Especificidad parasitaria e identificación morfológica de aislados de

Especificidad parasitaria e identificación morfológica de aislados de
Phytophthora nicotianae var. parasitica obtenidos de suelos cultivados con
tomate
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Boix Ruiz A , Marín Guirao J I , Ruíz Olmos C A , García Lara M J , Martínez Beltrán C D
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M , Palmero Llamas D , Díaz Pérez M , Camacho Ferre F , Tello Marquina J C
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, De Cara García
Grupo de Investigación AGR-200. Departamento de Producción Vegetal. Universidad de Almería. Ctra.
Sacramento s/n 04120. Almería. España. [email protected]
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Universidad Politécnica de Madrid. E.U.I.T. Agrícola. Ciudad Universitaria s/n, 28040. Madrid. España.
La especificidad parasitaria de Phytophthora nicotianae var. parasitica (Phytophthora
parasitica) es un tema poco abordado en la bibliografía especializada. Tal vez sea
debido al amplio rango de hospedadores descritos para este patógeno. Sin embrago,
algunos autores han señalado cómo P. parasitica puede mostrar cierta preferencia para
parasitar a uno u otro hospedador. Recientemente se ha puesto de manifiesto que P.
parasitica puede presentar una especificidad casi completa sobre tomate y pimiento. El
tema tiene interés puesto que podría existir una relación genética estrecha entre dicha
especificidad y los genes de los hospedadores.
En esta comunicación se presenta el resultado de evaluar 28 aislados de P. parasitica,
25 de ellos obtenidos de muestras de suelo conservadas en el laboratorio durante 9
años. Se inocularon los aislados sobre plantas de pimiento (cv Sonar) y sobre tomate
(cv Río grande). La evaluación se realizó sobre plantas con 3 hojas verdaderas que
habían crecido en vermiculita desinfectada (1hora a 120ºC en autoclave), inoculando
por riego al sustrato con una mezcla de distintos tipos de propágulos del hongo. El
ensayo se mantuvo en cámara de ambiente controlado durante 30 días (23-25 ºC, 14
horas de luz/día y 12.000 lux sobre las plantas), evaluando la enfermedad conforme
aparecían los síntomas. Al final del experimento se encontró que ninguno de los
aislados enfermó al pimiento, pero todos ellos produjeron la muerte de las plantas de
tomate. Estos resultados comprueban otros ya obtenidos anteriormente y sugieren una
estrecha especificidad parasitaria de P. parasitica.
Palabras clave: Capsicum annuum, Oomicetos, Resistencia genética, Solanum lycopersicum
Introducción
En las plantaciones de pimiento bajo invernadero se asoció, desde finales de los 70
hasta mediados de los 80, a Phytophthora capsici con la muerte masiva de plantas de
pimiento afectadas por la enfermedad conocida como “seca” o “tristeza” del pimiento
(Tello y Lacasa 2004), enfermedad limitante para el cultivo; sin embargo, desde hace
más de cinco años, se ha encontrado con mucha frecuencia a Phytophthora parasitica
asociada a plantas con síntomas de tristeza (A. Lacasa, comunicación personal, 2012). En
años posteriores se ha podido asociar a P. parasítica con una enfermedad del tomate
tipo “cherry” en las provincias de Granada y Almería (Peregrina 2005), enfermedad
conocida por la podredumbre del cuello y las raíces del tomate.
Debido a que la especificidad parasitaria de Phytophthora ha sido un tema poco tratado
en bibliografía, se ha supuesto de forma genérica que la seca o tristeza del pimiento se
asociaba con P. capsici, mientras que la podredumbre del cuello y las raíces del tomate
se asociaba con P. parasitica. No obstante Bonnet et al. (1978) realizaron un estudio
sobre el poder patógeno de P. parasitica e introdujeron la noción de especialización
parasitaria siendo este un tema necesitado de investigación. Ambas especies del
género Phytophthora presentan características morfológicas parecidas, sin embargo su
habilidad parasitaria se presenta como distinta según la bibliografía.
Erwin y Ribeiro (1996) definen a P. parasitica como la especie de Phytophthora con
mayor número de hospedadores de todas las descritas hasta el momento. En la lista de
hospedadores que fueron citados para P. parasitica (sensu Dastur, 1913) o para cada
variedad de P. nicotianae (sensu Waterhouse, 1963), se encontraban 264 especies
distintas de hospedadores naturales, número que se ampliaba a 301 cuando se
añadían los hospedadores inoculados artificialmente. P. nicotianae es la especie de
Phytophthora que presenta el mayor número de hospedadores pero hay evidencias de
que en algunos aislados existe una preferencia por el hospedador (Erwin y Ribeiro,
1996).
En ensayos muy recientes realizados en Extremadura (Morales Rodríguez 2011), P.
parasitica es la única especie de Phytophthora que se ha encontrado afectando al
cultivo de pimiento para pimentón en dichas zonas. Se realizaron aislamientos de P.
parasitica en plantas de tomate y pimiento enfermas. Después se inocularon sobre
especies vegetales que son hospedadores habituales de P. parasitica y que se podrían
incluir en las rotaciones de cultivos en ambas zonas. Así los aislados de tomate se
inocularon en plantas de pimiento y los de pimiento en plantas de tomate pero además
se inocularon otras especies como tabaco, berenjena, kenaf, altramuz y algodón.
Los resultados mostraron a los aislados de plantas de tomate mucho más específicos
en su patogenicidad, ya que independientemente del estado de desarrollo de la planta
o el tipo de inoculación (riego o decapitación) únicamente causaron enfermedad o daño
en plantas de tomate, especie de la que fueron aisladas. Los aislados de plantas de
pimiento se muestran menos específicos en su patogenicidad. Además, ninguno de los
aislados inoculados, ni los procedentes de plantas de pimiento ni los de plantas de
tomate fue patógeno en tabaco, berenjena, kenaf, altramuz y algodón.
Por otra parte, el hecho de que coexistan los dos tipos de compatibilidad genética A1 y
A2 en un mismo suelo determinaría un posible incremento de la variabilidad genética
de Phytophthora, que podría traducirse en una mayor patogeneicidad, expresando así
un parasitismo inesperado (Boccas 1978, Boccas y Zentmyer 1976), además de ser un
mecanismo de conservación para el Oomiceto al producir órganos sexuales.
En el caso de Phytophthora parasitica ambos tipos de compatibilidad coexisten en los
cultivos de pimiento del Campo de Cartagena y en los cultivos de tomate tipo “cherry”
en el interior de la provincia de Granada. Este hecho es diferencial con respecto a los
aislados estudiados por Morales Rodríguez (2011) que fueron todos heterotálicos y del
tipo A2.
El conocimiento de aspectos como la conservación, convivencia de dos tipos de
compatibilidad genética y la especificidad parasitaria, nos sirve para realizar
recomendaciones apropiadas a los agricultores con respecto a la rotación de cultivos o
incluso desaconsejar el uso de un cultivo en concreto que pueda ser gravemente
afectado por Phytophthora. Además puede orientar los programas de mejora genética
para la búsqueda de resistencia.
Por estos motivos, los objetivos del trabajo consisten en identificar taxonómicamente y
evaluar la patogenicidad de diversos aislados de muestras de suelo, en los cuales ya
se había encontrado Phytophthora parasitica con anterioridad, y a su vez, confirmar su
especificidad parasitaria en plantas de tomate y pimiento.
Materiales y Métodos
Se estudiaron 28 aislados. 25 procedían de muestras de suelos recogidas en
explotaciones de tomate de la provincia de Granada y conservadas durante 8 y 9 años
en bolsas de plástico en el laboratorio (códigos: Kik2, AR35inv2, AR43B y AR51B). 3
de los aislados fueron obtenidos directamente de plantas de tomate con síntomas de
Phytophthora (código: 11/39). Cada uno se dejó crecer en placas de 90 mm con medio
PDA (Patata, D-glucosa, Agar) hasta llegar al borde.
Para proceder a su identificación las cepas aisladas se enfrentaron en una placa de
petri con medio V8, jugo vegetal rico en esteroides para cruzamientos entre especies
de Phytophthora y la producción de órganos sexuales (Tello et al. 1991). El
enfrentamiento se realizó con dos aislados de tipo de compatibilidad conocido, A1 y A2,
de Phytophthora cryptogea. Se observaron con el micrómetro ocular las principales
características de los órganos sexuales producidos, tamaño y forma del oogonio,
anteridio y oospora, y órganos asexuales de cada cepa, esporangios y clamidosporas.
Para comprobar la especificidad parasitaria, se inoculó cada aislado en una maceta con
seis plantas de pimiento cv Sonar y otra con seis plantas de tomate cv San Pedro,
cuando estas presentaron de 2 a 3 hojas verdaderas. Como sustrato para pimiento y
tomate se empleó vermiculita desinfectada en autoclave durante 1 hora a 120ºC. La
inoculación se llevó a cabo mediante la técnica de inoculación por riego al sustrato. La
suspensión de inóculo se preparó triturando el contenido de la placa donde crecía el
hongo en 50 ml de agua y la dosis de inóculo fue de 104 propágulos ml-1.
Se evaluaron los síntomas en las plantas inoculadas durante 30 días en cámara de
ambiente controlado, con un fotoperiodo de 14 horas de luz al día, temperaturas entre
23-26ºC y una intensidad luminosa de 12.000 lux. Tras este periodo de evaluación se
calculó el índice de severidad de la enfermedad (ISE). Se asignó el valor 0 cuando las
plantas no presentaron ningún síntoma, 1 cuando mostraban podredumbres en las
raíces secundarias, 2 si la pudrición alcanzaba la raíz principal, 3 si se observaba
necrosis en el cuello de la planta y 4 si esta moría durante el ensayo. La fórmula para
obtener el valor es la siguiente: (
(número total de plantas x 4).
(clase de escala x número de plantas) x 100) /
Al final del periodo de ensayo se reaisló el patógeno de las macetas inoculadas con la
técnica de trampas vegetales, para comprobar la presencia en las macetas inoculadas,
utilizando como tales pétalos inmaduros de clavel (Tello et al. 1991).
Resultados y Discusión
Todos los aislados se comportaron como heterotálicos produciendo órganos sexuales
en los enfrentamientos. Los datos recogidos, tras consultar con la bibliografía existente
(Erwin y Ribeiro 1996), indican que el 100% de los aislados corresponden a
Phytophthora parasitica. El 21,42% de los aislados pertenecen al grupo A1 y el 78,57%
al A2, presentando la muestra AR43B aislados de ambos grupos de compatibilidad
(Cuadro 1).
Según Boccas (1978) y Boccas y Zentmyer (1976), la autofecundación de un aislado
puede dar lugar no solamente a una reducción o a un aumento del poder patógeno de
la descendencia frente a sus hospedadores reconocidos o tradicionales de la especie,
sino también a una ampliación de su espectro parasitario. Esto indica que la
variabilidad genética de las poblaciones puede aumentar en dichas parcelas, lo que
podría modificar su patogeneicidad, afectando, por ejemplo, a su especificidad
parasitaria y a la resistencia frente a los pocos tratamientos químicos disponibles para
su control.
En el ensayo de especificidad parasitaria, el 69,23% de las cepas evaluadas fueron
capaces de matar a todas las plantas de tomate, antes incluso de los 30 días de
ensayo (Cuadro 1). El 30,76% de los aislados restantes no causaron la muerte de
todas las plantas, aunque estas mostraron graves síntomas de pudrición de cuello y
raíces, con un ISE por encima del 80%, lo que sin duda conduciría a la muerte de las
plantas pocos días después. Sin embrago, ninguna planta de pimiento se vio afectada
por alguna de las cepas.
Frente a la falta de expresión de síntomas en pimiento, la patogeneicidad de la que
hicieron gala los aislados de P. parasítica inoculados en tomate, inclusive tras los
nueve años de conservación en bolsas de plástico de alguna de las muestras de las
que procedían, no hace sino mostrar la marcada especificidad parasitaria de dichos
aislados en tomate. En este caso, como recomendación a los agricultores de las
parcelas afectadas podría dictaminarse un cambio de cultivo de tomate a variedades de
pimiento.
Agradecimientos
Proyecto Ministerio de Ciencia e Innovación/INIA: RTA2010-00038-C03-02
Referencias Bibliográficas
Boccas B, Zentmyer GA. 1976. Genetical studies with interspecific crosses between Phytophthora
cinnamomi and P. parasitica. Phytopathology 66, 79-85.
Boccas B. 1978. La reproduction sexuelle chez les Phytophthora. Ses voies et quelques unes ses
conséquences génetiques. Thèse docteur es Sciences Naturelles. Université Paris-Sud. France.
Bonnet PH, Maïa N, Tello-Marquina JC, Venard P. 1978. Pouvoir pathogène de Phytophthora parasitica
(DASTUR). Facteurs de variabilitè et notion de Specialisation parasitaire (Pathogenic capacity of
Phytophthora parasitica (Dastur). Annuals of Phytopathology 10, 15-29.
Erwin DC, Ribeiro K. 1996. Phytophthora Diseases Worldwide. APS press. St. Paul, Minnesota. USA.
562 pp.
Morales Rodríguez MC. 2011. Caracterización fenotípica y molecular de Phytophthora nicotianae (Breda
de Haan, 1896) de cultivos de pimiento y tomate de Extremadura. Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias.
Universidad de Extremadura. 220 pp.
Peregrina I. 2005. Epidemiología y control de la podredumbre del pie del tomate tipo cherry causada por
Phytophthora nicotianae var. parasitica en los cultivos bajo malla del Embalse de los Bermejales
(Granada). Proyecto Fin de Carrera. Escuela Politécnica Superior. Universidad de Almería. 103 pp.
Pérez Vargas M. 2011. Epidemiología y control de Phytophthora parasitica en cultivos de tomate y
pimiento bajo abrigo en el Sureste Peninsular de España. Tesis Doctoral. Universidad de Almería. 211
pp.
Tello JC, Varés F, Lacasa A. 1991. En: Manual de Laboratorio. Diagnóstico de Hongos, Bacterias y
Nematodos Fitopatógenos. M.A.P.A., Madrid, 485 pp.
Cuadro 1. Porcentaje de plantas muertas, Índice de severidad de la enfermedad (ISE) y Grupo de
compatibilidad vegetativa de los aislados estudiados sobre tomate cv San Pedro como hospedador.
Código aislado
% Plantas muertas
ISE
Grupo de compatibilidad
Kik2 Phy 1
Kik2 Phy 2
Kik2 Phy 3
Kik2 Phy 4
Kik2 Phy 5
Kik2 Phy 6
Kik2 Phy 7
Kik2 Phy 8
Kik2 Phy 9
Kik2 Phy 10
Kik2 Phy 11
Kik2 Phy 12
Kik2 Phy 13
AR35inv2 Phy 1
AR35inv2 Phy 2
AR35inv2 Phy 3
AR35inv2 Phy 4
AR43B Phy 1
AR43B Phy 2
AR43B Phy 3
AR43B Phy 4
AR43B Phy 5
AR51 B Phy 1
AR51 B Phy 2
AR51 B Phy 3
11/39 Phy 1
11/39 Phy2
11/39 Phy 3
100
100
100
100
80
100
100
60
100
100
80
83,33
100
83,33
83,33
100
100
50
83,33
100
40
83,33
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
95
100
100
90
100
100
95
91,66
100
95,83
95,83
100
100
87,5
91,66
100
84
95,83
100
100
100
100
100
100
A2
A2
A2
A2
A2
A2
A2
A2
A2
A2
A2
A2
A2
A1
A1
A1
A1
A2
A2
A2
A1
A1
A2
A2
A2
A2
A2
A2