DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE CANALES DE CLORO

DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE CANALES DE CLORO DE LA
FAMILIA CLC EN OVOCITOS DE Xenopus tropicalis
Pérez Gutiérrez E. (1);
Salazar Soto D.B. (2);
Martínez Torres A. (2);
(1)
Facultad de Ciencias Químicas
Universidad Autónoma de Querétaro
(2)
Instituto de Neurobiología
Universidad Nacional Autónoma de México Campus Juriquilla
RESUMEN
Los canales de cloro son proteínas de transporte que cumplen funciones como regulación del
volumen celular, transporte transepitelial, excitabilidad eléctrica, etc. La familia de los canales
de cloro CLC son activados por voltaje. Un modelo de estudio de estos canales es mediante el
uso ovocitos de Xenopus laevis y Xenopus tropicalis. Se han identificado nueve canales CLC
en Homo sapiens; pero, poco se sabe de los canales endógenos de los ovocitos y su
conocimiento será de gran utilidad cuando los ovocitos se utilicen como medio de expresión.
En este estudio se extrajo RNA de ovocitos desfoliculados de X. tropicalis y se realizó RTPCR con primers específicos para determinar la expresión de los canales de cloro de la familia
CLC, con lo que se encontró un amplicón para los ClC 5 y 7.
INTRODUCCIÓN
Los canales de cloro son proteínas de membrana forman
canales por los cuales transportan cloruro, se encuentran en
organismos procariotas y eucariotas. Sus principales
funciones son: la regulación del volumen celular, transporte
transepitelial, regulación de excitabilidad eléctrica, entre
otras. La pérdida y mutaciones génicas de éstos pueden
causar patologías como el síndrome de Bartter, la
enfermedad de Dent, ceguera, fibrosis quística, etc. Han
sido estudiados en los últimos años; sin embargo, muchos
de estos canales aún no han sido caracterizados
molecularmente y las funciones de algunos son hasta ahora
desconocidas. Una forma de estudiar canales iónicos,
receptores y sistemas de transporte es mediante el uso de
ovocitos de Xenopus laevis y Xenopus tropicalis; resulta
más fácil hacer estudios electrofisiológicos en X. laevis por
el tamaño relativamente grande de los ovocitos, pero una de
las ventajas de utilizar X. tropicalis es que hasta ahora se
tienen más bases de datos y se está llevando a cabo un
proyecto para secuenciar su genoma, lo que puede facilitar
el estudio en bioinformática al momento de caracterizar
nuevos elementos, además de que posee un genoma mucho
más simple y su tiempo más corto de generación, facilitan el
estudio multigeneracional. Hasta ahora se han identificado
Figura 1: Dendograma de canales de cloro
CLC.
Se clasifican en tres ramas. Los
canales de la primera rama se encuentran
en membrana plasmática, mientras que los
demás son intracelulares. Se muestra
también la localización cromosómica en
humanos.
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tres familias de canales de cloro (CLC, CFTR y receptores activados por GABA y glicina). La
familia de canales CLC son activados por voltaje, un modelo de estudio son los ovocitos. Se
han identificado nueve genes de estos canales en Homo sapiens (figura 1) y es posible su
expresión heteróloga en ovocitos para su caracterización funcional; pero, poco se sabe de los
canales endógenos del ovocito. Previamente se identificaron CLC-5 y CLC-7 en una
biblioteca de genes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) hecha a partir de huevos de X. tropicalis.
A pesar de que algunos autores definen ciertas características diferenciales entre las corrientes
endógenas de las exógenas, es poco el conocimiento de las mismas, caracterizar las corrientes
iónicas producidas por los ovocitos será de gran utilidad para evitar confusiones cuando los
ovocitos se empleen como modelo de expresión.
METODOLOGÍA
Se diseñaron primers específicos para amplificar fragmentos de cada canal de cloro (CLC).
Las secuencias nucleotídicas de CLC 1 a 4, 6, Ka y Kb de Homo sapiens, de CLC 5, 7, y de
tubulina α1 de X. tropicalis se obtuvieron de la base de datos de NCBI. Se separó la CDS
(Coding DNA Sequence) de cada gen y se buscaron similitudes de cada una con fragmentos
EST (Expressed Sequence Tag) de la base de datos Xenopus tropicalis assembly v4.1 de JGI
Eucaryotic genomics (http://genome.jgi-psf.org). Los primers se diseñaron a partir de las
secuencias EST y se analizaron con el software IDT Oligoanalizer 3.1. Los primers se
mandaron sintetizar a Sigma-Aldrich México, se resuspendieron a una concentración final de
2.5mM y se almacenaron a -30°C hasta su uso. Las características de los primers se muestran
en la siguiente tabla:
TABLA 1: CARACTERÍSTICAS DE LOS PRIMERS
Nombre**
CLC-1*
Dirección
Secuencia
Pb %GC
TM
Fragmento
Sentido
GTCACACACACCGTCTCCACA
21 57.1% 67.5 ºC
~350pb
Antisentido
ACAGAGCCCAGCAGGATCAT
20 55% 66.1 ºC
CLC-2
Sentido
CACACAGATCCTCGCCCC
18 66.7% 67 ºC
~300pb
Antisentido
CAGCACCCAACACCCACAG
19 63.2% 67.9 ºC
CLC-3
Sentido
CCTGGAGTTGGGACCTATGATGA 23 52.2% 68 ºC
~476pb
Antisentido CCACACGCATAAGGGGCAAATAC 23 52.2% 69.7 ºC
CLC-4
Sentido
GATGAGCCGATTCCAGATGTCG 22 54.5% 69.9 ºC
~558pb
Antisentido GGTCCATTTTCCTAAGTATCCCCT 24 45.8% 64.9 ºC
CLC-5
Sentido
CTTCAGTCTGGAAGAGGTCAGC 22 54.5% 64.3 ºC
~403pb
Antisentido
CGAGTCAAGAAGGCCACAGT
20 55% 64.4 ºC
CLC-6a
Sentido
TGCAGCATTCCTGGGTGGT
19 57.9% 69.1 ºC
~353pb
Antisentido
TGCGTAGCTCACTGGATGG
19 57.9% 65.1 ºC
CLC-7
Sentido
GGAAGCCACTGGAAACGTCACC 22 59.1% 70.8 ºC
~518pb
Antisentido
TGGGGTTCATGAACTCCGTGA
21 52.4% 69.8 ºC
CLC-Ka*
Sentido
CGGCAGCACCATATTCCTGG
20 60% 69.6 ºC
~373pb
Antisentido
CTCAGGCAGGTCGAAGGGAA
20 60% 68.8 ºC
TUB α1
Sentido
CCTCTATCACTGCCTCCCTC
20 60% 62.7 ºC
~550pb
Antisentido
GAGAACTCCCCTTCCTCCAT
20 55% 63.3 ºC
* Las secuencias EST de donde se obtuvieron los primers antisentido para CLC-1 y CLC-Ka eran menores a 20pb y se les
añadieron nucleótidos en el extremo 5’ a partir de las secuencias CDS de Homo Sapiens correspondientes.
**No se diseñaron primers para CLC-Kb porque no se encontraron secuencias EST que coincidieran con la CDS de Homo
Sapiens correspondiente en la base de datos de JGI.
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Para la obtención de ovocitos se eligieron ranas adultas hembras de X. tropicalis, fueron
anestesiadas por hipotermia y mediante cirugía se extrajo un folículo de ovario para obtener
ovocitos, los cuales se colocaron en solución Barth y se conservaron en incubadora a 14°C.
Los ovocitos fueron desfoliculados manualmente con fórceps y se les dio un tratamiento con
colagenasa (0.5 mg/ml) por 45 min para eliminar los restos de células foliculares.
Posteriormente se lavaron con solución Barth y fueron congelados con nitrógeno líquido
agitando el tubo para tratar de separarlos. Se mantuvieron a -80°C hasta realizar la
extracción de RNA, (Chomczynski y Sacchi, 1987), mediante extracción con solventes
orgánicos fenol-cloroformo a bajo pH. El RNA extraído fue resuspendido en 50μl de agua
DEPC, se visualizó por medio de electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% en agua DEPC
con buffer de carga tipo III 6X y se cuantificó por espectrofotometría (a 280 y 260nm). La
retrotranscripción (RT) se realizó con el kit para síntesis de cDNA usando SuperScriptTM RT
con oligoDT. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se hizo bajo las siguientes
condiciones: un ciclo de 95°C por 1min; 35 ciclos de: 95°C por 30s para desnaturalizar, 55°C
por 30s para el alineamiento de los primers y 72°C por 25s para la elongación; un ciclo a
72°C por 5min para finalizar la reacción y posteriormente se mantiene a 4°C. Se prepararon
controles para cada PCR de los canales de cloro (CLC): tubulina como control positivo de
reacción, y como control negativo se reemplaza el cDNA por agua. Los resultados de las
PCR’s se visualizaron mediante electroforesis con gel de agarosa al 1.5% usando buffer de
carga tipo III 3X sin azul de bromofenol y utilizando λ-pst como marcador de peso molecular.
RESULTADOS
Los ovocitos desfoliculados de X. tropicalis que se utilizaron para hacer la extracción de
RNA, así como el gel de agarosa con el RNA se muestran en la figura 2. Están presentes las
bandas de rRNA 28S y 18S, la banda 5S es muy tenue, indicando que hay una poca
cantidad de pequeños RNAs (rRNA 5S y tRNA), no hay contaminación de DNA genómico, el
RNA no está degradado y se pudo usar como templado para la retrotranscripción. La
concentración final del RNA fue de 775ng/ul.
Figura 2: A) Ovocitos desfoliculados de X. tropicalis de los que se
extrajo el RNA. B) Gel de agarosa al 0.8% muestra el RNA obtenido.
Los geles de agarosa con los productos de las PCRs se muestran en la figura 3. En el
control positivo de reacción con tubulina se amplificó el fragmento esperado de 550pb. No
aparecieron bandas para CLC-1, 2, 3, 4, 6 y Ka. Para CLC-5 y 7 se amplificaron los
fragmentos de los tamaños esperados (~403 y ~518 respectivamente), sin embargo,
aparecieron contaminaciones inespecíficas en los controles negativos. Los fragmentos
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amplificados en los controles negativos nunca aparecieron en las reacciones con cDNA y los
fragmentos del tamaño esperado amplificados en las reacciones con cDNA nunca
aparecieron en los controles negativos. Es posible que esto se deba a que, aunque las
contaminaciones también estén presentes en las reacciones con el cDNA, los primers, al ser
específicos y tomando en cuenta la cantidad de cDNA en relación con la posible cantidad de
contaminaciones, sólo se amplifiquen los fragmentos a partir del cDNA. Para tratar de
eliminar las contaminaciones, se cambiaron las alícuotas de todos los reactivos y siguieron
apareciendo, por lo que es posible que se encuentren en los primers resuspendidos o haya
un problema en la técnica.
Figura 3: Geles de agarosa al 1.5% con los resultados de las PCRs realizadas. Aparece el control positivo de reacción de
tubulina (fragmento esperado de ~550pb). No se amplificó nada para CLC-1, 2, 3, 4, 6 y Ka. Se amplificaron fragmentos en
CLC-5 (+) y CLC-7 (+) de los tamaños esperados (~403 y ~518 respectivamente). Aparecen contaminaciones inespecíficas en
los controles negativos de CLC-4, CLC-5 y CLC-7 que aún no han podido ser eliminadas. Los fragmentos amplificados a partir
de estas contaminaciones nunca aparecieron en las reacciones con cDNA y los fragmentos amplificados en las reacciones con
cDNA no están presentes en los controles negativos. No se muestra la reacción con los primers para tubulina en todos los
geles.
CONCLUSIONES
Los fragmentos de los genes que codifican para los canales de cloro CLC-1, 2, 3, 4, 6 y Ka
no lograron amplificarse en ovocitos, por lo que es posible que no se encuentren en el
ovocito de X. tropicalis. Se propone buscar su expresión en distintos tejidos como corazón,
riñón, cerebro y músculo esquelético, dependiendo de dónde se ha encontrado cada uno de
estos canales en distintas especies como humano y ratón. Para CLC-5 y 7 se logró
amplificar los fragmentos de los tamaños esperados, pero los resultados obtenidos deben
corroborarse con la secuenciación de los fragmentos amplificados.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Harvor Laboratory Press, Cold Spring Harvor, NY. 2001.
-National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
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