Tubos Leucosep - Oxford Immunotec

Tubos Leucosep
LTK.615
PROSPECTO
Para uso diagnóstico in vitro
PI-LT.615-ES-V3
Información e instrucciones
Uso previsto
El uso previsto de los tubos Leucosep es la recogida y la separación de células mononucleares a
partir de sangre completa. Los tubos facilitan la separación de las células mononucleares cuando
se aplica el procedimiento FICOLL-PAQUE* PLUS antes de utilizar estas células en análisis
ELISPOT.
Introducción
Las técnicas ELISPOT utilizan células T que se han separado de sangre completa. Un método
para separar estas células requiere el uso de FICOLL-PAQUE PLUS. Este procedimiento consta
de una serie de pasos que se deben llevar a cabo con cuidado para garantizar resultados óptimos.
El uso de los tubos Leucosep reduce el número de pasos, aumenta la solidez del procedimiento y
disminuye el tiempo necesario para realizar el procedimiento de separación.
Principio del método
Los tubos Leucosep se han desarrollado para conseguir una separación óptima de las células
mononucleares de sangre periférica humana mediante centrifugación por gradiente de densidad.
Estos tubos Leucosep incorporan una barrera porosa en un tubo de polipropileno transparente.
Esta barrera biológicamente inerte consiste en polietileno de alto grado. El tubo Leucosep elimina
la prolongada y laboriosa estratificación del material de la muestra sobre FICOLL-PAQUE PLUS.
Se mezcla la sangre completa anticoagulada con un medio de cultivo y luego se vierte en el tubo
Leucosep. La barrera porosa impide que la sangre se mezcle con el medio de separación
(FICOLL-PAQUE PLUS). Durante la centrifugación, las células mononucleares se separan de los
eritrocitos no deseados como consecuencia de sus diferentes densidades y se recogen en la
interfase por encima del medio de separación. Cuando la separación es completa, la barrera
impide una nueva contaminación de la capa de mononucleares en el momento de retirarla.
Advertencias y precauciones
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Exclusivamente para uso diagnóstico in vitro.
Sólo para uso por profesionales; los técnicos han de estar formados para este procedimiento.
Las muestras de sangre se deben considerar potencialmente peligrosas. Hay que tener
cuidado al manipular material de origen humano.
La manipulación de las muestras de sangre completa y de los componentes del análisis,
durante el uso, la conservación y la eliminación, debe atenerse a los procedimientos definidos
en las directrices o las normas nacionales pertinentes de seguridad ante riesgos biológicos.
Cualquier desviación de los procedimientos recomendados de pipeteo, técnicas de lavado,
tiempos de centrifugación y temperaturas puede alterar la pureza de los aislamientos de
células mononucleares e influir en los posteriores resultados de la prueba.
No recoja sangre en Tubos para Preparación de Células (CPT™, Becton Dickinson) o tubos
de extracción de sangre con EDTA porque son incompatibles con los tubos Leucosep.
No refrigere ni congele las muestras de sangre completa. Conserve y transporte las muestras
de sangre al laboratorio a temperaturas de 18-25°C o de 10-25°C si van a tratarse con el
reactivo T-Cell Xtend™.
La sangre no deberá almacenarse durante más de 8 horas, o de 32 horas si más tarde va a
tratarse con el reactivo T-Cell Xtend.
Utilice únicamente recipientes de un solo uso para la recogida de muestras de sangre venosa.
No use el producto después de la fecha de caducidad.
Utilice técnicas asépticas al usar este producto.
No conserve los tubos Leucosep bajo la luz directa.
No use el producto si los tubos Leucosep están dañados o si FICOLL-PAQUE PLUS se ha
deteriorado, como indicaría la aparición de un color amarillo evidente o de partículas en la
solución.
Prospecto de Leucosep
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PI-LT.615-ES-V3
Materiales suministrados
Cada caja contiene:
50 tubos Leucosep precargados con FICOLL-PAQUE PLUS.
CD con el prospecto y la MSDS (hoja de datos de seguridad de materiales).
Conservación y estabilidad
Almacene el producto sin abrir a 4-30°C hasta la fecha de caducidad indicada en la caja. Conserve
el producto abierto a temperatura ambiente (18-25°C) y utilícelo en un plazo de 12 semanas
después de abrir la bolsa externa, o antes de la fecha de caducidad que figura en la caja, lo que
ocurra primero.
Equipo y materiales necesarios pero no suministrados
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Tubos de extracción de sangre heparinizados.
®
Medios de cultivo celular AIM V y RPMI.
Tubos de centrifugación de 15 ml.
Una centrífuga para el fraccionamiento de las células mononucleares capaz de al menos
1.000 RCF (g) y capaz de mantener las muestras a temperatura ambiente (18-25°C).
Cámara de flujo laminar con un nivel de seguridad biológica 2 (BL 2) (recomendado).
Pipetas y puntas de pipeta estériles.
Kit de ELISPOT.
Reactivo T-Cell Xtend, que podrá adquirirse si se utilizan muestras de más de 8 horas.
Procedimiento
Nota: Hay que realizar los pasos siguientes aplicando los principios de buena práctica de
laboratorio:
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Asegúrese de que cuenta con el número necesario de tubos Leucosep a temperatura
ambiente (18-25°C) antes del procedimiento.
Si ha quedado FICOLL-PAQUE PLUS encima de la barrera porosa, centrifugue los tubos
Leucosep a 350 x g durante un minuto para desplazar FICOLL-PAQUE PLUS por debajo de
la barrera.
Invierta la muestra de sangre completa y luego diluya en una proporción de 5 partes de
sangre por 3 partes de medio de cultivo celular AIM V o RPMI en un tubo de centrífuga de 15
ml. Invierta varias veces el tubo de centrífuga para mezclar.
Vierta directamente la sangre diluida en el tubo Leucosep y centrifugue a 1.000 x g durante
10 minutos a 18-25°C sin frenar.
Aspire la capa turbia de células mononucleares y diluya hasta ~10 ml con AIM V o RPMI en
un tubo de centrífuga de 15 ml. Invierta el tubo para mezclar.
Centrifugue a 600 xg durante 7 minutos. Deseche el sobrenadante.
Vuelva a suspender el sedimento celular con AIM V o RPMI, diluya hasta ~10 ml con AIM V o
RPMI y centrifugue a 350 x g durante 7 minutos más.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en el volumen de AIM V
(no RPMI) necesario para el análisis ELISPOT.
Si se precisan células para estimulación antigénica en un análisis ELISPOT, dilúyalas con
AIM V (no RPMI).
Limitaciones
1.
Como ocurre con otros métodos de separación, los tubos Leucosep pueden alterar la
proporción de algunas subpoblaciones de células mononucleares (p. ej., células T y B) con
respecto a los presentes en sangre completa no separada. Se considera que tal alteración es
relativamente insignificante en los casos normales.
Prospecto de Leucosep
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Control de calidad
Análisis internos no han demostrado una disminución significativa de la producción de células
mononucleares al comparar FICOLL-PAQUE PLUS con tubos Leucosep. Como parte de la
actividad de control de calidad en cada laboratorio, se deben diseñar y validar métodos de
recuento para garantizar la obtención de suficientes células mononucleares para el sistema
analítico pertinente. Además, en las actividades de control de calidad se deben emplear controles
positivos y negativos establecidos para garantizar el rendimiento previsto de células T en el
procedimiento analítico.
Características de rendimiento
Sangre conservada con el reactivo T-Cell Xtend
Se obtuvieron dos muestras de 6 ml de sangre de 46 donantes. Se procesó una muestra de cada
donante en las 8 horas siguientes a la extracción mediante disposición manual en capas con
FICOLL*. La segunda muestra se procesó utilizando un tubo Leucosep tras la conservación
durante 29-32 horas usando el reactivo T-Cell Xtend.
Se obtuvo una cantidad suficiente de células empleando ambos métodos para las muestras que
iban a usarse en el análisis ELISPOT y las células obtenidas de todas las muestras fueron
funcionales en el análisis.
Sangre fresca
Se obtuvieron 2 muestras de 6 ml de sangre de 52 donantes. Las dos muestras de cada donante
se procesaron en las 8 horas siguientes a su extracción. La primera muestra se procesó mediante
disposición manual en capas con FICOLL. La segunda muestra se procesó utilizando un tubo
Leucosep.
Se obtuvo una cantidad suficiente de células empleando ambos métodos para las muestras que
iban a usarse en el análisis ELISPOT y las células obtenidas de todas las muestras fueron
funcionales en el análisis.
Guía de detección de problemas en la recogida y separación de células mononucleares para
ELISPOT
Problema
Baja producción de células
Prospecto de Leucosep
Posible causa
Leucopenia
Posible solución
Añada otro tubo de extracción
de sangre
Extracción incorrecta de la
sangre
Los CPT y los tubos de
extracción de sangre con
EDTA no son compatibles con
los tubos Leucosep
El tubo de extracción de sangre
no está a temperatura ambiente
(18-25°C)
Deje que el tubo de extracción
de sangre se equilibre a
temperatura ambiente
La sangre no está conservada a
la temperatura requerida
Asegúrese de que el envío de
sangre sea a 18-25°C o a
10-25ºC si se usa el reactivo
T-Cell Xtend
Uso de volúmenes o diluciones
distintos de los recomendados
Asegúrese de seguir las
instrucciones correctas
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Contaminación por
eritrocitos
La sangre no está conservada a
la temperatura requerida
Asegúrese de que la sangre
se transporta a 18-25°C o a
10-25°C si se usa el reactivo
T-Cell Xtend
El tubo de extracción de sangre
no está a temperatura ambiente
(18-25°C)
Deje que el tubo de extracción
de sangre se equilibre a
temperatura ambiente
La sangre no está diluida
Asegúrese de que se diluye la
sangre según el procedimiento
Inversión de la muestra de
sangre en el tubo Leucosep
Asegúrese de que el tubo
Leucosep está en posición
vertical antes de la
centrifugación
Centrifugación incorrecta
Asegúrese de que se siguen
las instrucciones de la
centrifugación
Compruebe que la
centrifugadora es capaz de
refrigerar a 18-25°C
Compruebe que el freno de la
centrifugadora está
desconectado
No hay una capa de células
mononucleares definida o
clara
Separación incompleta de las
muestras
Separación incompleta de las
muestras
Aumentar el tiempo de
centrifugación de 10 minutos
Aumentar el tiempo de
centrifugación de 10 minutos
La centrífuga no está calibrada
correctamente
Calibre la centrífuga
Asegúrese de que se siguen
las instrucciones de la
centrifugación
Centrifugación incorrecta
Obtenga la muestra de sangre
en ayunas
Resultados no válidos
Prospecto de Leucosep
Muestra hiperlipémica
Los resultados no válidos
pueden deberse a una serie de
incorrecciones en la
manipulación de la muestra
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Consulte los apartados
anteriores
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Glosario de símbolos
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´
Ó
i
1
j
²
Uso por/fecha de caducidad (año-mes-día)
Número de lote
Número de catálogo
Atención, ver las instrucciones de uso
Fabricante
Suficiente para “n” análisis
Dispositivo de diagnóstico in vitro
Limitación de temperatura/Conservar a
Consultar las instrucciones de uso
T-Cell Xtend y Oxford Immunotec logo son marcas registradas de Oxford Immunotec Limited.
AIM V es una marca registrada de Invitrogen.
CPT es una marca registrada de Becton Dickinson.
* FICOLL y FICOLL-PAQUE son marcas registradas de las empresas GE.
El uso del reactivo T-Cell Xtend está protegido por las siguientes patentes y patentes en trámite:
EP2084508; US13/253,598, CN101529221, AU2007-303994, JP2009-530943, IN2165/DELNP/2009,
CA2665205
© Oxford Immunotec Limited, 2013. Reservados todos los derechos.
Fabricante:
Oxford Immunotec Ltd
94C Innovation Drive, Milton Park, Abingdon
Oxfordshire, OX14 4RZ, Reino Unido
+44(0)1235 442796
www.oxfordimmunotec.com
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