DESPLIEGUE DE LA TOXINA Cry1Ac DE Bacillus thuringiensis EN

XI CONGRESO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOINGENIERÍA
DESPLIEGUE DE LA TOXINA Cry1Ac DE Bacillus thuringiensis EN LA SUPERFICIE DEL
BACTERIÓFAGO T7: EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD INSECTICIDA
Sabino Pacheco-Guillén, Isabel Gómez, Alejandra Bravo y Mario Soberón.
Departamento de Microbiología Molecular. IBT-UNAM. Apdo. Postal 510-3 CP 62251, Cuernavaca, Morelos
Tel: (777)3291624, fax: 3172388. [email protected]
Palabras clave: Toxina, B. thuringiensis, Phage Display.
Introducción. Bacillus thuringiensis es una bacteria que
presenta un ciclo de vida bifásico, en presencia de nutrientes
se encuentra en una fase vegetativa y en ausencia de los
mismos se diferencia a espora, es en este estadío que es
capaz de sintetizar proteínas que presentan actividad
especifica sobre diferentes órdenes de insectos (1). Estas
toxinas se agrupan en dos categorías: Cry y Cyt. Las toxinas
Cry están organizadas en 3 dominios estructurales que
presentan funciones diferenciales en el mecanismo de
toxicidad; el Dominio I esta involucrado en la formación del
poro, el Dominio II interacciona con receptores específicos
de los insectos y el Dominio III protege a la toxina a
degradación proteolíca (2). Cry1Ac es una toxina específica
para Lepidópteros y con capacidad de unión a N-acetilgalactosamina, un azúcar que se encuentra con frecuencia en
proteínas de membrana (3). El uso adecuado de estas toxinas
permite el control de insectos plaga
y vectores de
enfermedades. Sin embargo se ha observado que los insectos
llegan a generar resistencia, por lo que es importante abordar
este problema. Mediante ingeniería genética es posible
obtener mutantes que sean capaces de unirse a nuevos
blancos o con actividad incrementada y utilizando “phage
display” es posible hacer una selección de las mismas, por lo
que resulta importante evaluar si este sistema es útil para
desplegar toxinas Cry con actividad insecticida.
Objetivo: Desplegar la toxina Cry1Ac en fago T7 y evaluar
la unión a receptores naturales y actividad en insectos.
Metodología. Mediante PCR se amplificó el fragmento
tóxico del gene de cry1Ac. Este se clonó en el vector T7Select1-1b, haciendo una fusión en el C-terminal de la
proteína B de la cápside viral con el N-terminal de la toxina
(T7Select System Manual, Novagen). El oligonucleótido
“forward” utilizado para obtener a cry1Ac se diseñó
introduciendo un sitio de corte para la tripsina, con la
finalidad de liberar la toxina de la cápside del fago T7. La
toxina desplegada en el fago se detectó en un extracto de los
fagos mediante Western-blot. Una vez que se confirmó el
despliegue, se evaluó la capacidad de unión a su receptor
natural utilizando vesículas preparadas a partir del intestino
medio del lepidóptero Manduca sexta. Las proteínas de las
vesículas se separaron en un gel desnaturalizante y se
transfirieron a membrana de nitrocelulosa, la cual se incubó
con los fagos y éstos se detectaron con un anticuerpo antiT7. Finalmente evaluamos la actividad de la toxina en
bioensayo mediante la técnica de contaminación de
superficie empleando larvas neonatas de M. sexta.
Resultados y discusión. Previamente se ha intentado
desplegar la toxina Cry1Ac en los fagos M13 y λ, sin
embargo, estos dos sistemas resultaron poco exitosos pues la
toxina no es capaz de reconocer a su receptor y se degrada, o
bien la incorporación de la proteína al fago es muy poca y no
permite una selección eficiente (4,5). En este trabajo
demostramos que es posible desplegar la toxina Cry1Ac en
el fago T7. La toxina desplegada se detectó por Western-blot
como una banda de aproximadamente 100 kDa (que
corresponde a la fusión de proteinas: 65 kDa de la toxina +
35 kDa de la proteína B del fago T7). La toxina desplegada
muestra capacidad de unión a su receptor natural como la
toxina silvestre, demostrándose que la fusión al fago no
altera sus propiedades biológicas. Además su actividad “in
vivo” se analizó en bioensayo sobre larvas de M. sexta, en el
cual observamos una mortalidad del 100%.
Cuadro 1. Efecto de los fagos T7 sobre larvas neonatas de M. sexta
Dosis
% de Mortalidad
Fago T7/Cry1Ac
3.5 x 107 pfu/pozo
100%
Fago T7 silvestre
3.5 x 107 pfu/pozo
0%
Cry1Ac
1 ng/cm2
50%
Conclusiones. El sistema de despliegue en bacteriófago T7
permite desplegar toxinas Cry en su superficie, capaces de
reconocer sus receptores naturales y probar su efecto tóxico
en insectos, por lo que lo hace potencialmente útil para
construir bibliotecas de variantes de la toxina en este formato
y seleccionarlas retándolas contra insectos poco o no
susceptibles y evaluar la toxicidad sin necesidad de
subclonación en vectores de expresión.
Agradecimientos. A Blanca Lizbeth Cabrera Zavaleta por
proporcionarnos las larvas de M. sexta y su ayuda con los
bioensayos.
Bibliografía.
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