Inmovilización celular

inmovilización
Una estrategia
i metodológica
d l i
i
interesante
que se
presenta como alternativa al empleo de células en
suspensión es la inmovilización de células vegetales.
vegetales
e trabajo
b jo reportado
epo do een 1966
9
fue
ue sob
sobree la
El pprimer
especie Umbilicaria pustulata y se emplearon geles
de poliacrilamida.
Toda la tecnología de inmovilización de células
viables
i bl
se ha
h desarrollado
d
ll d sobre
b la
l base
b
d los
de
l
conocimientos existentes de inmovilización de
enzimas.
enzimas
El empleo de células enteras inmovilizadas presenta una
serie de ventajas frente a las enzimas aisladas:
•Se evita los procesos de aislamiento y purificación
enzimática.
enzimática
•Las enzimas de interés se hallan en su ambiente celular
natural
t l con lo
l que aumenta
t su estabilidad
t bilid d y consecuentemente
t
t
la vida útil del sistema permitiendo la reutilización del material
catalítico.
•El ambiente celular provee a las enzimas de los cofactores,
coenzimas y demás compuestos necesarios para asegurar una
óptima actividad, además de brindar buenas condiciones de
temperatura y pH.
•Los sistemas celulares permiten el desarrollo de reacciones
multienzimáticas.
Inmovilización celular
•Condiciones básicas que debe reunir un método
• Sencillez de preparación
• Baja toxicidad de la matriz y de los elementos de
preparación
• Bajo costo
• Alta resistencia mecánica
• Baja o nula interferencia en los procesos de
purificación de productos
• Posibilidad de alternar ciclos de crecimiento y ciclos
de producción y/o biotransformación
Inmovilización celular
Por adsorción
•Adsorción a
soportes inertes
Por entrampamiento
•Inclusión en estructuras
preformadas
•Entrampamiento
Entrampamiento en matrices
poliméricas
Inmovilización celular
•Adsorción a soportes inertes
•Bolillas de vidrio
• Virutas de madera, etc
•Inclusión en estructuras preformadas
•Biorreactores de fibra hueca
• Espumas de poliuretano
•Membranas
M b
dde nylon
l
Inmovilización celular
•Entrampamiento en matrices poliméricas
• Matrices que polimerizan por reacciones de radicales
libres (Geles de poliacrilamida)
• Matrices
M i
que polimerizan
li
i
por enfriamiento
fi i
(Agar)
(A )
• Matrices que polimerizan por cross-linking (Alginato,
Carragenanos, Celulosas, etc)
Las matrices que polimerizan por enfriamiento
como el agar pueden ser quebradas
mecánicamente y colocadas en una fase líquida
hidrófoba.
El problema fundamental de los métodos que
utilizan poliacrilamida es la toxicidad de los
iniciadores y agentes de entrecruzamiento
utilizados
ili d en ell proceso de
d polimerización
li
i i que
en muchos casos han sido causantes de una
b j viabilidad
baja
i bilid d celular.
l l
El κ-carragenano
•Heteropolisacárido
H t
li á id no tóxico
tó i aislado
i l d de
d algas
l
marinas.
•Esta compuesto por sulfato de β-D-galactosa y 3,6anhidro-α-D-galactosa
g
•Gelifica por enfriamiento o en solución con algún
agente inductor
i d
como K+, NH4+, Ca++, Cu++, Mg++
o Fe+++, aminas o solventes orgánicos miscibles con
agua.
agua
Inmovilización celular:
en esferas de celulosa-polidimetilpirrolidilamonio
p
p
Sulfato de celulosa
Cloruro de polidimetilpirrolidilamonio
-O4SO
O
O
O
O
O
N
+
OSO4-
n
n
-O4SO
-O4SO
-O4SO
O
O
O
O
O
O
O
OSO4-
N
N
N
N
N
O
O
O
O
OSO4-
O
O
OSO4-
OSO4-
N
N
N
N
-O4SO
O
O
O
N
N
-O4SO
O
O
N
N
N
-O4SO
O
O
O
O
O
O
O
O
OSO4-
OSO4-
Inmovilización celular: en esferas alginato
Alginato (Acido manurónico β 1,4)
OH
+
O
O
O
O
C Cl2
CaCl
O
O
O
OH
n
Ca
Ca
O-
O-
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O-
O-
Ca
Ca
O-
O-
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O-
Ca
O-
Ca
Inmovilización celular: Metodología de trabajo
Mezcla de solución de alginato
Y cultivo celular en medio libre
De agentes complejantes de Ca++
Solución de Ca++
Ca
La captación pasiva de los sustratos no polares limita
la cinética de conversión
La penetración al interior celular debe de ocurrir en la escala de
tiempo de la bioconversión
El transporte
p
no deben controlar la velocidad gglobal del p
proceso si se
quiere analizar reactividades de una serie de compuestos
La degradación de los productos es más rápida cuando se forman
en la etapa de crecimiento que en fase estacionaria
Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial
pproducidos en sistemas de células vegetales
g
inmovilizadas
Especie
Matriz
Producto
Comentarios
Catharanthus roseus
Agarosa
Catelamina
Suministro
ajmalicina
Catharanthus roseus
Alginato
Alcaloides
indólicos
Prolonga capacidad
biosintética
Catharanthus roseus
Alginato
Ajmalicina
Prolonga estabilidad y
capacidad biosintética
(220 dias con cambio
d medio)
de
di )
Catharanthus roseus
Xantanos/po Serpentina
liacrilamida
Prolonga estabilidad y
capacidad biosintética
(180 dias con cambio
de medio)
de
Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial
pproducidos en sistemas de células vegetales
g
inmovilizadas
Especie
Matriz
Producto
Daucus carota
Alginato
g
5-β-hidroxidigiβ
g
toxigenina
Daucus carota
Alginato
fenoles
Comentarios
Suministro de
digitoxigenina
No hay variaciones
Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial
pproducidos en sistemas de células vegetales
g
inmovilizadas
Especie
Matriz
Producto
Comentarios
Digitalis lanata
Alginato
β
βmetildigoxina
Suministro de β
β-metildimetildi
gitoxina
Di it li lanata
Digitalis
l
t
Al i t
Alginato
di
digoxina
i
Suministro
S
i it
digitoxina
d
de
Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial
pproducidos en sistemas de células vegetales
g
inmovilizadas
Especie
Matriz
Producto
Beta vulgaris
Nylon
Capsicum frutescen
Espuma de Capsaicina
poliuretano
Betacianina
Comentarios
Incrementa
acumulación
Incrementa
rendimiento
Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial
pproducidos en sistemas de células vegetales
g
inmovilizadas
Solanum
Especie
Matriz
Producto
Comentarios
Morinda citrifolia
Alginato
Antraquinonas Incrementa acumulación
intracelular
Talictrum minus
Alginato
Berberina
Incrementa liberación
S l
Solanum
surretense
t
Alginato
Solasodina
Incrementa liberación
Lithospermun
erithrorhysum
Fibra
hueca
fenoles
Incrementa rendimiento.
Métodos para inmovilizar por entrampamiento
Parámetros a controlar en un sistema
inmovilizado:
viabilidad
crecimiento celular
capacidad biosintética
Métodos para evaluar la viabilidad de un cultivo inmerso
en una matriz inerte
•Colorimétricos:
C l i ét i
azull de
d Evans
E
y diacetato
di t t de
d
fluoresceína
•Medición de parámetros de crecimiento como consumo
de O2 y producción
p
de CO2 con electrodos selectivos en
cultivos no continuos.
•Métodos
é d no destructivos
d
i
(Parr
(
et al.)
l ) que permite
i
determinar y expresar de manera porcentual el volumen
ocupado por células viables en una matriz de
inmovilización.
Se basa en la determinación de la dilución diferencial de dos
moléculas marcadas radioactivamente.
Una de ellas debe ser excluida del plasmalema y la otra debe
difundir libremente
La primera es manitol u otro polialcohol no metabolizable
marcado con 14C y la otra es agua marcada con 3H.
El método determina el "volumen viable" expresado como el
espacio porcentual que excluye manitol pero no agua expresado
de otra manera las células viables se sacan de la relación entre
el 3H y el 14C puesto que excluyen al manitol y utilizan el
g
agua.
También ppueden monitorearse ppor RMN la
cantidad de metabolitos fosforilados como
índice de actividad metabólica
este es un método no invasivo que se basa en
cuantificar
tifi
l cantidad
la
tid d de
d ATP o ell uptake
t k de
d
fosfatos por medio de 31P-RMN.
Capacidad biosintética: Debe ser evaluada
específicamente
de acuerdo con el
propósito del sistema en particular
ya sea en su capacidad de producir un
metabolito determinado por síntesis de
novo, o a partir de precursores sistemas o
bien en su actividad enzimática específica
para producir
d i reacciones
i
d bioconversión.
de
bi
ió
El empleo de células inmovilizadas ofrece una serie de ventajas
vinculadas al estado fisiológico
g y al diseño y modo de operación
p
del
proceso fermentativo.
•El entrampamiento en matrices inertes permite un gran contacto
intercelular y la generación de gradientes físicos y químicos que
conducen a un mayor grado de diferenciación.
•Al estar minimizada la tasa de reproducción celular la inestabilidad
génica se disminuye notablemente.
•Se alcanzan fases estacionarias prolongadas lo cual es muy importante
cuando
d la
l producción
d ió esta
t asociada
i d a la
l idiofase
idi f
o all final
fi l de
d la
l etapa
t
exponencial
•Estos sistemas permiten desacoplar las fases de crecimiento y
pproducción facilitando el empleo
p de estrategias
g como la elicitación
biótica y abiótica o la permeabilización para incrementar la
producción
• Es posible realizar ciclos alternantes de rejuvenecimiento/crecimiento
para mantener la viabilidad y capacidad biosintética.
•las células inmovilizadas permiten operar en sistemas continuos a
altas velocidades de disolución sin riesgo de lavado de los cultivos
•Es posible controlar el tamaño de los agregados celulares en caso de
ser importante esa variable para la acumulación y/o producción de
metabolitos.
•Con la biomasa entrampada es más sencillo trabajar con procesos en
dos fases,, lo más común es realizar una de crecimiento pprevio a la
inmovilización y la segunda de producción inmovilizando cuando el
cultivo ha llegado a su etapa estacionaria.
•En cultivos inmovilizados se facilita la remoción de inhibidores
metabólicos
•se protege a las paredes celulares de las fuerzas de corte
Con inmovilización es posible lograr: sistemas de producción de
metabolitos
t b lit de
d una vida
id útil prolongada
l
d puesto
t que se puede
d
reutilizar la biomasa y realizar una recuperación continua de los
productos.
Es posible inducir la liberación al medio extracelular los metabolitos de
interés que naturalmente no son excretados mediante el empleo de
agentes permeantes, especialmente DMSO
El empleo de estos sistemas se encuentra limitado a la producción de
compuestos secundarios y la realización de procesos de
bioconversión dónde los productos de interés se liberen al medio de
cultivo.