Procesamiento del ARN - Departamento de Quimica Biologica
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ARN 2009 Procesamiento del ARN Departamento de Química Biológica Expresión de genes Propiedades del ARN • • • • Generalmente simple cadena (Alto grado de plegamiento) El azúcar es ribosa: -OH en 2’ (-H en deoxi) AUGC (U reemplaza a T del ADN); pares A:U El ADN es nuclear en eucariotas; proteínas se sintetizan en citoplasma; RNA INTERMEDIARIO Experimentos de pulse chase usando 3H-U Microscopia electrónica de la transcripción de ARNr Procariotas transcripción y traducción simultánea Eucariotas transcripción en núcleo traducción en citoplasma INTERVALO: Fase post transcripcional ??? ARN en eucariotas RNA Pol I: rRNA RNA Pol II: mRNA RNA Pol III: tRNAs y snRNAs genes eucariotas intrones secuencias sin sentido exones secuencias codificantes Gen eucariota típico Procesamiento Details of processing: •5’ Cap: m7Gppp (guanyltransferase) 5’Cap •3’ PolyA (150-200) AAUAAA: Signals Cleavage of nascent transcript ca. 20 nt downstream Poly A polymerase adds 3’ A Splicing Pasos en el procesamiento del ARN: co-transcripcionales Capping: modifica el extremo 5’ Clivaje y poliadenilación: forma el extremo 3 Splicing: ocurre en el núcleo antes del transporte Split Genes Exp con SV40: los transcriptos no siempre corresponden a las secuencia lineales del ADN… Confirmación por tecnología del ADN recombinante Encontrado en mRNA, tRNA and rRNA Gen de la Ovalbumina : Microscopia electrónica Intron Intron Exon Exon Secuencia completa de eventos del procesamiento del ARN. SPLICING ALTERNATIVO Gran flexibilidad genética Intrones en diferentes genes • ARNm (0 a 60) • ARNr • ARNt (0 o 1) • Genes en mitocondria • Genes en cloroplastos ARNhn es el precursor del ARNm HIBRIDIZACION ARN - ADN Weissmann y col. 1978 Splicing los intrones son removidos Clases de intrones Auto - splicing Grupo I: genes nucleares, mitocondriales y cloroplásticos que codifican para ARNr, ARNt y ARNm, en Tetrahynena, Physarum, hongos y phage T4 Grupo II: transcriptos primarios de ARNm mitocondrial o cloroplástico en hongos, algas y plantas No auto - splicing Splicing de transcripto primario de ARNm: spliceosoma Splicing de ARNt de levaduras Intrones no auto splicing Transcriptos primarios de ARNm Se forma el intermediario lazo Requiere: • small nuclear ribonucleoproteins: snRNP o snurps • small nuclear RNA: snRNA (U1, U2, U4, U5, U6) Señales de splicing • exon GU-intrón-AG exón • secuencia consenso 5’-AG GUAAGU-intrón-YNCURAC-YnNAG G-3’ Y: U o C A R: purina Yn: 9 pirimidinas N • en levaduras 5’- GUAUGU-intrón-UACUAAC-YAG -3’ Disturbios en secuencias consenso inhibe el splicing normal Mecanismo de Splicing: las secuencias son claves At the 3’ splice site = AG Other consensus elements further upstream help define where these splice joints exist. Small nuclear RNAs (snRNAs) act as guides in the splicing process: Forms the splicosome Most begin with GU end with AG at the flanks spliceosoma Esquema del mecanismo de Splicing en 2 etapas Reacciones de transesterificación • 1) - 2’OH de un A interno ataca al fosfodiester que une el extremo 5’ del intrón al exón 1, produciendo el LAZO y moléculas 5’ exón • 2) - 3’OH del exón 5’ ataca al fosfodiester que une el comienzo del exon 2 y el extremo 3’ del intrón, ligado a los exones • El intrón se libera como lazo • El N de fosfodiésteres se conserva!!!! El splicing puede estudiarse in vitro Hicks y col. Methods (2005) 37: 306 ME: Suero control DO: antisuero anti RNA-prot PAGE 4% PAGE 10% Sharp y col, 1984 Análisis de los productos de la reacción de splicing in vitro Cinética del Splicing In vitro. Extracto nuclear de Hela Pre - radioactively labeled precursor RNA The splicing reactions were separated by gel electrophoresis. Notice that the intron and intronexon RNAs have an unusually reduced mobility in these polyacrylamide-urea gels. ¿Es este ARN atípico producto del splicing? Sharp y col, 1984 Mecanismo de splicing en 2 etapas: predicciones • intrón spl tiene un grupo 3’ OH • exón P exón sitio spl 3’downstream • intrón spl y exón 2+intrón nt ramificado (2’, 3’ y 5’ OH unidos a nt) • extremo 5’ del intrón en la ramificación Mecanismo de la RNasa T1 y T2 La ramificación involucra el extremo 5’ del intrón unido a un sitio dentro del intrón Conclusión Los RNAm nucleares sufren splicing vía un intermediario ramificado o tipo lazo Sharp y col. ¿Como ensayamos el splicing? Comparamos la secuencia del ADN con la del ARNm maduro RT-PCR Síntesis de la sonda para el ensayo de protección de la ribonucleasa (RPA) Señal de ramificación A dentro de región especial del intrón WT Splicing Mutante 1 No splicing Mutante 2 Splicing aberrante Mutante 3 Splicing aberrante Secuencia UACUAAC Gen: actina de levaduras Langford y Gallwitz, 1983 RESUMEN Los precursores de los ARNm sufren splicing Se forma el intermediario lazo Requiere: • Secuencias consenso en los extremos 5’ y 3’ de los intrones • Secuencias consenso en el punto de ramificación En levaduras: UACUAAC y determina cual AG downstream es el sitio 3’ de splicing En eucariotas superiores: UNCURAC El nt del BP is la A final Spliceosomas: intermediarios unidos a partículas Spliceosoma humano levaduras snRNAs y snRNPs Small nuclear RNAs • son los agentes que reconocen las señales de splicing • Actúan acoplados a proteínas • Small nuclear ribonuclear proteins “snurps’’ Se unen al spliceosoma y juegan roles críticos RNA que esta siendo sintetizado U1, U2, U4, U5 y U6 snARN son abundantes en el núcleo Reconocimiento de los sitios de splicing sitio donor 5 Y: C o U sitio de ramificación sitio aceptor 3 N: cualquier nt • snRNA U1 reconoce la secuencia en el sitio donor interacción por apareamiento de bases • snRNA U2 se une al sitio de ramificación interacción por apareamiento de bases Splicing en los transcriptos primarios de ARNm Spliceosoma: ensamblaje de la maquinaria de splicing Spliceosoma: ensamblaje de la maquinaria de splicing Spliceosoma: los grupos reactivos entran en estrecha proximidad U5 funciona como puente Formación del spliceosoma U1snRNP 13S 12S 9S Adenovirus E1A Apareamiento de bases entre U1 snRNA y el sitio 5’ de splicing es necesario pero no suficiente Porque cambios en U1 fallan en compensar cambios de bases en el sitio 5’ spl? Es necesario proteína/s que reconozca la secuencia en 5’???? U6snRNP • S: exón -(4tioU) intrónexón + extracto spl • UV cross-linking 4tioU a ARN • Electroforesis Conclusiones • U6 se une al nt 2 del intrón Evidencia por reversión del crosslinking • U6 se asocia a S antes de formación lazo U6 precursor, U6 lazoy U6U2 Steitz, 1991 Doble reconocimiento U1 y U6 Sitio 5’ Prueba de lectura para mejorar la especificidad del splicing
