Efecto de la Hipoxia sobre la Respuesta a la 5

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Ciencias Básicas/Basic Research
Efecto de la Hipoxia sobre la Respuesta a la
5-Hidroxitriptamina en Anillos de Arteria
Pulmonar Principal de la Rata
Rodríguez Rondón M.A. *,Leal L. **,
Alfonso C.***, Lamanna V. *
*Universidad Central de Venezuela. Escuela Luis Razetti, Cátedra de Farmacología,
**Hospital Dr. Ricardo Baquero González. Caracas, Venezuela,
***Sección de Investigaciones Cardio-renales. Instituto de Medicina Experimental. U.C.V.
La 5-hidroxitriptamina (serotonina) (5-HT3) es un potente modulador vascular presente en la circulación
pulmonar que cumple un papel importante en regular la vasoreactividad vascular en condiciones
fisiológicas y fisiopatológicas. Produce vasoconstricción principalmente por su acción sobre los receptores
5-HT2A y por liberar en calcio almacenado, así como en promover su entrada por el plasmalema a través
de los canales de Ca+2 voltaje dependientes. Se conoce acerca del papel de la serotonina en la
hipertensión pulmonar, pero poco con respecto a su acción in vitro sobre la arteria pulmonar. Nos hemos
propuesto evaluar los efectos de la serotonina en condiciones de normoxia e hipoxia y el papel del calcio
sobre dicha respuesta. Para ello, utilizamos ratas Sprague-Dawley de 345 ± 15 g las cuales una vez
anestesiados se les extrajo la arteria pulmonar principal (Ap) de la que se obtuvieron anillos que se
colocaron en un baño para órgano aislado a 37° C, pH 7,4 en una solución de Kreb´s-Henseleit
burbujeada constantemente con 95% O2, 5% CO2 en normoxia y 95% N2, 5% CO2 durante la hipoxia. Se
realizaron curvas de dosis-respuesta a la 5-HT3 en condiciones de normoxia e hipoxia (1 x 10-6 M - 1 x
10-3 M) en ausencia y presencia de verapamil (1 x 10-6 M). En condiciones de normoxia, el verapamil
disminuyó la respuesta máxima a la 5HT-3 en un 48% (p < 0,01), mientras que la hipoxia, la disminuyó
en un 49% (p < 0,01). En presencia de verapamil y en condiciones de hipoxia, la disminución fue de un
73% (p < 0,01). Al estimular con 5-HT3, el principal mecanismo vasoconstrictor estaría mediado por la
entrada del calcio extracelular. En conclusión, la hipoxia permitiría una recaptación mayor del calcio por el
retículo sarcoplásmico, siendo importante la entrada del mismo por el plasmalema.
La serotonina [5-hidroxitriptamina (5-HT)] es un potente vasoconstrictor pulmonar que contribuye con la
vasoconstricción pulmonar hipóxica e hipertensión pulmonar. Se encuentra fundamentalmente en el
cerebro, tejido enterocromafín y plaquetas [13]. Dependiendo de la situación del lecho vascular, las
condiciones experimentales, el grado de tono simpático y la vía de administración, la amina puede
producir constricción o dilatación de los vasos sanguíneos. Estos efectos múltiples sobre los vasos
sanguíneos pueden explicarse por la existencia clara de dos subtipos de receptores serotonérgicos: 5-HT 1
y 5-HT 2A [2,14]. El receptor 5-HT 1 regula la actividad vasodilatadora de la serotonina, mientras que el
receptor 5-HT 2A regula los efectos vasoconstrictores [18,19] (figura 1). El incremento en la concentración
intracelular de calcio inducida por la 5-HT se manifiesta por una respuesta fásica, debido a la liberación de
calcio del RS, seguida por la fase de meseta (debido a la entrada de calcio por el plasmalema). Esto ha
sido observado en cultivo de células pulmonares lisas de arterias intrapulmonares y en ramas de la arteria
pulmonar principal [13]. La respuesta contráctil a la 5-HT es inhibida parcialmente por nifedipina, en
arteria pulmonar principal de humano [9]. Aunque el incremento pasajero del calcio luego de estimulación
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con 5-HT se ha atribuido a la producción de IP 3, la naturaleza de la entrada de calcio en respuesta a la 5HT en la arteria pulmonar principal no ha sido bien determinada, sino más bien en las pequeñas arterias
pulmonares, siendo el papel del RS menor mientras las arterias sean más pequeñas, predominando en
estas, la entrada de calcio del medio extracelular [1,6]. El objetivo de este trabajo fue evaluar la acción de
la 5-hidroxitriptamina sobre la arteria pulmonar principal de la rata en condiciones de hipoxia y cómo se
vería afectada esta respuesta en presencia de un agente que bloquee la entrada de este ión, como es el
caso del verapamil.
Figura 1. Representación esquemática de las vías de señalización de 5-HT en
células de músculo liso vascular. La activación de los receptores 5-HT 1B , 5HT 2A, 5-HT 2B , causan vasoconstricción. El receptor 5-HT 1B activa la
proteína Gi que suprime la actividad de la adenilciclasa. Esta normalmente
incrementa los niveles citosólicos de AMPc, activa la PKA y la PKG. La primera
fosforila y activa a los VOC, a los K V y a los BK Ca , mientras que la PKG,
potencia el BK Ca (Barman y col, 2003). El efecto de este último canal es
modular la vasoconstricción. El receptor 5-HT 2A y 5-HT 2B activan la
fosfolipasa (PLC) a través de la G q para incrementar los niveles citosólicos
de IP 3 . Este libera Ca +2 de los sitios de almacenamiento intracelular y
causa vasoconstricción. Asimismo, los receptores 5-HT 2B incrementan la cSrc, que bloquea el canal BK Ca y promueve la vasoconstricción. El canal 5HT 2B también está relacionado en la activación de una proteíncinasa
activada por mitógenos (MAPK), que conduce a una proliferación celular
(Nebigil y col, 2000) El transportador de 5-HTT permite la entrada de este al
citosol mediante la utilización de un gradiente transmembrana de Na + . La
5-HT intracelular active a la NAD(P)H oxidasa por medio de una combinación
de Ras y Rac que incrementa la producción del anión superóxido (O 2 – ) y
del peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) (Fanburg y Lee, 2000). Estas ERO
activan a señales extracelulares (ERK) MAPK, las cuales incrementan la
fosforilación del factor de transcripción GATA–4 que a su vez promueve la
transcripción de genes de proteínciclina (Suzuki y col, 2003). La ciclina D2 se
ha implicado en la proliferación de células musculares lisas. Tomado de Weir
y col, (17).
MATERIALES Y MÉTODOS
Como animales de experimentación se utilizaron ratas Sprague-Dawley provenientes del bioterio del
Instituto de Medicina Experimental, Universidad Central de Venezuela (Caracas), los cuales se
mantuvieron hasta el momento del experimento con comida [Ratarina®] y agua a voluntad. Los animales
fueron inyectados intraperitonealmente con tiopental sódico (Nesdonal®, Specia, Rhone Poulenc Rorer,
París) (50 mg/Kg de peso). Se colocaron en una tabla de disección y mediante toracotomía media se
expusieron el corazón y la arteria pulmonar principal, realizándose la extracción de estos rápidamente. Se
cortó la arteria pulmonar principal, para luego cortar pequeños anillos (3-4 mm de longitud); estos fueron
colocados en una cápsula de Petri que contenía una solución de Krebs-Henseleit con la siguiente
composición (en mM/litro): NaCl, 119; KCl, 4,7; MgSO 4 , 1,5; KH 2 PO 4 , 1,2; NaHCO 3 , 25; CaCl 2 ,
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2,5; MgSO 4 , 1,2 y glucosa, 11, burbujeada constantemente con 95% O 2 , 5% CO 2 a 37° C, pH= 7.
Estos anillos se montaron en dos estribos de acero inoxidable y se llevaron a un baño para órgano aislado
(15 mL). Uno de los estribos se unió al fondo del baño y el otro a un transductor de fuerza-desplazamiento
FTO 3 , (Grass Instruments C.O. Quince, Mass. USA) y este, a su vez, a un preamplificador Grass, modelo
7C. A cada anillo se le aplicó una tensión basal de dos gramos. Estabilizado cada segmento de arteria
durante 2 horas, se indujo una primera contracción con una solución de KCl= 40 mM y media hora
después, la segunda contracción para asegurar la viabilidad de la preparación y normalizar las respuestas.
Los registros de las contracciones isométricas se obtuvieron en un polígrafo Grass. Modelo 7C a una
velocidad de 2,5 mm/min. Los experimentos con hipoxia se realizaron sustituyendo el burbujeo de la
solución de la mezcla de gases de 95% O 2, 5% CO 2 a una mezcla de 95% N 2 , 5% CO 2. Para
determinar si el endotelio estaba intacto funcionalmente en las preparaciones, se añadió acetilcolina a una
concentración de 1 x 10 -6 M a la arteria pulmonar principal contraída, según el método de Furchgott y
Zawadzki [3]. Todos los anillos fueron utilizados una sola vez. Los experimentos son expresados como la
media ± el error estándar (X ± EEM). La significación estadística fue determinada por la prueba no
pareada de t de Students para dos grupos de comparación. Para más de dos grupos de comparación, fue
utilizado un ANOVA, y la prueba de Tukey. Una regresión no lineal simple se realizó en cada curva de
dosis-respuesta (Graphpad Software Inc. Versión 4,0). Se realizaron curvas de dosis-respuesta a la 5-HT
en condiciones de normoxia, añadiendo la droga en forma acumulativa a partir de una concentración de 1
x 10 -6 M, hasta 1 x 10 -3 M, con incrementos sucesivos dados por un factor geométrico de 3; cada
incremento se efectuó cuando el registro de la respuesta contráctil obtenida se estabilizó en un valor
máximo. Una vez obtenida la respuesta a la concentración máxima, se procedió a lavar rápidamente las
preparaciones, hasta obtenerse una nueva estabilización. Obtenida la curva control a la 5-HT, la misma
fue repetida en condiciones de hipoxia. Luego de lavados sucesivos, se añadió durante 30 minutos una
concentración de 1 x 10 -6 M de verapamil, repitiéndose el procedimiento anterior, tanto en condiciones
de normoxia como en condiciones de hipoxia.
RESULTADOS
Como se muestra en la figura 2, en condiciones de normoxia, la serotonina incrementó la respuesta
contráctil en anillos de arteria pulmonar principal de la rata, de una manera dosis-dependiente,
alcanzándose el efecto máximo a una concentración de 1 x 10 -3 M, obteniéndose una DE 50 de 3 x 10 -5
M (n= 7). En condiciones de hipoxia, se disminuyó el efecto máximo en un 49% a la misma
concentración de 5-HT, y se obtuvo una DE 50 de 3,98 x 10 -5 M (n= 4), encontrándose diferencias
significativas en cuanto a la disminución del efecto máximo (p < 0.01). En presencia de verapamil, en
condiciones de normoxia se alcanzó una disminución del 48% del efecto máximo, encontrándose
diferencias significativas con respecto al control (p < 0,01) (n= 4). En presencia de verapamil, la hipoxia
disminuyó el efecto máximo cerca de un 50% (p < 0,01) (n= 4), encontrándose diferencias significativas
con respecto al control hipoxia (p < 0,05) El efecto porcentual del verapamil en condiciones de normoxia a
hipoxia, fue similar en ambas condiciones.
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Figura 2. Curva de dosis-respuesta a la 5-hidroxitriptamina en anillos de arteria pulmonar
principal de la rata en condiciones de normoxia e hipoxia, en ausencia y en presencia de
verapamil. normoxia; ( ___ ) (N= 7); hipoxia; ( ___ ) (n= 4); normoxia en presencia de
verapamil; ( ---- ) (n= 4); hipoxia en presencia de verapamil ( ---- ) (n= 4). Todos los
valores son expresados como la media ± el error estándar. En la arteria pulmonar principal
de la rata, la hipoxia disminuyó el efecto máximo en un 49% (p < 0,01). En presencia de
verapamil, la hipoxia disminuyó el efecto máximo cerca de un 50% (p < 0,01) (n= 4),
encontrándose diferencias significativas con respecto al control hipoxia (p < 0,05). En
normoxia, el verapamil disminuyó el efecto máximo en un 48% (p < 0,05). La disminución
porcentual del efecto, en presencia de verapamil en condiciones de normoxia a hipoxia, fue
similar.
DISCUSIÓN
Se pudo observar que la disminución de la respuesta en presencia de verapamil durante la normoxia, fue
similar en magnitud a la observada en condiciones de hipoxia. Podemos especular entonces que en la
arteria pulmonar principal de la rata, el mecanismo de contracción inducida por la 5-HT sea dependiente
principalmente de la concentración externa de calcio, pudiendo la hipoxia afectar principalmente los
mecanismos de recaptación de Ca +2 de los sitios de almacenamiento intracelular. Otra posibilidad sería
que la hipoxia favorezca la liberación del NO o un factor hiperpolarizante derivado del endotelio, que
contribuiría a disminuir la respuesta contráctil. En apoyo a esto, Hampl y col, [15] observaron que la
exposición a hipoxia de un cultivo de células pulmonares de bovino, incrementaba los niveles de Ca +2 en
las células endoteliales de 113 ± 10 a 23 a 231 ± 45 nM. Y que la thapsigargina, disminuía este
incremento, lo que les sugirió una principal contribución de esta fuente de Ca +2. Este incremento del Ca
+2 en las células endoteliales, aumenta la síntesis del óxido nítrico (NO) y produce vasodilatación.
Experimentos similares realizados por Yuan y col, [13]; utilizando células musculares lisas de rata,
mostraron que el NO inhibía significativamente la fase de meseta de la contracción inducida por la 5-HT, lo
que les sugirió que esta sustancia disminuía tanto la liberación de calcio inducida por agonistas en los
sitios de almacenamiento intracelular sensibles al ácido ciclopiazónico (CPA), como la entrada del mismo
por el sarcolema. La posible liberación de NO durante la hipoxia, contribuiría a incrementar el secuestro de
Ca +2 por el RS y esto explicaría la disminución en la respuesta observada. Por otra parte, Wilson y col,
[12], utilizando arteria pulmonar de perro, determinaron que los niveles basales de Ca +2 más que la
entrada del mismo, es el mecanismo más importante para mantener el Ca +2 citosólico necesario para
que se sostenga la contracción en esta arteria, una vez estimulada con 5-HT. Resultados diferentes fueron
reportados por McLean y col, [8]; pero en condiciones de hipoxia crónica, donde se producía un incremento
en la sensibilidad y en la respuesta máxima a la 5-HT en arteria pulmonar principal en la rata, mientras
que Tasaki y col, [10] observaron que el verapamil inhibía marcadamente la respuesta contráctil inducida
por la 5-HT, lo que relacionaba su acción con los canales de Ca +2 dependientes de voltaje.
Debido a que el CPA, no afectaba la señal de calcio sostenida, inducida por la 5-HT en solución de calcio,
González de La Fuente y col, [4], excluyeron la fuente de calcio intracelular en la respuesta observada. Sin
embargo, Yuan y col, [13], describieron una señal intracelular de calcio en respuesta a la 5-HT en arteria
pulmonar de rata, así como la entrada por el plasmalema en cultivo de células pulmonares lisas del mismo
animal. Es posible que el papel del calcio almacenado sea el mecanismo más importante que se
presentaría en las arterias de pequeño calibre, siendo la entrada de Ca +2 por el plasmalema el
mecanismo más importante en las arterias de mayor calibre, cuando se estimula con 5-HT [5,7], mientras
que la hipoxia contribuiría con un mayor almacenamiento de Ca +2 en el RS, unido posiblemente a un
mayor aumento en la síntesis de NO o un incremento en la recaptación de 5-HT que explicaría la
disminución en la respuesta observada. En apoyo a esto, Lee y col, [16], demostraron en cultivo de células
musculares lisas de bovino que el mecanismo de recaptación de 5-HT se incrementaba por exposición de
las células a 24 horas de anoxia, mientras que Wanstall y col, [11] evaluaron esta recaptación en ratas
expuestas a hipoxia crónica con 10% O 2, por 8 horas, durante 5 días. Observaron una potenciación del
efecto de la 5-HT en anillos de ratas hipóxicas, independiente de endotelio y propusieron que en la
circulación pulmonar la hipoxia induce aumento en la recaptación de 5-HT. Podemos concluir que la
disminución en la respuesta en la arteria pulmonar principal de la rata en hipoxia, puede relacionarse con
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un mayor almacenamiento de Ca +2 en el RS, siendo la concentración extracelular de este ión la principal
fuente para el mantenimiento de la contracción cuando se estimula con 5-HT,
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Publicación: Octubre 2005
Tope
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