidos de
interés, son generalmente bien conocidos en la técnica y no se describen aquı́ con detalle. Los métodos
de identificación y aislamiento de genes codificadores de proteı́nas de interés, o los métodos para la construcción de tales genes, están bien comprendidos y desarrollados. Estos procedimientos se describen en la
bibliografı́a de patentes y en otras fuentes (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. N◦ 4.431.739).
En general, los métodos implican la selección del material genético que codifica los aminoácidos que definen a los polipéptidos de interés, de acuerdo con el código genético.
Por consiguiente, además de tomar en consideración los principios de construcción del ADN descritos
en la presente, los polipéptidos de esta invención pueden sintetizarse por vı́a recombinante, empleando
una cualquiera de las varias técnicas de construcción y enzimas de restricción diferentes conocidas. Hay
disponibles diversas secuencias promotoras y otras secuencias reguladoras de ADN, utilizadas para llevar
a cabo la expresión, ası́ como diversos tipos de células hospedantes, incluyendo lı́neas celulares animales y
células procarióticas. Una célula hospedante actualmente preferida es E. coli. Pueden emplearse diversos
9
ES 2 147 727 T3
5
10
tipos de vectores, tales como plásmidos y virus, incluyendo virus animales y bacteriófagos, ası́ como sus
combinaciones. Los vectores también pueden aprovechar diversos genes marcadores bien conocidos en
la técnica, que imparten a una célula transfectada con éxito, una propiedad fenotı́pica detectable, que
puede emplearse para identificar cuál de entre una familia de células ha incorporado con éxito el ADN
recombinante del vector. Dado el estado precedente de la técnica de ingenierı́a genética, las personas
expertas están capacitadas para poner en práctica la invención descrita en la presente Memoria, a la
vista de esta descripción.
La unidad repetitiva que forma el núcleo del péptido P150, utilizada en los diseños de genes descritos
a continuación, es un 14-mero de la siguiente secuencia (Listado de Secuencia ID N◦ 3):
Ala-Ala-Ala-Lys-Tyr-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Tyr-Lys-Tyr-Ala.
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Un par de oligonucleótidos sintéticos de aproximadamente 60 residuos (véase la Fig. 6A y/ó 6B,
Listados de Secuencia ID N◦ 7 y/ó 8, respectivamente), que codifican este bloque básico de construcción,
se sintetizan utilizando un sintetizador de polinucleótidos convencional, automatizado (por ejemplo, un
sintetizador de ADN Milligen 7500). Seguidamente, los oligonucleótidos sintéticos se desprotegen, se
purifican por métodos convencionales y se clonan en un vector apropiado (por ejemplo, un vector de
clonación del tipo pUC), empleando la tecnologı́a general de clonación conocida en la técnica (véase, por
ejemplo, Yanisch-Perron, C. et al. (1985), Gene 33, 103-19).
El diseño de genes dado a continuación e ilustrado en la Fig. 6 (A y B) incorpora las siguientes
consideraciones: el gen comienza con una metionina, termina en un codón de parada, y está flanqueado
por sitios de restricción para corte y empalme en vectores de expresión adecuados. Contiene además
un conjunto de sitios de restricción que permiten la disposición en tándem y otras prolongaciones de los
segmentos repetitivos. Pueden hacerse dos versiones, que se utilizan para producir un primer tándem
con sitios de restricción internos únicos. La secuencia contiene también un sitio AlwNI que permite la
polimerización de fragmentos en una forma unidireccional, debido a la naturaleza del extremo cohesivo
de este sitio de restricción.
Utilizando las dos versiones de la secuencia de nucleótidos mostradas en la Fig. 6, se genera fácilmente
una secuencia en tándem, por corte y empalme del extremo 3’ PvuII del gen de la versión I (Fig. 6A,
Listado de Secuencia ID N◦ 7) con el extremo 5’ PvuII del gen de la versión 2 (Fig. 6B, Listado de
Secuencia ID N◦ 8). Después de combinar las dos hebras, se obtiene el gen en tándem mostrado en la
Fig. 7.
Se puede también insertar uno o más fragmentos que contienen el gen en tándem de la Fig. 5, en
uno de los sitios Pst generados por una digestión parcial con PstI, para obtener un gen codificador, por
ejemplo, de cuatro repeticiones de la secuencia de 14 aminoácidos que forma el núcleo de P150 (Véase la
Fig. 7).
El procedimiento general descrito en la presente permite la sı́ntesis de genes que codifican cualquier
número de repeticiones de la región del núcleo de P150. La precisión del ensamblaje del gen se evalúa por
métodos convencionales de secuenciación de Sanger. Si se desean cambios en la secuencia de aminoácidos
(por ejemplo, para mejorar la solubilidad de la proteı́na), esto puede hacerse por mutagénesis dirigida al
sitio sobre la molécula de la unidad básica de P150, antes de una extensa formación del tándem.
La expresión directa de las proteı́nas P150 en E. coli es posible empleando metionina como primer
aminoácido. La expresión de las proteı́nas también puede mejorarse utilizando la tecnologı́a de expresión
de polipéptidos descrita en la solicitud de patente de los EE.UU. N◦ de serie 028.500 (presentada el 20
de marzo de 1987, incorporada por su referencia, ut supra) y en la patente de los EE.UU. N◦ 4.743.679,
cuya descripción se incorpora a la presente por su referencia.
El empleo de esta tecnologı́a para sobre-expresar los péptidos de esta invención da como resultado
la precipitación de la proteı́na deseada, como una proteı́na de fusión, dentro de la bacteria, para formar
cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión pueden recuperarse fácilmente de la bacteria sometida a
lisis, y la proteı́na de fusión renaturalizarse empleando una mezcla de agentes reductor y desnaturalizante.
La secuencia lı́der de la proteı́na puede seguidamente retirarse de la proteı́na expresada, por métodos de
escisión quı́mica o enzimática, y la proteı́na resultante puede purificarse por cromatografı́a secuencial.
Ejemplos adicionales
La capacidad de “encolar” de las composiciones de esta invención, se mide fácilmente utilizando el
10
ES 2 147 727 T3
procedimiento de Harris et al. (1988, Laryngoscope 98, 731), en el que la composición se aplica a dos
superficies de tejido fresco (dura), las superficies se ponen en contacto para permitir la formación de
enlaces entre las superficies, y se determina la cantidad en peso necesaria para romper el enlace.
5
10
15
20
25
30
Los productos de suministro de fármacos de las composición de esta invención pueden también evaluarse fácilmente en un ensayo de mitogénesis in vitro. Se determina, en primer lugar, la concentración
mı́nima de agente reticulante (preferiblemente tirosinasa) necesaria para la formación de la matriz. Empleando esta concentración, la enzima tirosinasa y un factor de crecimiento apropiado se mezclan con la
proteı́na adhesiva que ha de evaluarse, en placas de cultivo de células de 96 pocillos. Tras la formación de
la matriz, las placas se lavan y se incuban con células confluentes de fibroblastos 3T3 y timidina marcada.
La presencia de los factores de crecimiento induce la mitogénesis, permitiendo que las células incorporen
timidina marcada. La cantidad de timidina incorporada se cuantifica por autorradiografı́a o por recuento
de centelleo de lı́quidos, para determinar el grado de estimulación de las células.
La replicación celular dentro de la matriz puede medirse siguiendo la velocidad de incorporación,
al ADN, de un nucleótido marcado, empleando metodologı́a estándar y, por ejemplo, timidina tritiada.
Muestras que comprenden la composición de esta invención, una concentración conocida de células de
reposición y una enzima tirosinasa, se incuban, en primer lugar, en un medio de crecimiento, en presencia
de 3 H-timidina. Las muestras se liofilizan seguidamente, y los pesos en seco se determinan en una balanza
analı́tica. A continuación, se disuelven las muestras en ácido fórmico al 70 %, a lo largo de la noche, a
70◦C, se neutralizan y se someten a recuento en un contador de centelleo de lı́quidos. Las células en
crecimiento incorporarán la timidina marcada y la cantidad de timidina marcada incorporada, asociada
con la matriz, será proporcional al grado de replicación celular que tiene lugar.
La invención puede realizarse de otras formas especı́ficas, sin apartarse de su espı́ritu o de sus caracterı́sticas esenciales. Las presentes realizaciones han de considerarse, por tanto, desde todos los puntos
de vista, como ilustrativas y no como restrictivas, estando indicado el alcance de la invención por las
reivindicaciones anexas más bien que por la descripción precedente, y todos los cambios que quepan en el
significado e intervalo de equivalencia de las reivindicaciones, se entiende, por tanto, que están abarcados
por ellas.
Listado de secuencias
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
35
40
(i)
SOLICITANTE:
Roy H.L. Pang,
Charles M. Cohen
Peter C. Keck
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Bioadhesivo sintético
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
45
50
(iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
(A) DESTINATARIO: Lahive & Cockfield
(B) CALLE: 60 State Street
(C) CIUDAD: Boston
(D) ESTADO: Massachusetts
(E) PAÍS: EE.UU.
(F) CÓDIGO ZIP: 02109
55
60
(v) FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
(A) TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5 pulg., 720 kb
(B) ORDENADOR: IBM XT
(C) SISTEMA OPERATIVO: DOS 3.30
(D) PROGRAMA: Asc II Text
(vi) DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 14 diciembre 1990
11
ES 2 147 727 T3
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No.1:
5
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 10 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteı́na
10
(ix) CARACTERÍSTICA:
(D) OTRA INFORMACIÓN: Xaa1 es 3Hyp ó 4Hyp; Xaa2 es
3-4-dihidroxilfenil-alanina.
15
(x) INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
(A) AUTORES:
20
25
Waite, J. Herbert
Housley, Timothy J.
Tanzer, Marvin L.
(B) TÍTULO: “Peptide Repeats in a Mussel Glue Protein:
theme and variations”
(C) REVISTA: Biochemistry
(D) VOLUMEN: 24
(E) NÚMERO: 19
30
(F) PÁGINAS: 5010-2014
(G) FECHA: 1985
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No.1:
Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa1 Xaa1 Thr Xaa2 Lys
1
5
10
35
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No.2:
40
45
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 14 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteı́na
(ix) CARACTERÍSTICA:
50
55
(D) OTRA INFORMACIÓN: Xaa1 es cualquier aminoácido apolar formador de
hélice; Xaa2 y Xaa3 son aminoácidos reticulables adheribles a la superficie. La secuencia
puede repetirse hasta, al menos, aproximadamente 100 veces en una cadena polipeptı́dica.
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No.2:
60
Xaa1 Xaa1 Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa2 Xaa1 Xaa1 Xaa1 Xaa1 Xaa3 Xaa2 Xaa3 Xaa1
1
5
10
12
ES 2 147 727 T3
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No.3:
5
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 14 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteı́na
10
(ix) CARACTERÍSTICA:
15
(D) OTRA INFORMACIÓN: La secuencia puede repetirse hasta, al menos, aproximadamente 100 veces en una cadena polipeptı́dica.
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No.3:
20
Ala Ala Ala Lys Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Tyr Ala
1
5
10
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No.4:
25
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 21 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
30
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteı́na
35
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No.4:
Ala Ala Ala Lys Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Tyr Ala Ala Ala
1
5
10
15
40
Ala Lys Tyr Lys Ala
20
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No.5:
45
50
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 10 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteı́na
(ix) CARACTERÍSTICA:
55
(D) OTRA INFORMACIÓN: Xaa1 es 3Hyp ó 4Hyp.
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No.5:
60
Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa1 Xaa1 Thr Tyr Lys
1
5
10
13
ES 2 147 727 T3
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No.6:
5
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 18 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteı́na
10
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No.6:
15
Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Asn Leu Glu Asp
1
5
10
15
Ala Gly
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No.7:
20
25
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 63 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No.7:
30
CC ATG GCT GCT GCA GCT AAG TAC AAA GCA GCC GCT GCA TAT AAA TAT 47
Met Ala Ala Ala Ala Lys Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Tyr
1
5
10
15
35
GCC GCA GCT GGC TAGC
Ala Ala Ala Gly
63
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No.8:
40
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 63 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
45
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN
50
55
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No.8:
CC ATG
Met
1
GCT GCT
Ala Ala
GCA GCA GCT GCT AAG TAC AAA GCA GCC GCT GCA TAT AAA TAT 47
Ala Ala Ala Ala Lys Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Tyr
5
10
15
GCA GGC TAGC
63
Ala Gly
60
14
ES 2 147 727 T3
REIVINDICACIONES
1. Un método de preparación de una composición sintética para su uso como adhesivo en medios
acuosos, que comprende:
5
ensamblar una pluralidad de cadenas polipeptı́dicas, comprendiendo cada cadena polipeptı́dica
aminoácidos apolares y polares, y teniendo una estructura helicoidal en medios acuosos;
10
15
20
disponer los aminoácidos apolares y polares para definir bandas longitudinales, en espiral, apolares y
polares, sobre la superficie de la hélice, estando las bandas polares interpuestas entre las bandas apolares,
siendo capaces, al menos dos bandas apolares juntas, de establecer una interacción hidrófoba suficiente
con las correspondientes bandas apolares de, al menos, otra cadena polipeptı́dica, para agregar las cadenas en una estructura superhelicoidal;
comprendiendo cada banda polar aminoácidos reticulables, adherentes a la superficie, adaptados para
formar reticulaciones intercadenas dentro de las cadenas polipeptı́dicas agregadas y entre ellas, y dicha
pluralidad de cadenas polipeptı́dicas están agregadas y reticuladas, con lo que dicha composición puede
adherirse a una superficie en un medio acuoso.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la estructura superhelicoidal es una espiral enrollada.
3. El método de la reivindicación 1, en el que tres bandas polares están distribuidas en forma de
circunferencia alrededor de la superficie de la hélice, y cada banda polar está definida, por ejemplo, por
una disposición alternante repetitiva de dos aminoácidos polares reticulables diferentes.
25
4. Un método de preparación de una composición sintética, que comprende la construcción de una
pluralidad de cadenas polipeptı́dicas que tienen una o más copias de la secuencia de aminoácidos (Listado
de Secuencia ID N◦ 2):
30
(Xaa1 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa2 -Xaa3 -Xaa2 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa3 -Xaa2 -Xaa3 -Xaa1 )b
donde Xaa1 es cualquier aminoácido apolar que forma hélice; Xaa2 y Xaa3 son aminoácidos polares reticulables, adheribles a la superficie; y b es un número de 1 a 100.
35
5. El método de la reivindicación 4, en el que las cadenas polipeptı́dicas se suministran con una o
más copias de la secuencia de aminoácidos (Listado de Secuencia ID N◦ 3):
(Ala-Ala-Ala-Lys-Tyr-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Tyr-Lys-Tyr-Ala)b
40
donde b es un número de 1 a 100.
6. Un método de preparación de una matriz sintética que tiene propiedades adhesivas sustanciales en
medios acuosos, que comprende:
45
50
55
proporcionar cadenas polipeptı́dicas reticuladas, comprendiendo cada cadena polipeptı́dica aminoácidos apolares y polares, y teniendo una estructura helicoidal en medios acuosos;
disponer los aminoácidos apolares y polares para definir bandas longitudinales, en espiral, apolares y
polares, sobre la superficie de la hélice, estando las bandas polares interpuestas entre las bandas apolares,
siendo capaces, al menos dos bandas apolares juntas, de establecer una interacción hidrófoba suficiente
con las correspondientes bandas apolares de, al menos, otra cadena polipeptı́dica, para agregar las cadenas en una estructura superhelicoidal;
dotar cada banda polar de aminoácidos reticulables, adherentes a la superficie, y formar con ellos
reticulaciones intercadenas dentro de las estructuras superhelicoidales y entre ellas.
7. El método de la reivindicación 1, 4 o 6, que comprende seleccionar aminoácidos apolares de las
cadenas polipeptı́dicas, del grupo que incluye alanina, valina, leucina, isoleucina, glicina, fenilalanina y
metionina.
60
8. El método de la reivindicación 1, 4 o 6, en el que los aminoácidos polares reticulables comprenden
residuos de tirosina y de lisina.
15
ES 2 147 727 T3
9. El método de la reivindicación 1 o 4, que comprende reticular covalentemente las cadenas polipeptı́dicas, por ejemplo, mediante aldehı́do glutárico, o por tratamiento con una enzima tirosinasa.
10. Un método para unir dos superficies, que comprende las etapas de:
5
a) formar reticulaciones intercadenas entre cadenas polipeptı́dicas sintéticas, alfa-helicoidales, para
crear una matriz cohesiva, comprendiendo las cadenas polipeptı́dicas aminoácidos apolares y polares, y
teniendo una estructura helicoidal en medios acuosos;
10
estando dispuestos los aminoácidos apolares y polares para definir bandas longitudinales, en espiral,
apolares y polares, sobre la superficie de la hélice, estando las bandas polares interpuestas entre las bandas
apolares, siendo capaces, al menos dos bandas apolares juntas, de establecer una interacción hidrófoba
suficiente con las correspondientes bandas apolares de, al menos, otra cadena polipeptı́dica, para agregar
las cadenas en una estructura superhelicoidal; y
15
comprendiendo cada banda polar aminoácidos adheribles a la superficie, adaptados para formar reticulaciones intercadenas dentro de las cadenas polipeptı́dicas agregadas y entre ellas;
20
dichos aminoácidos adaptados para formar reticulaciones intercadenas comprendiendo, por ejemplo,
residuos de tirosina y de lisina;
b) aplicar dicha matriz a una o a las dos superficies; y
c) poner en contacto dichas superficies.
25
11. El método de la reivindicación 10, en el que los aminoácidos polares se seleccionan del grupo que
incluye alanina, valina, leucina, isoleucina, glicina, fenilalanina y metionina.
30
12. El método de la reivindicación 10, en el que las bandas polares se definen por una disposición
alternante repetitiva de dos aminoácidos reticulables diferentes.
13. El método de la reivindicación 10, en el que la secuencia de aminoácidos de dichas cadenas
polipeptı́dicas comprende una o más copias de la secuencia de aminoácidos (Listado de Secuencia ID N◦
3):
35
(Ala-Ala-Ala-Lys-Tyr-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Tyr-Lys-Tyr-Ala)b
donde b es un número de 1 a 100.
40
45
50
55
60
14. El método de la reivindicación 10, en el que las reticulaciones intercadenas se forman por tratamiento con un agente reticulante multifuncional, o por tratamiento con una enzima tirosinasa.
15. Uso de la composición preparada por el método de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, junto
con una enzima tirosinasa, para la fabricación de un agente para combinar con células, para aplicar y
mantener las células en un sitio de aplicación in vivo, en el que las células se dispersan dentro de una
matriz adhesiva cohesiva de dicha composición.
16. Uso de la composición preparada por el método de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, junto
con una enzima tirosinasa, en combinación con compuestos capaces de estimular el crecimiento celular,
para la fabricación de un agente para estimular el crecimiento celular sobre una superficie de tejido, en
el que dichos compuestos se dispersan dentro de una matriz adhesiva cohesiva de dicha composición.
17. Uso de la composición preparada por el método de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, junto
con una enzima tirosinasa, para la fabricación de un agente para combinar con células de reposición de
tejido, para la aplicación a una superficie de tejido y su reparación, en el que las células se dispersan
dentro de una matriz adhesiva cohesiva de dicha composición, y opcionalmente la matriz comprende un
compuesto capaz de estimular el crecimiento celular.
18. El uso de la reivindicación 16 o la reivindicación 17, en el que el compuesto se selecciona del grupo
que consta de EGF, IGF, TGF-α, TGF-β, PDGF y FGF.
19. Uso de la composición preparada por el método de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, junto
con una enzima tirosinasa, para la fabricación de una matriz adhesiva cohesiva, para su aplicación a una
16
ES 2 147 727 T3
o más superficies de una incisión quirúrgica, para cerrar la incisión.
5
10
15
20
20. Uso de la composición preparada por el método de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, junto
con una enzima tirosinasa en combinación con un compuesto terapéutico, para la fabricación de un medicamento para terapia, para aplicar y mantener dicho compuesto terapéutico en un sitio de aplicación in
vivo, en el que dicho compuesto se dispersa dentro de una matriz adhesiva cohesiva de dicha composición.
21. Uso de la composición preparada por el método de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, junto
con una enzima tirosinasa, para la fabricación de un agente para combinar con células de reposición de
fibroblastos, para su aplicación a una superficie de ligamento periodontal, para reponer los fibroblastos
del ligamento, en el que dichas células de reposición se dispersan dentro de una matriz adhesiva cohesiva
de dicha composición, y opcionalmente la combinación de la matriz comprende, además, un factor de
crecimiento para estimular el crecimiento celular.
22. Un método de preparación de una matriz adhesiva artificial para el relleno de los huecos de
un tejido, que comprende la formulación de la matriz a partir de las cadenas polipeptı́dicas reticuladas
sintéticas, preparadas por el método de la reivindicación 6.
23. Un método de preparación de una composición para estimular el crecimiento celular, que comprende combinar las cadenas polipeptı́dicas reticuladas sintéticas, preparadas por el método de la reivindicación 6, con un compuesto capaz de estimular el crecimiento celular, dispersado entre dichas cadenas
polipeptı́dicas reticuladas, y dicho compuesto es, por ejemplo, un factor de crecimiento seleccionado del
grupo que consta de EGF, IGF, TGF-α, TGF-β, PDGF y FGF.
25
24. Un método de preparación de una matriz sintética, capaz de mantener un compuesto terapéutico
en un sitio de aplicación in vivo, en el que se prepara una matriz a partir de las cadenas polipeptı́dicas
reticuladas sintéticas preparadas por el método de la reivindicación 5, y el compuesto terapéutico se
dispersa en ella.
30
25. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 15, 16, 17, 19, 20 y 21, en el que dichas cadenas
polipeptı́dicas comprenden una o más copias de la secuencia de aminoácidos de (Listado de Secuencia ID
N◦ 3):
(Ala-Ala-Ala-Lys-Tyr-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Tyr-Lys-Tyr-Ala)b
35
donde b es un número de 1 a 100.
26. El método de la reivindicación 6, en el que dichas cadenas polipeptı́dicas comprenden una o más
copias de la secuencia de aminoácidos de (Sec. ID N◦ 2):
40
(Xaa1 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa2 -Xaa3 -Xaa2 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa1 -Xaa3 -Xaa2 -Xaa3 -Xaa1 )b
donde Xaa1 es cualquier aminoácido apolar que forma hélice; Xaa2 y Xaa3 son aminoácidos polares
reticulables, adheribles a la superficie; y b es un número de 1 a 100.
45
27. El método de la reivindicación 26, en el que dichas cadenas polipeptı́dicas comprenden una o más
copias de la secuencia de aminoácidos de (Sec. ID N◦ 3):
(Ala-Ala-Ala-Lys-Tyr-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Tyr-Lys-Tyr-Ala)b
50
donde b es un número de 1 a 100.
28. Un método de preparación de un adhesivo artificial para el relleno de los huecos de un tejido, que
comprende la formulación del adhesivo a partir de una matriz que comprende las cadenas polipeptı́dicas
reticuladas sintéticas, preparadas por el método de la reivindicación 6, 26 ó 27.
55
60
17
ES 2 147 727 T3
29. Un método de preparación de una composición para estimular el crecimiento celular, que comprende dispersar, entre las cadenas polipeptı́dicas reticuladas sintéticas preparadas por el método de la
reivindicación 6, 26 ó 27, un compuesto capaz de estimular el crecimiento celular.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
18
ES 2 147 727 T3
19
ES 2 147 727 T3
20
ES 2 147 727 T3
21
ES 2 147 727 T3
22
ES 2 147 727 T3
23
ES 2 147 727 T3
24
ES 2 147 727 T3
25
ES 2 147 727 T3
26