preparacion de composiciones complejas de liposomas y

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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ES 2 087 151
kInt. Cl. : A61K 9/127
11 N.◦ de publicación:
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ESPAÑA
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 90906530.2
kFecha de presentación : 28.03.90
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 467 954
kFecha de publicación de la solicitud: 29.01.92
T3
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54 Tı́tulo: Preparación de composiciones complejas de liposomas y lı́pidos.
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30 Prioridad: 31.03.89 US 332609
05.04.89 US 334055
The Regents of the University of California
300 Lakeside Drive, 22nd Floor
Oakland, California 94612-3550, US
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72 Inventor/es: Szoka, Francis, C., Jr.
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74 Agente: Durán Moya, Carlos
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.07.96
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.07.96
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73 Titular/es:
Aviso:
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 087 151 T3
DESCRIPCION
Sector técnico al que pertenece la invención
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La presente invención se refiere al campo de las composiciones farmacéuticas, y a la administración
de compuestos que tienen una reducida solubilidad en agua. La presente invención también se refiere a
la producción de liposomas y partı́culas de lı́pidos que tienen unas dimensiones definidas de partı́culas.
Antecedentes de la invención
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Los liposomas son pequeñas vesı́culas compuestas de lı́pidos antifáticos dispuestos en capas secundarias esféricas. Los liposomas se clasifican habitualmente en vesı́culas unilaminares pequeñas (SUV),
vesı́culas unilaminares grandes (LUV), o vesı́culas multilaminares (MLV). Por definición, las SUV y LUV
tienen solamente una capa adyacente, mientras que las MLV contienen muchas capas adyacentes o secundarias concéntricas. Los liposomas se pueden utilizar para encapsular diferentes materiales, al secuestrar
compuestos hidrofı́licos en el interior acuoso o entre capas secundarias, o secuestrando compuestos hidrofóbicos dentro de la capa secundaria o accesoria.
Los liposomas muestran una amplia variedad de caracterı́sticas dependiendo de sus dimensiones, composición y carga. Por ejemplo, los liposomas que tienen un pequeño porcentaje de lı́pidos insaturados
tienden a ser ligeramente más permeables, mientras que los liposomas que incorporan colesterol u otros
esteroles tienden a ser más rı́gidos y menos permeables. Los liposomas pueden ser positivos, negativos o
neutros en su carga dependiendo del grupo hidrofı́lico. Por ejemplo, los lı́pidos basados en colina imparten
una carga positiva, los lı́pidos basados en fosfatos y sulfatos aportan una carga negativa, y los lı́pidos
basados en glicerol y los esteroles son generalmente neutros en solución.
Se han utilizado liposomas para administrar materiales biológicamente activos. Ver, por ejemplo,
Allison Patente U.S.A. N◦ . 4.053.585, que da a conocer la administración de varios antı́genos en liposomas cargados negativamente, incluyendo opcionalmente M. tuberculosis muertos. Fullerton y otros,
Patente U.S.A. N◦ . 4.261.975, dan a conocer la utilización de membranas de gripe separadas, con puntas
de hemaglutinina acopladas, que se une a liposomas para su utilización en vacunas contra la gripe.
Los liposomas han sido utilizados para encapsular una amplia variedad de compuestos que muestran
reducida solubilidad acuosa o que muestran toxicidad inaceptable en dosis terapéuticas. Por ejemplo, la
anfotericina B es un antibiótico antihongos poco soluble en agua, alcoholes, cloroformo, y otros disolventes
habituales halocarbonados. Si bien la anfotericina B es un fungicida efectivo, también es peligrosamente
tóxico en concentraciones ligeramente por encima de las concentraciones terapéuticas. El encapsulado
en liposomas parece reducir la toxicidad in vivo para células de mamı́feros, mientras que la actividad
fungicida permanece relativamente inalterada (F.C. Szoka y otros, Antimicrob Agents Chemother (1987)
31:421-29). Los efectos de la citotoxicidad y de la actividad fungicida eran dependientes de la composición
especı́fica del liposoma, estructura liposomal (por ejemplo, SUV, MLV, etc.), y método de preparación.
Se pueden formar vesı́culas de fosfolı́pidos (liposomas) por una serie de técnicas que, en general, se
inician con lı́pidos “secos” que son introducidos en una fase acuosa (D. Lasic, J Theor Biol (1987) 124:3541). Una vez el lı́pido es hidratado, los liposomas se forman de manera espontánea. Ver por ejemplo
los documentos US-A-4 812 312, WO-A-8500751 y EP-A-0 282 405. Se han desarrollado técnicas para
controlar el número de láminas en los liposomas y para producir un determinado tamaño de partı́culas.
Los procedimientos conocidos son satisfactorios para la mayor parte de aplicaciones en las que requieren
pequeñas cantidades de material (G. Gregoriadis, “Liposome Technology” I-III (Boca Raton, Florida,
CRC Press, Inc.) 1984). No obstante, para la fabricación de vesı́culas a gran escala, la fase de hidratación de lı́pidos puede ser una fuerte limitación para la producción de vesı́culas.
Para acelerar la fase de hidratación del lı́pido, los lı́pidos se pueden disolver en un disolvente orgánico,
siendo inyectados en la fase acuosa. Esto permite la producción continua de vesı́cula puesto que el
disolvente puede ser eliminado por diálisis o por evaporación. Utilizando etanol como disolvente, se pueden formar liposomas unilaminares de dimensiones definidas por inyección (S. Batzri y otros, Biochem
Biophys Acta (1973) 298:1015-1019; J. Kremer y otros, Biochemistry (1977) 16:3932-3935). Este procedimiento genera vesı́culas unilaminares siempre que la concentración de lı́pido en el etanol se encuentre
por debajo de 40 mM y que la concentración final de etanol en la suspensión acuosa sea menor de 10%
aproximadamente (F. Boller, y otros, EP-A-0 253 619, archivado el 14 de julio de 1987). Estos dos
factores limitan la concentración de liposomas con tamaños definidos formados por inyección de etanol a
unos 4 mM aproximadamente. Esto es una solución más bien diluida de los liposomas, siendo pobre el
rendimiento de encapsulado para compuestos solubles en agua, mientras que para compuestos solubles
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en lı́pidos se requieren grandes volúmenes para obtener una cantidad suficiente de material. A causa de
estas limitaciones, la inyección de etanol no ha sido utilizada de manera amplia para conseguir vesı́culas
de lı́pidos (D. Lichtenberg, y otros, en “Methods of Biochemical Analysis”, (D. Glick, ed., John Wiley &
Sons, N.Y.) (1988) 33:337-462).
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Las partı́culas de lı́pidos son complejos de un lı́pido antifático con otra molécula, en una proporción
definida, que resulta en una estructura o partı́cula supramolecular. La principal diferencia entre un liposoma y una partı́cula lipı́dica es que un liposoma tiene una capa secundaria continua de lı́pido que
rodea un núcleo acuoso, mientras que una partı́cula lipı́dica no lo rodea. A causa de esta diferencia, en
muchos casos, las partı́culas lipı́dicas no pueden encapsular moléculas solubles en agua. Las partı́culas
lipı́dicas pueden quedar comprendidas en tamaño desde aproximadamente 5 nm hasta unas dimensiones
mayores de 1000 nm. Las dimensiones de la partı́cula lipı́dica final dependen de la composición y del
método de preparación. Son ejemplos de partı́culas lipı́dicas las emulsiones de lı́pidos (S. Ljungberg y
otros, Acta Pharmaceutica Suecica (1970) 7:435-40), lipoproteı́na (A. Gotto y otros, Meth Enzymol (1986)
129:783-89), e iscoms (K. Lovgren y otros, J Immunol Meth (1987) 98:137-43).
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El documento US-A-4 804 539 da a conocer un proceso para la preparación de liposomas a partir de
una composición de lı́pidos que contiene un agente biológico. La composición de lı́pido es disuelta en un
agente orgánico y los liposomas son formados por añadidura de un medio acuoso, sonicado y eliminación
del disolvente orgánico.
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El documento US-A-4 609 113 se refiere a la utilización de una matriz de proteı́na que contiene una
dispersión de medicamentos quimioterapéuticos y se refiere a la utilización de compuestos tales como cisplatina y la utilización de DMSO para permeabilización celular. La referencia sugiere que los liposomas
son el medio útil para controlar la liberación de un compuesto medicamentoso y se pueden conformar a
partir de lı́pidos.
Objeto de la invención
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Se da a conocer un nuevo método para preparar suspensiones de compuestos de lı́pidos que contienen compuestos que muestran reducida solubilidad en agua, alcoholes, y disolventes de hidrocarburos
halogenados. El método proporciona un elevado y eficaz encapsulado. Además, el método es adecuado
para su práctica a escala de fabricación industrial, y se puede practicar en un proceso continuo. Otras
ventajas significativas del método incluyen: formación de elevadas concentraciones de liposomas, preparaciones de diámetros definidos, simplicidad, velocidad de formación de partı́culas, facilidad de pasar
a grandes volúmenes, y posibilidad de encapsular compuestos que tienen una reducida solubilidad en
agua/disolvente orgánico pero elevada solubilidad en disolventes apróticos.
El procedimiento comprende de acuerdo con una primera realización:
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disolución de un compuesto soluble en un disolvente aprótico y encapsulado de una cantidad de un
lı́pido capaz de formación de partı́culas de liposomas o lipı́dicas en un disolvente aprótico, para proporcionar una solución de compuesto/lı́pido; y
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extrusionar dicha solución de compuesto-lı́pido a través de una abertura en una fase acuosa para
formar una suspensión de lı́pido-compuesto con un tamaño de partı́culas definido y de acuerdo con una
segunda realización
disolver una cantidad de encapsulado de un lı́pido capaz de formación de partı́culas de liposomas o
lipı́dicas en un disolvente aprótico para proporcionar una solución de lı́pidos; y
extrusionar dicha solución de lı́pidos a través de una abertura formando una solución acuosa de un
compuesto soluble en una fase acuosa para constituir una suspensión de lı́pido-compuesto con un tamaño
de partı́culas definido.
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Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el efecto de la tasa o proporción de agitación sobre el diámetro de los liposomas,
tal como se describe en el Ejemplo 1.
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La figura 2 muestra el efecto de la tasa o proporción de inyección en el diámetro de los liposomas.
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La figura 3 muestra el efecto del volumen de inyección en el diámetro de los liposomas.
La figura 4 muestra el efecto de un volumen de solución acuosa en el diámetro de los liposomas.
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La figura 5 muestra el efecto del incremento del volumen del disolvente aprótico (con una concentración constante de lı́pidos y volumen de solución acuosa) sobre el diámetro de los liposomas.
La figura 6 muestra el efecto de la temperatura de una solución acuosa sobre el diámetro de los liposomas.
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La figura 7 muestra el efecto de la concentración iónica en fase acuosa sobre el diámetro de los liposomas.
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La figura 8 muestra el efecto de la composición de soluto en solución acuosa sobre el diámetro de los
liposomas.
La figura 9 muestra el efecto de las concentraciones de urea en la solución acuosa sobre el diámetro
de los liposomas.
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La figura 10 muestra el efecto del pH de una solución acuosa sobre el diámetro de los liposomas.
La figura 11 muestra el efecto de la proporción de EtOH con respecto a DMSO sobre el diámetro de
los liposomas.
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La figura 12 muestra los efectos de la concentración de EtOH después de la inyección sobre el diámetro
de los liposomas.
La figura 13 muestra el efecto de diferentes mezclas alcanol/DMSO sobre el diámetro de los liposomas.
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La figura 14 muestra el efecto de diferentes disolventes apróticos con EtOH sobre el diámetro de los
liposomas.
La figura 15 muestra el efecto de concentración de lı́pido sobre el diámetro de los liposomas para
EtOH y tres mezclas DMSO/alcanol.
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Formas de llevar a cabo la invención
A. Definiciones
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El término “compuesto escasamente soluble” utilizado en esta descripción se refiere a compuestos
que se muestran muy ligeramente solubles o substancialmente insolubles (menos de 1 mg/mL aproximadamente) a temperatura fisiológica y pH en disolventes estándar. El término “disolventes estándar”
comprende agua y soluciones acuosas, alcoholes inferiores (por ejemplo, metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanoles, t-butanol), e hidrocarburos halogenados (por ejemplo, diclorometano, cloroformo,
1,1,1-tricloroetano). Entre los compuestos poco solubles adecuados se incluyen la cisplatina, doxorrubicina, epinefrina, mebendazol, niridazol, antibióticos de polieno tales como amfotericina B, nistatina, y
primaricina.
El término “lı́pido adecuado” utilizado en esta descripción se refiere a un compuesto antifático capaz
de formación de liposomas, y que es substancialmente no tóxico cuando se administra en las concentraciones necesarias como liposomas. Los lı́pidos adecuados tienen generalmente un extremo polar o hidrofı́lico,
y un extremo no polar o hidrofóbico. Entre los lı́pidos adecuados se incluyen sin limitación egg fosfatidilcolina (EPC), egg fosfatidil-glicerol (EPG), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), colesterol (Chol), sulfato
de colesterol y sus sales (CS), hemisuccinato de colesterol y sus sales (Chems), fosfato de colesterol y
sus sales (CP), ftalato de colesterol, colesterilfosforilcolina, 3,6,9-trioxaoctan-1-ol-colesteril-3e-ol, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), fosfatidilcolina de soja hidrogenada
(HSPC), y otros derivados de hidroxi-colesterol o de aminocolesterol (ver e.g., K.R. Patel y otros, Biochim
Biophys Acta (1985) 814:256-64).
El término “cantidad encapsulada” se refiere a la cantidad de lı́pido necesaria para encapsular un
compuesto poco soluble y formar liposomas o partı́culas lipı́dicas de dimensiones apropiadas. Preferentemente, las dimensiones promedio de liposomas o de partı́culas lipı́dicas es menor de 1000 nm en diámetro,
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y más preferentemente y de modo aproximado 20-600 nm. La cantidad de encapsulado dependerá del
compuesto especı́fico y de las condiciones del proceso seleccionado, pero en general está comprendido
entre aproximadamente 2:1 hasta aproximadamente 1:100 compuesto:lı́pido, preferentemente y de modo
aproximado de 1:1 a 1:20.
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El término “suspensión de compuesto de lı́pidos con tamaño de partı́culas definido” se refiere de manera genérica a complejos de la invención formados a partir de un lı́pido adecuado y un compuesto a
encapsular o para formar complejo. Las suspensiones lı́pido-compuesto de tamaño de partı́culas definido
incluyen liposomas y partı́culas lipı́dicas que tienen una distribución de tamaños de partı́culas del orden
de <1000 nm en diámetro, preferentemente 20-600 nm.
El término “partı́cula lipı́dica” utilizada en esta descripción se refiere a partı́culas de estructura no
definida que consisten en un lı́pido adecuado y un compuesto encapsulado o en forma de complejo. Los
antibióticos polieno con elevadas proporciones de antibiótico:lı́pido forman de manera tı́pica partı́culas
lipı́dicas en vez de liposomas, debido a la estructura de polieno y a su interacción con el lı́pido. Las
partı́culas lipı́dicas pueden tener una estructura, laminar pero no se requiere que muestren ninguna estructura definida. La estructura de estas partı́culas es actualmente desconocida.
El término “disolvente aprótico” utilizado en esta descripción se refiere a disolventes que no son
cedentes de hidrógeno, y que no incluyen disolventes hidrocarburos o hidrocarburos halogenados. Los
disolventes apróticos adecuados incluyen dimetilsulfóxido (DMSO), dioxano, dimetilformamida (DMF),
acetonitrilo, 1,2-dimetoxietano (DME), N,N-dimetilacetamida (DMA), sulfolano, gamma butirolactona,
1-metil-2-pirrolidinona (MP), y metilpirrolina, preferentemente DMSO.
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El término “alcanol inferior” se refiere a compuestos de fórmula R-OH, en el que R es un radical
hidrocarburo completamente saturado que tiene de uno a seis átomos de carbono. Entre los alcanoles
inferiores adecuados se incluyen metanol, etanol, n-propanol, isopropanol y n-butanol. En la actualidad
son preferibles etanol y metanol, particularmente el etanol.
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B. Método general
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Las composiciones de la invención son preparadas disolviendo un compuesto de solubilidad reducida
en un disolvente aprótico, junto con una cantidad de encapsulado de un lı́pido adecuado. La solución de
disolvente aprótico puede contener adicionalmente un alcanol inferior en caso necesario para solubilizar
el lı́pido. La solución resultante es extraı́da a continuación en una fase acuosa, con agitación, formando
un liposoma o la suspensión de partı́culas lipı́dicas. La suspensión puede ser dializada o concentrada de
otro modo, en caso deseado.
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El disolvente aprótico se selecciona entre dimetilsulfóxido (DMSO), dioxano, dimetilformamida
(DMF), acetonitrilo, 1,2-dimetoxietano (DME), N,N-dimetilacetamida (DMA), sulfolano, gamma butirolactona, 1-metil-2-pirrolidinona (MP), y metilpirrolina. El DMSO es actualmente preferente.
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La concentración de lı́pido en la solución de disolvente aprótico variará dependiendo del lı́pido o mezcla de lı́pidos especı́ficos seleccionados. No obstante, en la práctica de la presente invención se pueden
utilizar concentraciones de lı́pidos comprendidas aproximadamente entre 2 mM hasta 400 mM, preferentemente y de modo aproximado 40-120 mM. La solución de lı́pido contiene preferentemente un alcanol
inferior, preferentemente etanol o metanol, en una proporción aproximada de 1:2 a 8:1 de disolvente
aprótico:alcanol. Las proporciones de disolvente actualmente preferentes son 1:1 a 7:3 DMSO:EtOH.
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El compuesto poco soluble es seleccionado por su solubilidad en el disolvente aprótico o en la mezcla
de disolvente aprótico/alcanol inferior utilizada. La proporción de compuesto a lı́pido utilizada puede
estar comprendida entre aproximadamente 2:1 hasta 1:100 de compuesto:lı́pido, preferentemente y de
modo aproximado 1:1 hasta 1:20, dependiendo del compuesto empleado. Con compuestos tipo polieno
tales como anfotericina B, son actualmente preferibles proporciones 1:1. Los compuestos solubles en agua
son disueltos y suspendidos en la fase acuosa con una concentración apropiada para la proporción deseada
de compuesto:lı́pido.
La solución compuesto/lı́pido es sometida a continuación a extrusión o es inyectada en una fase acuosa
adecuada. Los medios de extrusión pueden consistir en una jeringuilla, placa perforada o tubo u otros
dispositivos apropiados que proporcionan aberturas aproximadas de 0,05 mm hasta unos 5 mm, preferentemente unos 0,8 mm. También se puede utilizar un disco sinterizado con unas dimensiones de
retención nominal 0,1-50 mm. El método de la presente invención no es extensible a la tasa o proporción
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de extrusión; se sugiere una proporción aproximada de 0,5-10 ml/abertura a efectos de conveniencia. El
método de la presente invención tampoco es particularmente sensible a la velocidad de agitación. No
obstante, la solución acuosa es agitada preferentemente a una velocidad mı́nima de 150 rpm. Para los
compuestos solubles en lı́pidos, la fase acuosa puede contener pequeñas cantidades de compuestos tampón
y conservantes, pero la concentración iónica no debe superar la obtenida mediante NaCl 1 M aproximadamente, no superando preferentemente la concentración iónica de una solución aproximada de 0,1 M
NaCl, más preferentemente no superando la concentración iónica de una solución aproximada de 10 mM
NaCl. La temperatura de la fase acuosa se encontrará en general entre la temperatura de transición de
los lı́pidos utilizados, y el punto de ebullición del disolvente aprótico/mezcla de alcanol. Preferentemente,
la temperatura se encontrará en una gama aproximada de 25-80◦C, y más preferentemente de 30-60◦C.
La temperatura de la solución de lı́pidos puede quedar comprendida entre el punto de congelación de la
mezcla disolvente aprótica/alcanol y su punto de ebullición, pero en general se encuentra preferentemente
alrededor de la temperatura ambiente. El volumen de fase acuosa no es particularmente crı́tico con respecto al proceso de la presente invención, preferentemente se hace mı́nimo para facilitar la concentración
de los liposomas o de partı́culas lipı́dicas después de su formación. En general, la proporción de solución
de lı́pido con respecto a la fase acuosa puede quedar comprendida aproximadamente desde 1:25 a 1:1,
preferentemente y de modo aproximado de 1:10 a 1:15.
En caso deseado, la suspensión de liposomas o de partı́cula lipı́dica suspendida se puede concentrar
por técnicas normales incluyendo centrifugación, diálisis, diafiltración y diálisis en contracorriente.
Las suspensiones son utilizadas en un modo apropiado al compuesto encapsulado que es poco soluble.
Donde el compuesto es un compuesto farmacéuticamente activo, las suspensiones de la invención se administran preferentemente de forma parenteral, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, subcutánea,
o intravenosa. Otras modalidades de administración comprenden gotas intraoculares, pulverización intranasal o gotas y ungüentos tópicos.
C. Ejemplos
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Los ejemplos presentados a continuación están preparados como una nueva guı́a para el médico especialista de experiencia normal en esta técnica y en ningún caso se deben considerar como limitativos de
la invención.
Métodos y materiales
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Los ejemplos que se indican a continuación se obtuvieron de Sigma Inc., St. Louis, Mo., la fosfatidilcolina de huevo (EPC), fosfatidilglicerol de huevo (EPG), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) en
forma de soluciones cloroformo/etanol. Se obtuvieron colesterol (Chol), sulfato de colesterol (sal sódica)
(CS), y hemisuccinato de colesterol (sal tris) (Chems) de Sigma en forma de polvos secos. En algunos
experimentos los EPC, dimiristoilfosfatidilglicerol, dimiristoilfosfatidilcolina y la fosfatidilcolina (HSPC)
de soja hidrogenada se obtuvieron de Natterman, Colonia, en forma de polvos secos. La cromatografı́a
de capa delgada sobre gel de sı́lice 60 (Merck) en un sistema disolvente de cloroformo/metanol/agua
(65/25/4) con cargas elevadas de lı́pidos mostró solamente un componente para cada uno de los fosfolı́pidos anteriormente mencionados. El DL-α-tocoferol era de Serva. El platino cis era un producto
de Bristol Myers, Siracusa, N.Y. La doxorrubicina se obtuvo de Farmitalia en forma de polvo liofilizado
conteniendo lactosa. Los 1-metil-2-pirrolidinona (MP), 1,2-dimetoxietano (DME), gamma butirolactona,
lactosa, urea, anfotericina B (AmpB), nistatina y primaricina se obtuvieron de Sigma. Otros productos
quı́micos tenı́an calidad de reactivo. Los disolventes, excepto los que se han indicado anteriormente, se
obtuvieron de Merck y eran de calidad puriss o HPLC. El etanol absoluto (EtOH) era de Merck. Se
utilizó agua desionizada de doble destilación en la preparación de todas las soluciones.
Preparación de soluciones de material lı́pido
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Los lı́pidos fueron pesados en un recipiente de fondo redondo de peso conocido o depositados de la
solución de cloroformo/etanol por eliminación del disolvente sobre un evaporador rotativo. Los lı́pidos
fueron situados a elevado vacı́o y a temperatura ambiente durante 24 horas. Los recipientes fueron pesados nuevamente después de este perı́odo y se llevaron a un volumen estándar con etanol seco en un
recipiente volumétrico para obtener las concentraciones de material de lı́pido. Habitualmente se preparó
una solución transparente de fosfatidilcolina de huevo conteniendo 0,05 moles por cien de tocoferol bajo
atmósfera de nitrógeno a 300-400 mM por calentamiento de la solución de etanol a 60◦ C. Se disolvieron
DPPC y HSPC, por calentamiento, a una concentración de 300 mM. A esta concentración el HSPC formó
un gel cuando la temperatura fue reducida a 20◦C. Se utilizaron disolventes anhidros en la preparación de
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todas las soluciones de lı́pidos y se tomaron precauciones para minimizar la exposición de las soluciones
a la atmósfera. Cuando se utilizaron otros alcoholes tales como metanol (MeOH), propanol, isopropanol
y butanol terciario, se disolvió la fosfatidilcolina de huevo a 400 mM por calentamiento de 60◦C. Las
mezclas de la solución de material de lı́pido en alcohol con otros distintos disolventes tuvieron lugar en
base volumen/volumen por pipeteado en la solución alcohólica de lı́pido en un recipiente volumétrico y
añadiendo el segundo disolvente a la marca indicada. El colesterol fue preparado en etanol a 100 mM por
calentamiento a 60◦ C; una vez enfriado a temperatura ambiente, cristalizó a partir de la solución. Para
ciertos experimentos, el colesterol fue disuelto en 1-metil-2-pirrolidinona con una concentración de 364
mM. El sulfato de colesterol y Chems fueron disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) con una concentración
de 71 mM. Se prepararon mezclas de lı́pidos a partir de las soluciones en base volumen a volumen. Los
materiales de lı́pidos fueron almacenados bajo atmósfera de nitrógeno a -20◦C. La concentracción de
fosfolı́pido de las preparaciones finales de liposomas se determinaron midiendo la concentración de fósforo
después de digestión ácida tal como se describe en (G. Bartlett, J Biol Chem (1959) 234:466-468).
Sistema de inyección
Se utilizó para contener la fase acuosa un recipiente de reacción de cristal con camisa de agua con
un volumen de 15 mL. La temperatura del recipiente se mantuvo a 30◦ C, excepto si se especifica lo
contrario, haciendo circular agua desde un baño de agua a temperatura controlada. El recipiente fue
colocado sobre un agitador magnético y se colocó una barra de agitación magnética de 1 cm sobre el
fondo del compartimiento del receptor. La velocidad de rotación de la barra de agitación fue controlada
por el reostato sobre el agitador magnético y proporcionó una mezcla continua hasta unas 1000 rpm. Las
condiciones tı́picas para la inyección de disolvente fueron las siguientes: 3 ml de fase receptora acuosa
se colocaron en el recipiente y se hizo girar el agitador magnético a 750 rpm. La fase acuosa se dejó
equilibrar a la temperatura requerida. Se utilizó una jeringa Hamilton de 0,5 ml estanca a los gases con
un pistón de Teflón para inyecciones requiriendo menos de 0,5 ml. Se utilizó una jeringuilla de plástico
de 3 ml para inyecciones requiriendo entre 0,5 ml y 3,0 ml. La jeringuilla fue colocada en el centro del
recipiente, directamente sobre la barra de agitación magnética y la punta de la aguja de la jeringuilla
(de 0,64 mm, galga 25) fue colocada debajo de la fase acuosa y unos 2-4 mm por encima de la barra de
agitación. En un experimento tı́pico, se inyectaron 0,3 ml de solución de lı́pido en el disolvente a una
proporción de 3,6 ml/min (5 s). Esta disposición proporcionó una mezcla rápida y completa de solución
de lı́pido con la solución acuosa. La mezcla pudo ser observada colocando un tinte en la solución de
lı́pido e inyectándolo en la fase acuosa. La suspensión de lı́pido fue agitada durante 5 minutos, y después
retirada del recipiente y colocada en una bolsa de diálisis. La muestra fue dializada contra 100 volúmenes
de un tampón apropiado cambiado dos veces a lo largo de un perı́odo de 24 horas. Tal como se demostró,
el sistema es muy robusto y condiciones de inyección distintas producen vesı́culas con diámetros similares
en una amplia gama de velocidades de agitación, proporciones de inyección, temperaturas, volúmenes de
receptor y relaciones de medio acuoso:disolvente.
Determinación del diámetro de la vesı́cula
El diámetro de la vesı́cula fue medido por dispersión dinámica de luz utilizando láser de gas 100 mW
NEC helio-neón y un correlacionador Malvern K7027. Se hizo un mı́nimo de tres mediciones para cada
determinación. El diámetro y polidispersión se indicaron como media de las tres determinaciones.
45
Ejemplo 1
(Parámetros de formación de liposoma)
50
Los siguientes experimentos fueron llevados a cabo para determinar los efectos de los parámetros del
proceso sobre los productos finales de liposomas.
(A) Efecto de las condiciones de inyección
55
60
El sistema de inyección fue examinado en primer lugar utilizando un colorante disuelto en la mezcla
del disolvente. Se observó que la colocación de la punta de una jeringuilla dentro de la fase acuosa directamente sobre la barra de agitación magnética proporcionaba un mezclado rápido. Cuando se inyectaron
0,2 ml de una solución 70 mM EPC en DMSO:EtOH (7:3), en 2 ml de agua, se produjo una suspensión
ligeramente opalescente tan pronto como se mezcló el disolvente. En ausencia de agitación, el diámetro
de la vesı́cula fue de 152 nm. Al aumentar la velocidad de agitación a 250 rpm, el diámetro de la vesı́cula
disminuyó a 71 nm (figura 1). El diámetro de las vesı́culas resultantes permaneció constante al aumentar
adicionalmente la velocidad de agitación a 750 rpm (figura 1). Por lo tanto, en todos los experimentos
7
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siguientes se mantuvo la velocidad de agitación en 750 rpm.
5
10
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25
30
El diámetro de los liposomas resultantes era relativamente insensible a la velocidad de inyección de 0,4
ml/min a 6 ml/min (figura 2). En todos los experimentos subsiguientes la tasa de inyección se encontró
entre 2-6 ml/min.
Cuando el volumen de la fase acuosa fue constante pero la cantidad de lı́pido y del disolvente aumentaron, el diámetro de las vesı́culas resultantes difı́cilmente cambió (figura 3). Cuando el volumen de la fase
acuosa incrementó de 2 mL a 5 mL pero la proporción de disolvente a la fase acuosa y la concentración
final de lı́pido permanecieron constantes, el diámetro de las vesı́culas mostró una disminución ligera de
68 nm a 48 nm (figura 4). En todos los experimentos sucesivos, el volumen acuoso fue como mı́nimo de
3 ml y en la mayor parte de casos de 4 ml.
Si la cantidad de lı́pido inyectado y la fase acuosa permanecı́an constantes pero el volumen del disolvente inyectado aumentaba, el diámetro de las vesı́culas resultantes no cambiaba (figura 5). Ello a pesar
del hecho de que a la concentración más elevada de la comprobación, la mezcla final después de inyección,
contenı́a 50% de disolvente.
En estos experimentos la temperatura de la fase acuosa se mantuvo a 30◦C. No obstante, variando
la temperatura de la fase acuosa de 30 a 80◦ C tenı́a solamente un efecto moderado en el diámetro de
las vesı́culas resultantes (figura 6). En la totalidad de los experimentos de inyección siguientes, la temperatura de la fase acuosa fue regulada a 30◦C. Los lı́pidos en la mezcla de disolventes se utilizaron a
temperatura ambiente (20-24◦C).
Por lo tanto, los experimentos iniciales demostraron que el diámetro de las vesı́culas formadas durante el proceso de inyección de disolvente quedaba relativamente sin afectar por un gran número de
variables que podı́an influir previsiblemente en el sistema de inyección. Basándose en estos resultados,
las condiciones de inyección normales fueron las siguientes: el lı́pido fue inyectado a una proporción de
2-6 ml/min en un volumen acuoso de 3-4 ml a 30◦ C con agitación a 750 rpm de manera que la proporción
de disolvente final acuoso se encontraba entre 0,075 y 0,33. Esta solidez hace que el procedimiento sea
fácil de poner a punto con equipos de laboratorio habituales.
(B) Influencia de la fase acuosa
35
40
En una serie de procedimientos para la preparación de liposomas, las caracterı́sticas de la fase acuosa
durante la formación del liposoma tales como concentración iónica, pH y tipos de tampones pueden influir en las caracterı́sticas liposomales resultantes (Lichtenberg, supra). Se observó una relación lineal
(r2 =0,88) entre el diámetro de las vesı́culas y el logaritmo de la molaridad de NaCl (figura 7). Este efecto
aparente de la concentración iónica sobre el diámetro de las vesı́culas se observó en ambos casos en los
que se realizó una titulación completa de la sal de 0,001 a 1,0 mM. Se observó de manera consistente que
cuando se comparaban dos o más preparados, las vesı́culas formadas con la fase acuosa con una mayor
concentración iónica tenı́an diámetros más grandes, siendo iguales las demás condiciones.
45
Cuando se añadieron solutos no iónicos (glicerol, lactosa o urea) a la fase acuosa, no se observó efecto
alguno en el diámetro de las vesı́culas (figura 8) aunque la concentración de la urea aumentó de 0 a 8 M
(figura 9). Esto sugiere que el efecto de la sal es debido a un cambio de la concentración iónica y no a
un cambio de la osmolaridad de la suspensión acuosa.
50
Los cambios en el pH de la fase acuosa de pH 10 a pH 4, con una concentración iónica relativamente
constante, tenı́an poco efecto en el diámetro de las vesı́culas (figura 10). No obstante, las vesı́culas formadas a pH 2,0 eran apreciablemente más pequeñas que las vesı́culas formadas con valores de pH más
elevados.
(C) Influencia de la mezcla de disolventes
55
60
Experimentos preliminares indicaron que la naturaleza de los disolventes y la concentración de lı́pido
en la mezcla de disolvente influyen tanto en el aspecto de la suspensión del lı́pido como en los diámetros
de las vesı́culas medidos por dispersión de luz. El efecto de estos dos parámetros se examinó con una concentración máxima de lı́pido (40 mM) en la que el método de inyección de EtOH se indicó que producı́a
vesı́culas unilaminares (Kremer y otros, Biochemistry (1977) 16:3932-3935) y para concentraciones de
lı́pidos de dos a tres veces superiores. Alterando la proporción de DMSO:EtOH de 8:2 a EtOH absoluto
no tenı́a efecto significativo en los diámetros de vesı́culas resultantes (figura 11).
8
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5
En la técnica clásica de inyección de EtOH (Batzri, supra; Kremer, supra) el porcentaje final de EtOH
en la fase acuosa para una inyección constante de lı́pido influı́a en el diámetro de las vesı́culas resultantes.
Este efecto puede ser apreciado en la figura 12 en la que el diámetro de las vesı́culas cambia al aumentar
el porcentaje de EtOH en la suspensión resultante. A efectos de comparación, las vesı́culas formadas
a partir de una mezcla DMSO:EtOH con la misma concentración de lı́pidos en un porcentaje final de
disolvente de 7,5 tenı́an un diámetro de 93 nm con respecto a 483 nm para el EtOH puro. Tal como se ha
indicado anteriormente, el incremento del porcentaje final de disolvente hasta el 50% cuando se utilizó la
mezcla DMSO:EtOH como un disolvente difı́cilmente alteraba el diámetro de la vesı́cula (figura 5).
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15
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35
40
Dado que una proporción de DMSO:EtOH de 2:1 podı́a solubilizar los lı́pidos muy bien, se examinó el
efecto de cambio del alcohol para una concentración elevada de lı́pidos sobre los diámetros de las vesı́culas
(figura 13). Para esta concentración de lı́pidos, EtOH y MeOH mezclados con DMSO proporcionaron las
vesı́culas de menor diámetro 114 nm y 154 nm, respectivamente. Las mezclas de propanol e isopropanol DMSO proporcionaron vesı́culas con diámetros significativamente más grandes (295 nm y 254 nm,
respectivamente). Finalmente, las mezclas terciarias de butanol:DMSO proporcionaron las vesı́culas de
mayor diámetro, 832 nm. Las últimas tres mezclas de disolventes produjeron suspensiones de vesı́culas
que sedimentaron después de diálisis. El examen de estas tres al microscopio reveló una mezcla de pequeñas estructuras y estructuras más grandes que tenı́an el aspecto clásico MLV (A. Bangham y otros, J
Mol Biol (1965) 13:238-252).
El codisolvente aprótico utilizado con etanol también influye en el diámetro de las vesı́culas resultantes
(figura 14). El DMSO como codisolvente producı́a unas vesı́culas de menor diámetro (113 nm). Dioxano,
dimetilformamida, acetonitrilo y 1-metil-2-pirrolidinona producı́an vesı́culas en una gama de diámetros
de 160-200 nm. Las soluciones de tetrahidrofurano/EtOH y EtOH puro lı́pidos produjeron vesı́culas
con diámetros mayores de 800 nm (figura 14). Después de diálisis, estas dos últimas suspensiones de
liposomas estaban compuestas de estructuras grandes de tipo MLV con agregación extensa observadas al
microscopio.
(D) Influencia de la concentración de lı́pido
Un parámetro importante en el método original de inyección de EtOH fue la concentración de lı́pido
en el EtOH (Kremer, supra). El efecto de la concentración de lı́pido fue examinado en EtOH y tres
mezclas DMSO:alcohol (2:1): EtOH, MeOH y propanol (figura 15). Tal como se ha observado anteriormente, cuando la concentración de lı́pido supera 40 mM en el EtOH, el diámetro resultante de las
vesı́culas aumenta considerablemente (Kremer, supra). Los diámetros de las vesı́culas fueron de 83 nm
en 40 mM y 690 nm en 121 mM. Si bien no se ha mencionado previamente, la polidispersión de la preparación aumenta también de 0,33 en 40 mM a 0,69 en 121 mM. La mezcla DMSO/propanol dio lugar
asimismo a un incremento significativo del diámetro de las vesı́culas y polidispersión (0,24 a 0,59) de
la preparación cuando la concentración del lı́pido aumentó a 121 mM. Las mezclas de DMSO/EtOH y
DMSO/MeOH formaron vesı́culas con diámetros aproximados de 50 nm para la concentración más baja
de lı́pido utilizada, hasta aproximadamente 150 nm para la concentración de lı́pido más elevada (figura
15). La polidispersión de las preparaciones de vesı́culas sobre esta misma gama de concentración de
lı́pidos varió de 0,250 a 0,370 para las mezclas de disolventes que contenı́an EtOH y MeOH.
45
50
El incremento en diámetros de vesı́culas medido por dispersión de luz para las concentraciones de
lı́pidos más elevadas (figura 15) queda también reflejado en el aspecto de las preparaciones. Una suspensión muy turbia es visible con las mezclas de EtOH y propanol/DMSO en lı́pidos 121 mM y se
forma una suspensión mucho menos opalescente con mezclas EtOH/DMSO y MeOH/DMSO siguiendo la
inyección.
Ejemplo 2
(Encapsulado de Doxorrubicina)
55
60
La doxorrubicina es un importante compuesto para la quimioterapia del cáncer. Una serie de investigadores han demostrado que cuando este compuesto es administrado en forma encapsulada de liposomas,
su toxicidad en animales es reducida. Todos los preparados de liposomas de los que se ha informado
anteriormente para el encapsulado de la doxorrubicina han utilizado una fase de hidratación de lı́pido
en seco a pesar de la baja solubilidad acuosa del medicamento para pH 7,4. La doxorrubicina es muy
soluble en DMSO, de manera que se presta al proceso de inyección de DMSO de la invención.
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15
La doxorrubicina fue disuelta en DMSO y añadida a una solución de etanol de EPG:EPC:Chol (7:3:6)
para conseguir una concentración final de doxorrubicina de 6,2 mM y una concentración total final de
lı́pido de 96,4 mM en DMSO:EtOH (7:3) mezcla disolvente. Las vesı́culas de lı́pido fueron formadas por
inyección de 1 ml de la mezcla de lı́pido-doxorrubicina en 2 ml de una fase acuosa consistiendo en 140 mM
NaCl-10 mM Tris-HCl, pH 4,0, y 30◦C. La suspensión de lı́pidos fue dializada durante 2 horas a temperatura ambiente contra 100 volúmenes de 140 mM NaCl-10 mM Tris, pH 4,0 (NaCl-Tris). La doxorrubicina
encapsulada en liposomas fue separada del material no encapsulado por cromatografı́a de columna sobre
R
G-50 eluida con NaCl-Tris. La cantidad de doxorrubicina recuuna columna de 1 x 40 cm Sephadex
perada en el tipo de la vesı́cula fue corregida para cambios de volumen durante el procedimiento y se
comparó con la cantidad inicial inyectada para obtener rendimiento de encapsulado. La concentración
de doxorrubicina fue medida de forma espectrofotométrica en 480 nm siguiendo la solubilización de los
R
X-100 y calentamiento.
preparados de liposoma/doxorrubicina con Triton
El diámetro resultante de las vesı́culas fue de 227 nm, y el 41,2% de la doxorrubicina fue encapsulada
en las vesı́culas.
Ejemplo 3
(Preparación de complejos de lı́pido polieno)
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25
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35
40
45
50
55
60
(A) La preparación de liposomas de anfotericina B o partı́culas lipı́dicas (R. New y otros, Antimicrob
Chemotherap (1987) 8:371-381; G. Lopez-Berestein y otros, “Biophysics to Therapeutics” (M. Ostro, Ed.
1987) 253-76; F. Szoka y otros, Antimicrob Ag Chemotherap (1987) 31:421-429) ha presentado siempre
problemas técnicos a causa de la baja solubilidad de los antibióticos de polieno en la mayor parte de
disolventes (N. Rajagopalan y otros, J Parenteral Sci Tech (1988) 42:97-102). Debido a la limitada solubilidad de los antibióticos de polieno en la mayor parte de disolventes, los preparados iniciales de las
formulaciones requerı́an grandes cantidades de disolventes tales como metanol (Lopez-Berestein, 1987).
Para disminuir la cantidad de disolvente utilizado en las preparaciones, se habı́a añadido anfotericina B
en DMSO a pelı́culas secas de lı́pido para formar liposomas de anfotericina B (Szoka, supra). Esto no
suministró preparados con diámetros pequeños y requirió fases adicionales significativas de preparación,
tales como sonicado, para conseguir una formulación adecuada para su utilización en animales.
El desarrollo del método de la invención ha hecho posible la simple preparación de estas formulaciones.
No solamente son los antibióticos de polieno solubles en DMSO, sino que también lo son Chems y
CholSO4 . El colesterol es excesivamente soluble en 1-metil-2-pirrolidinona. Por lo tanto, se utilizó un
método de inyección de disolvente para preparar complejos de polieno/esterol. Se prepararon fácilmente
preparaciones que contenı́an hasta anfotericina B 5 mM con una serie de formulaciones (Tablas 1-4). Con
los antibióticos de polieno, más de 90% de polienos fueron recuperados en las preparaciones después de
extensa diálisis para eliminar los medicamentos no asociados. Estas composiciones tenı́an proporciones de
1:1 o 1:2 de polieno:lı́pido, de manera que el porcentaje en peso del componente activo en la formulación
es muy elevado. Se pueden formar complejos con diámetros de partı́culas menores de 1000 nm a partir de
colesterol, Chems, y CholSO4 (Tabla 1). También se formaron tres complejos adecuados de componentes
que contenı́an DPPC y Chems o Chol (Tabla 2).
TABLA 1
Preparación de complejos de anfotericina B/lı́pido único por inyección de disolvente
Lı́pido y
Proporcióna
Disolvente
Fase
acuosa
Chol 1:1
Chol 1:1
Chems 1:1
Chems 1:1
Chems 1:1d
CholSO4 1:1
CholSO4 1:1
DPPC 1:1
DPPC 1:1
DPPC 1:2
DMSO:EtOH 7:3
DMSO:MP 1:1
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO:EtOH 7:3
DMSO:EtOH 7:3
DMSO:EtOH 7:3
10 nM Hepes
NaCl-Hepes
NaCl-Hepes
10 mM Hepes
10 mM Hepes
NaCl-Hepes
10 mM Hepes
NaCl-Hepes
10 mM Hepes
NaCl-Hepes
b
10
Diámetroc
(nm)
451
>1500
>1500
90
160
>1500
143
>1500
>1500
>1500
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a. Proporción anfotericina B:lı́pido.
b. El volumen del disolvente era de 0,25 ml inyectado en 3,0 ml del tampón indicado a 30◦C. El pH del
tampón era de 7,4.
5
10
c. El diámetro de las partı́culas fue medido después de diálisis en el tampón de formación. Los valores
superiores a 1500 nm indican que se encontraban presentes diámetros de partı́culas grandes que no podı́an
ser medidos con exactitud por la dispersión dinámica de la luz. En todos los casos en los que los diámetros
eran superiores a 1500 nm, se observó una extensa agregación y sedimentación de las preparaciones en la
bolsa de diálisis.
d. El volumen de disolvente fue de 1,0 ml inyectado en 3,0 ml del tampón indicado.
15
TABLA 2
Preparación de complejos de anfotericina B/lı́pido múltiple por inyección de disolvente
Proporción
Componentesa
Fase
acuosa
Disolventeb
Diámetroc
(nm)
20
25
30
Chol:DPPC 1:1:1
Chol:DPPC 1:1:1
Chems:EPC 1:1:1
Chems:DPPC 1:1:1d
Chems:DPPC 1:1:1d
Chems:HSPC 1:1:1
DMSO:EtOH
DMSO:EtOH
DMSO:EtOH
DMSO:EtOH
DMSO:EtOH
DMSO:EtOH
7:3
7:3
7:3
7:3
7:3
7:3
10 mM Hepes
NaCl-Hepes
NaCl-Hepes
10 mM Hepes
NaCl-Hepes
NaCl-Hepes
254
>1500
>1500
92
>1500
>1500
a. Proporción anfotericina B:lı́pido.
b. El volumen del disolvente era de 0,25 ml inyectado en 3,0 ml del tampón indicado a 60◦C. El pH del
tampón era de 7,4.
35
40
45
50
55
60
c. El diámetro de las partı́culas fue medido después de diálisis en el tampón de formación. Los valores
superiores a 1500 nm indican que se encontraban presentes diámetros de partı́culas grandes que no podı́an
ser medidos con exactitud por la dispersión dinámica de la luz. En todos los casos en los que los diámetros
eran superiores a 1500 nm, se observó una extensa agregación y sedimentación de las preparaciones en la
bolsa de diálisis.
d. La temperatura de la fase acuosa fue de 30◦ C.
Se prepararon soluciones de los antibióticos de polieno anfotericina B (30 mM) y nistatina (50 mM)
en DMSO. La suspensión acuosa de primaricina obtenida de Sigma fue liofilizada y resuspendida en varios disolventes. La primaricina fue muy soluble en DMSO, pero después de permanecer a temperatura
ambiente durante 2 horas, se formó un precipitado que no se pudo resuspender por calentamiento de
la solución. Se pudo preparar una solución estable de color amarillo de primaricina en una mezcla de
disolventes 1:1 de DMSO:MP. Los antibióticos de polieno fueron combinados con los diferentes lı́pidos en
una mezcla de disolventes de DMSO, DMSO:MP o DMSO:EtOH (7:3) y a continuación inyectados en la
fase acuosa. Las preparaciones formadas fueron transferidas a una bolsa de diálisis y se dializaron contra
100 volúmenes de agua destilada, cambiando dos veces si no se indica lo contrario. La proporción de los
componentes, las mezclas exactas de disolventes y otras caracterı́sticas se indican en los resultados. Las
muestras de los preparados fueron disueltas en metanol y la concentración de polieno fue determinada
de forma espectrofotométrica (Szoka y otros, supra): anfotericina B en 406 nm, nistatina en 306 nm y
primaricina en 318 nm.
Los preparados que contenı́an antibióticos de polieno eran sensibles a la concentración iónica, pH y
proporción de disolvente a fase acuosa en el preparado (Tablas 1, 3, 4). Por ejemplo, para una concentración iónica baja (tampón 10 mM) se obtuvieron diámetros de partı́culas menores de 700 nm. Cuando
se incluyó 0,1 M NaCl en el tampón acuoso, manteniendo el resto de condiciones, las dimensiones de las
partı́culas resultaron mayores de 1500 nm, y se observó una extensa agregación. Ello es una función del
polieno, puesto que para una serie de lı́pidos, se obtuvieron diámetros de partı́culas menores de 200 nm
por la inyección de lı́pido solo en el tampón NaCl-Hepes.
11
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5
El pH de la fase receptora fue también importante en la determinación de las dimensiones de las
partı́culas. En el caso de los complejos Chems:polieno, las dimensiones de partı́culas más reducidas
se obtuvieron en pH>7, mientras que para complejos de CholSo4 :polieno se podı́an obtener diámetros
pequeños en pH 4,0 y en pH > 5 (Tablas 3,4).
TABLA 3
Preparación de complejos de anfotericina B/lı́pidos por inyección de disolvente
10
15
20
25
Diámetroc
(nm)
Proporción
Componentesa
pH
Fase
acuosa
A:Chems 1:1.1
A:Chems 1:1.1
A:Chems 1:1.1
A:CholSO4 1:1.1
A:CholSO4 1:1.1
A:CholSO4 1:1.1
A:CholSO4 1:1.1
A:CholSO4 1:1.1
A:CholSO4 1:1.1
A:CholSO4 1:1.1
4,0
7,0
8,0
2,0
4,0
5,0
7,0
8,0
10,0
7,0
10 mM acetato
10 mM Hepes
10 mM Hepes
10 mM glicina
10 mM acetato
10 mM citrato
10 mM Hepes
10 mM Hepes
10 mM glicina
10 mM Hepes:8 M urea
b
>1500
111
121
>1500
86,4
>1500
456
539
615
64,8
a. Proporción anfotericina B:lı́pido.
30
35
40
b. El volumen de disolvente fue de 0,3 ml del tampón a 30◦ C.
c. El diámetro de las partı́culas fue medido después de diálisis en agua destilada. Los valores superiores a 1500 nm indican que se encontraban presentes diámetros de partı́culas grandes que no podı́an ser
medidos con exactitud por la dispersión dinámica de la luz. En todos los casos en los que los diámetros
eran superiores a 1500 nm, se observó una extensa agregación y sedimentación de las preparaciones en la
bolsa de diálisis.
Con estos complejos, el cambio de la proporción de disolvente a fase acuosa, que también incrementaba
la concentración de los componentes, podı́a provocar un incremento en el diámetro de las partı́culas, tal
como se aprecia en el caso de Ny:CholSO4 (Tabla 4).
TABLA 4
Preparación de complejos de polieno/lı́pido por inyección de disolvente
45
50
55
60
Proporción
Componentesa
Ny:CholSO4 1.1.1
Ny:CholSO4 1:1.1
Ny:CholSO4 1:1.1d
Ny:Chol 1:1
Ny:Chol 1:1
Ny:Chems 1:1
Ny:Chems 1:1
Ny:Chems 1:1
Primaricina
Chol 1:1
Primaricina
Chems 1:1
Diámetroc
(nm)
pH
Fase
acuosa
4,0
8,0
8,0
4,0
8,0
4,0
7,0
8,0
10 mM acetato
10 mM Hepes
10 mM Hepes
10 mM acetato
10 mM Hepes
10 mM acetato
10 mM Hepes
10 mM Hepes
552
364
>1500
>1500
>1500
>1500
45
47
7,4
10 mM Hepes
1052
7,4
10 mM Hepes
>1500
b
12
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a. Proporción polieno:lı́pido. Ny = nistatina.
b. El volumen de disolvente fue de 0,3 ml inyectado en 3,0 ml del tampón indicado a 30◦ C.
5
c. El diámetro de las partı́culas fue medido después de diálisis en agua destilada. Los valores superiores a 1500 nm indican que se encontraban presentes diámetros de partı́culas grandes que no podı́an ser
medidos con exactitud por la dispersión dinámica de la luz. En todos los casos en los que los diámetros
eran superiores a 1500 nm, se observó una extensa agregación y sedimentación de las preparaciones en la
bolsa de diálisis.
10
d. Volumen de disolvente 1,0 ml inyectado en 2,0 ml de tampón.
15
La ventaja del método de inyección para preparar los complejos polieno:lı́pido para estudios quimioterapéuticos (T. Patterson y otros, J Infect Dis (1989) en impresión) es que una vez se han establecido
las condiciones de inyección, el procedimiento se aumenta fácilmente de escala. Cuando el preparado
anfotericina B:CholSO4 fue aumentado de 3 mL a 50 mL, se obtuvo el mismo tamaño de partı́culas en el
preparado de mayor escala. Una segunda ventaja es que los tamaños de las partı́culas menores de 200 nm
se pueden obtener con este método. Esto permite la esterilización mediante filtro de las formulaciones
resultantes.
20
25
30
35
(B) Se pueden utilizar otros derivados de colesterol para preparar partı́culas de anfotericina B-lı́pidos.
Por ejemplo, fosfato de colesterol, ftalato de colesterol, fosforilcolina de colesterol, 3,6,9-trioxaoctan-1ol-colesteril-3e-ol, y otros derivados hidroxi- o amino-colesterol, se pueden disolver en DMSO, EtOH,
metilpirrolina, o MP combinado con anfotericina B en DMSO con inyección en un tampón para formar
partı́culas de anfotericina B lı́pidos con diámetros menores de unas 700 nm.
Se prepararon soluciones de lı́pidos utilizando dimiristilfosfatidilcolina:dimiristilfosfatidilglicerol
(DMPC:DMPG, 7:3), colesterol fosfocolina, colesterol oleato, colesterol fosfato, colesteril ftalato, y colesterol sulfato en DMSO, DMSO/EtOH, y DMSO/metilpirrolina, y se combinaron con anfotericina B en
DMSO para formar soluciones 12,5 mM de cada componente (lı́pido y antibiótico, en proporción 1:1).
Las mezclas DMSO/metilpirrolina formaron dos fases, y se emulsificaron inmediatamente antes de la
inyección.
Una parte alı́cuota (0,3 ml) de cada mezcla fue inyectada en 2,7 mL de 10 mM Tris/lactato tampón (pH
7,0, 0,1 mM EDTA) a 30◦C para formar partı́culas lipı́dicas de anfotericina B. Después de la inyección, la
mezcla fue agitada durante 5 minutos, transferida a bolsas de diálisis y dializada durante 48 horas contra
100 volúmenes de 1 mM Tris/lactato (pH 7,0), cambiando dos veces. La anfotericina B fue retenida
cuantitativamente en las partı́culas bajo estas condiciones. Los diámetros de las partı́culas lipı́dicas
fueron determinados por dispersión de luz láser, y las medias se indican en la siguiente tabla 5.
40
TABLA 5
Partı́culas lipı́dicas de anfotericina B
45
50
55
60
Diámetro de
las partı́culas (nm)
Composición de lı́pidoa
Disolvente
DMPC:DMPG (7:3)
DMSO/EtOH
149
colesterol
fosfocolina
DMSO/EtOH
659
colesterol
oleato
DMSO/metilpirrolina
431
colesterol
fosfato
DMSO
182
colesterol
ftalato
DMSO
126
colesterol
sulfato
DMSO
76
13
ES 2 087 151 T3
a Cada una de las composiciones contenı́a anfotericina B en una proporción de 1:1 antibiótico:lı́pido
Ejemplo 4
5
10
15
20
(Encapsulado de cis-platino)
El cis-platino (cisplatina) es otro compuesto ampliamente utilizado en la quimioterapia del cáncer. Es
muy soluble en DMSO, y la formación de liposomas conteniendo cis-platino por la técnica de inyección de
DMSO tiene lugar de manera fácil. Se formaron liposomas con diámetros comprendidos entre 100 y 220
nm con una serie de composiciones de lı́pidos (Tabla 6). Con las condiciones utilizadas, la concentración
final del cis-platino en la suspensión de liposomas fue aproximadamente de 100 µg/ml.
Se disolvió cis-platino en DMSO a una concentración de 45 mg/ml y se añadió a varias composiciones
de lı́pidos para conseguir una concentración final de 7,5 mg/ml (25 mM) en una concentración de lı́pido
de entre 90 y 135 mM en una mezcla de DMSO:EtOH de 7:3. Las composiciones de lı́pidos comprobadas
comprenden EPC:Chems (2:1) 135 mM; EPC:EPG (7:3) 90 mM y EPC:EPG:Chol (7:3:6) 96,4 mM. A
temperatura ambiente la mezcla lı́pido-medicamento se volvió ligeramente turbia; la mezcla pasó a ser
una solución clara después de un breve calentamiento a 60◦ C en un baño de agua. Se inyectó un ml de
la solución lı́pido-medicamento en 2 ml de 150 mM NaCl-10mM Hepes, pH 7,4 (NaCl-Hepes) a 30◦ C.
Los liposomas fueron dializados con respecto a 100 volúmenes de NaCl-Hepes a temperatura ambiente
R
G-50 eluida
durante 2 horas, y a continuación cromatografiados en una columna de 1 x 40 cm Sephadex
con el NaCl-Hepes. La concentración de cisplatino fue determinada midiendo los niveles de platino en un
espectrómetro de absorción atómica.
TABLA 6
Preparación de liposomas de cis-platino por inyección de disolvente
25
Componentes
30
35
40
EPC:EPG 7:3
EPC:EPG:Chol 7:3:6
EPC:Chems 2:1
Rendimiento del encapsulado(%)a
Diámetro(nm)b
7,4
6,9
14,5
169
109
216
a. El rendimiento del encapsulado fue calculado como porcentaje del cis-platino inicial que permaneció
con la preparación de liposoma después de la separación de columna. El lı́pido total final en la fase acuosa
después de la separación de columna fue aproximadamente de 20 mM.
b. El diámetro de las partı́culas fue medido después de diálisis en 0,1 M NaCl-10 mM Hepes, pH 7,4.
Ejemplo 5
(Administración de anfotericina B)
45
50
55
60
Se prepararon liposomas con anfotericina B y sulfato de colesterol tal como se describe en el Ejemplo
3. Se utilizó un modelo de conejo neutropénico inmunosupresivo de aspergilosis invasiva para comparar
la formulación de partı́culas lipı́dicas con la anfotericina B libre.
Se sometieron a inmunosupresión veintiocho conejos por administración de ciclofosfamida y triamcinolona. Los conejos fueron atacados a continuación con 106 A. fumigatus. Después de 24 horas, los conejos
fueron divididos en tres grupos de tratamiento: ocho conejos recibieron 4,5 mg/Kg/dı́a de anfotericina
B libre; cuatro conejos recibieron 7,5 mg/Kg/dı́a de anfotericina B libre; cinco conejos recibieron 6-9
mg/Kg/dı́a de partı́culas lipı́dicas de anfotericina B (equivalente a 3-4,5 mg/Kg/dı́a de anfotericina B);
tres conejos recibieron 15 mg/Kg/dı́a de partı́culas de anfotericina B lipı́dica (equivalente a 7,5 mg/Kg/dı́a
de anfotericina B); y se utilizaron ocho conejos como controles.
Se observó mortalidad aguda (muerte dentro de 24 horas de la administración del medicamento) en
4/4 animales que habı́an recibido 7,5 mg/Kg de anfotericina libre, y en 3/8 animales que habı́an recibido
4,5 mg/Kg de anfotericina libre. No se observó mortalidad aguda en los grupos que recibı́an formulaciones
de partı́culas lipı́dicas. Se continuó el tratamiento durante 30 dı́as para los grupos de tratamiento de 4,5
mg/Kg de anfotericina B libre y 6-9 mg/Kg de partı́culas lipı́dicas.
14
ES 2 087 151 T3
Al final del perı́odo de tratamiento, los animales fueron sacrificados, y se examinaron el hı́gado,
riñones, pulmones, y cerebro para encontrar Aspergilis por cultivo de los órganos. Los resultados se
indican en la Tabla 7 como número de órganos estériles (libres de Aspergilis) sobre el total.
TABLA 7
Tratamiento de Aspergilosis Cultivo de órganos (N◦ . de estériles/total)
5
Grupo
10
15
Control
AmpBa libre
AmpBb lipı́dica
Hı́gado
Riñón
Pulmón
Cerebro
0/8
5/5
4/5
0/8
5/5
4/5
0/8
3/5
4/5
1/3
1/5
3/5
a 4,5 mg/Kg/dı́a
b 6-9 mg/Kg/dı́a
20
Los resultados indican que la formulación de partı́culas lipı́dicas fue tan eficaz como la formulación
de anfotericina B libre, proporcionando una toxicidad significativamente más reducida.
Ejemplo 6
25
30
35
40
45
(Encapsulado de compuestos solubles acuosos)
(A) Encapsulado de fosfonoformato sódico en liposomas de dimensiones definidas se consigue utilizando el método de la invención. Una solución 80 mM de fosfonoformato trisódico (Sigma Chemical
Co.) se utiliza como fase receptora. Un mL de la mezcla de lı́pido EPC/EPG/Chol (7:3:6) en 96 mM
en DMSO:EtOH (7:3) se inyecta en 2 ml de una solución de fosfonoformato. Los liposomas resultantes
se dializan contra 100 volúmenes de tampón 140 mM NaCl-10 mM Hepes (pH 7,4) a 4◦ C, que se cambia
dos veces en un perı́odo de 24 horas. La proporción medicamento:lı́pido en el producto final se determina utilizando medios conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, F. Szoka y otros, Antimicrob Agents
Chemother (1988) 32:858-64). Se forman liposomas que tienen un diámetro ≤ 200 nm.
(B) Tal como se ha mostrado en el Ejemplo anterior 1(B), se pueden emplear fases receptoras que
tienen una gran variedad de solutos sin efecto perjudicial de la formación de liposomas. Cualquiera solutos presentes en la fase receptora se encapsulan en la formación de liposomas. De este modo se pueden
encapsular ácidos débiles, bases débiles, aminoácidos, agentes quelantes, y similares. Se preparan y se
utilizan como fase receptora soluciones de 140 mM carbonato sódico, bicarbonato sódico, acetato sódico,
formato sódico, succinato sódico, mono, di y tri citrato sódico, benzoato sódico, salicilato sódico, EDTA,
desferroxamina, y similares. Un mL de solución de lı́pido (EPC, 120 mM) en DMSO:EtOH 7:3 es inyectada en 2 mL de la fase receptora. Las suspensiones resultantes de liposomas son dializadas con respecto
a 100 volúmenes de una solución de lactosa 280 mM, se cambia dos veces, proporcionando los tampones
encapsulados.
(C) Se encapsulan los aminoácidos del modo siguiente:
50
55
60
Se preparan arginina, glicina, glutamato, lisina, histidina, prolina, u otros aminoácidos en la concentración y pH deseados en solución acuosa. Un ml de solución de lı́pido (EPC, 120 mM) en DMSO:EtOH
7:3 es inyectada en 2 ml de la solución de aminoácido. Las suspensiones de liposoma resultante se dializan
con respecto a 100 volúmenes de 280 mM solución de lactosa, se cambia dos veces, para conseguir los
aminoácidos encapsulados.
(D) Se pueden encapsular varios compuestos de manera simultánea. Los compuestos pueden ser solubles en agua, solubles en lı́pidos, o pueden ser una mezcla de solubles en agua y compuestos solubles
en lı́pidos. Por ejemplo, una solución acuosa de un aminoácido que contiene un compuesto seleccionado
entre glicina, arginina, ornitina, u otros aminoácidos se prepara aproximadamente a 100 mM, y el pH se
ajusta a 7,4. Se inyecta una mezcla de lı́pidos (1 ml) conteniendo EPC (120 mM) y el lı́pido endotoxina A
(1 mM; J. Dijkstra y otros, J Immunol (1987) 138:2663-71) en 2 mL de una fase acuosa, y la suspensión
de liposoma resultante es dializada contra 100 volúmenes de 0,14 M NaCl. Los liposomas contienen un
aminoácido en la fase acuosa, y el lı́pido A en la fase de lı́pido, y presentan un diámetro de ≤ 200 nm.
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5
10
(E) Se encapsula un amplio espectro de compuestos utilizando el método de la invención. Entre los
compuestos adecuados, se comprenden, sin limitación, moléculas fluorescentes, agentes de radiocontraste,
isótopos y compuestos radioactivos, compuestos paramagnéticos, marcadores de giro (spin), compuestos
que contienen flavina, antibióticos tales como aminoglicósidos, compuestos antivı́ricos tales como azidotimidina o desoxicitina y sus derivados fosforilados, nucleótidos y sus derivados fosforilados, carbohidratos,
péptidos tales como vasopresina, oxitocina, hormona liberadora de hormonas luteinizantes, derivados muramilpéptidos y análogos, calcitonina, insulina, inhibidores de proteasa tales como captopril y leupeptina,
inhibidores de renina, oligonucleótidos y sus derivados (ver, por ejemplo, G. Zon, Pharmaceut Res (1988)
5:539-49), ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos, ácidos nucleicos modificados, proteı́nas tales como superóxido dismutasa, hormona de crecimiento humano, interferonas, factores de estı́mulo de
colonias, factores de crecimiento nerviosos, factor de crecimiento transformante alfa y beta, factor de
crecimiento epidérmico, interleuquinas tales como IL-1, IL-2, y similares. El método de la invención
forma de manera ventajosa liposomas o partı́culas lipı́dicas en condiciones de baja cortadura, formando
partı́culas con dimensiones bien definidas y elevada concentración.
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REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la preparación de una suspensión de compuestos de lı́pidos de dimensiones de
partı́culas definidas, cuyo proceso comprende:
5
10
disolver un compuesto soluble en un disolvente aprótico y una cantidad de encapsulado de un lı́pido
capaz de formación de liposomas o de partı́culas lipı́dicas en un disolvente aprótico para proporcionar
una solución compuesto/lı́pido; y
extrusionar dicha solución de compuesto-lı́pido a través de una abertura en una fase acuosa para
formar una suspensión lı́pido-compuesto con tamaño de partı́culas definido.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es muy ligeramente soluble o
substancialmente soluble en agua, alcoholes y disolventes hidrocarburos halogenados.
15
20
3. Procedimiento, según la reivindicación 2, en el que dicha suspensión de lı́pido-compuesto comprende una suspensión de liposomas.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dicho disolvente aprótico es seleccionado entre
dimetilsulfóxido, dioxano, dimetilformamida, acetonitrilo, dimetilacetamida, sulfolano, gamma butirolactona, 1-metil-2-pirrolidinona, y metilpirrolina.
5. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es seleccionado entre cisplatina, doxorrubicina, epinefrina, mebendazol, y niridazol.
25
30
6. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dicha solución de compuesto-lı́pido comprende
además una cantidad solubilizante de lı́pidos de un alcanol completamente saturado que tiene de 1 a 6
átomos de carbono.
7. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que dicho alcanol es etanol.
8. Procedimiento, según la reivindicación 2, en el que dicha suspensión lı́pido-compuesto comprende
una suspensión de partı́culas lipı́dicas.
35
9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que dicho compuestos es seleccionado entre anfotericina B, nistatina, y primaricina.
10. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que dicho lı́pido y dicho compuesto se encuentran
presentes en una proporción de 1:1 a 1:5.
40
45
11. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dicho lı́pido es seleccionado entre fosfatidilcolina de huevo, fosfatidilglicerol de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina, colesterol, sulfato de colesterol y
sales del mismo, hemisuccinato de colesterol y sales del mismo, ftalato de colesterol y sales del mismo,
fosfato de colesterol y sales del mismo, colesterilfosforilcolina, 3,6,9-trioxaoctan-1-ol-colesteril-3e-ol, dimiristoilfosfatidilglicerol, dimiristoilfosfatidilcolina, y fosfatidilcolina de soja hidrogenada.
12. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende además la concentración de dicha suspensión de lı́pido-compuesto.
50
13. Procedimiento para la preparación de una suspensión lı́pido-compuesto de tamaño de partı́culas
definido, cuyo proceso comprende:
solución de una cantidad de encapsulado de un lı́pido capaz de formación de liposomas o partı́culas
lipı́dicas en un disolvente aprótico para conseguir una solución lipı́dica; y
55
60
extrusionar dicha solución lipı́dica a través de una abertura en una solución acuosa de un compuesto
soluble en una fase acuosa para formar una suspensión lı́pido-compuesto con tamaño de partı́culas definido.
14. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que los compuestos solubles en fase acuosa se
seleccionan entre ácidos débiles, bases débiles, agentes quelantes, aminoácidos, moléculas fluorescentes,
agentes de radiocontraste, isótopos y compuestos radioactivos, compuestos paramagnéticos, marcadores
de giro, antibióticos solubles, compuestos antivı́ricos, nucleótidos y sus derivados fosforilados, carbohi17
ES 2 087 151 T3
5
dratos, péptidos, oxitocina, hormona liberadora de hormonas lutenizantes, derivados muramilpéptidos
y análogos, calcitonina, insulina, inhibidores de proteasa, inhibidores de reinina, oligonucleótidos y sus
derivados, ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos, ácidos nucleicos modificados, superóxidos
dismutasa, hormona de crecimiento humano, interferonas, factores estimuladores de colonias, factores de
crecimiento nervioso, factores de crecimiento transformante alfa y beta, factor de crecimiento epidérmico,
IL-1, e IL-2.
15. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que dicha suspensión de lı́pido-compuesto comprende una suspensión de liposomas.
10
16. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que dicho disolvente aprótico es seleccionado
entre dimetilsulfóxido, dioxano, dimetilformamida, acetonitrilo, dimetilactamida, sulfolano, gamma butirolactona, 1-metil-2-pirrolidinona, y metilpirrolina.
15
17. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que dicha solución de lı́pido comprende además
una cantidad solubilizante de lı́pidos de un alcanol completamente saturado con 1 a 6 átomos de carbono.
18. Procedimiento, según la reivindicación 17, en el que dicho alcanol es etanol o metanol.
20
19. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que dicho lı́pido es seleccionado entre fosfatidilcolina de huevo, fosfatidiliglicerol de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina, colesterol, sulfato de colesterol y
sus sales, hemisuccinato de colesterol y sus sales, ftalato de colesterol y sus sales, fosfato de colesterol y
sus sales, colesterilfosforilcolina, 3,6,9-trioxaoctan-1-ol-colesteril-3e-ol, dimiristoilfosfatidilglicerol, dimiristoilfosfatidilcolina, y fosfatidilcolina de soja hidrogenada.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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