Repasar est primaria secundaria terciaria y cuaternaria

Proteínas
Proteínas cumplen diversas funciones en sistemas biológicos:
• enzimática (enzimas intervienen en todos procesos biológicos y
químicos en la célula)
• estructural (colágeno, queratina, elastina)
• hormonal (insulina)
• de reserva (proteínas semillas y huevos)
• transporte (albúmina, proteínas transportadoras de ácidos grasos)
• contráctil (miosina, actina y tubulina)
• protectora (toxinas y alergenos)
• anticuerpos (inmunoglobulinas)
Cómo se logra esa diversidad funcional?
diversidad de secuencias
primarias
Pro-Ile-Asp-Asn-Glu-Glnl-Arg-Gly-Met-Thr-Pro-Phe-Tyr-Trp-Pro-Phe-Tyr-Trp-Pro-Phe-Tyr-Trp
Tyr-Trp-Leu-Ile-Asp-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-ThrPro-Phe-Tyr-Trp-Leu-PhePro-Phe-Tyr--Lys-VaTrp-Leu-Ile-Asp-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-Thr
Leu-Ile-Pro-Phe-Tyr-Trp-Asp-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-Thr-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-Thr
Phe-Tyr-TrPro-p-Leu-Ile-Asp-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-Thr-Gln-Lys-Val-Gln-Lys-Val
Pro-Phe-Tyr-Trp-Leu-Ile-Asp-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-Thr
Ile-Asp-Asn-Glu-Gln-Lys-Val-Arg-Gly-Met-Thr-Pro-Phe-Tyr-Trp-Leu-Thr-Pro-Phe-Tyr-Trp-Thr-Pro-Phe-Tyr-Trp
estructuras tridimensionales posibles
Infinitas formas proteicas distintas
dependiendo de la longitud de la cadena
polipeptidica, tipo y proporción de
aminoácidos presentes y la secuencia en
que estos se encuentran
Niveles estructurales
en las proteínas
Estructura primaria:
cadena lineal de aminoacidos
unidos por enlace amida
Estructura secundaria:
disposición espacial
periódica de los a.a. en
segmentos de la cadena
polipeptdidica
Estructura terciaria:
disposición espacial lograda
cuando la cadena
polipeptidica se pliega en una
estructura tridimensional
Estructura cuaternaria:
disposición espacial de
monómeros de proteínas
Plegamiento de proteínas
Desplegado
Nativo
Conocer como ocurre el proceso de plegamiento es uno de los grandes problemas
de la bioquímica
• importancia básica
• relevancia biotecnológica
• importancia médica
Toda la información para el plegamiento se encuentra en la secuencia de aminoácidos
(experimento de replegamiento de ribonucleasa (Anfinsen)
Proceso cooperativo
no se acumulan estados
parcialmente plegados
Paradoja de Levinthal: las proteínas no se pliegan explorando todas
las conformaciones al azar
Se “fijan” estados intermediarios parcialmente plegados
Conformación nativa: estado termodinámico en que se favorecen
interacciones favorables y se minimizan desfavorables
Qué fuerzas están implicadas en la estabilidad de proteínas?
• Interacciones electrostáticas (atractivas o repulsivas) su fuerza depende del
medio
• Interacciones puente Hidrógeno: interacción entre átomo de hidrógeno unido
covalentemente a átomo electronegativo (N, O, S) con otro átomo
electronegativo
• Interacciones de van der Waals: dipolo-dipolo inducido, dipolo inducido-dipolo
inducido entre átomos neutros
• Impedimentos estéricos
• Enlaces disulfuro: por oxidación de cisteínas
Todas estas interacciones estabilizan la estructura de una
proteína, pero no provocan su plegamiento en solución
acuosa
“Interacciones hidrofóbicas”
Porqué se pliegan las proteínas?
Fuerza impulsora: efecto hidrofóbico
(cadenas laterales apolares se esconden del solvente)
∆Gpleg=∆Hpleg-T∆Spleg
Cadenas laterales
hidrofóbicas interaccionan con el agua (∆H negativo).
Al hacerlo, muchas moléculas de
(∆S
agua se estructuran a su alrededor
negativo)
El sistema se rearregla para acomodar grupos
hidrofóbicos escondidos del
agua e hidrofílicos interaccionando con ella.
La entropía del
sistema aumenta y es la que dirige el proceso
Investigación en proteínas
Proteoma: proteínas expresadas por el genoma
• función de proteínas
• interacciones entre proteínas en vía metabólica
• proceso dinámico (depende de estado fisiológico,
edad, etc.)
Pasos a seguir:
• Fraccionamiento celular
• Purificación
• Análisis de estructura
Material de partida:
reconocer en que fracción
celular se encuentra
la proteína de interés.
Métodos de purificación:
diferencias en solubilidad, tamaño, carga o afinidad por ligandos
Importante!
•Ensayo para identificar proteína de interés
•Cuantificar proteína en cada paso de purificación
Precipitación salina (solubilidad)
Las proteínas son menos solubles en soluciones concentradas
de ciertas sales (carácter cosmotrópico de ciertos iones:
aumentan la estructura del agua)
≠ proteínas presentan distinta solubilidad a alta
concentración de sal
Se precipitan las moléculas de proteína por “interacción
hidrofóbica” entre aminoácidos de distintas moléculas
Diálisis (tamaño)
• Membrana porosa que permite
el flujo de ciertas moléculas y
retiene otras de acuerdo a su
tamaño.
• Técnica muy utilizada para
cambio de buffer o separación
de proteínas grandes de
moléculas pequeñas
Cromatografía de exclusión molecular: separa por tamaño molecular
Se utiliza para:
• Separación de proteínas
• Desalado
• Cálculo de peso molecular (relación entre peso molecular y
coeficiente de partición en una columna cromatográfica)
Cromatografía de intercambio iónico:
separa de acuerdo a la carga de la molécula
Intercambio aniónico
Intercambio catiónico
Cómo despego las proteínas unidas?
Cromatografía de afinidad
Ventajas: especificidad
Desventajas: especificidad
Enzima-sustrato
Antígeno anticuerpo
Ligando-receptor
Ligando-proteína transportadora
Cómo despego las proteínas unidas?
HPLC: high pressure liquid cromatography
× aumenta la resolución
× disminuye la dilución de
la muestra
Electroforesis en gel de poliacrilamida:
separa por tamaño
y carga (No se utiliza como método de separación
sino de identificación y cuantificación)
velocidad de migración
ν=qE/f
Coeficiente de fricción
f = 6πηr
Condiciones nativas: migración depende de
Soporte sólido actúa como tamiz
E= campo eléctrico
q= carga proteína
η= viscosidad del medio
r= radio proteína
carga, masa y forma
Electroforesis en condiciones desnaturalizantes:
•Se despliega la proteína y se la “tapiza” con cargas negativas con SDS
•Separa por
masa molecular (relación inversamente proporcional
entre la masa de una proteína y su movilidad relativa en un gel de
electroforesis)
•Nos independizamos de la carga y la forma de la proteína
Tinción con coomasie
Técnica altamente resolutiva y “económica”
Isoelectroenfoque: separa por diferencia en pI
velocidad de migración
ν=qE/f
Electroforesis bidimensional
• isoelectroenfoque (carga)
• SDS-poliacrilamida (masa)
En cada calle se siembra igual cantidad de
proteína total.
Al final de la purificación la banda de
la proteína de interés se hace más importante
Sedimentación diferencial
Permite conocer masa,
densidad, forma
S= m(1-νρ)/f
ν=volumen específico
parcial
ρ=densidad del medio
f= coeficiente de fricción
(1-νρ)= fuerza flotación ejercida
por líquido
Obtenida la proteína pura…..
Técnicas para estudiar distintos niveles de la estructura proteica
•Secuenciación (estructura primaria)
•Fluorescencia (estructura “tridimensional” y terciaria)
•NMR (estructura secundaria y terciaria)
•Rayos X (estructura secundaria y terciaria)
•Infrarrojo (estructura secundaria y terciaria)
•Dicroísmo Circular (estructura secundaria y terciaria)
Análisis de estructura primaria
Determinación de composición de aminoácidos: hidrólisis con HCl 6N a 110ºC
durante 24 hs y posterior análisis cromatográfico del producto.
Secuenciación de Edman: separa de a uno a la vez el residuo amino terminal
En la práctica, los segmentos de aminoácidos no pueden ser muy largos:
previamente a la secuenciación se somete a la proteína a proteólisis con
distintas proteasas para obtener segmentos más cortos y fáciles de analizar
Luego por solapamiento de secuencias se obtiene la secuencia de la proteína
Espectroscopía de emisión de fluorescencia
Emisión siempre ocurre desde S1
λem > λexc; energíaem< energíaexc
Triptofano: muy sensible a la polaridad del medio
Muy útil para medir cambios conformacionales
Proteína con muchos triptofanos, se observa un
promedio: pierde sensibilidad
ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN EN EL INFRARROJO
medición de transiciones vibracionales
entre el estado basal y el
primer estado vibracional
las vibraciones características de
átomos unidos covalentemente
son: “stretching” y “bending”
la banda de absorción más utilizada
para el estudio de la estructura de
proteínas es la Amida I (C=O
stretching)
0.30
Espectro de absorción al infrarrojo de B-FABP
0.25
t(0)
t(3 hs)
Amida I (')
0.20
Absorbance
el espectro de IR de proteínas
presenta varias bandas que son
debidas a la vibración de los
átomos involucrados en el
enlace peptídico
0.15
Amida II
(y cadenas laterales)
0.10
0.05
Amida II'
0.00
1700
1650
1600
1550
1500
-1
Wavenumber (cm )
1450
Asignación de bandas (cm-1)
Conformación
hélice alfa
cadena beta
antiparalela
en solución
de H2O
1653
1632
en solución de
D2O
1650
1632
1690
1630
1675
1632
1645
1656
1648
1643
cadena beta
paralela
desordenadas
de acuerdo a los distintos arreglos
de puente hidrógeno (distintas
estructuras secundarias) “la banda
Amida I aparecerá en distintas
posiciones”
α-lactalbumina
BSA
Absorbance
Absorbance
Absorbancia
B-FABP
1690 1680 1670 1660 1650 1640 1630 1620 1610 1600
ν (cm-1)
1700
1700
1690
1680
1670
1660
1650
-1
ν (cm )
1640
1630
1620
1610
1600
1690
1680
1670
1660
1650
-1
ν (cm )
1640
1630
1620
1610
1600
Cristalografía de rayos X
Patrón de difracción de rayos X
Mapa de densidad electrónica
Cristal proteico conserva actividad biológica: estructura
Desventajas:
• no todas las proteínas son cristalizables
• costoso
• permite solo el estudio de proteínas en solución
nativa
Nuclear magnetic resonance (NMR)
Núcleos atómicos intrínsicamente magnéticos: spin (rotación)
Rotación genera momento magnético
Al aplicar un campo magnético este momento
puede adoptar dos orientaciones
Se aplica pulso de radiación electromagnética
(radiofrecuencia)
Entorno químico afecta la frecuencia con la que el núcleo resuena
Determinación de estructura
Proteína de 55 aminoácidos
Más compleja la molécula,
más complejo el espectro