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Crecimiento y Cultivo Vegetal CÉLULAS INMOVILIZADAS Una estrategia metodológica interesante que se presenta como alternativa al empleo de células en suspensión es la inmovilización de células vegetales. El primer trabajo reportado en 1966 fue sobre la especie Umbilicaria pustulata y se emplearon geles de poliacrilamida. Toda la tecnología de inmovilización de células viables se ha desarrollado sobre la base de los conocimientos existentes de inmovilización de enzimas. El empleo de células enteras inmovilizadas presenta una serie de ventajas frente a las enzimas aisladas: • Se evita los procesos de aislamiento y purificación enzimática. • Las enzimas de interés se hallan en su ambiente celular natural con lo que aumenta su estabilidad y consecuentemente la vida útil del sistema permitiendo la reutilización del material catalítico. • El ambiente celular provee a las enzimas de los cofactores, coenzimas y demás compuestos necesarios para asegurar una óptima actividad, además de brindar buenas condiciones de temperatura y pH. • Los sistemas celulares permiten el desarrollo de reacciones multienzimáticas. Las técnicas de inmovilización pueden clasificarse de acuerdo a las características de la fase inerte utilizada: 1- Tipo1: Inmovilización en matrices tridimensionales inertes. Implica el entrampamiento de las células en geles poliméricos como alginato, agar, agarosa, carragenanos, poliacrilamida, colágeno o en matrices como redes de nylon y espuma de poliuretano. 2- Tipo 2: Inmovilización por adsorción inespecífica a soportes inertes como bolillas de vidrio. 3- Tipo 3: Inmovilización por unión covalente a soportes inertes como carboximetilcelulosa. 4- Tipo 4: Inmovilización por confinamiento en biorreactores de fibra hueca. Dentro de las categorías mencionadas, para células indiferenciadas , las posibilidades de aplicación de algún sistema se reducen casi específicamente al tipo 1, pues solo un apropiado Células inmovilizadas Crecimiento y Cultivo Vegetal entrampamiento permite conservar características como viabilidad y capacidad biosintética que son fundamentales para desarrollar un sistema productivo. Dentro de esta categoría podemos subdividir a las técnicas de entrampamiento en: • Inmovilización en matrices que polimerizan por cross-linking como es el caso mas ampliamente difundido del alginato de calcio. • Inmovilización en matrices que polimerizan por enfriamiento como el agar. • Inmovilización en matrices que polimerizan por reacciones de radicales libres como las de poliacrilamida. • Inmovilización en matrices preformadas por entrampamiento pasivo como en espuma de poliuretano. Las condiciones básicas que debe reunir un método para ser de elección en inmovilización son: • Sencillez de preparación • Baja toxicidad de la matriz y de los elementos de preparación. • Bajo costo. • Alta resistencia mecánica. • Baja o nula interferencia de la matriz en el proceso down-stream. El método más difundido es la formación de perlas de alginato. El alginato es un polisacárido que forma geles muy estables en presencia de cationes polivalentes como Ca++. Las perlas se forman sencillamente haciendo gotear una solución que contenga alginato de sodio y las células a inmovilizar sobre una solución de CaCl. El método es reversible y vasta adicionar un agente quelante de calcio como EDTA que solubiliza el gel por sustracción del catión. La desventaja es que se deben reformular los medios de cultivos de tal manera de suprimir el uso de agentes específicos quelantes de calcio como EDTA y además tener en cuenta que en cultivos prolongados los fosfatos pueden ocasionar la licuación de los geles. Células inmovilizadas Crecimiento y Cultivo Vegetal Estructura química del alginato de calcio El κ-carragenano es un heteropolisacárido no tóxico aislado de algas marinas. Esta compuesto por sulfato de β-D-galactosa y 3,6-anhidro-α-D-galactosa, gelifica por enfriamiento o en solución con algún agente inductor como K+, NH4+, Ca++, Cu++, Mg++ o Fe+++, aminas o solventes orgánicos miscibles con agua. Otro método utilizable es la formación de esferas mediante interacciones iónicas entre sulfato de celulosa y cloruro de polidimetilalilamonio. La suspensión celular se mezcla con la solución de celulosa y se hace gotear sobre un baño con cloruro de polidimetilalilamonio dónde tiene lugar la interacción iónica y la formación de las esferas que entrampan las células. Células inmovilizadas Crecimiento y Cultivo Vegetal Estructura química del sistema sulfato de celulosa-PDMDAAC Las matrices que polimerizan por enfriamiento como el agar pueden ser quebradas mecánicamente y colocadas en una fase líquida hidrófoba. El problema fundamental de los métodos que utilizan poliacrilamida es la toxicidad de los iniciadores y agentes de entrecruzamiento utilizados en el proceso de polimerización que en muchos casos han sido causantes de una baja viabilidad celular. El entrampamiento en estructuras preformadas consiste en mallas abiertas por las que se drena el medio de cultivo y las células o los agregados celulares quedan retenidos. El siguiente esquema simplifica un procedimiento para inmovilizar células o agregados celulares en perlas de alginato. Células inmovilizadas Crecimiento y Cultivo Vegetal Inmovilización de células vegetales en biorreactor desde una planta intacta A continuación se listan algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial producidos en sistemas de células vegetales inmovilizadas. Especie Matriz Producto Comentarios Catharanthus roseus Agarosa Catelamina Suministro de ajmalicina Catharanthus roseus Alginato Alcaloides Prolonga capacidad indólicos biosintética Ajmalicina Prolonga Catharanthus roseus Alginato estabilidad y capacidad biosintética (220 dias con cambio de medio) Catharanthus roseus Xantanos/poliac Serpentina Prolonga estabilidad y rilamida capacidad biosintética (180 dias con cambio de medio) Daucus carota Alginato 5-β-hidroxidigi- Suministro de digitoxige- toxigenina nina Daucus carota Alginato fenoles No hay variaciones Digitalis lanata Alginato β-metildigoxina Suministro de β-metildigitoxina Digitalis lanata Alginato digoxina Suministro de digitoxina Mentha sp. Poliacrilamida Neomentol Suministro de mentona Mentha sp. Poliacrilamida isomentona Suninistro de pulegona Células inmovilizadas Crecimiento y Cultivo Vegetal Mucuna pruriens Alginato L-DOPA Suministro de L-Tyr Nicotiana sylvestris Poliacrilamida Alcoholes Suministro de geraniol monoterpénicos Nicotiana sp. Alginato Putrecina Prolonga la biosíntesis Papaver somniferum Alginato Codeína Suministro de codeinona Amaranthus tricolor Chitosan oxalato Incrementa liberación. Asclepias syriaca Chitosan proteasas Incrementa liberación. Beta vulgaris Nylon Betacianina Incrementa acumulación Capsicum frutescen Espuma de Capsaicina Incrementa rendimiento poliuretano Coffea arabiga Alginato Metilxantinas Incrementa la producción Glycyrrihiza echinata Alginato Equinatina Incrementa producción Lavandula vera Alginato pigmentos Prolonga capacidad productiva Morinda citrifolia Alginato Antraquinonas Incrementa acumulación intracelular Talictrum minus Alginato Berberina Incrementa liberación Solanum surretense Alginato Solasodina Incrementa liberación fenoles Incrementa rendimiento. Lithospermun erithrorhysum Fibra hueca Tanto la viabilidad, el crecimiento celular y la capacidad biosintética son parámetros a controlar para asegurar el éxito de un sistema inmovilizado. • Viabilidad y crecimiento celular: se pueden emplear diferentes métodos para controlar la viabilidad de un cultivo inmerso en una matriz inerte que van desde los colorimétricos con azul de Evans y diacetato de fluoresceína descriptos para suspensiones hasta la medición de parámetros de crecimiento como consumo de O2 y producción de CO2 con electrodos selectivos en cultivos no continuos. Existen sofisticados métodos no destructivos como el de Parr y colaboradores que permite determinar y expresar de manera porcentual el volumen ocupado por células viables en una matriz de inmovilización. Se basa en la determinación de la dilución diferencial de dos moléculas marcadas radioactivamente. Una de ellas debe ser excluida del plasmalema y la otra debe difundir libremente La primera es manitol un polialcohol no metabolizable marcado con 14C y la otra es agua marcada con 3H. El método Células inmovilizadas Crecimiento y Cultivo Vegetal determina el "volumen viable" expresado como el espacio porcentual que excluye manitol pero no agua expresado de otra manera las células viables se sacan de la relación entre el 3H y el 14 C puesto que excluyen al manitol y utilizan el agua. Pueden utilizarse los tradicionales métodos de peso húmedo y seco puesto que el peso seco correspondiente a la matriz debe de ser constante. También pueden monitorearse por RMN la cantidad de metabolitos fosforilados como índice de actividad metabólica, este es un método no invasivo que se basa en cuantificar la cantidad de ATP o el uptake de fosfatos por medio de 31P-RMN. De todas formas estos parámetros deben ser interpretados criteriosamente y analizar cada caso en particular. Por ejemplo Brodelius demostró que Catharanthus roseus y Glycine max respiran y crecen aproximadamente a la misma velocidad que las células en suspensión cuando se encuentran inmovilizadas en agarosa o agar pero cuando están confinadas en matrices de alginato su índice de crecimiento es menor si bien no se afecta la viabilidad. Esto se debe a que estos tipos de geles afectan en cierta medida la difusión. • Capacidad biosintética: Debe ser evaluada específicamente de acuerdo con el propósito del sistema en particular, ya sea en su capacidad de producir un metabolito determinado por síntesis de novo, o a partir de precursores sistemas o bien en su actividad enzimática específica para producir reacciones de bioconversión. El empleo de células inmovilizadas ofrece una serie de ventajas vinculadas al estado fisiológico y al diseño y modo de operación del proceso fermentativo. Relacionado con el primer factor mencionado hay que considerar que tanto la producción como la acumulación de metabolitos secundarios esta están estrechamente relacionadas con el grado de diferenciación y la organización celular. El entrampamiento en matrices inertes permite un gran contacto intercelular y la generación de gradientes físicos y químicos que conducen a un mayor grado de diferenciación. Al estar minimizada la tasa de reproducción celular la inestabilidad génica que es uno de los principales problemas de los cultivos dediferenciados se disminuye notablemente. Además la inmovilización permite alcanzar fases estacionarias prolongadas lo cual es muy importante porque como sabemos la producción esta asociada a la idiofase o al final de la etapa exponencial. Estos sistemas no solo permiten desacoplar las fases de crecimiento y producción facilitando el empleo de estrategias como la elicitación biótica y abiótica o la permeabilización para incrementar la Células inmovilizadas Crecimiento y Cultivo Vegetal producción sino que también es posible realizar ciclos alternantes de rejuvenecimiento/crecimiento para mantener la viabilidad y capacidad biosintética. Con respecto al diseño y manejo del proceso fermentativo podemos puntualizar que las células inmovilizadas permiten operar en sistemas continuos a altas velocidades de disolución sin riesgo de lavado de los cultivos. Que es posible controlar el tamaño de los agregados celulares en caso de ser importante esa variable para la acumulación y/o producción de metabolitos. Con la biomasa entrampada es más sencillo trabajar con procesos en dos fases, lo más común es realizar una de crecimiento previo a la inmovilización y la segunda de producción inmovilizando cuando el cultivo ha llegado a su etapa estacionaria. En cultivos inmovilizados se facilita la remoción de inhibidores metabólicos y se protege a las paredes celulares de las fuerzas de corte. Como consecuencia de todas las características mencionadas es posible lograr sistemas de producción de metabolitos de una vida útil prolongada puesto que se puede reutilizar la biomasa y realizar una recuperación continua de los productos. Si bien es posible en sistemas inmovilizados inducir la liberación al medio extracelular los metabolitos de interés que naturalmente no son excretados mediante el empleo de agentes permeantes, especialmente DMSO, generalmente el empleo de estos sistemas se encuentra limitados a la producción de compuestos secundarios y la realización de procesos de bioconversión dónde los productos de interés se liberen al medio de cultivo. Células inmovilizadas
