VALORACION DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY
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Lowry-1 (Farmacia) VALORACION DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY 1.- FUNDAMENTO TEÓRICO El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer A= ε.l.c Este método consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato. 2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso. Reacción entre la proteína y los reactivos BIBLIOGRAFÍA O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951) Lowry-2 (Farmacia) 2.- MATERIALES Y REACTIVOS Materiales .- Tubos de ensayo -.- Tubos Falcon (50 mL) .- Pipetas .- Colorímetro .- Cubetas de colorímetro .- Agitadores de tubos Reactivos - Reactivo A: Na2CO3 al 2%, NaOH 0,1 M - Reactivo B1: CuSO4 ⋅ 5H2O al 1% - Reactivo B2: tartrato sódico-potásico al 2% - Reactivo C: Se prepara, mezclando los reactivos: A, B1 y B2, en proporciones 50:0,5:0,5 (en volumen) - Reactivo Folin-Ciocalteau: reactivo comercial diluido a 1/4 - Solución patrón de albúmina de suero bovino (BSA) (2 mg/mL) - Muestra problema 3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Para determinar la concentración de proteínas de la muestra problema se construye una curva patrón o de calibrado a partir de una solución patrón (BSA) (2 mg/mL). La concentración que tienen las muestras problema se determina por interpolación de los valores de absorbancia en la curva patrón. El tubo 0, que sólo contiene agua destilada y los reactivos, sirve de blanco para el ajuste del colorímetro a cero de absorbancia. Pasos a seguir: a) Numerar del 0 al 6, tubos de plástico de 10 mL b) Pipetear las cantidades de agua, solución patrón de albúmina y solución problema señaladas en la tabla. c) Preparar el reactivo C, a partir de A, B1 y B2 d) Pipetear a todos los tubos el reactivo C. Mezclar el contenido de cada tubo y dejarlo reposar 15 minutos en oscuridad (dentro de la taquilla). e) A continuación añadir a todos los tubos el reactivo de Folin (diluido 1/4), mezclando bien por agitación. Dejar reposar 30 minutos en la oscuridad para que así se desarrolle completamente la reacción coloreada. f) Leer las absorbancias en el colorímetro a 580 nm. Previamente el aparato se ajusta a Absorbancia=0 con el blanco (tubo nº 0); de esa forma sólo se mide el color producido por las proteínas, puesto que se resta el color debido a los reactivos. Anotar la medida de absorbancia en la tabla. problema Reactivo C Folin diluido -- 5 mL 0,5 mL 0,1 mL -- 5 mL 0,5 mL 0,8 mL 0,2 mL -- 5 mL 0,5 mL 3 0,7 mL 0,3 mL -- 5 mL 0,5 mL 4 0,6 mL 0,4 mL -- 5 mL 0,5 mL 5 0,7 mL -- 0,3 mL 5 mL 0,5 mL 6 0,5 mL -- 0,5 mL 5 mL 0,5 mL Tubo Agua 0 1,0 mL 1 0,9 mL 2 Patrón (2 mg/mL) -- Abs.580nm [proteínas] mg/mL Lowry-3 (Farmacia) 4.- TRATAMIENTO Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS 4.1.- Determinar la concentración de proteínas de la curva patrón (tubos 1 a 4), expresada en mg/mL, y anotar el resultado en la tabla. 4.2.- Curva patrón: Representar, en papel milimetrado, la absorbancia frente a la concentración de proteínas de los tubos 1 a 4. 4.3.- Determinar la concentración de proteínas de los tubos 5 y 6, expresada en mg/mL. 4.4.- Determinar la concentración de proteínas en la muestra problema, expresada en mg/mL. 5.- CUESTIONES 5.1.- ¿Cómo debería ser la concentración de proteínas de los tubos 5 y 6?. ¿Igual o diferente? Comentarlo. 5.2.- La relación entre absorbancias y concentración de proteínas ¿se mantiene lineal aunque se incremente mucho la concentración? Haga un comentario al respecto. 5.3.- Observaciones a la práctica.
