Capítulo 19. Inter Simple Sequence Repeats (ISSRs)

Inter Simple Sequence Repeats (IISRs) 567
Capítulo 19
Inter Simple Sequence
Repeats (ISSRs)
Andrea González y Xitlali Aguirre
Los ISSRs son un tipo de marcador genético que nos permite obtener los
niveles de variación en las regiones microsatélite que se encuentran dispersas
en varios genomas, particularmente el nuclear. Estas regiones consisten en
repeticiones en tandem de motivos simples como (CT)n ó (CA)n, ubicadas
entre secuencias no repetitivas del genoma nuclear eucarionte. Los motivos
repetidos, llamados también SSRs (simple sequence repeats) pueden ser
penta-, tetra-, tri- y dinucleótidos. La longitud de las secuencias de microsatélites tiende a ser altamente variable entre individuos debido a las altas tasas
de mutación que experimentan, ya que cuando el DNA se replica durante la
meiosis, la DNA polimerasa puede “tartamudear” hacia adelante o hacia atrás
en las unidades repetidas, eliminando o agregando unidades a la cadena. Las
cadenas resultantes pueden entonces presentar menos o más unidades de
repetición (o pares de bases) que las cadenas parentales (Zietkiewicz et al.,
1994; Wolfe, 2000).
Los ISSRs son marcadores semiarbitrarios amplificados por la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) a partir de la presencia de un oligonucleótido o
primer complementario a un microsatélite, diseñado para unirse a los motivos
repetidos de di y trinucleótidos (evitando los mononucleótidos presentes en
el cloroplasto). Los primers de ISSRs consisten en un motivo repetido de di- o
trinucleótidos complementario a la secuencia del microsatélite. En ocasiones
es posible agregar a esta secuencia un par de nucleótidos extras arbitrarios en
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el extremo 3’ o en el 5’, que jugarán el papel de “anclas” asegurando así que
la amplificación inicie siempre en el extremo 5’ o en el 3’ del microsatélite,
respectivamente (Zietkiewicz et al., 1994; Bornet y Branchard, 2001; Pradeep,
2002).
Cuando dos secuencias repetidas se presentan dentro de una distancia
amplificable y con una orientación invertida, el primer complementario a ellas
(uno por reacción de PCR; véase el capítulo 17 de este libro) puede inducir la
amplificación del segmento de ADN intermedio.
La molécula generada, con un tamaño particular (peso molecular), se considera un “locus”, que representa el segmento de ADN entre los microsatélites.
Y se ha visto que los ISSRs frecuentemente amplifican de 25 a 50 bandas en
una sola reacción. Este patrón característico de productos de PCR se considera la “huella digital genética” de cada uno de los individuos analizados. El
polimorfismo entre individuos de la misma población puede detectarse, ya
que el análisis es sensible a la presencia/ausencia del elemento genómico reconocido por el primer y a la longitud de la secuencia intermedia amplificada
(Zietkiewicz et al., 1994).
Figura 1. Amplificación con un primer (CA)n anclado en el extremo 5’
con tres nucleótidos extras. Se amplifica el segmento intermedio entre
dos secuencias de microsatélite en orientación invertida
Las bandas de ISSRs son consideradas marcadores dominantes. La presencia de la banda representa el genotipo dominante (homócigo o heterócigo),
mientras que su ausencia representa el genotipo homócigo recesivo. Se asume
que existen dos alelos por locus.
La ausencia de una banda puede deberse a varios factores:
1) La no existencia de un sitio de unión completo al primer debido a una
mutación,
2) Rearreglos estructurales en el cromosoma durante la meiosis,
3) Inserciones o deleciones suficientemente grandes como para aumentar o
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disminuir el tamaño de la banda, de manera que se identifica como un
locus diferente.
Ventajas y desventajas
Las ventajas que ofrece esta técnica se centran principalmente en la alta variación que detecta, así como en su reproducibilidad debida principalmente
a las altas temperaturas de alineación utilizadas en la PCR. Asimismo, no
son necesarias altas concentraciones de ADN. Por otro lado, para diseñar los
primers no es necesario conocer la secuencia del genoma del organismo en
estudio. Pueden visualizarse tanto en geles de agarosa como de acrilamida.
Finalmente, son sencillos de montar, rápidos, eficientes y poco costosos.
En cuanto a las desventajas, la homología de las bandas es incierta. Y dado
que son marcadores dominantes, no permiten el cálculo de ciertos parámetros
que exigen distinguir a los heterócigos de los homócigos dominantes (como
FIS y FIT; Wright, 1965). Asimismo, para estimar la heterocigosis poblacional
es necesario asumir a priori que la población se encuentra en equilibrio de
Hardy-Weinberg, por lo que las estimaciones de heterocigosis y estructuración
genética pueden sesgarse un poco, aunque existen correcciones estadísticas
(Lynch y Milligan, 1994).
Aplicaciones
Los ISSRs pueden ser utilizados como marcadores en la resolución de múltiples problemas biológicos. Los polimorfismos que presentan, además de
su heredabilidad, permiten aplicarlos en la identificación de individuos,
distinción de variedades intraespecíficas (particularmente en especies con
importancia económica), identificación de paternidad y maternidad, mapeo
genético, evaluación de diversidad y subdivisión genética en poblaciones,
reconstrucciones filogenéticas, introgresión e hibridización, y distinción de
individuos con origen clonal y sexual (Zietkiewicz et al., 1994; Wolfe, 2000;
Pradeep et al., 2002).
Ejemplo
Al empezar a trabajar con ISSRs es recomendable probar diferentes primers
en una condición estándar y después optimizar aquellos que dieron resultados
positivos. Esta optimización incluye modificar las condiciones iniciales de
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la PCR, particularmente la temperatura y tiempo de alineación, así como la
concentración de MgCl2.
Por ejemplo, en algunos estudios de genética de poblaciones con especies
del género Agave (Aguirre, 2004; González, 2004) se amplificaron ISSRs con
los siguientes primers:
841
842
846
857
GAG AGA GAG AGA GAG AYC
GAG AGA GAG AGA GAG AYG
CAC ACA CAC ACA CAC ART
ACA CAC ACA CAC ACA CYT
Y=C o T
R=A o G
Para una reacción de 25 µl se agregaron 2.5 µl de amortiguador para PCR
10X, 0.5 µl de dNTP mix (mezcla de los 4 dideoxinucleótidos a 10 mM), 0.2
µl de Taq polimerasa a 5 U/µl; 2 µl de DNA a 15 ng/µl; el volumen de MgCl2
(concentración inicial de 30 mM) depende de la concentración óptima para
cada primer y para completar los 25 µl de la reacción, se agregó el volumen
necesario de agua ultrapura correspondiente (tabla 1)
Tabla 1. Condiciones óptimas de amplificación para algunos primers.
Primer
Temperatura de alineación Tiempo de Alineación[MgCl2]
(mM)
841
842
846
857
60º C
60º C
52º C
52º C
45”
35”
45”
45”
2.1
2.3
0.96
1.5
No. de ciclos
30
35
30
30
Una vez que se visualizaron las bandas en geles de agarosa al 2% teñidos con
bromuro de etidio, se hizo un listado de todas las bandas o loci ampificados
en la población. Con estos datos se elaboró una matriz de presencia/ausencia
de las bandas por individuo. Esto puede hacerse a mano, o bien por medio de
programas como el 1D 3.5 de Kodak. Una vez obtenida la matriz, los datos
permitieron obtener frecuencias alélicas, y parámetros clásicos de la genética
de poblaciones como heterocigosis poblacional, por especie, estimaciones de la
estructuración, distancias genéticas, árboles de similitud y análisis jerárquicos
de la varianza molecular. Estos cálculos pueden realizarse con diversos programas como el TFPGA (Miller, 1997) o el Arlequin (Schneider et al., 2000).
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Bibliografía
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