CITOQUIMICA

CITOQUIMICA
“APLICADA A LA HEMATOLOGIA”
Bqca. Ivan María Victoria
Hematología Clínica
2012
La citoquímica estudia la composición química de la
célula y permite detectar la localización
topográfica de algunos principios inmediatos:
enzimas, metales pesados, sustancias orgánicas
moléculas de depósito y otras sustancias.
MORFOLOGÍA <----->
BIOQUÍMICA
 Son un complemento de las tinciones hematológicas.
 Por medio de ellas se localizan enzimas y sustancias
inorgánicas.
 Así se mejora la diferenciación celular.
 También sirven para el diagnóstico
CONFIABILIDAD DE LOS METODOS PARA EL Dx
DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS
CITOMORFOLOGIA.
70-80%
CITOQUIMICA.
90-95%
INMUNOFENOTIPO
MAS
MICROSC. ELECTRN.
CITOGENETICA Y BIOL. MOLECULAR
99-100%
MUESTRAS UTILIZADAS
 EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFÉRICA
 PUNCION DE MÉDULA ÓSEA
 PUNCION DE GANGLIOS
 LCR
TIPOS DE TINCIONES
Se pueden clasificar en:
 Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que se
pretende colorear, se pueden dividir en vitales y no vitales.
 Atendiendo al momento en el que empezaron a ser
utilizadas para el Dx hematológico, se dividen en
tradicionales y especiales.
TINCIONES VITALES Y NO VITALES

Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican
sobre células que están vivas.

Las tinciones vitales son aquellas que se efectúan sobre
células que están vivas, mediante la introducción de un
colorante en la circulación de un organismo vivo. Son
colorantes vitales: el verde Jano y el azul de metileno.

Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre
células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo
del que proceden.

Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas. La
coloración de células muertas requiere un proceso previo de
fijación, que tiene por objeto el mantener inalterada su
estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del
portaobjetos.
TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES
 Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad por las
estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la
hemoglobina (eosina).
 Colorantes básicos: tienen una especial afinidad por las
estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los
ácidos nucleicos (azul de metileno).
 Colorantes neutros:
neutros son sales de un ácido y de una base
coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de
otro (eosinato de azul de metileno).
 Colorantes indiferentes:
indiferentes son los que no tienen afinidad por
estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y
tiñen a aquellas sustancias que tienen un poder de
disolución superior al del líquido empleado para preparar la
solución colorante (Sudán III)
También hay combinaciones de colorantes que
dan lugar a tinciones polícromas.
 Una coloración es panóptica cuando se utilizan
sucesivamente sustancias colorantes neutras. (MayGrünwald-Giemsa)
 Y es pancrómica cuando se aplican todas las sustancias
colorantes neutras juntas (azul de metileno, eosina,
Wright)
Las reacciones citoquímicas pueden también
clasificarse según el mecanismo químico
involucrado
1-Progresivas estables: Son reacciones que
exigen un tiempo mínimo pero no un máximo.
2-Progresivas indefinidas: En estas la reacción
continúa y puede hacer ilegible el preparado o
conducir a valores erróneos.
3-Fugaces: Son las que pierden color
rápidamente y no pueden conservarse mucho
tiempo.
CLASIFICACION DE LAS TÉCNICAS
CITOQUÍMICAS
CITOQUÍMICA CLÁSICA
CITOQUÍMICA ELCTRÓNICA
CITOQUÍMICA FLUORESCENTE
INMUNOCITOQUÍMICA
NO FLUORESCENTE
CITOQUÍMICA AUTOMATIZADA
Citoquímica Clásica: Se fundamenta en reacciones coloreadas
que pueden observarse e interpretarse con el microscopio óptico
común.
Citoquímica electrónica: Se caracteriza por ser una metodología
de elevada sensibilidad
Citoquímica Fluorescente: puede o no ser inmunocitoquímica,
se fijan sobre distintas estructuras de las células y al ser excitadas
por luz UV producen fluorescencias de distintos colores
Inmunocitoquímica no fluorescente:Se basa en la marcación
de anticuerpos con sustancias que son capaces de dar reacciones
citoquímicas intensamente coloreadas que permiten su revelación.
Fisicocitoquímíca electroforética Permite reconocer
determinados componentes de las organelas celulares obtenidas
en solución mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis
en un campo eléctrico y la identificación por reacciones
citoquímicas, permite identificar complejos isoenzimáticos,
mientras que los métodos citoquímicos simples revelan una
enzima en bloque.
Citoquímica automatizada:
CITOQUIMICA ELECTRONICA:
CITOQUIMICA FLUORESCENTE:
•INMUNES
•NO INMUNES
S
P
INMUNOCITOQUíMICA NO FLUORESCENTE
Inmunocitoquímica con detección
indirecta y enzimática. La sección se
obtiene de tejido previamente fijado.
Inmediantemante después se incuban
en una solución de bloqueo que
satura los posibles sitios de unión
inespecífica, gracias a una alta
concentración de proteína como la
albúmina de suero bovino. Tras cada
paso de unión de anticuerpos o del
complejo avidina-biotina-peroxidasa
se procede a lavar los cortes en una
solución tamponada de fosfato
(tampón fosfato), en la que también
van disueltos los anticuerpos. La
reacción de la peroxidasa convierte
unos sustratos, la diaminobencidina y
el peróxido de hidrógeno, en un
producto insoluble y coloreado
visible con el microscopio ótico.
CITOQUIMICA AUTOMATIZADA:
Definición de reacción citoquímica
Es la reacción que por el método de uno o mas
reactivos químicos: aplicados a la célula en
condiciones definidas; determina la formación de
productos coloreados; insolubles; no difusibles;
que permiten el reconocimiento microscópico; de
sustancias o grupos químicos definidos; en su
real ubicación citológica; para lo cual no deben
destruir a la célula, y si lo hacen deben
reemplazar a la sustancia identificada en su
topografía
Las finalidades primordiales de la citoquímica son:
 El reconocimiento y diagnostico celular
 El estudio de la fisiología y la fisiopatología celulares
 El Dx de la patología
ESTANDARIZACION DE METODOS EN
CITOQUIMICA
 Preparación estricta de los reactivos
 Practicas permanentes de las reacciones con preparados testigos
 Realización, la fijación y conservación adecuada de los preparados y
reactivos
 Determinación de tiempos exactos para cada uno de los pasos
 Ídem de temperatura (especial para enzimas)
 Tiempo y condiciones de la inmersión para la lectura
 Diámetros y conservación idóneos de los elementos sobre los cuales
se lleva a cabo la determinación
Tres pasos fundamentales:
 Fijación: preservar las estructuras y reactividad funcional de las
células.
 Incubación en el medio de reacción: como consecuencia se generan
productos que ponen en evidencia el componente a ser estudiado.
 Contraste: permite detectar con mayor facilidad el producto de
reacción .
Las reacciones deben tener 3 características:
sensibilidad, especificidad y
reproductibilidad.
Pueden ser reconocibles….
SUSTANCIAS RECONOCIBLES:
ENZIMAS RECONOCIBLES
1-DNA Y RNA.
2-PROTEINAS.
3-HEMOGLOBINA.
4-HIDRATOS DE CARBONO.
5-LIPIDOS.
6-FOSFOLIPIDOS.
7-METALES
1-MIELOPEROXIDASAS (MPO)
2-FOSFATASA ALCALINA (FAL)
3-FOSFATASA ACIDA (FAC)
4-ESTERASAS (EST)
5-FOSFATASA ACIDA TARTRATO
RESISTENTE (FAC-TR)
6-DEHIDROGENASAS (DH)
CITOQUIMICA CLASICA
reconocimiento por:
principios no enzimáticos
principios enzimáticos
Hidratos de carbonos: PAS
MPO
Fe hemosiderínico: PERLS
FAL
Lípidos: Red Oíl/Sudan Black
FAL
Hemoglobina fetal: elución acida
ESTEARASAS
CATALASAS
ENZIMAS HIDROLITICAS
TINCIONES CLASICAS
1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO
ENZIMATICOS
TINCIÓN DE PAS
(Peryodic Schiff Acid)
Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los
carbohidratos por la acción del ácido peryódico, potente
agente oxidante, liberándose grupos aldehído que al
combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de
color rojo púrpura intenso.
-C-C-
ALDEHIDOS
ACIDO PERYODICO
“PURPURA”
SCHIFF
RESULTADOS: células (+) con patrón difuso fucsia
intenso, lacunar y granular de acuerdo a la progenie
 Serie granulocitica normal: (+) difusa en toda la serie
mieloide
 Basófilos: (+) con patrón lacunar o (–) hasta un 50%
 Serie eritroide normal: negativa
 Serie megacariocitica normal: (+) en plaquetas con un
patrón difuso mas granular o bloques
 Precursores linfoides: (-), hasta llegar a linfocito en el
que un 30% es (+) en corona de gránulos
NEUTROFILO Y ERITROBLASTOS NORMALES
MEGACARIOCITOS Y PLAQUETAS NORMALES
LINFOBLASTOS LEUCEMICOS PAS (+)
LMA6 en MO PAS (+)
TINCION DE PERLS
 Se basa en la liberación de los iones férricos de su
unión con las proteínas por la acción del ácido
clorhídrico; dichos iones férricos al reaccionar con
el ferrocianuro potásico dan un precipitado azul
verdoso de ferrocianuro férrico.
 Por esta reacción se detecta el Fe
hemosiderínico, que es insoluble, pero no el Fe
contenido en la ferritina que es hidrosoluble.
Sideroblastos en anillo
Reflejando una anormalidad
en la acumulación de Fe en
las mitocondrias
(azul de Prusia)
HEMOSIDENURIA: hierro liberado en orina en una
HPN
En el estudio del Fe medular hay que valorar
conjuntamente 3 parámetros:
nº de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe
macrofágico.
Básicamente se presentas 3 patrones:
1) nº sideroblastos alto y Fe de depósito aumentado: es frecuente
hallarlo en estados anémicos que cursan con sobrecarga férrica.
2) nº sideroblastos bajo y Fe de depósito disminuido o ausente:
es el patrón característico de la anemia ferropénica pura; de aparición
muy precoz en un balance férrico negativo.
3) nº sideroblastos bajo con acúmulo de Fe en los macrófagos
medulares. Este patrón disociado es propio de entidades que
condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los macrófagos, por lo que el
Fe no puede ser cedido a los eritroblastos, suele observarse en anemias
secundarias.
Hemocromatosis
(cortes histológicos de
hígado)
HEMOGLOBINA FETAL
Test de Kleihauer-Betke

La hemoglobina fetal (HbF o 22) es ácido y álcali
resistente. Por consiguiente, sometiendo un
preparado fresco de sangre a una elución ácida
será arrastrada la hemoglobina A y retenida la
fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce
por la coloración de estos últimos.

Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean con
eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina
A han sido reducidos a sus membranas vacías y
aparecen como sombras.
Esta prueba se usa para determinar si hay GR
del feto en una mujer embarazada con un
grupo sanguíneo Rh(-).
SUDAN BLACK / RED OIL
Ambas se utilizan para la detección de lípidos,
en el caso del Sudan Black este tiñe los
fosfolípidos y esteroles de membrana de los
gránulos.
 Es un colorante lipofilo que se une de forma irreversible a
un componente granular indefinido en los granulocitos, en
los eosinofilos y en algunos monocitos.
El producto de la
reacción es
negro y granular
Tiñe tanto los gránulos azurófilos
inespecíficos como los específicos de los
neutrofilos
LMA2 (con eosinofilia t(8;21): intensa tinción de
las células en maduración y de los gránulos de
los eosinofilos anormales.
2) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS
ENZIMATICOS
MIELOPEROXIDASA
La demostración citoquímica de esta enzima se
basa en la acción oxidante de la peroxidasa sobre
un sustrato (bencidina) en presencia de peróxido
de hidrógeno, apareciendo un precipitado azul en
el lugar del citoplasma en donde se ha producido
la reacción.
BENCIDINA
H2O2
MPO
Resultados….
siempre patrones granulares!
 ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS (etanol)
 GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : (+) patrón granular intenso en
toda la serie granulocítica mieloide y en menos del 3% de los blastos en
MO. Los blastos mieloides dan un patrón característico polar, en casquete.
 EOSINÓFILO (+) en la membrana granular, el fondo del granulo
conserva la coloración parda.
 BASÓFILO (+) en 50%
 LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS
 MONOCITOS: (+) patrón granular escaso o disperso
NORMALES.
.
PATOLOGICOS…
“ESTRES OXIDATIVO”
Scorificación de MPO en granulocitos:
 Se categorizaron los neutrófilos de acuerdo al contenido de gránulos presente en
el citoplasma, en scores que van de 0 a 4, en orden creciente.
Grado 0: Sin granulaciones teñidas. (fig. 1 y 2)
Grado 1: Escasas granulaciones teñidas dispersas (fig.3
y 4)
Scorificación de MPO en granulocitos:
Grado 2: Regulares granulaciones sin cubrir el
núcleo (fig. 5)
Grado 3: abundantes granulaciones teñidas en todo su
citoplasma sin llegar a cubrir completamente el núcleo.
(fig.6 )
Scorificación de MPO en granulocitos:
Grado 4: granulaciones que cubren la célula completamente dándoles un aspecto de
casquete. (fig.8 y 9)
FOSFATASA ALCALINA
 La FA es una fosfomonoesterasa que es activa francamente a ph
alcalino y actúa sobre grupos esteres fosforados liberando el ion
fosfato.
 La actividad de la FA granulocítica es marcadora de la
granulación especifica de los neutrófilos.
 Inicialmente se pensó que la FA estaba localizada en gránulos
específicos (secundarios), pero se demostró que esta asociada
con un componente membranoso del citoplasma identificado
como una estructura tubular de forma irregular distinta de los
gránulos 1 o 2 y de otras organelas citoplasmáticas.
Alfa-naftil fostato
ph alcalino
FAL
naftilo
fosfato
Colorante diazoico
Compuesto diazotado
Cuidados:
 Efectuar la reacción en frotis de no mas de 24 hs.
 Conservar los preparados en heladera envueltos en papel
absorbente con un desecador.
 Ph de la reacción
.
La actividad granulocitica de la FA se
manifiesta en forma de un
precipitado de color pardo negruzco
localizado en el citoplasma
Se encuentran actividad FA en algunas
células maduras y semimaduras de la
granulopoyesis neutrofilica (segmentados
y bandas)
Índice de actividad de FAL
Es la suma de los grados de positividad de 100 neutrófilos.
Score: 95+/-20
 Grado 0: sin reacción
 Grado I: coloración difusa o con pequeños puntos
coloreados
 Grado II: mayor densidad cromática, por lo general
en la zona del hilio nuclear.
 Grado III: mayor granulación oscura, tiñe todo el
citoplasma.
 Grado IV: completamente oscuro
FOSFATASA ACIDA
Se basa en la hidrólisis del substrato
naftol-AS-Bi-fosfato.
La aplicación práctica del estudio de la FA se refiere sobre todo al estudio de
los síndromes linfoproliferativos crónicos (LPC) y leucemia aguda
linfoblástica (LAL), dónde existe una buena correlación entre el tipo de
positividad y el fenotipo de membrana.
FAC LT(+) Y LB (-)
El 90% de las LAL de origen T dan una reacción + intensa de localización
centrosómica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores
elevados de FAC que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa
actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B.
Tricoleucemia: Tinción fosfatasa ácida (+) tartrato resistente
LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA EN
MAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS.
ESTEARASAS
4 sustratos:
Naftol-AS-C-cloroacetato (CAE)
 Naftol-AS-D-acetato
 α-naftil-acetato
 α -naftil-butirato

hidrolizados
“sal diazoica”
“precipitado insoluble”
ESTERASAS
Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar ésteres en sus componentes
ácidos y alcoholes. Existen diferentes variedades según el substrato
empleado.
GR y su
progenie
Granulocitos y su
progenie
Linfocitos y su
progenie
Monocitos y su
progenie
Naftil
butirato/
acetato
Normales (-)
(+) M6
(-) o con algunas
granulaciones F
Resit
(-) o + débil
(+++++)
Fluoruro
sensible
Naftil cloro
acetato
Idem
(+++++)
(-)
(+)
LMA5 (monocitica) MO “TINCION DE ESTERASAS COMBINADAS”:
monoblastos teñidos de marrones (esterasas no especificas) y un neutrófilo
teñido de azul (cloroacetoesterasa)
EN RESUMEN…..
PAS
Fe
MPO
FAL
FAC
ANAE
NCAE
Sudan
Black
Granulocitos
Linfocitos
Mb 
Seg
Lbl

Lin
Monocitos
Mbl

Mon
Plaquetas
Mg
 Pq
Eritrocitos
PEbl 
GR
|