las eficaces técnicas moleculares de identificación y cuantificación

LAS EFICACES TÉCNICAS MOLECULARES DE
IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS LEVADURAS
ENOLÓGICAS
Antonio Palacios*; David Carrillo*; Jesús Iruzubieta*; Stéphane Boutou**; Antoine
Fleury**; Dominique Labadie** y Pascal Chatonnet**
*Excell Ibérica; Calle Planillo Nº 12, 26006 Logroño, La Rioja; [email protected]
**Excell France; Rue del Golf, Merignac, Francia
Introducción:
Uno de los avances clave de la enología moderna es el reconocimiento de la importancia
de la levadura como un agente imprescindible para la adecuada obtención de vino. De
este reconocimiento nace, de manera inmediata, la necesidad de controlar las propiedades
genéticas y metabólicas de las cepas empleadas para las fermentaciones enológicas, así
como la de desarrollar sistemas analíticos capaces de distinguir entre las diferentes cepas
de levadura, tanto por las cepas inoculadas para ejercer un férreo control biológico de la
fermentación como las posibles levaduras contaminantes que pueden arruinar las
acciones de las que desarrollan una buena fermentación.
Actualmente existen varios métodos de identificación de levaduras de interés enológico.
Son técnicas de biología molecular con resultados rápidos, fiables y económicos. Estos
métodos se basan esencialmente en el análisis directo del ADN de la levadura; las
diferencias entre las propiedades de este DNA se denominan polimorfismo, el cual hace
posible su distinción.
El mayor reto al identificar cepas de levadura recae en la necesidad de diferenciar grupos
y especies que taxonómicamente están muy próximas, pero que tienen propiedades muy
diferentes en lo que respecta a sus aptitudes fermentativas y organolépticas. Además,
durante las primeras fases de la fermentación aparecen en el mosto levaduras de los
géneros Kloeckera, Candida, Rhodotorula, Pichia, Kluyveromyces o Hansenula, entre
otros. La presencia de estas especies puede dar lugar a metabolitos secundarios que
modifiquen las propiedades organolépticas del producto final, y, por tanto, es importante
disponer de buenos métodos de detección para su control. Finalmente, también es posible
utilizar las técnicas de identificación molecular para el análisis y comprobación de la
estabilidad genética de las cepas de levadura, un aspecto importante cuando se manejan
grandes volúmenes de cultivo, como es el caso de la multiplicación de levaduras
seleccionadas en forma de LSA (levadura seca activa).
Gracias a estas técnicas, el enólogo o elaborador de vino puede controlar mejor que tipo
de cepas de levadura que está utilizando en la bodega en forma de inóculo iniciador,
saber si ésta se implanta bien y si en definitiva, amortizar bien su inversión.
En el mercado de levaduras enológicas se pueden encontrar ciertas controversias respecto
a la cepa que va dentro del envase y darse la situación, que queriendo inocular una
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determinada levadura acorde al estilo de vino a elaborar, se compre otra distinta por
confusión intencionada o no. Para evitar esta embarazosa situación, los enólogos deben
saber que existen técnicas muy finas de biología molecular que les permiten saber
exactamente que cepa de Saccharomyces cerevisiae va dentro del paquete y por su puesto
su origen.
Se describen a continuación las técnicas disponibles en la actualidad, las cuales permiten
con exactitud valorar la identidad genética de la levadura, saber el grado de implantación
en bodega y su estabilidad genética, incluso el nivel de expresión génica, que será en
definitiva la responsable del resultado final de la transformación del mosto en vino.
•
Métodos clásicos de identificación de levaduras:
Tradicionalmente, las levaduras han sido clasificadas e identificadas según sus
características morfológicas y sus propiedades fisiológicas y bioquímicas. Entre los
criterios morfológicos, se contaba con su reproducción vegetativa, sexual, esporulación,
morfología celular, aspecto de colonia, etc.… Entre los criterios fisiológicos y
bioquímicos, la fermentación y asimilación de azúcares, poder fermentativo, asimilación
de nitratos, escisión de la arbutina, etc.…
Estas técnicas son complejas y en algunos casos pueden llevarnos a clasificaciones e
identificaciones incorrectas, ya que se basan principalmente en el estudio del fenotipo y
éste depende de las condiciones ambientales del desarrollo y del estado vegetativo o
amorfo, lo que puede llevar a duplicar especies, como es el caso de Brettanomyces
bruxellensis y Dekkera bruxellensis.
•
Métodos moleculares: identificación a nivel de especie
Estas técnicas se basan en la caracterización e identificación de especies utilizando
marcadores moleculares, normalmente de ADN, de cada especie o cepa.
-. Secuenciación de genes ribosomales: Los genes ribosomales presentan una secuencia
bastante conservada a nivel de género y especie en los organismos Eucariotas, por lo que
se trata de análisis genéticos muy útiles para establecer relaciones filogenéticas. La
técnica consiste en amplificar estas regiones conservadas por PCR (Polymerase Chain
Reaction) y posteriormente secuenciar los fragmentos amplificados. Esta técnica también
permite diferenciar especies.
-. Análisis de perfiles de restricción de ADNr (RFLP): Esta técnica (Restriction Fragment
Length Polymorphisms) consiste en el análisis de perfiles de restricción mediante la
comparación de los patrones de restricción de diferentes regiones de la zona ribosomal.
Ésta técnica es muy utilizada para la identificación de especies de interés enológico y en
estudios ecológicos y de dinámica poblacional.
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Figura 1: detección de secuencias
variables en los fragmentos de ADN,
(RFLP).
-. PCR: Las dos cadenas de ADN se separan y consiste en amplificar una región del
genoma por PCR (Polymerase Chain Reaction) y posteriormente estos fragmentos
amplificados se someten a una electroforesis en gel de poliacrilamida. Los fragmentos se
separan según su tamaño. Esta técnica se emplea en la caracterización e identificación de
levaduras y bacterias vínicas, también en estudios de biodiversidad.
-. FISH: Se basa en la utilización de unas sondas de ADN o ARN marcados y un
fluorocromo (Fluorescente In Situ Hybridization), que son capaces de hibridarse por tener
ácidos nucleicos complementarios. Posteriormente a la hibridación, se observan las
células marcadas al microscopio de fluorescencia. Es una técnica muy interesante, ya que
permite diferenciar especies dentro de una misma muestra, utilizando sondas específicas
y diferentes fluorocromos. Permite una buena exactitud en la diferenciación de especies,
siendo útil para estudios de diversidad poblacional y detección de levaduras y bacterias
alterantes del vino.
Figura 2: Identificación de bacterias lácticas y observación al microscopio de
fluorescencia. Fotografías tomadas de ww.probes.com.
•
Métodos moleculares: identificación a nivel de cepa
A veces no es suficiente con la identificación de especies y es necesario entonces ir más
allá. Para poder diferenciar a nivel de cepas, existen otras técnicas de biología molecular:
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-. Cariotipo o separación de cromosomas en PFGE: La separación de cromosomas se
presenta como una técnica muy útil para diferenciar especies y también a nivel de cepas.
Las diferentes cepas de una misma especie presentan una gran variabilidad en número y
tamaño de cromosomas, presentando cariotipos diferentes. Este polimorfismo
cromosómico se origina durante la reproducción. La técnica se basa en la separación de
cromosomas en electroforesis de campos pulsados (Pulsed Field Gel Electrophoresis) que
provoca una reorientación molecular del ADN, que es diferente dependiendo del tamaño
molecular. Con esta técnica se pueden realizar análisis de implantación de levaduras
inoculadas en bodega, que normalmente se hacen mediante PCR por ser rápida y mas
económica, pero en caso de incertidumbre, esta técnica es complementaria. También se
emplea en los programas de selección de levaduras enológicas de cepas Saccharomyces
cerevisiae.
Figura 3: separación de cromosomas
sobre gel de agarosa por campos
pulsados, (PFGE).
-. Análisis de restricción del ADN mitocondrial: El ADNmt de la levadura
Saccharomyces cerevisiae es una pequeña molécula con variabilidad dentro de la especie,
así que puede ser utilizada para diferenciar cepas. Necesita un trabajo previo de
extracción del ADNmt mediante la obtención de protoplastos y purificación del material
genético, aunque existen técnicas más avanzadas que han simplificado el método
mediante digestión total del ADN y utilización de enzimas de restricción que cortan más
el ADN nuclear que el mitocondrial (Querol et al. 1992). Esta técnica permite diferenciar
cepas no solo en el género Saccharomyces, si no que también lo consigue con otras
levaduras de interés enológico, como por ejemplo Brettanomyces o Zygosaccharomyces.
Figura 4: Digestión de fragmentos de
ADN mitocondrial y separación sobre
gel de agarosa.
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-. RAPD-PCR: La técnica RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic ADN-PCR)
consiste en amplificar al azar secuencias mediante la utilización de oligonucleótidos
cortos de secuencia arbitraria. Estos oligonucleótidos hibridan de manera inespecífica y
aleatoria a diferentes lugares del genoma, lo que permite la amplificación de fragmentos
polimórficos de ADN. Para cada cepa se obtiene un número determinado de
amplificaciones de diferente tamaño, lo que permite diferenciación entre cepas. La gran
ventaja de esta técnica, es que no es necesario información previa de ninguna secuencia
determinada y el principal inconveniente, es la reproducibilidad de resultados. Se utiliza
esta técnica en estudios de implantación de cepas Saccharomyces cerevisiae, para
estudios taxonómicos del grupo Saccharomyces y también para la caracterización de
estirpes no-Saccharomyces.
Figura 5: amplificación aleatoria de segmentos de ADN y separación de los
segmentos de tamaños diferentes en gel de agarosa, RAPD-PCR.
-. Microsatélites: Los microsatélites son repeticiones en serie de secuencias cortas. Estas
repeticiones están distribuidas a lo largo del genoma y son altamente variables entre
especies. Este elevado polimorfismo hace que los microsatélites sean unos buenos
marcadores moleculares para la identificación intra e ínter específico. La variabilidad de
estas secuencias es detectada mediante la amplificación por PCR utilizando
oligonucleótidos específicos. Se obtienen entonces perfiles de amplificación que permiten
distinguir cepas de una misma especie.
Figura
6:
amplificación
de
secuencias
de ADN repetidas
(microsatélites). Foto cedida por
Dorit Schuller de la Universidad de
Minho, (Portugal).
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-. Secuencias delta (δ): Estos elementos son secuencias de 330 pares de base que están
distribuidos de manera frecuente en el genoma de las levaduras. La técnica se basa en la
utilización de cebadores específicos a estos elementos delta (δ) para amplificar las
secuencias comprendidas entre estos elementos. Los elementos delta (δ) no están
presentes en levaduras no-Saccharomyces, por lo tanto esta técnica es limitada para
Saccharomyces cerevisiae.
-. AFLP: La técnica AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism) se basa en la
amplificación selectiva mediante PCR de los fragmentos de restricción de la digestión
total de ADN. La detección de polimorfismo se observa en un gel de poliacrilamida a
través de electroforesis capilar. Es una técnica muy sensible y reproducible, pero requiere
alta inversión y personal especializado, por lo que no es muy utilizada en enología.
Figura 7: Digestión d ADN en fragmentos y amplificación selectiva de ciertos
fragmentos. Foto cedida por la Universidad de LLN (Bélgica).
-. Microarrays: La técnica de análisis del ADN mediante la utilización de microarrays, ha
revolucionado la investigación y el desarrollo de estudios genómicos. La premia básica
de los microarrays de ADN es que las muestras de ARN o otros fragmentos de ADN
estén hibridados a regiones conocidas de oligonucleótidos de ADNc en los arrays.
Gracias a la alta densidad de los modernos microarrays, se puede medir el nivel de
expresión de genes funcionales. Se utilizan mucho en estudios de expresión de estrés en
Saccharomyces cerevisiae y permite determinar la función celular de los genes.
Figura 8: Medida de expresión génica mediante microarrays.
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-. PCR a tiempo real: La reacción en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en inglés
son PCR ("polymerase Caín reaction"), es una técnica que fue desarrollada por Kary
Mullis a mediados de los años 80. Con esta metodología, como se ha visto antes, se
pueden producir en el laboratorio múltiples copias de un fragmento de ADN específico,
incluso en presencia de millones de otras moléculas de ADN. Como su nombre indica, se
basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa que es capaz de fabricar una cadena de
ADN complementaria a otra ya existente. Sus únicos requerimientos son que existan
nucleótidos en el medio que son la materia base para fabricar el ADN (los nucleótidos de
adenina, timina, citosina y guanina), y una pequeña cadena de ADN que pueda unirse a la
molécula que queremos copiar para que sirva como cebadora (el cebador, en inglés
"primer").
La sensibilidad de la técnica de PCR es muy alta pero presenta algunos inconvenientes,
como son que no es una técnica cuantitativa y una relativamente alta probabilidad de
obtener falsos positivos por contaminación. Para solventar este último problema se ha de
optimizar la secuencia de los cebadores, así como la temperatura precisa para que estos se
unan al ADN en la localización correcta y realizar una adecuada manipulación de los
reactivos. Por otra parte para solventar el problema de la cuantificación se han generado
unas variaciones sobre el esquema inicial de la PCR, dando lugar a lo que se conoce
como PCR cuantitativa o PCR en tiempo real.
Figura 9: Curvas de calibración efectuada para cada tipo de micro-organismo
diana que permite cuantificar precisamente la cantidad de células presentes.
La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar en tiempo real la
amplificación de nuestro genoma de interés. Para llevar a cabo esta detección existen
varios métodos pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento de ADN
(sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que queremos amplificar. Esta
sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra molécula que inhibe esta
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fluorescencia ("quencher"), de tal forma que sólo cuando la sonda es desplazada de su
sitio por acción de la ADN polimerasa la molécula fluorescente se libera de la acción del
"quencher" y emite fluorescencia al ser iluminada con un láser. La cuantificación de la
fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la cantidad de
ADN que se está amplificando.
En general para que sea válida esta técnica requiere realizar en paralelo una curva patrón
en las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se está
amplificando.
Ejemplos prácticos de diferenciación genética entre cepas comerciales:
Vamos a exponer dos ejemplos ilustrativos de cómo diferenciar bien distintas cepas
comerciales de la especie Saccharomyces cerevisiae y de cómo resolver problemas en la
diferenciación de cepas, que pueden parecer similares con ciertas técnicas y no lo son.
Uno de ellos sirve para diferenciar 3 cepas comerciales que pueden parecer idénticas
mediante la técnica de PCR y el otro, diferenciando cepas dentro de Saccharomyces
cerevisiae variedad bayanus. Dentro de esta raza fisiológica, la diferenciación suele ser
más complicada, siendo necesario realizar varias técnicas en combinación para
distinguirlas sin problemas.
Normalmente, la técnica de PCR es suficiente para distinguir la gran mayoría de
levaduras comerciales, pero algunas de ellas necesitan técnicas complementarias para
resolver su definitiva distinción, como se verá más adelante.
•
Ejemplo Saccharomyces cerevisiae:
Las cepas denominadas 1, 2 y 3 no son diferenciables por métodos de RAPD-PCR, por lo
que se podría decir que las 3 cepas son idénticas. Como se observa en la figura 9, los
perfiles denominados como a) son iguales.
Sin embargo, analizando las mismas cepas mediante el método denominado PFGE con
unas condiciones electroforéticas de 60s-60s durante 15h seguido de 90s-90s por 9h a
6V/cm. En el apartado b) observamos que en esta condiciones, la cepa 1 es fácilmente
diferenciable de las otras dos cepas, mostrando que en realidad se trata de una cepa
distinta, aunque perteneciente a la misma especie de Saccharomyces cerevisiae.
Con esté método, las cepas 2 y 3 no son todavía diferenciables. Pero cuando se aplica el
método RFLP con las enzimas de restricción EcoRI, SalI, PstI y la sonda Ty, se puede
demostrar fácilmente que la cepa 2 es diferente de la cepa 1 y de la cepa 3, como se
deduce del análisis de los perfiles mostrados en los geles de los apartados c), d) y e).
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Figura 10: a) Identificación de 3 cepas mediante PCR (RAPD) con primers
específicos de secuencias de los elementos delta (δ). (1- cepa A, 2- cepa B, 3- cepa C
y 4-Ladder 100 bp). b) Identificación de las 3 cepas mediante PFGE (CHEF). (1Ladder, 2- cepa A, 3- cepa B y 4- cepa C). c) Identificación de las 3 cepas mediante
RFLP con la enzima SalI, (1- Ladder, 2- cepa A, 3- cepa B, 4- cepa C). d) igual que
c) pero con la enzima PstI y e) igual que c pero con la enzima EcoRI..
a)
1
•
b)
2
3
4
1
2
c)
3
4
1
d)
2
3
4
1
2
e)
3
4
1
2
3
4
Ejemplo Saccharomyces cerevisisiae variedad bayanus
En este caso, se comparan los perfiles genéticos de 7 cepas de levadura Saccharomyces
cerevisiae variedad bayanus. Los perfiles que se obtienen de estas levaduras con métodos
de RAPD-PCR no muestran diferencias entre ellas. Sin embargo cuando las mismas
cepas son estudiadas utilizando el método PFGE (figura 10), las diferencias se hacen
visibles, distinguiéndose claramente sus perfiles.
Figura 11: Perfiles por PFGE de 7 cepas de levadura diferentes de la especie
Saccharomyces cerevisiae, variedad bayanus.
A
B
C
D
9
E
F
G
Diferenciación de levaduras a nivel del fenotipo:
Llegados a este punto, es necesario entonces explicar que el comportamiento en bodega
de un microorganismo no depende solo de su estructura genética. Las condiciones de
vinificación y el estado fisiológico de la levadura van a condicionar la respuesta genética
en situaciones determinadas, como es la capacidad de respuesta al estrés, que en un
proceso de fermentación alcohólica, el nivel es elevado y la levadura necesita estar bien
provista metabólicamente para funcionar de forma correcta y cumplir así con sus
expectativas de elaboración de un vino en particular.
Un ejemplo de ello es la cantidad de glucógeno y trealosa celular, muy importante en
relación a la capacidad de conseguir una óptima respuesta de la levadura después de su
rehidratación (Novo et al. 2007). Dos cepas de levadura que comparten la misma carga
genética, van a comportarse de forma diferente cuando son inoculadas en un mosto a baja
temperatura después de la rehidratación y la cepa que mas trealosa y glucógeno tenga a
nivel citoplasmático, resolverá mejor su adaptación al tener mayor material energético y
a pesar de tener la misma carga genética de respuesta al estrés térmico.
Entonces, de cara a la elaboración de un determinado estilo de vino, no solo es
importante la carga genética de una cepa en particular, si no que también depende de la
tecnología empleada en su producción de biomasa, las condiciones de crecimiento y
secado y conservación. Así entonces, la estabilidad genética, la viabilidad celular, estado
fisiológico, contenido en nutrientes, trealosa y glucógeno, nivel de contaminación
microbiológica y la constitución lipídica de membrana, son factores determinantes que
influyen en los procesos bioquímicos de la fermentación alcohólica. Por tanto, también
son determinantes en la definición del resultado final cualitativo del vino.
Conclusiones:
1. Existen en la actualidad técnicas de biología molecular lo suficientemente
precisas y finas como para conseguir una buena diferenciación entre las levaduras
Saccharomyces y no-Saccharomyces, no solamente a nivel de especie, sino que
algunas de ellas conducen a la diferenciación clonal.
2. Estas técnicas permiten entonces llevar a cabo estudios de dinámica poblacional y
de biodiversidad, expresión génica de cada cepa, estudios de estabilidad genética,
control de calidad en la producción industrial de levaduras seleccionadas. En
bodega permiten realizar análisis de implantación de levaduras inoculadas y son
concluyentes para distinguir bien cepas comerciales las unas de las otras.
3. Son herramientas que poco a poco se van introduciendo en la industria enológica
por la gran información que proporcionan y van a permitir al enólogo y productor
de vino una clarificación muy oportuna y esperada del mercado de levaduras
enológicas.
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4. La tecnología empleada en la producción de las levaduras enológicas y su estado
fisiológico en el momento de su utilización condicionan la expresión génica, lo
que hace posible que dos levaduras idénticas a nivel genético, se comporten de
forma diferente según su capacidad de respuesta metabólica. Nada nuevo en
realidad, el genotipo es independiente de las condiciones del medio, pero el
fenotipo no. Este es totalmente dependiente de los recursos celulares disponibles
en un momento determinado y de las condiciones medioambientales donde debe
desarrollarse como ser vivo con capacidad de adaptación.
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