44 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Purificación de Tripsina La enzima

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Purificación de Tripsina
La enzima, necesaria para estandarizar el método de ELISA y el ensayo
de manchas, se obtuvo mediante 4 etapas de purificación a partir de 100 g de
ciegos pilóricos. La tripsina fue separada del resto de las moléculas del extracto
crudo mediante cromatografía de exclusión molecular; las fracciones con mayor
actividad enzimática fueron colectadas y se hicieron pasar por una columna de
intercambio iónico. El extracto crudo (ciegos pilóricos homogenizados con el
buffer de extracción) con un volumen total de 240 mL, 870 mg de proteína total
y una concentración de 4 mg/mL, tuvo una actividad específica tipo tripsina de
0.4 U/mg, que fue significativamente menor a la actividad de los extractos
obtenidos por Castillo-Yáñez y col., en el 2004 (de 0.5 U/mg). En la etapa final
de purificación de la enzima, se obtuvo una actividad tipo tripsina de 3 U/mg (8
veces mayor que la actividad inicial), con el 5% de recuperación de proteína en
5 mL totales, con una concentración de 1 mg/mL. Estos valores son semejantes
a los reportados en el 2004 por Castillo-Yáñez y colaboradores. En la Tabla IV
se muestra el resumen del proceso de purificación de la tripsina, y en la Figura
4 se puede apreciar el perfil electroforético característico de la enzima, bajo
condiciones desnaturalizantes; con una banda de aproximadamente 25 kDa,
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que corresponde al monómero de tripsina y una banda de aproximadamente 62
kDa que corresponde al dímero de la misma enzima. Este perfil es similar al
reportado por Castillo-Yáñez en el 2004. Sin embargo el porcentaje de
recuperación de la enzima obtenido de las fracciones con sulfato de amonio
comparado con el proceso final de purificación, que es la cromatografía de
intercambio iónico es 7 veces menor, lo cual puede traducirse en que la
cantidad de proteína obtenido en cuatro etapas es muy poco a pesar de tener
mayor actividad tipo tripsina a diferencia de las fracciones provenientes del
sulfato de amonio, además de obtener solo 1 mg de proteína por cada mililitro a
después de haber iniciado con 87 mg de proteína total. Este rendimiento y
recuperación proteica se puede decir que es muy bajo lo cual representa gran
desventaja el utilizar este proceso de purificación y por tal motivo se cree que
es de gran importancia contar con los anticuerpos monoclonales para tripsina
para lograr crear una cromatografía de afinidad biológica que a su vez permitiría
aumentar los rendimientos proteicos y por ésta misma razón es indispensable
estandarizar el ensayo de ELISA así como el ensayo de Manchas ya que son
indispensables en el tamizaje y amplificación en la generación del hibridoma.
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Tabla IV. Valores de proteína y actividad enzimática obtenidos en el proceso de
purificación de tripsina.
Volumen Proteína Proteína
Etapa de
total
(mL) total (mg) (mg/mL)
purificación
Extracto crudo
Fracción con
S.A.
Filtración en
gel: Sephadex
G-75
Intercambio
Iónico
A. T.
(U)
A.E.
(U/mg)
Aumento
en A.E.
%
Recuperación
24
87
4
34
0.4
1.0
10
36
20
6
12
0.6
1.5
35
10
55
5
68
1.2
3
20
5
6
1
18
3
8
5
U= µmol de nitroanilina por minuto
S.A.= sulfato de amonio
A.T.= actividad total
A.E.= actividad específica
46
200
116
97.4
66
45
31
21.5
14.4
6.5
Carril
1 2 3 4 5 6 7 8
9 10
Figura 4. Electroforesis en condiciones desnaturalizantes, al 12% de
acrilamida, de las fracciones proteicas obtenidas en cromatografía de
intercambio iónico. En el carril 2 y 9 se tienen los marcadores de masa
de amplio rango, en los carriles 4 y 7 se tienen mezclas de fracciones
provenientes de cromatografía de intercambio iónico las cuales contienen
una banda de aproximadamente 25 kDa (monómero de tripsina) y una
banda de aproximadamente 62 kDa (el dímero de la enzima).
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Estandarización de Métodos Inmunoenzimáticos (ELISA y Dot-Blot) para
la Evaluación de la Respuesta Inmune Humoral Murina Frente a Tripsina
Inmunoensayo Absorbente Ligado a Enzimas (ELISA)
Con el fin de estandarizar el ensayo inmunoenzimático en placa para la
evaluación de la respuesta inmune humoral frente a tripsina, se inmunizaron 3
ratones C3H/HeJ con tripsina pura, además se utilizaron los sueros preinmunes así como los sueros correspondientes a la tercera inmunización
(tercera semana de reto con tripsina). Se realizó el ensayo de ELISA indirecto,
utilizando de manera inicial 2 µg de la enzima (antígeno) y una dilución
constante del anticuerpo secundario (antisuero de cabra anti-IgG de ratón
1:2,000). En la Figura 5 se puede observar que el incremento en la D.O. a 415
nm, entre los sueros pre-inmunes y los sueros post-inmunes (obtenidos tras el
tercer refuerzo) fue de hasta 11 veces mayor para los sueros postinmunes, lo
cual es una demostración de la presencia de anticuerpos anti-tripsina en el
suero de los ratones. Además, en la misma figura se puede observar que con 2
µg de la enzima se detectaron anticuerpos en el suero murino hasta en una
dilución 1:1,000, lo cual nos indica la especificidad del anticuerpo generado
contra epítopes de la enzima. Los datos obtenidos en la estandarización de este
método son similares a los reportados con otras proteínas, por ejemplo con las
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proteínas de parásitos de G. lamblia, ya que con el ELISA se detecta un
incremento en la producción de anticuerpos de tipo IgG, desde la segunda
semana, utilizando la misma cantidad de antígeno pero con una ligera
modificación en la dilución del anticuerpo secundario (1:1,000) (Velázquez y
col., 2005).
D.O 415 nm
1 .0 0
1 :5 0
1 :2 00
1 :6 00
1 :1 00 0
0 .7 5
0 .5 0
0 .2 5
0 .0 0
R1/S1
R2/S1
R3/S1
R1/S3
R2/S3
R3/S3
P R E IN M U N IZA C IO N P O S T IN M U N IZA C IO N
R1/S1= Ratón número 1, suero número 1 o pre-inmune
R1/S3= Ratón número 1, suero número 3 o post-inmune
R2/S1 = Ratón número 2, suero número 1 o pre-inmune
R2/S3 = Ratón número 2, suero número 3 o post-inmune
R3/S1 = Ratón número 3, suero número 1 o pre-inmune
R3/S3 = Ratón número 3, suero número 3 o post-inmune
Figura 5. Evaluación de la respuesta inmune humoral anti-tripsina en ratón
mediante ELISA (indirecto). En este ensayo se detectó la presencia de
anticuerpos séricos anti-tripsina en los ratones utilizando 2 µg de la
enzima (antígeno) utilizando una dilución constante 1:2000 del
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anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón), además
se utilizaron los sueros pre-inmunes de cada uno de los ratones
(R1/S1/R2/S1/R3/S1)
así
como
correspondientes
la
tercera
a
los
sueros
semana
de
post-inmunes
inmunización
(R1/S3/R2/S3/R3/S3) en diluciones de 1:50, 1:200,1:600 y 1:1,000.
Una vez detectada la presencia de anticuerpos dirigidos contra tripsina
en el suero de los ratones, se continuó con la estandarización del método de
ELISA indirecto. Para lograr estandarizar ésta metodología se evaluaron los
siguientes parámetros: cantidad de antígeno o tripsina a partir de 0.0 hasta 2.5.
µg por pozo y dilución del anticuerpo primario (1:500-1:4000), tanto para los
sueros pre-inmunes como para los sueros post-inmunes. En la Tabla V se
muestran los resultados obtenidos en este ensayo; para el caso de los sueros
postinmunes se observó claramente una diferencia en las densidades ópticas
obtenidas para cada dilución del suero con respecto a las cantidades de
antígeno, ya que conforme aumentó la dilución del suero disminuyó la D.O, sin
embargo se logra detectar la mínima cantidad de antígeno adsorbido en la
placa que es de 0.25 µg inclusive con una dilución del suero de hasta 1:4,000,
lo cual indica una respuesta humoral murina intensa (Figura 6). Los datos
obtenidos se pueden comparar con ensayos llevados a cabo con tripsina
canina, ya que utilizando 0.1 µg de esta enzima se ha logrado desarrollar un
sistema que evalúa la inmunoreactividad de tripsina con anticuerpos
monoclonales para detectar insuficiencia pancreática en caninos (Waritani y
col., 2002). En la detección de anticuerpos contra distintas proteínas en peces
se pueden mencionar los resultados obtenidos por Aguillón en 1997, ya que en
su objetivo por obtener anticuerpos policlonales (antiinmunoglobulinas de
salmón), reporta la capacidad de los anticuerpos generados (en títulos de hasta
1:100,000) de reconocer 0.02 µg de antígeno (Ig de Salmón) lo cual nos indica
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que el sistema inmune de los peces está tan bien desarrollado como el de los
vertebrados superiores.
Con los resultados anteriores, se sugirió que la cantidad de antígeno
recomendable (cualitativamente) podría estar entre 0.5 y 2 µg por pozo, con
una dilución del suero post-inmune entre 1:500 y 1:1,000; estos datos se
resaltan de color rojo en la Tabla IV.
Tabla V. Determinación de la cantidad de antígeno (tripsina) para la técnica de
ELISA.
Dilución de Suero Post-inmune
Ag
µg/50µL
0
2.5
2*
1*
0.5*
0.25
0
0.078
0.078
0.069
0.069
0.069
0.069
Dilución de Suero Pre-inmune
´1:500 ´1:1000 ´1:2000 ´1:4000
0.602 0.424
0.491* 0.402*
0.499* 0.378*
0.432* 0.332*
0.392 0.283
0.061 0.061
0.319
0.267
0.261
0.236
0.194
0.065
0.22
0.201
0.183
0.168
0.137
0.07
0
0.076
0.072
0.072
0.072
0.068
0.066
´1:500 ´1:1000 ´1:2000 ´1:4000
0.066
0.065
0.067
0.072
0.064
0.07
0.067
0.068
0.067
0.07
0.065
0.067
0.068
0.064
0.065
0.068
0.069
0.066
0.070
0.065
0.067
0.068
0.068
0.09
* = en rojo aquellos resultados (D.O.) considerados como óptimos para éste
sistema.
51
52
ELISA con 2.0 µg de Tripsina
ELISA con 2.5µg de Tripsina
0.50
0.25
Sueros Pre-inmunes
0.00
Sueros Post-Inmunes
a)
0 Ab
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
0 Ab
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
0.5
D.O 415 nm
D.O 415 nm
0.75
0.4
0.3
0.2
Sueros Pre-Inmunes
0.1
0.0
Sueros Post-Inmunes
b)
2.5 µg Tripsina
2.0 µg Tripsina
ELISAcon 0.5 µg de Tripsina
ELISA con 1.0 µg de Tripsina
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
Sueros Pre-Inmunes
0.0
c)
Sueros Post-Inmunes
0 Ab
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
0 Ab
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
0.4
D.O 415 nm
D.O 415 nm
0.5
0.3
0.2
Sueros Pre-Inmunes
0.1
0.0
d)
1.0 µg de Tripsina
Sueros- Post-Inmunes
ELISA con 0.25 µg de Tripsina
0.3
0.2
0.1
0.0
e)
Sueros Pre-Inmunes
Sueros Post-Inmunes
0 Ab
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
0 Ab
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
0.5 µg de Tripsina
ELISA con 0.0 µg de Tripsina
0 Ab
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
0 Ab
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
0.5
D.O. 415 nm
D.O. 415 nm
0.4
0 Ab
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
0 Ab
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
0.4
0.3
0.2
0.1
Sueros Pre-Inmunes
0.0
f)
0.25 µg de Tripsina
Sueros Post-Inmunes
0 Ab
1:500
1: 1000
1:2000
1:4000
0 Ab
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
0.0 µg de Tripsina
Figura 6. Título de anticuerpos anti-tripsina con diferentes cantidades de
tripsina utilizando la técnica de ELISA (indirecto). Para el ensayo se
utilizaron diluciones de los sueros pre y post-inmunes de 1:500 a 1:4000
y las cantidades de tripsina variaron de 0.0 a 2.5 µg, representadas en
cada inciso.
53
Los resultados de los ensayos finales demostraron que utilizando 1 µg de
tripsina y diluciones del suero de la séptima semana de inmunización de
1:1,000 hasta 1: 16,000, se obtienen señales de D.O. adecuadas, tal como se
demuestra en la Tabla VI. Lo anterior, nos indica que el sistema inmunitario de
los ratones ha sido capaz de generar una memoria frente a la tripsina (Figura
7).
54
Tabla VI. Titulación del suero (anticuerpos anti-tripsina) mediante ELISA.
Dilución del Suero
1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:16000
Suero post-inmune
0.476
0.303
0.194
0.128
0.101
Suero pre-inmune
0.077
0.072
0.075
0.073
0.076
Se presentan las D.O. obtenidas utilizando 1 µg de tripsina con
diluciones seriadas de los sueros pre y post inmunes, en donde se observa la
presencia de anticuerpos hasta en una dilución de 1:16,000 a diferencia del
suero pre-inmune.
55
Título de Anticuerpos
anti-tripsina
Título de Anticuerpos
anti-tripsina
D.O. 415 nm
1:1000
1:2000
1:4000
1:8000
1:16000
0.4
0.3
0.2
0.1
D.O. 415 nm
0.5
0.5
1:1000
1:2000
1:4000
1:8000
1:16000
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0.0
a)
Dilución de Sueros Post-Inmunes
b)
Dilución de Sueros Pre-Inmunes
Figura 7. Título de anticuerpos anti-tripsina mediante ELISA indirecto. En la figura
a) y b) se presentan los títulos obtenidos para los sueros post-inmunes y
pre-inmunes respectivamente, en donde se observa la diferencia en
producción de anticuerpos debido a cada reto suministrado; en éste caso
corresponde al séptimo reto. Las diluciones del suero fueron de 1:1,000 a
1:16,000. EL anticuerpo secundario se utilizó en una dilución 1:2,000.
56
Ensayo de Manchas (Dot-Blot)
Se establecieron las condiciones experimentales para el ensayo de
manchas, evaluando distintas diluciones tanto de los sueros pre-inmunes como de
los sueros post-inmunes, acoplando 1.6 µg de tripsina a la membrana de
nitrocelulosa tal y como se plantea en la metodología. De acuerdo a lo anterior se
tituló el suero del ratón (Figura 8), observándose un ligero efecto de fondo en una
dilución de 1:2,000 para el caso de los sueros preinmunes que pudo deberse a la
manipulación del suero ya que no se observa en comparación con el control
negativo, el cual tiene acoplada la enzima a la membrana y como suero PBS. Sin
embargo en el caso de los sueros positivos claramente se evidencia la interacción
antígeno-anticuerpo, lo cual nos demuestra una vez más la presencia de
anticuerpos dirigidos a ciertas determinantes antigénicas de tripsina, aún en una
dilución de 1:4,000, sobre todo en las diluciones más concentradas (1:500 y
1:1,000); esto se corrobora al comparar con la señal generada por los sueros preinmunes en las mismas diluciones, y el control negativo (PBS). Con base en lo
descrito anteriormente, las condiciones óptimas para la inmunodetección de
anticuerpos anti-tripsina son las siguientes: 1.6 µg de antígeno, una dilución de
1:500 o 1:1000 para el caso del suero y una dilución en 1:10,000 para el
anticuerpo secundario. Los datos obtenidos en este ensayo son similares a los
reportados para otras proteínas, como péptidos de proteínas vegetales, los cuales
son reportados por Torres y col., en el 2003, quienes utilizan 1 µg como antígeno;
sin embargo, esa cantidad provocó reacciones inespecíficas con el suero
preinmune evidenciando efectos de fondo en la mayoría de las diluciones
evaluadas, en nuestro caso 1.6 µg de la enzima provocó un ligero efecto de fondo
solo en la dilución de 1:2,000 del suero preinmune, a la vez existen resultados para
enzimas como la iduronato-2-sulfato sulfatasa (IDS) (Peña y col., 2005) en donde
al evaluar anticuerpos contra la misma enzima mediante el ensayo de manchas
utilizan cantidades hasta 3 veces más pequeñas que la utilizadas en este trabajo;
57
y este tipo de variaciones pueden deberse al tipo de enzima utilizada así como a
los antisueros que se evaluaron, entre otras características.
.
58
Figura 8. Determinación del título de anticuerpos anti-tripsina mediante el
ensayo de manchas. Las diluciones de los sueros fueron seriadas de
1:500 a 1:16,000. El anticuerpo secundario se utilizó en una dilución
1:10,000.
59