Caracterización proteómica de Rhizobium leguminosarum bv. Viciae

Caracterización proteómica de Rhizobium
leguminosarum bv. Viciae
Virginia Marugán Hernández ([email protected])
Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos
Universidad Politécnica de Madrid
Tutores: Juan Imperial Ródenas, Tomás Ruiz Argüeso
1. INTRODUCCIÓN
1.1 LA SIMBIOSIS Rhizobium – LEGUMINOSA
La simbiosis Rhizobium – Leguminosa ha sido objeto de detallados estudios
estructurales, fisiológicos y genéticos desde su descubrimiento, debido a la importancia
agrícola de muchos de los cultivos de leguminosas, y al aporte nitrogenado derivado de
la fijación biológica de nitrógeno.
La familia de las leguminosas es una de las más extensas y diversificadas. Son
Angiospermas del orden Rosales y se dividen en tres subfamilias: Mimosoideas,
Caesalpinoideas y Papilonoideas. Una característica importante es su capacidad de
establecer simbiosis con bacterias del grupo Rhizobium.
Las bacterias del grupo Rhizobium son bacilos Gram negativos, proteobacterias
del grupo a, son aeróbicas y en muchos casos aeróbicas estrictas. Son mótiles por
medio de flagelos peritricos, y su hábitat natural es el suelo. Se reconocen cinco
géneros: Rhizobium y Sinorhizobium (ambas de crecimiento rápido), Bradyrhizobium
(de crecimiento lento), Mesorhizobium y Azorhizobium.
Las bacterias del grupo Rhizobium, además de poder desarrollarse como
organismos de vida libre en el suelo, son capaces de formar asociaciones fijadoras de
nitrógeno con plantas de la familia de las leguminosas. Esta asociación, que conecta la
capacidad fotosintética de la planta con la capacidad de las bacterias de reducir el
nitrógeno atmosférico, es el resultado de un complejo proceso de desarrollo que
requiere la expresión coordinada en el espacio y en el tiempo de un gran número de
genes, tanto de la planta como de la bacteria. La simbiosis es altamente específica, y su
establecimiento comienza por un intercambio de señales químicas entre ambas partes
(Downie, 1994) que permite el reconocimiento e invasión de la leguminosa
hospedadora apropiada por el rizobio, seguido por la proliferación y diferenciación de
una estructura altamente especializada denominada “nódulo”. Estos nódulos están
localizados en las raíces, salvo en el caso de Azorhizobium que también es capaz de
1
inducir nódulos en los tallos. En su interior, las bacterias, transformadas en bacteroides,
como se denomina la forma simbiótica de los rizobios, fijan nitrógeno, para lo cual
reciben fuentes de carbono y energía suministradas por la planta.
1.2 Rhizobium EN LA RIZOSFERA
La rizosfera es la zona del suelo que está modificada por la presencia y actividad
de las raíces de las plantas. En ella se establece un microclima cuyas condiciones están
alteradas por la presencia de estas raíces. Así, por ejemplo, se produce un cambio en la
composición química del suelo debido a exudados radiculares, tales como aminoácidos,
ácidos orgánicos, azúcares, factores de crecimiento, nucleótidos, flavonoides y enzimas,
que pueden suponer hasta un 20 % del fotosintato de la planta, siendo la exudación
mayor en los ápices radiculares. Algunos de los compuestos exudados que aparecen en
la rizosfera no sólo son utilizados por los microorganismos como nutrientes sino que
además tienen gran importancia en la atracción de microorganismos hacia la raíz. La
rizosfera es fundamentalmente heterogénea, existiendo zonas más o menos ricas en
determinados compuestos y está condicionada por diversos factores como son el tipo de
planta, edad de la raíz y tipo de suelo. Es precisamente en la rizosfera donde tiene lugar
el inicio de la interacción Rhizobium – Leguminosa que dará lugar a la formación de
nódulos radiculares.
1.3 POSIBLE PAPEL DE LOS SISTEMAS DE AUTOINDUCCIÓN EN LA
RIZOSFERA
Durante décadas se ha sabido que las bacterias vivían en colonias, pero se creía
que cada miembro de esas colonias actuaba de forma individual sin ninguna necesidad
aparente de comunicación con los demás.
La primera evidencia de la existencia de comunicación intercelular entre
bacterias se obtuvo al estudiar la bioluminiscencia en bacterias simbióticas marinas
(Vibrio fischeri). Ésta parecía mostrar una expresión dependiente de la densidad
(Nealson et al., 1970). Las investigaciones demostraron que estas especies producen y
responden a moléculas señal, N - acil homoserin lactonas, que se acumulan en el
exterior y actúan como autoinductores del crecimiento celular (Eberhard et al., 1981).
Cuando se alcanza el nivel umbral de concentración de autoinductores se desencadena
una serie de acontecimientos que concluyen en la producción de bioluminiscencia. La
producción de luz está controlada por dos proteínas: LuxI, responsable de la síntesis del
autoinductor, y LuxR, un activador transcripcional que cuando se une al autoinductor
promueve la transcripción del operón de la luciferasa (Enegebrecht et al., 1983;
Enegebrecht y Silverman, 1984) (Fig. 1.A). A este sistema de regulación dependiente de
la densidad celular se le conoce como de “quorum sensing” o autoinducción (Fuqua et
al., 1994).
La autoinducción consiste en la regulación de la expresión génica en respuesta a
las fluctuaciones en la densidad de población celular. Las bacterias producen y liberan
2
señales químicas denominadas autoinductores que, por su naturaleza, cruzan libremente
las membranas celulares en uno u otro sentido y que, por tanto, incrementan su
concentración en función de la densidad celular. Al alcanzar un determinado nivel
umbral, se estimula la producción de autoinductor y tiene lugar una alteración en la
expresión de genes, ya sea inducción o represión. La mayoría de las bacterias usan
circuitos de comunicación de tipo autoinducción para regular diversas actividades
fisiológicas. Estos procesos incluyen simbiosis, virulencia, competencia, conjugación,
producción de antibióticos, motilidad, esporulación y formación de biofilms, entre
otros. En general, las bacterias Gram negativas utilizan N - acil homoserin lactonas
como autoinductores, y las bacterias Gram positivas utilizan oligopéptidos modificados
para dicha comunicación. Se conocen ejemplos de comunicación interespecífica
mediante autoinductores, e incluso parece ser que dichos autoinductores pueden
producir respuestas específicas distintas en los diferentes organismos receptores.
Muchas bacterias que establecen asociaciones con plantas producen y responden
a N - acil homoserin lactonas para regular la expresión de genes específicos. La
regulación se produce mediante dos genes que codifican proteínas similares al sistema
LuxI/LuxR de Vibrio fischeri (Enegebrecht et al., 1983; Enegebrecht y Silverman,
1984).
Para tener éxito en su nicho ecológico las bacterias deben ser capaces de
sobrevivir y competir en complejas comunidades microbianas. Esto es especialmente
cierto para las interacciones bacteria – bacteria y bacteria – planta en la rizosfera. Estas
interacciones dependen de la apropiada expresión de genes específicos involucrados en
esas interacciones. Muchas bacterias han desarrollado mecanismos de regulación de
genes que les permiten detectar y responder a las diversas condiciones ambientales,
incluyendo la presencia de competidores y plantas o animales hospedadores. Entre esos
sistemas destacan los sistemas de autoinducción. En varias bacterias del grupo Gram
negativo se han identificado diversos sistemas de regulación por autoinducción
mediados por AHLs. Entre ellas se encuentran Agrobacterium tumefaciens, Erwinia
carotovora, Pantoea stewartii, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas aureofaciens y
Rhizobium leguminosarum (Tabla 1).
Tabla 1. Ejemplos de bacterias asociadas con plantas que utilizan sistemas de
autoinducción regulados por acil homoserin lactonas
3
Todas estas bacterias utilizan N - acil homoserin lactonas para coordinar el
comportamiento de células individuales en una población local. Recientemente se ha
descubierto la existencia de estrategias de competencia en el ecosistema del suelo
dirigidas específicamente contra los sistemas de autoinducción. Así, Bacillus sp.
(240B1) es capaz de producir la inactivación enzimática de estas N - acil homoserin
lactonas mediante la expresión del gen aiiA, que codifica una proteína con actividad
lactonasa (AiiA) y con capacidad de destruir el anillo lactónico de las AHLs. De esta
forma su actividad determinaría bajos niveles de autoinductores, suprimiendo cualquier
tipo de regulación por autoinducción. Bacillus sp. no se ve afectado por esta enzima ya
que se trata de una bacteria Gram positiva que no posee sistemas de autoinducción
regulados por AHLs (Dong et al., 2000).
1.4 SISTEMAS DE AUTOINDUCCIÓN EN Rhizobium leguminosarum
Recientemente se ha descrito la existencia de señales de autoinducción en
muchas especies de rizobios noduladores de leguminosas. Las estudios más completos
se han llevado a cabo con la cepa A34 de Rhizobium leguminosarum bv. viciae. Esta
cepa sintetiza una variedad de autoinductores, todos los cuales han sido identificados
como N - acil homoserin lactonas.
Bacteria
Agrobacteri
um
tumefaciens
Erwinia
carotovora
Pantoea
stewartii
Ralstonia
solanacearu
m
Pseudomona
s
aureofaciens
Rhizobium
leguminosar
um
Homólogo
LuxI/LuxR
TraI/TraR
CarI/CarR;
ExpI/ExpR
Estructura
Cadena lateral
N-3oxooctanol
N-3oxohexanol
Procesos que regulan
Transferencia del
plásmido Ti
Factores de virulencia
extracelulares, Carbapenem
Exopolisacáridos capsulares
EsaI/EsaR
N-3oxohexanol
PhcI/PhcR
N-hexanol
?
N-octanol
Fenazinas
PhzI/PhzR
N-hexanol
CinI/CinR
N-3-hidroxi-7cistetradecanol
Interacciones en la raíz,
nodulación
4
Una de esas N - acil homoserin lactonas es la N-(3-hidroxi-7-cis-tetradecanoil)-Lhomoserin lactona (Gray et al., 1996; Schripsema et al., 1996), conocida también como
bacteriocina small, porque inhibe el crecimiento de varias cepas de Rhizobium
leguminosarum. El responsable de la producción de esta bacteriocina es el locus
cinI/cinR (homólogo de luxI/luxR) (Tabla 1). CinR induce cinI en respuesta a esta AHL
producida por CinI, estableciéndose así un sistema de autoinducción con
autorregulación positiva (Lithgow et al., 2000).
El locus cinIR controla una compleja cascada de bucles de autoinducción con
otros tres sistemas de autoinducción con sus correspondientes AHLs. Estos sistemas
incluyen raiI/raiR (Rosemeyer et al., 1998), traI/traR y rhi/rhiR (Fig. 1.B). Otras cepas
de rizobios parecen compartir algunos de estos loci de autoinducción, pero no todos los
loci han sido encontrados en todas las cepas.
Una característica encontrada específicamente en cepas de R. leguminosarum bv.
viciae, pero no en otras cepas de rizobios, es su capacidad de producir grandes
cantidades de una proteína de una masa molecular de 24.000 Da en la rizosfera (Dibb et
al., 1984). Esta proteína es expresada en la rizosfera alrededor de las raíces de las
leguminosas pero no en bacteroides en el interior de los nódulos. El gen que codifica
para esta proteína se denomina rhiA y se localiza en una región de 10 kb de ADN
localizada entre entre los genes nod (de nodulación) y los genes nifHDK (que codifican
para el complejo de la nitrogenasa que reduce el nitrógeno atmosférico) (Rodelas et al.,
1999). La función de los genes rhiABC aún no esta claramente definida. Mutaciones en
rhiA y rhiR no tiene ningún efecto en la eficiencia de nodulación ni en la fijación de
nitrógeno (Dibb et al., 1984), pero en cepas mutantes en el operón nodFEL sí se
produce una disminución en la eficiencia de nodulación cuando se realizan mutaciones
en rhiA o rhiR (Cubo et al., 1992). La capacidad de nodulación de guisante por cepas
con mutaciones en rhiI no se ve perjudicada, pero el número de nódulos formados es
significativamente menor (Rodelas et al., 1999).
2. OBJETIVOS
Los objetivos de este trabajo se centran en la caracterización del proteoma de
Rhizobium leguminosarum bv. viciae y de sus cambios asociados a tres situaciones
experimentales:
1. Comparación del proteoma de dos cepas silvestres: R. leguminosarum bv. viciae
UPM791, la cepa de referencia de nuestro laboratorio, y R. leguminosarum bv.
viciae 3841, que ha sido escogida por el Sanger Centre para su secuenciación
genómica.
2. Efecto sobre el proteoma de la curación de dos de los cuatro plásmidos nativos
de la cepa UPM791, el plásmido simbiótico (pUPM791c) y el plásmido más
pequeño (pUPM791d).
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3. Efecto sobre el proteoma de la eliminación de los sistemas de autoinducción de
R. leguminosarum bv. viciae UPM791 y cepas derivadas, y de R.
leguminosarum bv. viciae 3841.
3. MATERIALES Y METODOS
3.1 CEPAS BACTERIANAS Y PLÁSMIDOS
Las cepas bacterianas y los plásmidos utilizados en este trabajo se recogen en las
siguientes tablas.
Tabla 2. Cepas bacterianas
Bacterias
Características relevantes
Fuente o referencia
Rhizobium leguminosarum bv. viciae
UPM791
128C53; Cepa silvestre Strr Nod+ Fix+
+
Hup (EEUU)
UPM791.5
Ruiz-Argüeso
et
al.
(1978)
128C53.5; Derivada de la cepa UPM791 Leyva et al. (1987)
curada del plásmido simbiótico
(pUPM791c)
UPM791.1
128C53.1; Derivada de la cepa UPM791 Leyva et al. (1987)
curada del plásmido pUPM791d
UPM791.0
128C53.0; Derivada de la cepa UPM791 Leyva et al. (1987)
curada del plásmido simbiótico
(pUPM791c) y del plásmido pUPM791d
3841
Mutante Strr espontaneo de la cepa 300
Johnston
y
Beringer
(1975)
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Tabla 2. Cepas bacterianas (continuación)
Bacterias
Características relevantes
Fuente o referencia
Agrobacterium tumefaciens
NTL4 (pZLR4)
Curada del plásmido pTiC58 / traG :: Cha et al. (1998)
lacZ, traR; Gmr
Escherichia coli
DH5a
RecA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17
-
+
(rk mk ) supE44 relA1
argF) U169
S17.1
HB101 (pRK2013)
Hanahan (1983)
(lacZYA-
80dlac(lacZ) M15
294::[RP4-2 (Tc::Mu) (Km::Tn7)]
pro res DrecA, Tpr, mod+, pir+ ;
Spcr
De Lorenzo y Timmis
(1994)
Cepa para movilización de plásmidos Ditta et al. (1980)
no transmisibles; Kmr
Tabla 3. Plásmidos
Plásmidos
Características relevantes
Fuente o referencia
pME6000
Vector de clonación de amplio rango
de hospedadores; Tcr
Maurhofer
(1998)
et
al.
pME6863
pME6000 portador del gen aiiA de la
cepa Bacillus sp. A24; Tcr
Reimmann
(2002)
et
al.
7
3.2 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE ACIL HOMOSERIN LACTONAS
3.2.1
EXTRACCIÓN DE ACIL HOMOSERIN LACTONAS
Los cultivos se crecieron en medio TY durante 48 horas hasta alcanzar una
densidad óptica (DO600) de aproximadamente 0,8 – 0,9 (momento en que se alcanza una
fase estacionaria temprana para una máxima expresión de autoinductores y una mínima
producción de derivados celulares). Las células fueron separadas por centrifugación y
las AHLs fueron extraídas del sobrenadante del cultivo mediante acetato de etilo con un
volumen equivalente [1:1], se separó posteriormente la fase orgánica de la acuosa y se
eliminaron los restos de agua por adición de sulfato de magnesio anhidro. El extracto de
AHLs se conservó a – 40 ºC.
3.2.2
SEPARACIÓN
DE
ACIL
HOMOSERIN
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
LACTONAS
POR
Las AHLs fueron analizadas por cromatografía en capa fina (TLC) utilizando
como organismo indicador Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4).
Se tomaron 2 ó 2,5 mililitros equivalentes de cultivo (un ml equivalente contiene
la cantidad de AHLs correspondientes a un ml de cultivo) y se secaron con un flujo de
nitrógeno. El extracto se aplicó sobre una placa de C18 – Silica Gel (UNIPLATE RPS
Reversed Phase Hydrocarbon Impregnated Silica Gel; Analtech) y se secó en corriente
de aire. Las AHLs fueron separadas por capilaridad (utilizando metanol y agua [60:40]
como fase móvil) hasta que el frente alcanzó la parte superior de la placa. La placa se
sacó del tanque de cromatografía y se secó al aire. Se cubrió con una capa de agar
mínimo AB con X-Gal e inoculado con Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) tal
como describen Cha et al. (1998). Después de toda la noche de incubación a 28 ºC las
AHLs se detectaron como manchas azules sobre el fondo blanco.
3.3 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL DE PROTEÍNAS
3.3.1 PREPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS
Las células de Rhizobium se lavaron 4 veces en tampón de lavado LSB (KH2PO4
1,5 mM, NaH2PO4 9,0 mM, KCl 3,0 mM y NaCl 68 mM) y se resuspendieron en 50 ml
de tampón de almacenamiento SB (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, MgCl2 1,5 mM, KCl 10
mM, DTE 0,5 mM, APMSF 100 mM, SDS 0,1%) por cada 50 ml de cultivo bacteriano
inicial y se congelaron a –20 ºC.
Las muestras se cuantificaron por el método del bicinconínico tal como
describen Smith et al. (1985). Mediante rectas de regresión se determinó el volumen de
muestra equivalente a 120 mg de proteína, cantidad utilizada para la electroforesis
bidimensional.
8
3.3.2
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Los volúmenes correspondientes a 120 mg de proteína se mezclaron con 350 ml de
solución de rehidratación (Urea 8 M, CHAPS 4%, DTE 65 mM, pH 3,5-10 2% v/v
(Merck), trazas de azul de bromofenol), se agitaron con un aparato Vortex (Heidolph,
Alemania) y se centrifugaron a 12.000 x g durante 2 min. Los sobrenadantes se
aplicaron a tiras ReadyStripTM IPG Strips (Bio-Rad) de pH 4-7 lineal en una cubeta de
rehidratación (Immobiline DryStrip Reswelling Tray, Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Suecia), dejándolas durante 16 horas a temperatura ambiente. La separación de
proteínas según su punto isoeléctrico se llevó a cabo en una cubeta Multiphor II
(Amersham Pharmacia Biotech). Tras la electroforesis en la primera dimensión se
equilibraron las tiras dos veces en 10 ml de tampón de equilibrado (Urea 6 M, Tris-HCl
50 mM pH 6,8, glicerol 30% v/v, SDS 2%) durante 15 min cada una, añadiendo en el
primer lavado DTE al 2% y en el segundo iodoacetamida al 2,5%. La separación de las
proteínas según su peso molecular se realizó en cubetas PROTEANâ II xi (Bio-Rad),
siguiendo esencialmente la técnica descrita por Lämmli (1970). Los geles de
poliacrilamida se prepararon al 11,5 %, utilizando diacrililpiperazina (PDA) en lugar de
N,N’-metilenbisacrilamida, y se desarrollaron a 6 °C a una intensidad constante de 40
mA por gel.
3.3.3 Tinción de plata
Para la tinción de plata de los geles bidimensionales de poliacrilamida se siguieron
los siguientes pasos: un lavado en agua ultrapura durante 5 min, seguido de un lavado
en etanol / ácido acético / agua ultrapura (40:10:50) durante 1 hora y etanol /ácido
acético / agua ultrapura (5:5:90) durante toda la noche. Después de haber lavado los
geles de poliacrilamida en agua ultrapura durante 5 min, se siguió con un lavado en una
solución de glutaraldehído al 1% y acetato de sodio 0,5 M durante 30 min, tres lavados
en agua ultrapura durante 10 min, dos lavados en una solución de ácido 2,7-naftalen
disulfónico al 0,05% de 30 min cada uno y 4 lavados en agua ultrapura durante 15 min.
A continuación se incubaron los geles en una solución de nitrato de plata (6 g de nitrato
de plata, 10 ml de amoniaco al 25% y 1,5 ml de NaOH 10 N en 750 ml de solución)
durante 30 min a temperatura ambiente. Por ultimo se realizaron 4 lavados en agua
ultrapura durante 4 min, y se revelaron los geles en una solución de ácido cítrico 0,01%
y formaldehído al 0,1% (v/v) durante 5 a 10 min. El revelado se paró incubando los
geles en una solución de Tris al 5% y ácido acético al 2% (v/v) durante 30 min.
3.4 ANÁLISIS DE GELES BIDIMENSIONALES
Los geles 2D teñidos con plata se digitalizaron mediante un escáner Astra 4000U
(UMAX Systems, Willich, Alemania). Las imágenes obtenidas se analizaron mediante
el programa MELANIE 3.0 (Genbio, Suiza) utilizando el % volumen como parámetro
de cuantificación de las manchas, que valora tanto el tamaño (en mm2) como la
densidad óptica (grado de oscuridad) de las manchas.
9
4. RESULTADOS
4.1 TRANSFERENCIA DEL PLÁSMIDO pME6863 A LAS CEPAS DE
Rhizobium leguminosarum bv. viciae
Con objeto de identificar proteínas reguladas por autoinducción en Rhizobium
leguminosarum bv. viciae se llevó a cabo la transferencia a las distintas cepas objeto de
estudio del plásmido pME6863, que expresa constitutivamente el gen aiiA de Bacillus
sp. A24 (Dong et al., 2000). El gen aiiA codifica para una lactonasa con capacidad de
destruir el anillo lactónico de las acil homoserin lactonas (AHLs). De esta forma se
mantendrían bajos niveles de dichas moléculas, asegurando la supresión de cualquier
tipo de regulación por autoinducción.
Dado que el gen aiiA se introducía inserto en un plásmido, se construyeron de
forma análoga una serie cepas control portadoras del plásmido control pME6000, el
mismo plásmido que el pME6863 pero carente del gen aiiA que codifica para la
lactonasa. Estas cepas control se utilizarían para descartar posibles efectos debidos a la
presencia del plásmido, independientes de la producción de lactonasa.
4.2 EFECTOS DEL PLÁSMIDO pME6863 SOBRE LOS NIVELES DE ACIL
HOMOSERIN LACTONAS EN CEPAS DE Rhizobium leguminosarum bv.
viciae
Las cinco cepas de Rhizobium leguminosarum bv. viciae con las que se trabajó
presentan un perfil plasmídico diferente. Las dos cepas silvestres, 3841 y UPM791,
poseen seis y cuatro plásmidos, respectivamente. Las cepas UPM791.5, UPM791.1 y
UPM791.0 son derivados de la cepa UPM791 por curación de plásmidos, y poseen tres,
tres y dos plásmidos, respectivamente. La Figura 2.A muestra el perfil plasmídico de
dichas cepas.
El patrón de producción de AHLs en la cepa UPM791 se altera por curación de
los plásmidos pUPM791c y pUPM791d en las cepas UPM791.5 y UPM791.0, y
UPM791.1 y UPM791.0, respectivamente. Estos patrones se muestran en la Figura 2.B,
en la que se muestra la separación por cromatografía en capa fina y posterior revelado
de las AHLs. Rhizobium leguminosarum bv. viciae UPM791 produce tres AHLs
mayoritarias, que comigran con patrones sintéticos de AHLs con cadenas aciladas de 6,
8 y 14 átomos de carbono (C6, C8, y C14; Fig. 2.B, carril 1). En la otra cepa silvestre,
R. leguminosarum bv. viciae 3841, se observó el mismo patrón de producción de
autoinductores, aunque los niveles de AHLs resultaron ser bastante inferiores que en la
cepa UPM791 (Fig. 2.B, carriles 10 y 1, respectivamente).
La cepa UPM791.5, curada del plásmido simbiótico (pUPM791c) presentaba
una variación importante en el patrón de producción de AHLs (Fig. 2.B, carril 3). Se
mantuvieron los niveles de AHL C14, disminuyeron de manera importante los de AHL
C6 y desapareció por completo la AHL C8. Esto indica que la producción de las AHLs
C6 y C8 está regulada o determinada por genes presentes en el plásmido simbiótico.
10
En la cepa UPM791.1, curada del plásmido más pequeño (pUPM791d) de nuevo
apareció una variación importante en el patrón de AHLs (Fig. 2.B, carril 6). Se
mantuvieron los niveles de AHLs C6 y C8, pero desapareció por completo la AHL
C14. Esto indica que la producción de la AHL C14 está regulada o determinada por
genes presentes en el plásmido pUPM791d.
La pérdida de los dos plásmidos (pUPM791c y pUPM791d) en la cepa
UPM791.0 resultó en un patrón de AHLs equivalente a la suma de los patrones de las
dos cepas anteriores (Fig. 2.B, carril 8). Los niveles de AHL C8 disminuyeron
apreciablemente, mientras que las AHLs C6 y C14 desaparecieron.
La Figura 2.B (carriles 2, 4, 7, 9 y 11) muestra también el efecto de la
introducción y expresión del gen de la lactonasa en las distintas cepas. Se observó una
clara disminución en la producción de AHLs en todas las cepas en presencia del
plásmido pME6863, especialmente en la cepa 3841 (Fig. 2.B, carril 11) en la que
desaparecieron por completo (Fig. 2.B, carril 10). También se observó la aparición de
una nueva AHL, con movilidad similar a la de la AHL C8, en las cepas que contenían el
plásmido pME6863 (Fig. 2.B, carriles 2, 4, 7, 9). Esta nueva AHL, que aparentemente
es resistente a la lactonasa codificada en el plásmido pME6863, también se pudo
detectar en sobrenadantes de cepas conteniendo el plásmido parental, pME6000 (Fig.
2.B, carril 5). Esto hace pensar que esta nueva AHL, que migra como una AHL C8,
podría venir codificada por el vector pME6000. La naturaleza de esta AHL es
desconocida.
4.3 ANALISIS PROTEÓMICO
Con el fin de estudiar a nivel proteómico el efecto de la presencia o no de AHLs
en las distintas cepas de Rhizobium leguminosarum bv. viciae, se separaron mediante
geles bidimensionales las proteínas de extractos de cuatro de la cepas portadoras del
plásmido pME6863 (aiiA) y de las cuatro cepas control correspondientes, portadoras del
plásmido pME6000. Este análisis también permitiría comparar los proteomas de las dos
cepas silvestres UPM791 y 3841, de especial interés a causa de la inminente
finalización de la secuenciación del genoma de la cepa 3841, así como cuantificar el
efecto de la curación de los plásmidos pUPM791c o pUPM791d sobre el proteoma de la
cepa UPM791.
4.3.1 Cepas silvestres Rhizobium leguminosarum bv. viciae UPM791 y 3841
En primer lugar se trató de caracterizar el proteoma de las dos cepas silvestres,
UPM791 y 3841, para ello se compararon geles bidimensionales de proteínas de ambas
cepas (Fig. 3).
Las grandes diferencias existentes en el proteoma “normal” de ambas cepas son
distinguibles a simple vista. En un análisis más exhaustivo se trató de buscar la máxima
similitud emparejando las manchas que por su posición en el gel e incluso por su forma
pudieran corresponder a la misma proteína. En ambos geles se consideraron ca. 500
11
manchas mayoritarias, y se pudieron establecer 196 parejas, lo que supone únicamente
un 40 % del total de manchas. El 60 % restante corresponde a proteínas cuya migración
es lo suficientemente diferente como para no permitir su emparejamiento.
Se realizó además un análisis cuantitativo con el fin de detectar posibles cambios
globales en los niveles de expresión entre manchas idénticas en los distintos geles. El
resultado del análisis se expresa en forma de gráfica cartesiana (Fig. 4) en la que cada
pareja se representa como un punto correspondiente a la intersección de las intensidades
(% volumen) en cada uno de los dos geles representadas en ambos ejes. En este tipo de
representación, en el caso ideal de dos geles completamente idénticos, los puntos de la
gráfica se dispondrían a lo largo de una recta con un ángulo de 45º en función de sus
abundancias relativas. Una dispersión de puntos distinta de la ideal puede estar causada
por variaciones experimentales, por cambios globales en los niveles de expresión o por
ambas cosas. En general, los cambios producidos por variaciones experimentales
deberían producir una dispersión pequeña, mientras que cambios globales en el patrón
de expresión del proteoma deberían producir una dispersión mayor.
En la gráfica resultante de comparar ambas cepas silvestres (Fig. 4) se indica
además el grado de dispersión de los puntos mediante una elipse con origen en la
coordenada cero que engloba al 95 % de las proteínas. Esto permite estimar visualmente
la dispersión relativa, y por tanto el efecto global de los diferentes tratamientos (curado
de plásmidos, lactonasa) sobre el proteoma. También se indican gráficamente los límites
de variación de % volumen inferiores y superiores a 2x en los geles comparados. Este es
el límite que se ha escogido arbitrariamente para considerar como significativos los
cambios en la expresión de proteínas en los geles que se comparan. La Figura 4 y su
comparación con el resto de gráficas de dispersión pone de manifiesto que las proteínas
comunes a ambas cepas silvestres no sólo son escasas (196), sino que los cambios
globales en su abundancia son más importantes que en ninguno de los otros casos, no
sólo por el tamaño relativo de la elipse de dispersión, sino por el número de proteínas
mayoritarias (% volumen no inferior a 0,1) cuya abundancia supera la barrera 2x en uno
de los geles: 18 (9%) para la cepa UPM791, y 20 (10%) para la cepa 3841.
4.3.2
Efectos de la curación de los plásmidos pUPM791c y pUPM791d de la cepa
UPM791
De forma análoga se procedió al análisis del proteoma de las cepas UPM791.5 y
UPM791.1, derivadas de la cepa silvestre UPM791 curadas de los plásmidos
pUPM791c y pUPM791d, respectivamente. Para ello se corrieron geles bidimensionales
de las proteínas de las distintas cepas y posteriormente fueron comparados con los de la
cepa silvestre UPM791 en busca de posibles diferencias tanto cualitativas como
cuantitativas, debidas a estas variaciones en el perfil plasmídico.
12
4.3.2.1 UPM791 vs. UPM791.5
La cepa UPM791.5 carece del plásmido simbiótico (pUPM791c). En este
plásmido se encuentran la mayoría de los genes implicados en la simbiosis con la
leguminosa huésped, tales como los genes nod, nif, y fix. Las proteínas se separaron en
geles bidimensionales de esta cepa, y se comparó con la cepa silvestre UPM791. En el
análisis se tuvieron en cuenta ca. 590 manchas mayoritarias en cada uno de los geles. Se
pudieron establecer 578 parejas, lo que supone una similitud muy alta entre los geles de
ambas cepas. Esto indica que las diferencias en el proteoma “normal” resultantes de la
curación del plásmido simbiótico son poco importantes. Estas diferencias se reducen a
la desaparición de 4 manchas y a la aparición de 13 nuevas manchas en la cepa
UPM791.5. El análisis gráfico de los niveles de abundancia relativa de las proteínas
comunes puso de manifiesto que la elipse de dispersión que incluye al 95% de las
proteínas comunes es una de las más pequeña de entre todas las comparaciones
realizadas en este Trabajo. En cuanto a las proteínas mayoritarias (% volumen no
inferior a 0,1) cuya variación supera la barrera de 2x en uno de los geles, fueron 14
(2,4%) en la cepa UPM791, y 17 (2,9%) en la cepa UPM791.5.
4.3.2.2 UPM791 vs. UPM791.1
En segundo lugar se analizó la cepa UPM791.1, curada del plásmido más
pequeño (pUPM791d). La comparación del patrón bidimensional de proteínas de esta
cepa con el de la cepa silvestre UPM791 permitió establecer la existencia de ca. 420
manchas mayoritarias en cada uno de los geles, de las que 412 estaban presentes en
ambos geles, lo que indica que la curación del plásmido pUPM791d no resulta en
diferencias globales en el proteoma. Estas diferencias se resumen en la desaparición de
14 manchas y en la aparición de 6 manchas nuevas en la cepa UPM791.1. Asimismo, el
análisis gráfico de la dispersión de las abundancias relativas de las manchas comunes
sugiere que la curación del plásmido pUPM791d tiene efectos mucho más drásticos
sobre el proteoma que la pérdida del plásmido simbiótico pUPM791c. De acuerdo con
ello, el número de proteínas mayoritarias (% volumen no inferior a 0,1) cuya
abundancia supera la barrera 2x en uno de los geles fue de 22 (5,3%) para la cepa
UPM791, y de 23 (5,6%) para la cepa UPM791.1.
4.3.3
Efectos de la introducción del plásmido pME6863 (aiiA) en las distintas
cepas de Rhizobium leguminosarum bv. viciae
Finalmente se separaron en geles bidimensionales las proteínas de todas las
cepas de Rhizobium leguminosarum bv. viciae a las que se había transferido el plásmido
pME6863 (aiiA) que codifica para la lactonasa.
En los análisis realizados mediante cromatografía de capa fina para observar los
efectos del plásmido pME6863 sobre los niveles de AHLs se observó que efectivamente
la producción de éstas disminuía notablemente (véanse apartado 4.2 y Fig. 2.B). Esto
podría suponer una alteración en procesos regulados por autoinducción, lo cual debería
traducirse en diferencias en el proteoma de las cepas portadoras del plásmido pME6863.
13
Los geles bidimensionales de las proteínas de las distintas cepas de Rhizobium
leguminosarum bv. viciae portadoras del plásmido pME6863 se compararon con los de
cepas control portadoras del vector pME6000. La Tabla 4 muestra para cada
comparación el número promedio de proteínas en cada uno de los geles, el número de
proteínas presentes en ambos geles, el número de proteínas que aparece y desaparece
como resultado de la presencia del plásmido pME6863, y el número y porcentaje de
proteínas mayoritarias (% volumen no inferior a 0,1) cuya abundancia supera la barrera
2x en uno de los geles. Se realizaron análisis comparativos de las abundancias relativas
de las proteínas presentes tanto en la cepa conteniendo el plásmido pME6863 como en
la control. Los mayores efectos globales de la presencia del plásmido pME6863 sobre el
proteoma se presentaron en las dos cepas silvestres, R. leguminosarum 3841 y UPM791.
Este efecto fue progresivamente menor para las cepas UPM791.1 y UPM791.5,
respectivamente. No obstante, si consideramos aquellas proteínas comunes a los geles
de extractos de las cepas con y sin el plásmido pME6863, que muestran cambios en %
volumen superiores a 2x en uno u otro gel, los mayores efectos se apreciaron en la cepa
UPM791.1 (8,2% de las proteínas), seguida por UPM791 (6%), 3841 (5,1%), y por
último UPM791.5, con sólo un 1, 6% (Tabla 4).
Tabla 4. Efectos de la expresión del gen aiiA sobre el proteoma de las cepas de R.
leguminosarum bv. viviae.
Cepas
UPM791
(silvestre)
Proteínas
Nº
Aparecen Desaparecen Aumentanb Disminuyenb
analizadas Parejas
515
482
6
10
14 (2.9)
15 (3.1)
UPM791.5
(pUP791c)
848
834
7
13
4 (0.5)
9 (1.1)
UPM791.1
(pUP791d)
480
464
14
1
25 (5.4)
13 (2.8)
538
527
11
6
12 (2.3)
15 (2.8)
3841
(silvestre)
a
Valores calculados como la media del número de proteínas en los dos geles
comparados
b
Número (porcentaje)
La Figura 5 presenta un detalle de los geles anteriores, donde se pone de
manifiesto la presencia de una proteína mayoritaria que se vió afectada tanto por la
curación de plásmidos como por la interrupción de los sistemas de autoinducción. Esta
proteína estaba presente en la cepa silvestre R. leguminosarum bv. viciae UPM791 y en
14
la cepa curada R. leguminosarum bv. viciae UPM791.1 (pUPM791d-), ambas
portadoras del plásmido simbiótico, y desaparecía en la cepa R. leguminosarum bv.
viciae UPM791.5, que carece de él, lo que podría indicar que es una proteína regulada
por genes de dicho plásmido. Esta proteína también desapareció completamente en estas
dos primeras cepas cuando se introdujo el gen aiiA y se vieron interrumpidos los
sistemas de autoinducción, lo que sugiere que su síntesis está regulada por sistemas de
autoinducción. La cepa R. leguminosarum bv. viciae 3841 no presentaba dicha proteína
en ningún caso.
5. DISCUSIÓN
5.1 PRODUCCIÓN DE ACIL HOMOSERIN LACTONAS Y EFECTOS DEL
PLÁSMIDO pME6863 SOBRE SUS NIVELES EN CEPAS DE Rhizobium
leguminosarum bv. viciae
La cepa R. leguminosarum bv. viciae 3841 presenta esencialmente el mismo patrón
de producción de AHLs que UPM791, pero en una menor cantidad. Debido a esto se
podría esperar que ambas presenten los mismos circuitos de autoinducción.
En las cepas derivadas de R. leguminosarum bv. viciae UPM791 por curación de
plásmidos se observan claros efectos en el patrón de producción de AHLs a causa de
esta curación.
El patrón que presentan R. leguminosarum bv. viciae UPM791.5 y UPM791.0
parece indicar la existencia de los genes rhiI y traI en el plásmido simbiótico, ya que su
curación tiene un efecto drástico sobre las AHLs que comigran con patrones sintéticos
de AHLs de cadenas aciladas de 6 y 8 átomos de carbono. En trabajos previos
realizados en el laboratorio se ha encontrado rhiI, pero aún no se ha podido demostrar la
existencia del gen traI. Al comparar estos resultados con ensayos de producción de
AHLs en TLC realizados en otros laboratorios (Lithgow et al., 2001) se puede observar
una migración equivalente a la nuestra, que correspondería a esas AHLs con cadenas
aciladas de 6 y 8 átomos de carbono, tanto en el caso de la cepa R. leguminosarum bv.
viciae 300, de la cual deriva 3841, como en el caso de R. leguminosarum bv. viciae A34. En esta última, además, se observa una disminución en la producción de todas las
AHLs cuando se le cura del plásmido simbiótico (pRL1JI). En estos ensayos aparece
también una AHL correspondiente a una C7, la cual no es detectada en nuestro caso
posiblemente a causa de la utilización de distintos sistemas para su detección,
Chromobacterium violaceum en su caso y Agrobacterium tumefaciens en el nuestro.
Además se ha demostrado (L. Cantero, datos no publicados) que rhiI y cinI son
esencialmente idénticos en R. leguminosarum bv. viciae UPM791 y en la cepa A-34,
luego las AHLs que producen deben serlo también. En R. leguminosarum bv. viciae
UPM791 se ha demostrado (L. Cantero, datos no publicados) que no existe raiI donde
se supone que tendría que estar a nivel genético, como tampoco en la cepa 3841, lo que
hace pensar que ambas carezcan del sistema de autoinducción regulado por los genes
rai.
15
En el patrón de producción de AHLs de R. leguminosarum bv. viciae UPM791.5 y
UPM791.0 sigue apareciendo una AHL correspondiente a una C8, luego debe existir
otro sistema de autoinducción distinto de traI y rhiI localizado fuera del plásmido
simbiótico posiblemente en alguno de los otros plásmidos.
La AHL de migración equivalente a una C14 podría corresponder a la bacteriocina
small, ya que presenta el mismo tamaño, y además, el gen cinI que determina su
producción, ha sido encontrado en el cromosoma (L. Cantero, datos no publicados).
La curación del plásmido pequeño tuvo un efecto drástico sobre todas las AHLs:
desaparece la AHL correspondiente a C14, y aumentan las C6 y C8 del plásmido
simbiótico. Pero los genes cin responsables de la producción de la AHL C14 están en el
cromosoma (L. Cantero, datos no publicados), luego debe existir algún tipo de
regulador de los niveles de dicha AHL en el plásmido pequeño (pUPM791d). Es
probable que se trate un sistema de autoinducción que interaccione (Cross-talk,
regulación cruzada) con el sistema cin de autoinducción. No parece que este sistema
esté relacionado con la AHL correspondiente a una C8 que queda al curar el plámido
simbiótico porque ésta sigue apareciendo en R. leguminosarum bv. viciae UPM791.0.
Los efectos de la introducción del gen aiiA que codifica una lactonasa resultaron ser
drásticos. La lactonasa AiiA se expresa y es funcional en R. leguminosarum bv. viciae,
y las AHLs de dicha cepa son sensibles a la acción de la lactonasa. Los niveles de AHLs
bajan mucho, especialmente en la cepa 3841 en la que desaparecen, seguramente porque
los niveles iniciales eran mucho más bajos. La utilización del plásmido pME6863 con el
gen aiiA ha sido necesaria porque los intentos previos para hacer disminuir los niveles
basales de AHLs mediante cambios en las condiciones de cultivo no habían tenido
éxito, las diferencias entre condicciones de inducción y de no inducción de AHL no
eran claras.
Al introducir el plásmido pME6863 (aiiA) también nos encontramos con algo
extraño en el caso de R. leguminosarum bv. viciae UPM791 y las cepas que derivan de
ella, pero no en R. leguminosarum bv. viciae 3841, tiene lugar la aparición de una nueva
AHL. Ésta no es específica de AiiA porque también aparece cuando introducimos el
plásmido control pME6000. Se podría pensar que está codificada por el propio
plásmido, pero es poco probable, ya que se conoce la secuencia y no hay nada que se
parezca a un sistema de autoinducción del tipo LuxI/LuxR. La otra posibilidad es que
sea una AHL de R. leguminosarum bv. viciae UPM791 que se induce por la presencia
del plásmido, pero esto es también difícilmente explicable. Además, parece que la
nueva AHL es parcialmente resistente a la lactonasa. Por ello sería interesante
identificarla y caracterizar su origen y regulación.
La introducción del gen aiiA ha permitido conseguir la reducción de los niveles
basales de AHLs, y por tanto, abre la posibilidad de comparar los proteomas con y sin
AHLs, de cara a estimar:
1.
La contribución global cualitativa y cuantitativa de los sistemas de
autoinducción al proteoma de R. leguminosarum (objeto de este Trabajo)
16
2.
La identificación de las proteínas pertenecientes a, o reguladas por,
dichos sistemas de autoinducción (objeto de trabajos posteriores del
laboratorio basados en este Trabajo)
5.2 ANÁLISIS PROTEÓMICO DE Rhizobium leguminosarum bv. viciae
Para la separación de proteínas en geles bidimensionales se ha utilizado la
metodología clásica. No se pretendía hacer un esfuerzo para visualizar el mayor número
de proteínas sino para obtener patrones fácilmente identificables y reproducibles. Así, se
han usado geles bidimensionales de 20 cm x 20 cm en lugar de otros de mayor tamaño,
y pI de 4 - 7 en lugar de otras estrategias, como separar la muestra en dos geles, uno
ácido y otro básico. Además, para el análisis de imagen, y también de cara a obtener la
máxima reproducibilidad, se han escogido sólo aquellas proteínas cuya aportación al
proteoma total supera un umbral determinado (> 0,1 % volumen). Por ello, en la mayor
parte de comparaciones se manejaron unas 500 proteínas (oscilando entre ca. 400 y ca.
800).
Los geles se analizaron mediante el programa Melanie 3.0, desarrollado en la
Unidad de Proteómica de la Universidad de Ginebra, por el grupo del Dr. Hochstrasser
(Appel et al., 1997). Este software facilita enormemente el análisis de las imágenes
generadas por la tinción de plata porque permite corregir las distorsiones debidas a
diferencias experimentales en los geles, las muestras o las carreras, la asignación
semiáutomática de equivalencias entre los geles comparados, y la generación de geles
virtuales fruto de la superposición de varios geles reales.
En nuestras condiciones experimentales aparecen sobre todo problemas con las
proteínas básicas, ya que no se resuelven bien. Esto hace posible que hayamos perdido
proteínas que se sitúen en dicha zona. También hemos perdido todas las proteínas de
membrana, porque no se ha seguido ninguna metodología específica para solubilizarlas.
Debido a esto, las estimaciones que se pueden hacer sobre número y cantidad de
proteínas modificadas por diferentes tratamientos objeto de estudio, serán siempre
estimaciones muy conservadoras.
La cepa R. leguminosarum bv. viciae UPM791 es la cepa de referencia en nuestro
laboratorio, y los trabajos realizados en él durante los últimos 20 años se han hecho con
dicha cepa, sobre la cual se tiene un amplio conocimiento fisiológico y genético. La
cepa R. leguminosarum bv. viciae 3841 ha sido elegida por el Sanger Centre (Hinxton,
Cambridge, U.K.) para su secuenciación genómica. Esto implica que, para cualquier
futuro estudio proteómico, debería escogerse la cepa 3841. La próxima disponibilidad
de la secuencia de todos los genes de este organismo permite aplicar técnicas
proteómicas avanzadas, como son la espectrometría de masas MALDI-TOF y la
secuenciación de extremos de péptidos para determinar la identidad de las proteínas de
interés detectadas en los geles. En ausencia de dicha secuencia, como es el caso de la
cepa UPM791, la identificación se hace difícil y en muchos casos imposible. En la
comparación de las dos cepas se aprecian diferencias notables pese a pertenecer a la
misma especie. Esto es aún más sorprendente si se tiene en cuenta que las
17
comparaciones se han realizado con extractos de cultivos crecidos en laboratorio en
condiciones “normales”, donde se espera que las proteínas mayoritariamente expresadas
sean aquellas que constituyen el complemento “normal” que define a la especie
Rhizobium leguminosarum bv. viciae, a la que pertenecen ambas cepas. No obstante,
existen diferencias importantes en cuanto a la dotación plasmídica de ambas cepas, por
un lado, la cepa UPM791 porta cuatro plásmidos, mientras que la cepa 3841 porta seis.
El más característico de entre ellos, el plásmido simbiótico, presenta diferencias en
tamaño y en composición de genes entre ambas bacterias (datos no publicados de
nuestro laboratorio). Puesto que los plásmidos pueden representar ca. 40 – 50 % del
genoma, no es de extrañar que los resultados del análisis de los proteomas, obtenidos en
este Trabajo, demuestren también diferencias importantes entre ambas cepas. Los
resultados del trabajo realizado con la cepa 3841 permiten establecer un “mapa” tipo del
proteoma de esta cepa para futuros estudios proteómicos.
Idealmente, este Trabajo se debería haber realizado con cepas curadas en cada uno
de los plásmidos de R. leguminosarum bv. viciae UPM791. No obstante, en el
laboratorio sólo se disponía de cepas curadas en los plásmidos pUPM791c (plásmido
simbiótico) y pUPM791d (plásmido al que no se le ha asignado ninguna función). El
plásmido simbiótico pose un tamaño de ca. 282 kb, lo que implicaría una capacidad de
codificación de ca. 280 genes, representando el 3,7 % de la capacidad codificante de la
bacteria (suponiendo un tamaño del genoma de 7,7 Mb, calculado para la cepa 3841). El
plásmido pUPM791d, el menor de los que porta la cepa UPM791, tiene un tamaño de
ca. 190 kb, lo que podría implicar unos 190 genes. Es evidente que una gran parte de los
genes que constituyen el genoma de las cepas objeto de estudio no tendría por qué
expresarse en las condiciones de cultivo que hemos usado en el laboratorio: genes
relacionados con la asimilación y metabolismo de sustratos alternativos, genes
relacionados con la vida en el suelo, la rizosfera y la simbiosis. Un gran número de los
genes implicados en la simbiosis se localiza en el plásmido simbiótico, y estos genes
normalmente no deberían expresarse en cultivo. Por ello no es sorprendente que las
diferencias en el proteoma de vida libre de las cepas UPM791 y UPM791.5
(pUPM791c-) sean mínimas, desapareciendo cuatro proteínas y apareciendo trece
nuevas. En cambio, en el caso de la cepa UPM791.1 (pUPM791d-) se observan mayores
diferencias, desapareciendo catorce proteínas y apareciendo seis nuevas. Estas
diferencias resultan aún mayores si tenemos en cuenta el menor tamaño del plásmido
pUPM791d. Considerando el total del proteoma, la curación de los plásmidos
pUPM791c y pUPM791d, afecta a ca. un 6% y a ca. un 11% de las proteínas,
respectivamente (véanse Resultados, apartados 4.3.2.1 y 4.3.2.2).
El efecto de la expresión de la lactonasa, AiiA, se ha estudiado tanto en las dos
cepas silvestres, UPM791 y 3841, como en las derivadas curadas de plásmidos de la
cepa UPM791 (UPM791.5 y UPM791.1). La eliminación de las AHLs tuvo su efecto
más importante en las cepas silvestres UPM791 y 3841, en las que desaparecieron diez
y seis proteínas, respectivamente, mientras que aparecieron seis y once,
respectivamente. Estas cifras permiten acotar por primera vez un número mínimo de
proteínas (y por tanto genes) reguladas por AHLs en R. leguminosarum bv. viciae, es
decir, la importancia del regulón de autoinducción en esta especie (Tabla 4). Esta cifra
(16 para la cepa UPM791, y 17 para la cepa 3841) representa una fracción modesta (3,1
18
% en ambos casos) de las proteínas expresadas en condiciones normales de cultivo en
las cepas UPM791 y 3841. Es posible que algunos de los sistemas de autoinducción no
se expresen en las condiciones que hemos escogido (medio TY, aeróbico, 28 ºC), que
algunas de las proteínas reguladas sean minoritarias, o que sean de membrana, o que
tengan un pI superior o inferior a los analizados. Por ello la cifra apuntada más arriba
debe considerarse como una estimación mínima. Además, los resultados del estudio de
los niveles de AHLs en las distintas cepas (Fig. 2.B) demuestran que la presencia o
ausencia del plásmido pUPM791d tiene un efecto importante sobre los sistemas de
autoinducción, por lo que es posible que algunos sistemas regulados por autoindución
no se expresen en ausencia de dicho plásmido. Los resultados de las comparaciones de
cada cepa sugieren que esto podría en efecto ser así, ya que, a pesar de que los mayores
efectos proteómicos de la lactonasa AiiA se encontraron en las cepas silvestres, no todas
las proteínas que se vieron afectadas por su presencia en la cepa UPM791.1
(pUPM791d) tenían contrapartida en la cepa silvestre UPM791. Es interesante señalar
que los menores efectos de la presencia de la lactonasa AiiA sobre el proteoma se
dieron en la cepa UPM791.5 (pUPM791c-). Esto puede estar relacionado con el hecho
que dos de los sistemas de autoinducción (rhiI/rhiR y traI/traR) se localizan en el
plásmido simbiótico, lo que permite suponer que los genes diana de dichos sistemas se
encuentran en dicho plásmido. Esto ha sido demostrado en otra cepa de R.
leguminosarum bv. viciae (Rodelas et al., 1999; Wisniewsky – Dyé y Downie, 2002) y,
al menos para el sistema rhiI/rhiR (L. Cantero, datos no publicados) en la cepa
UPM791.
Una de las proteínas que aparece por efecto de la presencia de la AiiA es la propia
lactonasa. Pese a que no se han llevado a cabo experimentos para demostrar
inequívocamente su identidad, prácticamente se podría asegurar que se trata de ella, ya
que aparece únicamente en los geles de todas las cepas que portan el gen aiiA, y su Mr y
pI son compatibles con los estimados a partir de la secuencia de aminoácidos.
El estudio proteómico llevado a cabo ha permitido definir las bases para etapas
posteriores del trabajo de caracterización del regulón de autoinducción en R.
leguminosarum bv. viciae. Por ejemplo, gracias a los mapas proteómicos y a las
comparaciones elaboradas en este Trabajo debería ser relativamente inmediato pasar a
la caracterización de las proteínas cuya expresión se ve drásticamente alterada en
ausencia de AHLs. Esto, unido a la próxima disponibilidad de la secuencia genómica de
la cepa 3841, debería asegurar la correcta identificación de la identidad de dichas
proteínas por análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF. Una de las proteínas
cuya identificación es más interesante es la que aparece detallada en la Figura 5. Dicha
proteína desaparece al curar el plásmido simbiótico de la cepa R. leguminosarum bv.
viciae UPM 791, y también al interrumpir sus sistemas de autoinducción, por lo que
podría ser una proteína codificada por el plásmido simbiótico y regulada por
autoinducción; además es una de las proteínas mayoritarias en los extractos. Por sus
características de Mr y pI podría corresponder a RhiA, aunque está ausente en los
extractos de la cepa R. leguminosarum bv. viciae 3841, cuya proteína RhiA tiene Mr y
pI teóricos muy similares.
19
Podría ser interesante correr geles de las mismas cepas en condiciones de inducción
en rizosfera para ver la influencia real de los plásmidos en el proceso de simbiosis.
También puede ser interesante conseguir buenos geles de la cepa R. leguminosarum bv.
viciae UPM791.0, curada del plásmido simbiótico (pUPM791c-) y del mas pequeño
(pUPM791d-) para ver si los efectos de la curación son la suma de los efectos de las
cepas curadas en sólo uno de ellos.
Entre las estrategias futuras para mejorar los mapas proteómicos determinados en
este Trabajo, se pueden citar: la utilización de geles de mayor tamaño, mejorar la
resolución de las zonas básicas mediante tratamiento específico, analizar las proteínas
de membrana, acumular más geles para que los geles “promedio” tengan más fiabilidad,
y pasar a la versión 4.0 de Melanie, que tiene algoritmos matemáticos más
evolucionados para el cálculo de las manchas.
6. CONCLUSIONES
1. Existen grandes diferencias a nivel proteómico entre las cepas silvestres R.
leguminosarum bv. viciae UPM791 y 3841, pese a pertenecer a la misma especie y
haberse cultivado en condiciones “normales”, donde se espera una expresión
mayoritaria de las proteínas que constituyen el complemento “normal” de la especie.
2. La curación de plásmidos de la cepa R. leguminosarum bv. viciae UPM791 presenta
un efecto a nivel proteómico. Este efecto es más significativo en el caso de la
curación del plásmido pUPM791d que en el de la curación del plásmido simbiótico
(pUPM791c). La mayoría de genes asignados al plásmido simbiótico parecen estar
directamente relacionados con los procesos de simbiosis; las condiciones de cultivo
utilizadas han sido condiciones “normales” de laboratorio y no de inducción en
rizosfera. El plásmido simbiótico podría no estar expresándose de forma
significativa en dichas condiciones.
3. El gen aiiA de Bacillus sp. que codifica una acil homoserin lactonasa, se expresa y
es funcional en R. leguminosarum bv. viciae. Esta expresión funcional resulta en
una disminución drástica de los niveles de AHLs presentes en cultivo.
4. La interrupción de los sistemas de autoinducción como resultado de la expresión del
gen aiiA tiene efectos a nivel proteómico. Globalmente, los efectos mas importantes
se dan en las cepas silvestres R. leguminosarum bv. viciae UPM791 y 3841 tanto
por el número total de proteínas que aparecen y desaparecen como por aquellas cuya
expresión se ve aumentada o disminuida. En las cepas curadas, R. leguminosarum
bv. viciae UPM791.5 (pUPM791c-) y UPM791.1 (pUPM791d-) la expresión del gen
aiiA tenía efectos cualitativa y cuantitativamente menores, lo que es compatible con
la presencia de sistemas de autoinducción en dichos plásmidos.
20
5. Se ha detectado la existencia de proteínas mayoritarias cuya síntesis se ve afectada
reproduciblemente por la curación de plásmidos o por la presencia o ausencia de
AHLs. Estas proteínas son candidatas para su identificación mediante técnicas de
espectrometría de masas por MALDI-TOF.
FIGURAS
Figura 1. A. Sistema LuxI/LuxR de autoinducción. Genes reguladores: luxR y luxI. La
proteína LuxI sintetiza el autoinductor (AHL). LuxR es una proteína reguladora de la
transcripción. Cuando se une al autoinductor activa la transcripción del operon
luxICDABE, que codifica para la luciferasa y permite por tanto la producción de luz.
B. Cascada de regulación por autoinducción en R. leguminosarum (A-34). 1. CinR
induce la expresión de cinI permitiendo la producción de 3-OH-C14:1-HLS, que al unirse
a CinR activa cinI por un sistema de retroalimentación positivo. 2. 3-OH-C14:1-HLS
influencia la producción de rhiI, gen situado en el pSym (pRL1JI) y que codifica RhiI
21
que produce AHLs de cadena corta (C6-C8); estas AHLs junto con RhiR induce la
transcripción de rhiI y rhiABC (genes expresados en la rizosfera y que tienen influencia
en la nodulación). 3. 3-OH-C14:1-HLS también tiene influencia en la expresión de traI,
también situado en el pSym, que dirige la transcripción de AHLs de cadena corta (C6C8); estas junto con TraR permite la expresión de los genes trb (genes relacionados con
la transferencia del pSym y con la inhibición del crecimiento). 4. También existe una
influencia de 3-OH-C14:1-HLS fuera del pSym, RaiI produce AHLs de cadena corta (C6C8), que junto con RaiR regulan una serie de genes que todavía no han sido
identificados. 5. Existen unas funciones localizadas dentro del pSym responsables de de
la represión de 3-OH-C14:1-HLS.
Figura 2. A. Perfil plasmídico de R. leguminosarum bv. viciae UPM791 en gel de tipo
“Eckhardt” junto con las cepas curadas en diferentes plásmidos. Carriles: 1. UPM791.5
(pUPM791c-). 2. UPM791.0 (pUPM791c- y pUPM791d-). 3. UPM791.1 (pUPM791d-).
4. UPM791 (silvestre). Las flechas indican cada uno de los plásmidos que porta la cepa
silvestre.
B. Efecto de la expresión del gen aiiA sobre los niveles de AHLs en distintas cepas de
R. leguminosarum bv viciae separadas por cromatografía en capa fina. Carriles: 1.
UPM791. 2. UPM791 (pME6863). 3. UPM791.5. 4. UPM791.5 (pME6863). 5.
UPM791.5 (pME6000). 6. UPM791.1. 7. UPM791.1 (pME6863). 8. UPM791.0. 9.
UPM791.0 (pME6863). 10. 3841. 11. 3841 (pME6863). 12. 3841 (pME6000). A la
izquierda se indica la posición de marcadores sintéticos de composición conocida. En la
parte inferior se indican los mililitros equivalentes de sobrenadante de cultivo que se
cargaron para cada cepa.
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Figura 3. A. Separación bidimensional de proteinas de las cepas de Rhizobium
leguminosarum bv.viciae: A. UPM791 (silvestre). B. 3841 (silvestre). A la izquierda se
indica la posición de migración de marcadores de masa molecular conocida, y debajo se
indica la escala de pI estimada.
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Figura 4. Análisis de los cambios globales entre el proteoma de R. leguminosarum bv.
viciae UPM791 y R. leguminosarum bv. viciae 3841. En las gráficas se comparan las
proteínas de ambas cepas distribuidas a lo largo de un eje en función de su abundancia
(en % volumen). Para las comparaciones se utilizaron aproximadamente 200 proteínas
presentes en ambos geles. En cada una de las gráficas la elipse de dispersión de tramo
continuo delimita el área que ocupa el 95 % de las proteínas. La elipse de tramo
discontinuo es una transformación de la anterior para hacer comparables las diferentes
gráficas entre si. Las rectas de tramo discontinuo excluyen las proteínas cuya expresión
(en % volumen) resulta ser del doble o la mitad de una cepa respecto a la otra.
24
Figura 5. Detalle de variaciones en el proteoma de R. leguminosarum bv viciae
UPM791 debidos a los efectos de la curación de plásmidos y de la expresión del gen
aiiA. Parejas de ventanas: A. UPM791 (pME6000) y B. UPM791 (pME6863). C.
UPM791.5 (pME6000) y D. UPM791.5 (pME6863). E. UPM791.1 (pME6000) y F.
UPM791.1 (pME6863). En la figura aparece la ampliación correspondiente a la zona
recuadrada en Figura 3. A. comparada con la misma región de las geles de las otras
cepas. Las proteínas que sólo se encontraron en una de las ventanas de cada pareja se
indican mediante flechas negras. Las proteínas cuya expresión se vio aumentada en una
de las ventanas de cada pareja respecto a la otra se indican mediante elipses de color
rojo. La flecha azul indica una proteína mayoritaria que desaparece al curar el plásmido
pUPM791c y al intoducir el gen aiiA.
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