Factores de splicing a la carta

Factores de splicing a la carta
Jesús Valdés
Con miras a subsanar enfermedades genéticas ligadas a defectos de splicing, se han
creado factores de splicing que pueden reconocer prácticamente cualquier secuencia
de RNA fusionado a activadores o inhibidores de splicing.
El splicing es uno de los mecanismos principales involucrados en la regulación de la
expresión génica, y consiste en la remoción de los intrones seguido de la ligación de los
exones generando así un RNA mensajero maduro con sentido codificante. Tal remoción de
los intrones requiere de una variedad de factores constitutivos de splicing así como de
secuencias de nucleótidos específicas del propio RNA.
Aproximadamente el 75% del genoma humano consiste de genes interrumpidos por
intrones y múltiples exones alternativos, que generarán muchas variedades de mensajeros, y
por tanto de proteínas, a partir de un solo gen. Además, la mitad de las enfermedades
genéticas humanas, y algunos tipos de cáncer, están asociadas a defectos de splicing o a
eventos de splicing aberrante. En este sentido, es comprensible que la regulación de los
eventos de splicing alternativo requiera de la actividad de factores auxiliares de splicing
que activan o inhiben la inclusión de un exón.
Entre las proteínas activadoras se encuentran las proteínas SR en tanto que entre las
proteínas inhibidoras se encuentran las proteínas hnRNP. Ambos tipos de proteínas constan
de uno o dos dominios de unión a RNA (RRM y de homología K), que reconocen
secuencias específicas de RNA con una afinidad moderada. Las proteínas SR por su parte
activan el splicing por medio de su dominio rico en Arginias-Serinas (RS) que interactúan
con otros factores de splicing. Por otro lado, el dominio rico en Glicinas (Gly) de las
proteínas hnRNP inhibe la interacción de otros factores de splicing inhibiendo la inclusión
de exones.
Considerando los avances en Ingeniería Genética, sería formidable contar con proteínas
sobre diseño que contase con dominios de unión a RNA que pudiesen reconocer cualquier
secuencia de RNA así como con dominios de activación o de inhibición de splicing de
modo que pudieran aliviar defectos de splicing o corregir eventos de splicing aberrantes.
Luca Cartegni y Adrian Krainer [1] abrieron la puerta para explorar estas posibilidades por
el uso de activadores sintéticos de splicing consistentes en fragmentos de DNA unidos
covalentemente a dominios RS. Así, los fragmentos de DNA fueron capaces de enlazarse a
secuencias mutantes de RNA en células cancerosas y corrigieron el defecto de splicing
mediante el domino activador, eliminando el carácter canceroso de las células tratadas.
Ahora, el grupo de Zefeng Wang, del Departamento de Farmacología de la Escuela de
Medicina de la Universidad de Carolina del Norte y colaboradores dieron los pasos
siguientes en la ingeniería de dichos factores [2].
Para lograr un factor de splicing con especificidades prediseñadas, utilizaron el dominio
PUF de unión a RNA de la proteína Pumilio 1 humana, y otros dos dominios PUF con
especificidades diferentes, fusionados a una señal de direccionamiento nuclear y a un
dominio activador RS del factor de splicing ASF/SF2 o a un dominio inhibidor Gly de
hnRNP A1. El dominio PUF de Pumilio 1 consta de ocho repetidos PUF que reconocen 8
bases constitutivas del RNA con gran afinidad, mayor a la de los dominios RRM y de
homología K. Los repetidos PUF pueden ser modificados para reconocer prácticamente
cualquier secuencia de RNA y éstos clonados en fase con diversos dominios RS o Gly
pueden activar o inhibir prácticamente cualquier exón en cualquier transcrito naciente.
Los factores de splicing así diseñados, inhibieron o activaron, según el caso, en sistemas de
prueba en ensayos de splicing in vivo. Es decir, los genes de los 6 factores de splicing sobre
diseño se introdujeron en una de las tres células portadoras de sendas construcciones
reporteras con secuencias blanco para ellos e, ingeniosamente, cada juego de proteínas y
construcciónes reporteras sirvieron de testigos negativos de los otros juegos.
Wang y colaboradores también probaron que la activación del splicing se lograse
seleccionando sitios alternativos de splicing localizados tanto río arriba como río debajo del
sitio de reconocimiento de los dominios PUF y además construyeron otros factores sobre
diseño utilizando los dominios RS y Gly de otras proteínas obteniendo los mismos
resultados.
Pero el sistema es todavía más robusto ya que puede modular el splicing de genes de
células “en la vida real”. Los autores eligieron modificar el splicing del pre-RNA mensajero
de Bcl-X, que puede ser procesado en dos productos con funciones opuestas: la forma larga
Bcl-xL, codifica a un potente inhibidor de la muerte celular programada (es decir,
apoptosis) que esta presente en células inmortales y esta sobre-expresada en células
cancerosas; por otra parte, la forma corta Bcl-xS, es pro-apoptótica provocando que la
división de las células que las expresan sea altamente regulada. Para estimular la expresión
de Bcl-xS (es decir, inhibir la expresión de Bcl-xL), Wang y colaboradores expresaron un
factor de splicing sobre diseño con un dominio PUF que reconoce un segmento de RNA
intermedio entre los sitios de splicing 5’ que compiten entre las dos formas, dominio que
esta fusionado al dominio inhibidor Gly. El factor así diseñado estimuló la expresión de
Bcl-xS en tres tipos de células cancerosas y como resultado de dicha expresión esas células
cancerosas aumentaron su porcentaje de apoptosis y se tornaron más sensibles a las drogas
antitumorales.
En resumen, el trabajo de Wang y colaboradores promete el diseño casi universal de
factores de splicing a la carta.
Lecturas recomendadas
1.
2.
Cartegni, L. y Krainer, A.R. (2003) Correction of disease-associated exon skipping
by synthetic exon-specific activators. Nat Struct Biol, 10, 120-125.
Wang, Y., Cheong, C.G., Hall, T.M. y Wang, Z. (2009) Engineering splicing factors
with designed specificities. Nat Methods, 6, 825-830.