Presentación de PowerPoint

F.I.G.: Experimento de Volkin and Astrachan, 1956
Pi
32
Ultracentrifugación
en CsCl y BrEt
DNA
5’
Bacterias más
fagos
RNA
Aislamiento de
ácidos
nucleicos
Cómo seguiría el experimento?
Qué esperaría?
F.I.G.: Experimento de Volkin and Astrachan, 1956
En un cultivo de E. coli fue infectado con un becteriófago T2
Luego de la infección se dio un pulso de 32P por unos pocos minutos
Luego se aislaron ácidos nucleicos, se separó por ultracentrifugación el
ADN del ARN y se vió que sólo el ARN presentaba marca. Se trató con
álcali (degrada sólo el ARN) y se analizó la composición de bases. La
sorpresa es que esta composición reflejaba la composición del fago
Ellos dicen:” This labeled RNA may be largely responsible for phage
synthesis”
Habían descubierto el RNA mensajero, ellos lo llamaron DNA-like RNA
pero no fue aceptado.
F.I.G.: Experimento de Pardee, Jacob y Monod 1960
Hasta el año 1960 se pensaba que todos los moldes necesarios
para la síntesis proteica se encontraban en el RNA ribosómico
(rRNA). Sin embargo, los pesos moleculares de las proteínas
varían hasta en dos órdenes de magnitud respecto de los pesos de
los rRNA (5S, 16S, y 23S).
Monod había puesto a punto cómo manipular bacterias por
mutaciones y conjugación. Utilizó la enzima β-galactosidasa que
hidroliza la lactosa. Sabían que cuando una bacteria mutada
perdía la capacidad de metabolizar la lactosa, y era conjugada por
otra, la bacterias rápidamente recobraban la capacidad de
metabolizarla.
Cómo esta información podía pasar tan rápidamente sugería la
existencia de una molécula simple que fuera complementaria al
ADN .
Actividad β-galactosidasa
F.I.G.: Experimento de Jacob y Monod 1961
glucosa
lactosa
glucosa
F.I.G.: Experimento de Jacob y Monod 1961
Jacob y Monod decidieron continuar el estudio de la degradación de
la lactosa en E. coli , de la cual se sabía que estaba controlada por tres
enzimas cuyos genes se encuentran adyacentes en el cromosoma
bacteriano.
Cuando cultivaban bacterias en glucosa como fuente de carbono
podían observar cómo la concentración de β-galactosidasa era muy
baja. Al sustituir glucosa por lactosa se observaba un rápido aumento
en los niveles de β-galactosidasa y de las otras dos enzimas Al retirar
de nuevo la lactosa, los niveles de las tres enzimas disminuían rápida
y drásticamente. Este hecho sugería que los moldes para la síntesis de
estas enzimas eran muy inestables, sintetizándose y degradándose
rápidamente, lo cual no encajaba con la elevada estabilidad de los
rRNAs. Lo llamaron RNA mensajero.
F.I.G.: Experimento de Niremberg, Matthei y Ochoa 1962
El código genético debía ser un lenguaje usando los cuatro
nucleótidos que especificara 20 aminoácidos.
1 nucleotido= 4
2 nucleótidos= 4 x 4 = 16
3 nucleótidos= 4 x 4 x 4 = 64
Se aceptó la hipótesis de triplete (codon) y se comenzó a
experimentar
Posibles experimentos?
F.I.G.: Experimento de Niremberg, Matthei y Ochoa 1962
Descifrado del código genético
http://www.dnaftb.org/dnaftb/22/concept/index.html
F.I.G.: Transcripción
•La RNA polimerasa, a diferencia de la DNA polimerasa, no requiere
cebador para comenzar la síntesis de RNA.
•.En
procariotas hay un único tipo de RNA polimerasa que, en realidad,
es un gran complejo multienzimático asociado con varias proteínas que
participan en diferentes momentos de la transcripción. En eucariotas hay
tres diferentes que transcriben diferentes tipos de genes.
•Cuando va a iniciar la transcripción, la RNA polimerasa se une al DNA
en una secuencia específica denominada secuencia promotora o
promotor.
•Señales de terminación de diverso tipo
•En procariotas, mensajeros policistrónicos
•En eucariotas la mayoría de los transcriptos sufren splicing. Concepto
de exones e intrones.
F.I.G.: Transcripción
Transcription
F.I.G.: Gen
Entonces, los genes son unidades codificantes para proteínas y ARNs
que contienen:
5’UTR
3’UTR
AUG
Promotor
UAA
Secuencia codificante
F.I.G.: Genes Procariotas
Codon de stop
Codon de
iniciación
Promotor
Codon de
iniciación
Codon de stop
Codon de stop
Codon de
iniciación
Mensajero policistrónico
Señal de
terminación
F.I.G.: Genes Eucariotas
exon
exon
intron
exon
intron
Codon de stop
Promotor
Splicing
Codon de
iniciación
Codon de
iniciación
Señal de
poladenilació
n
AAAAAAAA
Codon de stop
Mensajero maduro
RNA Processing
F.I.G.: Genes Procariotas
F.I.G.: Traducción
Requiere de tres tipos de RNA: mRNA, rRNA y tRNA
Los rRNA junto con proteínas
ribosomales forman los ribosomas
F.I.G.: Traducción
F.I.G.: Traducción
Existen tantas aminoacil t-RNA sintasas como aminoácidos, que
son específicas para producir la unión de cada aminoácido a su
correspondiente t-RNA
La especificidad está dada en las bases modificadas del brazo
aceptor, en el anticodón y bases adyacentes. Fue demostrado
por mutaciones puntuales en los genes de t-RNAs. Además las
aminoacil tRNA sintasas poseen un segundo sitio que une
aminoácidos con características semejantes, lo que aumenta la
especificidad de la unión (proof reading).
La especificidad de la unión codón-anticodón reside sólo en el
anticodón aun con otro aminoácido cargado. Experimento de
marca de Cys desulfurada convertida en Ala
F.I.G.: Traducción
F.I.G.: Traducción
Traducción: tres etapas
F.I.G.: Traducción
F.I.G.: Traducción
F.I.G.: Traducción
Lsa actividad de peptidil transferasa está asociada al RNA más
que a las proteínas ribosomales,esto es:
Los ribosomas son ribozimas, RNAs con actividad enzimática
capaces de catalizar reacciones
Observaciones. Ausencia parcial de proteínas ribosomales no
inhiben la actividad
Los rRNA están mehjor conservados que las proteínas
ribosómicas
La mayoría de las mutaciones que confieren resistencia a
antibióticos o inhiben la síntesis de proteínas están en genes de
RNA rinosomales
F.I.G.: Traducción
Translation
F.I.G.: Traducción
Transcripción y traducción simultáneas en un gen bacteriano
F.I.G.: Traducción
Inhibidores de la traducción